TWI657140B - 具有屍胺生產力之微生物及使用該微生物製造屍胺之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於製造二胺之微生物，其中經引入或增強具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列或具有42%或更高之與SEQ ID NO：6之序列同源性的胺基酸序列之蛋白的活性；及一種使用該微生物製造二胺之方法。

Description

具有屍胺生產力之微生物及使用該微生物製造屍胺之方法
本發明係關於用於製造二胺之微生物及使用該微生物製造二胺之方法。
生源胺(BA)為含氮化合物，其主要藉由胺基酸之去羧基作用(decarboxylation)或藉由醛及酮之胺化作用及轉胺作用而製造。此等生源胺為低分子量化合物且在微生物、植物及動物之代謝中合成，且因此已知生源胺為頻繁發現於此等細胞中之組分。詳言之，生源胺為多胺，諸如精三胺(spermidine)、精胺(spermine)、腐胺(putrescine)或1,4-丁二胺及屍胺(cadaverine)。
一般而言，腐胺為用於製造多胺耐綸-4,6之重要原料，多胺耐綸-4,6藉由使腐胺與己二酸反應而製造。腐胺通常藉由涉及將丙烯轉化為丙烯腈及丁二腈之化學合成而製造。
作為使用微生物之腐胺之製造方法，已報導藉由大腸桿菌及棒狀桿菌之轉型來製造高濃度的腐胺之方法(國際專利公開案第WO06/005603號；國際專利公開案第 WO09/125924號；Qian ZD等人，Biotechnol.Bioeng.104：4,651-662,2009；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.88：4,859-868,2010；Schneider等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.95,169-178.,2012)。此外，已經積極地對大腸桿菌、酵母、植物及動物細胞中的腐胺轉運蛋白(transporter)進行了研究(K Igarashi,Plant Physiol.Biochem.48：506-512,2010)。
同時，屍胺為在動物組織的腐化期間藉由蛋白水解製造具臭味的二胺化合物。屍胺具有化學式NH2(CH2)5NH2，其類似於腐胺的化學式。
屍胺用作諸如聚醯胺或聚胺基甲酸酯、螯合劑或其他添加劑之聚合物的組分。詳言之，已知具有3.5百萬噸的每年全球市場的聚醯胺藉由屍胺或丁二酸之聚縮合作用而製備，且因此屍胺作為工業上適用之化合物已受到大量關注。
屍胺為發現於一些微生物中之二胺(Tabor及Tabor,MicrobiolRev.,49：81-99,1985)。在革蘭氏陰性細菌大腸桿菌中，屍胺藉由L-離胺酸去羧酶由L-離胺酸而生物合成。大腸桿菌中屍胺之含量藉由屍胺之生物合成、降解作用、攝取及輸出而調節(Soksawatmaekhin等人，MolMicrobiol.,51：1401-1412,2004)。
本發明的發明人已集中精力研究具有輸出諸如腐胺或 屍胺之二胺的能力以便改良具有二胺生產力的微生物中之二胺生產力之蛋白。結果，其發現溶血隱秘桿菌(Arcanobacterium haemolyticum)源性蛋白或與之具有高胺基酸序列同源性之蛋白具有二胺輸出活性，且此蛋白被引入用於製造二胺之微生物中以增強其活性，導致輸出諸如腐胺及屍胺之二胺的能力顯著增加，藉此完成本發明。
本發明之一目的係提供一種用於製造二胺之微生物。
本發明之另一目的係提供一種製造二胺之方法，其包括以下步驟：(i)培養用於製造二胺之微生物以獲得細胞培養物；及(ii)自經培養之微生物或細胞培養物回收二胺。
[最佳模式]
在實現以上目標之一態樣中，本發明提供一種用於製造二胺之微生物，其中經引人或增強具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列或具有42%或更高之與SEQ ID NO：6的序列同源性之胺基酸序列的蛋白之活性。
如本文所用，術語「二胺」共同地指具有兩個胺基之化合物，且其特定實例可包括腐胺及屍胺。腐胺為四亞甲基二胺，其可由作為前驅體(precursor)之鳥胺酸而製造。屍胺稱作1,5-戊二胺或五亞甲基二胺，其可由作為前驅體之離胺酸而製造。該等二胺為工業上適用的化合物，其用作合成諸如多胺耐綸、聚醯胺或聚胺基甲酸酯之聚合物的有價值原料。
如本文所用，術語「具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列 之蛋白」為發現於溶血隱秘桿菌中之蛋白，且亦稱作ARCH_0271。已研究發現，此蛋白保留與棒狀桿菌之膜蛋白NCgl2522的高同源性。在本發明之一實施例中，ARCH_0271蛋白經鑒定為假定蛋白(putative protein)，其涉及於具有二胺生產力之菌株中的二胺輸出，藉此顯著增加二胺生產力。
此處，具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列之ARCH_0271蛋白可為由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列編碼之蛋白。然而，在編碼ARCH_0271蛋白之聚核苷酸中，可在編碼區中產生各種修飾，限制條件在於其不改變自該編碼區表現之多肽的胺基酸序列，此係歸因於密碼子簡併性(codon degeneracy)或考慮到其中欲表現該蛋白之生物體所偏好的密碼子。因此，CE2495蛋白可由各種核苷酸序列以及由SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列編碼。其中，由SEQ ID NO：7表示的核苷酸序列為藉由針對麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)之密碼子用法最佳化ARCH_0271基因(SEQ ID NO：5)所製備的序列，但不限於此。
此外，本發明之ARCH_0271蛋白可為具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列或具有40%或更高、較佳地60%或更高、更佳地80%或更高、更佳地90%或更高、甚至更佳地95%或更高且最佳地99%或更高的與之同源性之胺基酸序列的任何蛋白，只要該蛋白呈現實質性二胺輸出活性。顯然，其中一部分刪除、經修飾、經取代或經添加之具有該同源 性之胺基酸序列亦在本發明的範圍內，只要所得胺基酸序列具有實質上等於或對應於SEQ ID NO：6之蛋白的生物活性。
如本文所用，術語「具有42%或更高之與SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列同源性之胺基酸序列的蛋白」意謂任何蛋白而無限制，只要該蛋白具有42%或更高之與SEQ ID NO：6的胺基酸序列之序列同源性之胺基酸序列且其亦實質上具有二胺輸出活性即可。例如，該蛋白可為具有SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26的胺基酸序列之蛋白，但不限於此。
例如，具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列之蛋白為發現於糞產鹼菌糞亞種(Alcaligenes faecalis subsp.faecalis)中之蛋白，且亦稱作QWA_00075。已研究發現，此蛋白保留與棒狀桿菌之膜蛋白NCgl2522的41%同源性及與溶血隱秘桿菌之ARCH_0271的42%同源性。在本發明之一實施例中，已研究發現QWA_00075蛋白在具有二胺生產力之菌株中呈現二胺輸出活性，藉此顯著增加二胺生產力。
具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列之QWA_00075蛋白可為由SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的核苷酸序列編碼之蛋白。然而，在編碼此蛋白之聚核苷酸中，可在編碼區中產生各種修飾，限制條件在於其不改變自該編碼區表現之多肽的胺基酸序列，此係歸因於密碼子簡併性或考慮到其中欲表現該蛋白之生物體所偏好的密碼子。因此，此蛋白可由各種核苷酸序列以及由SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24的核苷酸序列編碼。其中，由SEQ ID NO：24表示的核苷酸序列為藉由針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子用法最佳化QWA_00075基因(SEQ ID NO：22)所製備的序列，但不限於此。
此外，具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列之蛋白為發現於嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)中之蛋白，且亦稱作SMD_2351。已研究發現，此蛋白保留與棒狀桿菌之膜蛋白NCgl2522的52%同源性及與溶血隱秘桿菌之ARCH_0271的47%同源性。在本發明之一實施例中，已研究發現SMD_2351蛋白在具有二胺生產力之菌株中呈現二胺輸出活性，藉此顯著增加二胺生產力。
具有SEQ ID NO：26的胺基酸序列之SMD_2351蛋白可為由SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列編碼之蛋白。然而，在編碼此蛋白之聚核苷酸中，可在編碼區中產生各種修飾，限制條件在於其不改變自該編碼區表現之多肽的胺基酸序列，此係歸因於密碼子簡併性或考慮到其中欲表現該蛋白之生物體所偏好的密碼子。因此，此蛋白可由各種核苷酸序列以及由SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27的核苷酸序列編碼。其中，由SEQ ID NO：27表示的核苷酸序列為藉由針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子用法最佳化SMD_2351基因(SEQ ID NO：25)所製備的序列，但不限於此。
如本文關於序列所用的術語「同源性」係指與給定胺基酸序列或核苷酸序列之同一性，且同源性可以百分比表 述。在本發明中，具有與給定胺基酸序列或核苷酸序列同一或相似之活性的同源性序列係以「同源性%」表述。例如，同源性可使用計算評分、同一性及相似性之參數的標準軟體程式，特定言之BLAST 2.0或藉由在南方(Southern)雜交實驗中在所定義之嚴格條件下比較序列來鑒別。定義適當雜交條件係在此項技術之技能內(例如參見Sambrook等人，1989，下文)，且藉由熟習此項技術者已知之方法確定。
如本文所用，術語「用於製造二胺之微生物」係指藉由對不具有二胺生產力之親本菌株(parent strain)提供二胺生產力所製備的微生物或具有內源二胺生產力之微生物。特定言之，具有二胺生產力之微生物可為具有腐胺或屍胺生產力之微生物。
「具有腐胺生產力之微生物」可為但不限於將麩胺酸轉化為N-乙醯基麩胺酸之乙醯基麩胺酸合成酶、將乙醯基鳥胺酸轉化為鳥胺酸之鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)、將乙醯基麩胺酸轉化為N-乙醯基麩胺醯基磷酸之乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)、將乙醯基麩胺醯基磷酸轉化為N-乙醯基麩胺酸半醛之乙醯基-γ-麩胺醯基-磷酸還原酶(ArgC)或將乙醯基麩胺酸半醛轉化為N-乙醯基鳥胺酸之乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)的活性與其內源活性相比有所增強，以便增強自麩胺酸至鳥胺酸之生物合成路徑，且用作腐胺生物合成之前驅體的鳥胺酸之生產力有所增強的微生物，但不限於此。
此外，具有腐胺生產力之微生物可為經修飾以具有比其內源活性弱的自鳥胺酸合成精胺酸所涉及之鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)、麩胺酸輸出所涉及之蛋白(NCgl1221)及/或腐胺乙醯化所涉及之蛋白(NCgl469)的活性，及/或經修飾以引入鳥胺酸去羧酶(ODC)的活性之微生物。
此處，作為非限制性實例，乙醯基-γ-麩胺醯基磷酸還原酶(ArgC)可具有SEQ ID NO：15的胺基酸序列，乙醯基麩胺酸合成酶或鳥胺酸乙醯基轉移酶(ArgJ)可具有SEQ ID NO：16的胺基酸序列，乙醯基麩胺酸激酶(ArgB)可具有SEQ ID NO：17的胺基酸序列，且乙醯基鳥胺酸胺基轉移酶(ArgD)可具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列。然而，個別酶蛋白的胺基酸序列並未特定受限於此，且該等酶可為具有80%或更高、較佳地90%或更高或更佳地95%或更高的與之同源性的胺基酸序列之蛋白，只要其具有該等個別酶之活性。
此外，作為非限制性實例，鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(ArgF)可具有由SEQ ID NO：19表示之胺基酸序列，麩胺酸輸出所涉及之蛋白可具有由SEQ ID NO：20表示之胺基酸序列，且鳥胺酸去羧酶(ODC)可具有由SEQ ID NO：21表示之胺基酸序列。然而，個別酶蛋白的胺基酸序列並未特定受限於此，且該等酶可包括具有80%或更高、較佳地90%或更高、更佳地95%或更高或尤其較佳地97%或更高的與之同源性的胺基酸序列，只要其具有該等個別酶之活性。
同時，「具有屍胺生產力之微生物」可為但不限於藉由在具有離胺酸生產力之微生物中另外引入或增強離胺酸去羧酶(LDC)的活性而製備之微生物。例如，該微生物可為具有增強之離胺酸生產力以便增加屍胺產生之微生物。增強離胺酸生產力之方法可藉由熟習此項技術者可預知之已知方法執行。
離胺酸去羧酶為催化離胺酸轉化為屍胺之酶，且其活性經引入或增強，藉此有效地產生屍胺。
離胺酸去羧酶可具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列，但未特定受限於此。該酶可具有80%或更高、較佳地90%或更高或更佳地95%或更高的與之同源性之胺基酸序列，只要其具有以上活性。
如本文所用，術語「產生」為包括二胺之細胞外釋放(例如二胺釋放至培養基中)以及微生物內二胺之產生的概念。
同時，如本文所用之術語「蛋白活性之引入」意謂不具有內源蛋白之微生物由外部提供該蛋白之活性，且例如，其可藉由引入外源基因來執行。此外，術語「蛋白活性之增強」意謂保留於或引入微生物中之蛋白的活性狀態與其固有活性狀態相比有所增強。
蛋白活性之引入或增強之非限制性實例可包括存在於微生物中的蛋白自身之活性由於突變而改良以便實現超出內源功能之效果，及/或存在於微生物中的蛋白之內源基因活性的改良、內源基因由內部或外部因子擴增、基因複本 數增加、藉由外源基因之額外引入或啟動子之置換或修飾增加活性，但不限於此。
基因複本數增加可(但不特定限於)藉由將該基因可操作性連接於載體或藉由將其整合至宿主細胞基因組中來執行。特定言之，宿主細胞基因組中之聚核苷酸之複本數可藉由在宿主細胞中引入可操作性連接於編碼本發明蛋白之聚核苷酸且獨立於宿主細胞進行複製且起作用的載體，或藉由在宿主細胞中引入可操作性連接於該聚核苷酸且能夠將該聚核苷酸整合至宿主細胞基因組中之載體而增加。
如本文所用，「用於增加聚核苷酸表現之表現調節序列的修飾」可(但不特定限於)藉由經由核苷酸序列之刪除、插入、非保守性或保守性取代或其組合誘導表現調節序列上的修飾以便進一步增強表現調節序列之活性，或藉由用具有較強活性之核苷酸序列置換表現調節序列來進行。表現調節序列包括(但不特定限於)啟動子、操作子序列、編碼核糖體結合位點之序列及調節轉錄及轉譯之終止的序列。
如本文所用，啟動子之置換或修飾(儘管未特定受限於此)可藉由用比初始啟動子強之啟動子進行置換或修飾來執行。替代初始啟動子之強異源啟動子可連接於聚核苷酸表現單元的上游，且強啟動子之實例可包括CJ7啟動子、lysCP1啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA或aceB啟動子，且特定言之，棒狀桿菌源性啟動子lysCP1啟動子或CJ7啟動子可操作性連接於編碼該酶之聚核苷酸，使得 其表現率可增加。此處，lysCP1啟動子為經由編碼天冬胺酸激酶及天冬胺酸半醛去氫酶之聚核苷酸的啟動子區域之核苷酸序列取代改良的啟動子(WO 2009/096689)。此外，CJ7啟動子為源自產氨短桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)之強啟動子(韓國發明專利第0620092號及WO 2006/065095)。
此外，染色體上之聚核苷酸序列的修飾(儘管未特定受限於此)可藉由經由聚核苷酸序列之刪除、插入、非保守性或保守性取代或其組合誘導表現調節序列上的突變以便進一步增強該聚核苷酸序列之活性，或藉由用經修飾以具有較強活性之聚核苷酸序列置換該序列來執行。
如本文所用，術語「載體」係指包括編碼所需蛋白的核苷酸序列的DNA構築體，其可操作性連接於適當表現調節序列以在合適之宿主細胞中表現所需蛋白。調節序列可包括可起始轉錄之啟動子、用於調節轉錄之視情況存在的操作子序列、編碼合適之mRNA核糖體結合位點的序列及調節轉錄及轉譯的終止之序列。在載體引入至合適之宿主細胞中之後，其可獨立於宿主基因組複製或起作用，且可整合至基因組自身中。
用於本發明之載體並未受特定限制，只要其能夠在宿主細胞中複製，且此項技術中已知之任何載體均可使用。習知載體之實例可包括天然或重組質體、黏質體、病毒及噬菌體。例如，pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A及Charon21A可 用作噬菌體載體或黏質體載體。pBR類型、pUC類型、pBluescriptII類型、pGEM類型、pTZ類型、pCL類型及pET類型可用作質體載體。適用於本發明之載體並未受特定限制，且任何已知表現載體均可使用。較佳地，可使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118或pCC1BAC載體。
此外，染色體中編碼所需內源蛋白之聚核苷酸可使用用於細菌染色體插入之載體由突變型聚核苷酸置換。該聚核苷酸插入至染色體中可藉由此項技術中已知之任何方法，例如同源重組來執行。由於本發明之載體可藉由同源重組插入至染色體中，其可進一步包括選擇標誌物以確認染色體插入。選擇標誌物將選擇由載體轉型之細胞，亦即確認所需聚核苷酸之插入，且選擇標誌物可包括提供可選擇表型(諸如藥物抗性、營養缺陷型、對細胞毒性劑之抗性或表面蛋白表現)之標誌物。僅表現選擇標誌物之細胞能夠在用該選擇性試劑處理之環境下存活或顯示不同表現，且因此可選擇經轉型細胞。
如本文所用，術語「轉型」意謂包括編碼標靶蛋白之聚核苷酸的載體以使得由該聚核苷酸編碼之蛋白在宿主細胞中表現之方式引入至宿主細胞中。只要經轉型之聚核苷酸可在宿主細胞中表現，其可整合至宿主細胞之染色體中且位於其中，或在染色體外存在。此外，該聚核苷酸包括編碼標靶蛋白之DNA及RNA。該聚核苷酸可以任何形式引入，只要其可引入至宿主細胞中且在其中表現。例如， 該聚核苷酸可以表現卡匣(cassette)之形式引入至宿主細胞中，該表現卡匣為包括其自主表現所需之所有元素的基因構築體。典型地，該表現卡匣包括可操作性連接於該聚核苷酸之啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合位點或轉譯終止信號。該表現卡匣可呈可自複製表現載體之形式。又，該聚核苷酸可原樣引入至宿主細胞中且可操作性連接於在宿主細胞中表現所需之序列。
此外，如本文所用，術語「可操作性連接」意謂在編碼本發明之所需蛋白的聚核苷酸序列與起始且介導該聚核苷酸序列之轉錄的啟動子序列之間的功能連接。
此外，具有二胺生產力之微生物可為其中二胺乙醯基轉移酶活性與內源活性相比有所減弱以便增加二胺產生之微生物。
如本文所用，術語「二胺乙醯基轉移酶」為催化乙醯基自乙醯基-CoA轉移至二胺之酶，且其可由麩胺酸棒狀桿菌NCgl1469或大腸桿菌SpeG例示，但其名稱可視具有二胺生產力之微生物的屬而變化。NCgl1469可具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13的胺基酸序列，且SpeG可具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列，但該序列可視微生物之屬而變化。該蛋白可具有80%或更高、較佳地90%或更高、或更佳地95%或更高或尤其較佳地97%或更高的與之同源性之胺基酸序列，只要其具有二胺乙醯基轉移酶活性。
由於二胺乙醯基轉移酶將二胺轉化為乙醯基-二胺(例如，N-Ac-腐胺或N-Ac-屍胺)，二胺生產力可藉由與內源 活性相比之下減弱其活性而增加。
如本文所用，術語「內源活性」係指初始微生物具有之蛋白呈其原生或未變性狀態的活性，且「經修飾以具有與內源活性相比之下減弱之活性」意謂與初始微生物具有之相應蛋白呈原生或未變性狀態的活性相比蛋白之活性進一步減弱。
蛋白活性之減弱意謂與非修飾之菌株相比蛋白活性降低，或活性消除。有可能將此項技術中熟知之方法應用於蛋白活性之減弱。
該方法之實例可包括由突變以降低酶活性或消除蛋白活性之基因置換染色體上編碼該蛋白之基因的方法；將突變引入至染色體上編碼該蛋白之基因之表現調節序列中的方法；由具有較弱活性之序列置換編碼該蛋白之基因之表現調節序列的方法；使染色體上編碼該蛋白之基因之一部分或全部刪除的方法；引入互補性結合於染色體上該基因之轉錄物之反義寡核苷酸以抑制mRNA轉譯為該蛋白的方法；在編碼該蛋白之基因之SD序列的上游人工添加與SD序列互補的序列以形成二級結構，藉此阻止核糖體次單元之進入的方法；及在相應序列之開放閱讀框(ORF)的3’-端添加用於逆轉錄之啟動子的逆轉錄工程改造(RTE)方法，及其組合，但並未特定受限於此。
詳言之，編碼該蛋白之基因的部分或完全刪除可藉由將用於染色體插入之載體引入至微生物中，藉此用具有部分刪除或標誌物基因之聚核苷酸取代染色體上編碼內源標 靶蛋白之聚核苷酸來進行。「部分」可視聚核苷酸之類型而變化，但特定言之係指1至300個，較佳地1至100個，且更佳地1至50個核苷酸。
同時，本發明之微生物為具有二胺生產力之微生物，且包括表現具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列之蛋白的原核微生物，且其實例可包括屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、志賀氏菌屬(Shigella sp.)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、腸桿菌屬(Enterobacter sp.)、耶爾森氏菌屬(Yersinia sp.)、克氏桿菌屬(Klebsiella sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)、短桿菌屬(Brevibacterium sp.)、乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)、新月單胞菌屬(Selenomanas sp.)、弧菌屬(Vibrio sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鏈黴菌屬(Streptomyces sp.)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium sp.)、產鹼桿菌屬(Alcaligenes sp.)或其類似屬之微生物，但不限於此。本發明之微生物特定言之為屬於棒狀桿菌屬或埃希氏菌屬，且更特定言之麩胺酸棒狀桿菌或大腸桿菌之微生物，但不限於此。
特定實例可為藉由使基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之產腐胺菌株KCCM11240P(韓國發明專利公開案第2013-0082478號)刪除NCgl2522且接著將ARCH_0271引入至轉位子基因中而製備之微生物，NCgl2522為具有腐胺輸出活性之蛋白。因此，此微生物KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-ARCH_0271指定為CC01-0758，且在2013年11月15日根據布達佩斯條約以 寄存號KCCM11476P寄存於韓國微生物培養中心(Korean Culture Center of Microorganisms；KCCM)。
在另一態樣中，本發明提供一種製造二胺之方法，其包含：(i)培養具有腐胺二胺之微生物，其中經引入或增強具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列或具有42%或更高的與之序列同源性之胺基酸序列的蛋白之活性，以便獲得細胞培養物；及(ii)自經培養之微生物或細胞培養物回收二胺。
二胺、具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列之蛋白或具有42%或更高的與之序列同源性的胺基酸序列之蛋白、蛋白活性之引入、蛋白活性之增強、二胺及具有二胺生產力之微生物與上文所述相同。
在該方法中，培養微生物之步驟可(但未特定限於)較佳地藉由此項技術中已知之分批培養、持續培養及分批饋料培養執行。就此而言，培養條件並未受特定限制，但最佳pH(例如pH 5至pH 9，較佳地pH 6至pH 8，且最佳地pH 6.8)可藉由使用鹼性化學製品(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水)或酸性化學製品(例如磷酸或硫酸)來維持。另外，需氧條件可藉由向細胞培養物中添加氧氣或含氧氣體混合物來維持。培養溫度可維持於20至45℃下，且較佳地25至40℃下，且培養可執行約10至160小時。
此外，欲用於培養之培養基可包括個別地或組合作為碳源之糖及碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、油及脂肪(例如，大豆油、向日葵籽油、花生油及椰子油)、脂肪酸(例如，棕櫚酸、 硬脂酸及亞油酸)、醇(例如，甘油及乙醇)及有機酸(例如，乙酸)；個別地或組合作為氮源之含氮有機化合物(例如，蛋白腖、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米溶液、大豆粉及脲)或無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)；個別地或組合作為磷源之磷酸二氫鉀、磷酸二鉀或與其對應之含鈉鹽；其他必需生長刺激物，包括金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸及維生素。在本發明中，培養基可用作培養液體之同義語。
如本文所用，術語「細胞培養物」為藉由培養微生物獲得之材料，且包括培養基、所培養之微生物及自所培養之微生物釋放的物質。例如，可包括細胞培養物所需之營養供應源，諸如礦物質、胺基酸、維生素、核酸及/或除碳源及氮源以外一般含於培養基(或培養液體)中之其他組分。此外，可包括所需物質或由細胞製造/分泌之酶。
由於由培養物製造之二胺可分泌至培養基中或保留於細胞中，細胞培養物可包括藉由培養微生物所製造之二胺。
回收在本發明之培養步驟中製造之腐胺的方法可例如使用此項技術中已知之合適方法根據培養方法，例如分批培養、持續培養或分批饋料培養來進行，藉此自培養液體收集所需胺基酸。
在本發明中，已證明溶血隱秘桿菌源性ARCH_0271蛋白為具有二胺輸出活性之蛋白，且腐胺輸出活性可藉由 將此蛋白活性引入至具有腐胺合成路徑但具有低腐胺輸出活性之棒狀桿菌屬微生物中來增強。亦已證明，腐胺及屍胺之產生可同時藉由將此蛋白活性引入至具有腐胺及屍胺之合成路徑的大腸桿菌中來增加。因此，二胺可有效地藉由將溶血隱秘桿菌源性ARCH_0271蛋白應用於具有二胺生產力之微生物來製造。
下文中，本發明將參考實例更詳細地加以描述。然而，此等實例僅用於說明性目的，且本發明不意欲受此等實例限制。
參考實例1.製備具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬微生物
已證實當作為具有腐胺生產力之棒狀桿菌屬微生物的基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之產腐胺菌株KCCM11240P(韓國發明專利公開案第2013-0082478號)及基於麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之產腐胺菌株DAB12-a △NCgl1469(ArgF刪除、NCgl1221刪除、大腸桿菌speC引入、Arg操縱子啟動子取代、NCgl1469刪除；指定為DAB 12-b，韓國發明專利公開案第2013-0082478號)中刪除NCgl2522(屬於主要協助轉運蛋白超家族(MFS)之透性酶)時，腐胺產生減少。
亦已證實，腐胺在藉由將NCgl2522基因額外引入至 KCCM11240P或DAB12-b中之轉位子中或藉由用CJ7啟動子取代染色體上之NCgl2522啟動子以增強NCgl2522活性而製備之麩胺酸棒狀桿菌菌株中以高產率製造。此外，腐胺之細胞內的量在其中NCgl2522表現增強之菌株中量測，且結果，與對照組之量相比，觀察到較少量之腐胺。由此指示NCgl2522具有輸出腐胺之能力。
詳言之，基於編碼麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之NCgl2522的基因之核苷酸序列，一對用於獲得NCgl2522之N-端區域的同源重組片段之引子SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2及一對用於獲得NCgl2522之C-端區域的同源重組片段之引子SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4如下表1中使用。
使用作為模板之麩胺酸棒狀桿菌ATCC13032之基因組DNA及兩對引子執行PCR以便分別擴增N-端及C-端區域之PCR片段。此等PCR片段進行電泳以獲得所需片段。此時，進行PCR反應：在95℃下變性30秒，在55℃下退火30秒，且在72℃下延伸30秒，持續30個循環。因此獲得之N-端區域的片段用限制酶BamHI及SalI處理，且 因此獲得之C-端區域的片段用限制酶SalI及XbaI處理。因此處理之片段選殖至用限制酶BamHI及XbaI處理之pDZ載體中，以便構築質體pDZ-1’NCgl2522(K/O)。
質體pDZ-1’NCgl2522(K/O)藉由電穿孔引入至麩胺酸棒狀桿菌KCCM11240P中，以便獲得轉型體。接著，該轉型體塗於含有用於菌落形成之卡那黴素(25μg/ml)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚啉-D-半乳糖苷)的BHIS培養板(37g/l腦心浸液、91g/l山梨糖醇及2%瓊脂)上且培養。自因此形成之菌落選擇藍色菌落作為引入質體pDZ-1’NCgl2522(K/O)之菌株。
所選擇之菌株在震盪下在CM培養基(10g/l葡萄糖、10g/l聚蛋白腖、5g/l酵母提取物、5g/l牛肉提取物、2.5g/l NaCl及2g/l脲，pH 6.8)中在30℃下培養8小時。隨後，各細胞培養物連續地自10-4稀釋至10-10。接著，經稀釋之樣品塗於用於菌落形成之含X-gal固體培養基上且培養。自因此形成之菌落選擇以相對較低頻率出現的白色菌落以最終獲得其中編碼NCgl2522之基因刪除且腐胺生產力減弱之麩胺酸棒狀桿菌菌株。其中腐胺輸出活性減弱之麩胺酸棒狀桿菌菌株指定為KCCM11240P △NCgl2522。
以相同方式，使用作為模板之麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869之基因組DNA及表1中給出之兩對引子執行PCR以便藉由上文所述之方法構築質體pDZ-2’NCgl2522(K/O)。構築麩胺酸棒狀桿菌菌株，其中根據上文所述之方法使用該載體使編碼DAB12-b菌株之 NCgl2522的基因刪除以減弱腐胺生產力。此具有減弱之腐胺輸出活性的麩胺酸棒狀桿菌菌株指定為DAB12-b △NCgl2522。
實例1.選擇溶血隱秘桿菌ARCH_0271
如參考實例1中所證實，發現NCgl2522膜蛋白用於輸出腐胺。因此，基於NCgl2522之胺基酸序列，本發明的發明人使用國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI,www.ncbi.nlm.nih.gov)之BlastP程式檢查除棒狀桿菌屬基因外與之具有同源性之基因，且結果，其獲得溶血隱秘桿菌DSM 20595之ARCH_0271的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)及胺基酸序列(SEQ ID NO：6)，該ARCH_0271與之具有56%同源性。在非棒狀桿菌屬之其他屬中發現的與NCgl2522之胺基酸序列具有同源性之膜蛋白中，ARCH_0271之胺基酸序列在系統發育方面與NCgl2522之胺基酸序列最接近。
以相同方式，獲得源自糞產鹼菌糞亞種NCIB 8687之QWA_00075的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)及胺基酸序列(SEQ ID NO：23)，QWA_00075顯示與NCgl2522之胺基酸序列41%同源性；及源自嗜麥芽寡養單胞菌D457之SMD_2351的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)及胺基酸序列(SEQ ID NO：26)，SMD_2351顯示與NCgl2522之胺基酸序列52%同源性。QWA_00075之胺基酸序列及SMD_2351之胺基酸序列分別顯示與ARCH_0271之胺基酸序列42% 及47%同源性，如下表2中所顯示。
同時，具有顯示與NCgl2522之同源性的基因之微生物及其同源性在下表3中給出。
實例2.藉由將具有腐胺輸出活性之蛋白引入至源自棒狀桿菌屬之產腐胺菌株中使腐胺發酵
<2-1>將ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351引入至基於ATCC13032之產腐胺菌株之染色體中的轉位子基因中
為了檢查ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351基因之染色體插入是否影響在參考實例1中製備之具有降低的腐胺輸出活性之KCCM11240P △NCgl2522的腐胺輸出，藉由以下方法將ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351引入至轉位子基因中。
作為允許使用棒狀桿菌屬微生物之轉位子基因將基因插入至染色體中之用於轉型之載體，使用pDZTn(WO 2009/125992)，且CJ7(WO 2006/65095)用作啟動子。
基於溶血隱秘桿菌DSM 20595之核苷酸序列，藉由針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子用法最佳化核苷酸序列(SEQ ID NO：7)來合成ARCH_0271基因。以相同方式，亦藉由 針對麩胺酸棒狀桿菌之密碼子用法最佳化核苷酸序列(SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：27)來分別合成源自糞產鹼菌糞亞種NCIB 8687之QWA_00075及源自嗜麥芽寡養單胞菌D457之SMD_2351。所合成之基因作為選殖至pGEM B1中之基因獲得。
因此獲得之質體分別指定為pGEM B1-ARCH_0271、pGEM B1-QWA_00075及pGEM B1-SMD_2351。
約1.51kb、1.53kb或1.53kb之基因片段分別使用作為模板之pGEM B1-ARCH_0271、pGEM B1-QWA_00075或pGEM B1-SMD_2351質體及一對引子SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31(參見表4)擴增。此時，進行PCR反應：在95℃下變性30秒，在55℃下退火30秒，且在72℃下延伸1分30秒，持續30個循環。接著，此等PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳以溶離且純化所需大小的各色帶。
此外，藉由使用作為模板之p117-Pcj7-gfp及一對引子SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9(參見表4)進行PCR來獲得CJ7啟動子區域：在95℃下變性30秒，在55℃下退火30秒，且在72℃下延伸30秒，持續30個循環。CJ7啟動子基因之片段在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳以溶離且純化所需大小的色帶。
pDZTn載體用XhoI消化，且執行以上所獲得之各PCR產物的融合選殖。In-Fusion◎HD選殖套組(Clontech)用於融合選殖。所得質體分別指定為pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、pDZTn-P(cj7)-QWA_00075及pDZTn-P(cj7)-SMD_2351。
三種質體pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、pDZTn-P(cj7)-QWA_00075及pDZTn-P(cj7)-SMD_2351中之每一者均藉由電穿孔引入至參考實例1中所述之具有降低的腐胺輸出活性之麩胺酸棒狀桿菌KCCM11240P △NCgl2522中以獲得轉型體。該等轉型體在震盪下在CM培養基(10g/l葡萄糖、10g/l聚蛋白腖、5g/l酵母提取物、5g/l牛肉提取物、2.5g/l NaCl及2g/l脲，pH 6.8)中培養(30℃下持續8小時)。隨後，各細胞培養物連續自10-4稀釋至10-10。接著，經稀釋之樣品塗於用於菌落形成之含X-gal固體培養基上且培養。
自所形成之菌落選擇以相對較低頻率出現的白色菌落 以最終獲得其中藉由二次雜交引入編碼ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351之基因的菌株。最終選擇之菌株使用一對引子SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：31進行PCR以確認引入編碼ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351之基因。此等麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株分別指定為KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-ARCH_0271、KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-QWA_00075及KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-SMD_2351。
<2-2>將ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351引入至基於ATCC13869之產腐胺菌株之染色體中的轉位子基因中
為了檢查ARCH_0271基因之染色體插入是否影響參考實例1中製備之具有降低的腐胺輸出活性之DAB12-b △NCgl2522的腐胺輸出，將上文製備之pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、pDZTn-P(cj7)-QWA_00075或pDZTn-P(cj7)-SMD_2351引入至麩胺酸棒狀桿菌DAB12-b △NCgl2522中且以與實例<2-1>中相同的方式確認菌株之轉位子基因中引入ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351。
因此選擇之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株分別指定為DAB12-b △NCgl2522 Tn：P(cj7)-ARCH_0271、DAB12-b △NCgl2522 Tn：P(cj7)-QWA_00075及DAB12-b △NCgl2522 Tn：P(cj7)-SMD_2351。
<2-3>評估引入ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351之棒狀桿菌屬源性產腐胺菌株的腐胺生產力
為了確認ARCH_0271引入對產腐胺菌株之腐胺生產力的效果，比較在實例<2-1>及<2-2>中製備之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株的腐胺生產力。
詳言之，將10種類型之麩胺酸棒狀桿菌突變體(KCCM11240P；KCCM11240P △NCgl2522；KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-ARCH_0271；KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-QWA_00075；KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-SMD_2351；DAB12-b；DAB12-b △NCgl2522；DAB12-b △NCgl2522 Tn：P(cj7)-ARCH_0271；DAB12-b △NCgl2522 Tn：P(cj7)-QWA_00075及DAB12-b △NCgl2522 Tn：P(cj7)-SMD_2351)分別塗於含1mM精胺酸之CM板培養基(1%葡萄糖、1%聚蛋白腖、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉提取物、0.25% NaCl、0.2%脲、100μl 50% NaOH及2%瓊脂，pH 6.8，以1L計)上，且在30℃下培養24小時。將1鉑環的因此培養之各菌株接種於25ml滴定培養基(8%葡萄糖、0.25%大豆蛋白、0.50%玉米浸漬固體、4%(NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4．7H2O、0.15%脲、100μg生物素、3mg硫胺鹽酸鹽、3mg鈣-泛酸、3mg菸鹼醯胺及5% CaCO3，pH 7.0，以1L計)中，且接著在震盪下在30℃及200rpm下培養98小時。將1mM精胺酸添加至用於培養該等菌株之所有培養基中。量測各細胞培養物中之腐胺濃度，且結果顯示於下表5中。
如表5中所顯示，發現腐胺產生在兩種類型之引入ARCH_0271之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株中均增加。此外，發現與親本菌株KCCM 11240P △NCgl2522或DAB12-b △NCgl2522相比，腐胺產生在引入QWA_00075或SMD_2351之菌株中增加。由此指示QWA_00075或SMD_2351具有腐胺輸出活性。
實例3.藉由棒狀桿菌屬源性產離胺酸菌株中之ARCH_0271引入及離胺酸去羧酶表現使屍胺發酵
<3-1>在產L-離胺酸之麩胺酸棒狀桿菌KCCM11016P之染色體中的轉位子基因中引入ARCH_0271
為了確認ARCH_0271蛋白之屍胺輸出活性，將ARCH_0271基因引入至產離胺酸菌株KCCM11016P之染 色體中(此微生物在1995年12月18日以寄存號KFCC10881寄存於韓國微生物培養中心，且接著根據布達佩斯條約以寄存號KCCM11016P寄存於國際寄存管理局，韓國發明專利第10-0159812號)。將上文製備之pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271引入至麩胺酸棒狀桿菌KCCM11016P中且以與實例<2-1>中相同之方式確認菌株之轉位子中引入ARCH_0271。
因此選擇之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株指定為KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271。
<3-2>將大腸桿菌源性離胺酸去羧酶基因引入至引入ARCH_0271之產L-離胺酸菌株中
在實例<3-1>中製備之引入ARCH_0271之產L-離胺酸菌株KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271中引入用於屍胺產生之呈質體形式之大腸桿菌源性離胺酸去羧酶基因。自NCBI數據庫獲得來自大腸桿菌之離胺酸去羧酶ldcC之核苷酸序列(SEQ ID NO：32)及胺基酸序列(SEQ ID NO：33)。
藉由使用作為模板之大腸桿菌W3110菌株的染色體及一對引子SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：37(參見表6)進行PCR來獲得約2.1kb之ldcC基因片段：在95℃下變性30秒，在52℃下退火30秒，且在72℃下延伸2分鐘，持續30個循環。此產物用HindIII及XbaI處理，且接著在0.8%瓊脂糖凝膠中進行電泳以溶離且純化所需大小的色帶。
此外，藉由使用作為模板之p117-Pcj7-gfp及一對引子 SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35(參見表6)進行PCR來獲得CJ7啟動子區域：在95℃下變性30秒，在55℃下退火30秒，且在72℃下延伸30秒，持續30個循環。CJ7啟動子基因之基因片段用KpnI及HindII處理，且接著在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳以溶離且純化所需大小的色帶。
使用T4 DNA連接酶(NEB)選殖藉由在0.8%瓊脂糖凝膠中對KpnI及XbaI處理之pECCG117(Biotechnology letters第13卷，第10期，第721-726頁(1991))載體執行電泳且接著溶離且純化所需大小的色帶所獲得之基因片段、用KpnI及HindIII處理之CJ7啟動子基因片段及用HindIII及XbaI處理之離胺酸去羧酶ldcC基因片段。藉由以上實驗獲得之編碼大腸桿菌ldcC之質體指定為pECCG117-Pcj7-ldcC。
所製備之pECCG117-Pcj7-ldcC載體或pECCG117載體分別藉由電穿孔引入至KCCM11016P及KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271中。轉型體塗於含有用於選擇之25μg/ml卡那黴素的BHIS培養板上。所選擇之菌株分別指定 為KCCM11016P pECCG117、KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC、KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117及KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC。
<3-3>評估具有ARCH_0271之染色體插入及作為質體之離胺酸去羧酶基因的棒狀桿菌屬源性產離胺酸菌株之屍胺生產力
為了檢查將ARCH_0271引入至產屍胺菌株中是否影響屍胺產生，在實例<3-2>中製備之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株之間比較屍胺生產力。
詳言之，藉由以下方法培養4種類型之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株(KCCM11016P pECCG117；KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC；KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117；及KCCM11016P Tn：P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC)，且在其間比較屍胺生產力。
個別突變型菌株塗於CM板培養基(1%葡萄糖、1%聚蛋白腖、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉提取物、0.25% NaCl、0.2%脲、100μl 50% NaOH及2%瓊脂，pH 6.8，以1L計)上，且在30℃下培養24小時。所培養之菌株各自接種於含有25ml種子培養基(2%葡萄糖、1%蛋白腖、0.5%酵母提取物、0.15%脲、0.4% KH2PO4、0.8% K2HPO4、0.05% MgSO4 7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺HCl、2000μg鈣-泛酸及2000μg菸鹼醯胺，pH 7.0，以1L計)之250ml 三角燒瓶中，且在震盪下在30℃及200rpm下培養20小時。
接著，將1ml種子培養物接種於含有24ml製造培養基(4%葡萄糖、2%(NH4)2SO4、2.5%大豆蛋白、5%玉米浸漬固體、0.3%脲、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4 7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺鹽酸鹽、2000μg鈣-泛酸、3000μg菸鹼醯胺、0.2g白胺酸、0.1g蘇胺酸、0.1g甲硫胺酸及5% CaCO3，pH 7.0，以1L計)之250ml三角燒瓶中，且接著在震盪下在30℃及200rpm下培養72小時。
在培養後，藉由HPLC量測屍胺生產力。各菌株之細胞培養物中屍胺之濃度在下表7中給出。
如表7中所顯示，引入ARCH_0271之麩胺酸棒狀桿菌突變型菌株中之屍胺產生增加超過17%。
實例4.藉由將具有二胺輸出活性之蛋白引入至大腸桿菌中使二胺發酵
<4-1>藉由將ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351引入至W3110中來製備菌株
為了檢查溶血隱秘桿菌DSM 20595源性ARCH_0271、糞產鹼菌源性QWA_00075或嗜麥芽寡養單胞菌源性 SMD_2351之表現是否增加具有腐胺及屍胺之生物合成路徑的野生型大腸桿菌菌株W3110中之腐胺及屍胺產生，分別將基於棒狀桿菌及大腸桿菌穿梭載體之pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、pDZTn-P(cj7)-QWA_00075或pDZTn-P(cj7)-SMD_2351引入至W3110中。
2X TSS溶液(Epicentre)用於轉型至大腸桿菌中，且轉型體塗於含有用於菌落形成之卡那黴素(50μg/ml)的LB培養板(10g胰蛋白腖、5g酵母提取物、10g NaCl及2%瓊脂，以1L計)上且培養。因此形成之菌落分別指定為W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075及W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351。
<4-2>比較引入ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351之大腸桿菌的二胺生產力
檢查上文獲得之菌株之腐胺及屍胺生產力。
詳言之，W3110及W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075或W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351在LB固體培養基上在37℃下培養24小時。
接著，其中每一者在25ml滴定培養基(2g(NH4)2PO4、6.75g KH2PO4、0.85g檸檬酸、0.7g MgSO4．7H2O、0.5%(v/v)微量元素、10g葡萄糖、3g AMS及30g CaCO3，以1L計)中在37℃下培養24小時。微量金屬溶液含有5M HCl：每1公升10g FeSO4．7H2O、2.25g ZnSO4．7H2O、1g CuSO4．5H2O、0.5g MnSO4．5H2O、0.23g Na2B4O7．10H2O、2g CaCl2．2H2O及0.1g(NH4)6Mo7O2．4H2O。
量測自各細胞培養物製造之腐胺及屍胺的濃度，且結果在下表8中給出。
如表8中所顯示，與親本菌株W3110相比，分別引入ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351之W3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075或W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351菌株中的腐胺及屍胺產生顯著增加。
亦即，已確認在細胞培養物中製造之二胺的量藉由增強與NCgl2522之胺基酸序列具有56%、41%或52%序列同源性的ARCH_0271、QWA_00075或SMD_2351蛋白之活性而顯著增加，表明輸出諸如腐胺及屍胺之二胺的能力可藉由增強CE2495或具有42%或更高的與之序列同源性的蛋白之活性而改良。
因而，本發明的發明人證明藉由將ARCH_0271引入至具有腐胺合成路徑但具有降低之腐胺輸出活性的棒狀桿菌屬微生物KCCM11240P △NCgl2522之轉位子中而製備 之具有增強的ARCH_0271活性之麩胺酸棒狀桿菌具有增強之腐胺輸出活性，藉此以高產率製造腐胺。
因此，此菌株KCCM11240P △NCgl2522 Tn：P(cj7)-ARCH_0271指定為CC01-0758，且在2013年11月15日根據布達佩斯條約以寄存號KCCM11476P寄存於韓國微生物培養中心(KCCM)。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.財團法人食品工業發展研究所、2015.06.22、BCRC910684
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.韓國、韓國微生物培養中心、2013.11.15、KCCM11476P
【無須寄存之生物材料】
所屬技術領域中具有通常知識者易於獲得之生物材料
1. KCCM11016P
2. KCCM11240P
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<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl2522-del-F1_BamHI
<400> 1
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl2522-del-R1_SalI
<400> 2
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl2522-del-F2_SalI
<400> 3
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl2522-del-R2_XbaI
<400> 4
<210> 5
<211> 1521
<212> DNA
<213> 溶血隱秘桿菌
<400> 5
<210> 6
<211> 506
<212> PRT
<213> 溶血隱秘桿菌
<400> 6
<210> 7
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARCH_0271(密碼子最佳化)
<400> 7
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7-F
<400> 8
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7-R
<400> 9
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARCH_0271-F
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARCH_0271-R
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<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl1469(麩胺酸棒狀桿菌)
<400> 12
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<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl1469(麩胺酸棒狀桿菌)
<400> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SpeG(大腸桿菌)W3110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ArgC
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ArgJ
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ArgB
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NCgl1221
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ODC(SpeC)
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<211> 1536
<212> DNA
<213> 糞產鹼菌糞亞種NCIB 8687
<400> 22
<210> 23
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<212> PRT
<213> 糞產鹼菌糞亞種NCIB 8687
<400> 23
<210> 24
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QWA_00075(密碼子最佳化)
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<211> 1533
<212> DNA
<213> 嗜麥芽寡養單胞菌D457
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<212> PRT
<213> 嗜麥芽寡養單胞菌D457
<400> 26
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<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMD_2351(密碼子最佳化)
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> QWA_00075-F
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SMD_2351-F
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<220>
<223> SMD_2351-R
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<211> 2142
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
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<211> 713
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
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<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7-F_KpnI
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7-R-HindIII
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ldcC-F_HindIII
<400> 36
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ldcC-R_XbaI
<400> 37

Claims (8)

  1. 一種微生物，係具有增強的屍胺生產力，其係相較於非經修飾之微生物，該微生物具有經引入或增強之蛋白活性之一蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：26的胺基酸序列，且該蛋白活性與其固有活性相比係增強的。
  2. 如請求項1所記載之微生物，其中二胺乙醯基轉移酶活性與內源活性相比之下係進一步減弱。
  3. 如請求項2所記載之微生物，其中該二胺乙醯基轉移酶具有選自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14組成之群的胺基酸序列。
  4. 如請求項1所記載之微生物，其中該微生物為屬於棒狀桿菌屬或埃希氏菌屬之微生物。
  5. 如請求項1所記載之微生物，其中該微生物為屬於棒狀桿菌屬之微生物，該微生物中另外引入離胺酸去羧酶的活性，藉此進一步產生屍胺。
  6. 一種製造屍胺之方法，其包含以下步驟：(i)培養如請求項1至5中任一項所記載之微生物以獲得細胞培養物；及(ii)自該經培養之微生物或該細胞培養物回收屍胺。
  7. 如請求項6所記載之製造屍胺之方法，其中該微生物為屬於棒狀桿菌屬或埃希氏菌屬之微生物。
  8. 如請求項7所記載之製造屍胺之方法，其中該微生物為屬於棒狀桿菌屬之微生物，該微生物中另外引入離胺酸去羧酶的活性。
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