CN110305808B

CN110305808B - 一种高耐受1,5-戊二胺的大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110305808B
Application number: CN201810947913.2A
Authority: CN
Inventors: 陈可泉; 毛静文; 田威龙; 王璟; 魏国光; 许晟; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2018-08-20
Filing date: 2018-08-20
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2038-08-20
Also published as: CN110305808A

Abstract

本发明公开了一种高耐受1,5‑戊二胺的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号为NT1005，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年05月23日，保藏编号为CCTCC NO:M 2018304，还公开了菌株NT1005在发酵生产L‑赖氨酸中的应用。菌株NT1005在含40g/L的1,5‑戊二胺培养基中能正常生长，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。

Description

一种高耐受1,5-戊二胺的大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及大肠杆菌，具体涉及一种高耐受1,5-戊二胺的大肠杆菌及其应用。

背景技术

1,5-戊二胺是一种广泛存在于生物体中、具有多种生物活性的生物多胺，广泛应用于农业、医疗和工业产品中，特别是用于合成生物基聚酰胺产品。

目前合成戊二胺的方法有化学合成法、生物合成法。化学合成法条件苛刻、污染环境，不适合大规模推广。而生物法合成1,5-戊二胺具有原料来源广、生产条件温和、环境友好等优势。虽然人们对微生物发酵及酶法制备1,5-戊二胺做了大量的研究，但是直到目前都没有实现产业化的原因之一是1,5-戊二胺对微生物细胞有毒害作用。有研究表明，当培养液的1,5-戊二胺浓度达到0.2mol/L时，大肠杆菌的生长速率下降35％，当1.5-戊二胺浓度达到0.3mol/L时，培养液中的部分菌体已发生裂解。因此提高大肠杆菌对1,5-戊二胺的耐受性是解决发酵法产1,5-戊二胺的关键步骤之一。

发明内容

发明目的：为了解决现有大肠杆菌1,5-戊二胺耐受性差的问题，本发明第一方面提供了一种高耐受1,5-戊二胺的大肠杆菌，第二方面提供了大肠杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

技术方案：本发明第一方面提供一种大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号为NT1005，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年05月23日，保藏编号为CCTCC NO:M 2018304，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。

本发明的出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)NT1003ΔMetΔThr，该菌株是一株赖氨酸高产菌，经过32h的发酵罐发酵可产60g/L的L-赖氨酸，该菌株后期可通过基因工程等手段提高其1,5-戊二胺的产量，在利用葡萄糖直接发酵生产1,5-戊二胺方面有很大的潜能。但实验发现菌株NT1003ΔMetΔThr对1,5-戊二胺的耐受性很低，当培养基中含有30g/L的1,5-戊二胺时，其生长就受到很大抑制，当培养基中中含有40g/L的1,5-戊二胺时，菌株基本不生长，而将出发菌株NT1003ΔMetΔThr通过ARTP诱变后，利用含1,5戊二胺的平板及含1,5-戊二胺的发酵培养基筛选出的高1,5戊二胺耐受性的菌株NT1005，在含40g/L的1,5-戊二胺培养基中可以正常生长；出发菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2013年5月30日，保藏编号为CCTCC NO:M2013239，该菌株已公开于中国专利201310285525X中。

本发明第二方面提供大肠杆菌NT1005在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

优选地，使用的发酵培养基中包括质量百分比为3-4％的1,5-戊二胺。

优选地，所述发酵培养基的配方如下：葡萄糖3-4％、硫酸铵0.5-2％、磷酸氢二钾0.5-1％、硫酸锰0.02-0.08％、硫酸亚铁0.04-0.08％、硫酸镁0.1-0.3％、1,5-戊二胺3-4％、余量为水，pH为6.8-7.2。

优选地，所述发酵温度为33-37℃，发酵时间为32-40h。

有益效果：本发明采用ARTP诱变大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr，再利用含1,5-戊二胺的平板筛选出对1,5-戊二胺耐受性高的菌株NT1005，该菌株能够在含40g/L 1,5-戊二胺的发酵培养基中正常生长，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。在高耐受1,5-戊二胺的基础上，利用基因工程技术易于实现菌株NT1005高产1.5戊二胺，因此该菌株在直接发酵生产1,5-戊二胺方面有很大潜能。

附图说明

图1是菌株NT1003ΔMetΔThr在含不同浓度1,5-戊二胺培养基中的生长曲线；

图2是菌株NT1003ΔMetΔThr在含不同浓度1,5-戊二胺培养基中的L-赖氨酸生产曲线；

图3是菌株NT1003ΔMetΔThr的ARTP诱变致死率；

图4是NT1005菌株与原始菌株在含40g/L的1,5-戊二胺培养基中的生长曲线；

图5是NT1005菌株与原始菌株在含40g/L的1,5-戊二胺培养基中的L-赖氨酸生产曲线。

具体实施方式

实施例1大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr原始菌株对1,5戊二胺的耐受性考察

大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr原始菌株接于种子培养基扩大培养，500mL摇瓶装液量50mL，37℃，200rpm培养12h，然后接种于摇瓶发酵培养基中培养，500mL摇瓶装液量50mL，接种量1％(v/v)，37℃，200rpm发酵培养40h，然后每隔一定时间取样检测发酵液中的菌体量和L-赖氨酸产量。实验结果如图1和图2所示，当发酵液中含20g/L的1,5-戊二胺时菌体生长及L-赖氨酸的产量与不含1,5-戊二胺相比几乎没有差别，说明培养基中含有20g/L的1,5-戊二胺对菌体还未产生抑制；当发酵培养基中含30g/L的1,5戊二胺时部分菌体发生裂解，菌体生长受到很大抑制，而且赖氨酸的产量也急剧下降；当培养基中含40g/L及50g/L的1,5戊二胺时菌体生长就被完全抑制，菌体几乎不生长且不产赖氨酸。

本实施例中培养基的配方如下：

种子培养基按质量百分比包括如下组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2；

摇瓶发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖3％，硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸亚铁0.04％，硫酸镁0.1％、余量为水，pH6.8-7.2；1,5-戊二胺的添加量的质量百分比分别为0％、2％、3％、4％、5％，即0g/L、20g/L、30g/L、40g/L和50g/L。

实施例2大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr原始菌株进行第一步ARTP诱变

大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr原始菌株进行活化培养：将大肠杆菌NT1003ΔMetΔThr原始菌株在LB平板中划线分离出单菌落。再从LB平板中挑取单菌落接入50mL摇管，摇管中装有5mLLB培养基，37℃，200rpm，培养8-10h。再从摇管按体积比1-2％的接种量转接到500mL摇瓶，摇瓶装有为100mL LB培养基，37℃，200rpm培养12-14h得到处于对数生长期的菌液；将培养的菌液稀释至OD₆₀₀＝0.1-1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以20-100s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变。实验结果如图3所示，由图可知，50s是最佳的ARTP诱变时间。

实施例3筛选耐受高浓度1,5-戊二胺的菌株

1、1,5-戊二胺平板初筛

将50s诱变后的载片置于装有1mL生理盐水的离心管中，剧烈震荡，将载玻片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含1,5戊二胺(2％)的固体平板上，33-37℃培养24-36h，挑选出生长良好的菌落70株。

2、1,5-戊二胺平板复筛

将步骤1中筛选出的70个突变菌株，转接到含1,5戊二胺(2.5％)的固体平板上富集培养。33-37℃培养24-36h，通过平板上菌株生长情况筛选出3株生长较好菌株进行摇瓶发酵验证，筛选出的菌株为A-3、A-15、A-48。

3、摇瓶发酵筛选

将步骤2筛选得到的菌株A-3、A-15、A-48和原始菌株NT1003ΔMetΔThr分别接入种子培养基中扩大培养，500mL摇瓶装液量50mL，33-37℃，200rpm，培养10-12h，然后接种至含1,5-戊二胺(4％)的发酵培养基中培养，接种量1％(v/v)，500mL摇瓶装液量50mL，33-37℃，200rpm，发酵40h后检测各菌株的菌体量如表1所示：

表1

通过组合筛选得到的三株突变株在发酵过程中L-赖氨酸产量及菌体量均明显高于出发菌株，其中A-48的菌体量最高，命名为NT1005送至中国典型培养物保藏中心进行专利保藏。

其中，本实施例中使用的培养基配方如下：

(1)固体平板培养基按质量百分比包括如下组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、琼脂粉2％、余量为水；

(2)1,5戊二胺筛选培养基按质量百分比包括如下组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、琼脂粉2％、余量为水，pH6.8-7.2，初筛平板1,5戊二胺添加量2％，复筛平板1,5戊二胺添加量2.5％；

(3)种子培养基按质量百分比包括如下组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2；

(4)摇瓶筛选发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖3％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、1,5-戊二胺4％、余量为水，pH6.8-7.2。

实施例4突变菌株NT1005的传代稳定性

以葡萄糖为碳源的摇瓶发酵培养基中，检测突变株NT1005的传代稳定性，菌株NT1005传代发酵试验结果如表2所示。

菌株传代发酵试验具体步骤如下：

(1)菌株传代

将实施例3中获得的突变株大肠杆菌(Escherichia coli)NT1005，从平板中挑取单菌落接种到50mL摇管中，摇管装有LB培养基，装液量5mL，培养温度33-37℃，转速200rpm，培养8-10h，取出一部分菌液进行菌株保存，作为突变菌株的第一代。然后将剩下的菌液按照体积比1-2％的接种量转接新的摇管中，摇管装有新鲜LB培养基，装液量5mL，培养温度33-37℃，转速200rpm，培养8-10h，取出一部分菌液进行菌株保存，作为突变菌株的第二代。以此类推，分别得到突变菌株的第三代至第七代。

(2)发酵试验

将步骤(1)获得的突变菌株的第一代接种至LB平板培养基中活化，33-37℃下倒置培养24-40h，然后从活化后的平板中挑取一环菌株接种至种子培养基中33-37℃培养，200rpm，12h，从种子培养基中按体积百分比1-2％的接种量，然后接种于摇瓶发酵培养基中培养，500mL摇瓶装液量50mL，37℃发酵培养，200rpm，40h，取终样检测发酵液中菌株生长情况及L-赖氨酸含量。

按照步骤(2)依次验证突变菌株的第二代至第七代L-赖氨酸的含量。

其中，本实施例使用的培养基的配方如下：

(1)LB培养基，包含如下质量百分比组分：氯化钠0.5％、蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、余量为水。

(2)种子培养基，包含如下质量百分比组分：蔗糖2％、蛋白胨2％、硫酸铵2％、酵母提取物1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸镁0.3％、硫酸亚铁0.02％、硫酸锰0.07％、余量为水，pH6.8-7.2。

(3)摇瓶发酵培养基按质量百分比包括如下组分：葡萄糖3％、硫酸铵0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸亚铁0.04％、硫酸镁0.1％、1,5-戊二胺4％、余量为水，pH6.8-7.2。

表2

从实验结果可知，经过7次连续传代，NT1005突变株的菌体生长情况及L-赖氨酸的生产较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的菌株。

Claims

1.一种高耐受1,5-戊二胺的大肠杆菌，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)，菌株号为NT1005，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年05月23日，保藏编号为CCTCC NO:M 2018304；其特征在于，所述高耐受1,5-戊二胺是指1,5-戊二胺的浓度为40g/L。

2.权利要求1所述大肠杆菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方如下：葡萄糖3-4％、硫酸铵0.5-2％、磷酸氢二钾0.5-1％、硫酸锰0.02-0.08％、硫酸亚铁0.04-0.08％、硫酸镁0.1-0.3％、1,5-戊二胺4％、余量为水，pH为6.8-7.2。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵温度为33-37℃，发酵时间为32-40h。