JP7011622B2 - ジアミンを生産する微生物及びそれらを用いてジアミンを生産する方法 - Google Patents
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Description
,6を合成する重要な原料物質であり、主にプロピレン(propylene)からアクリロニト
リル(acrylonitrile)及びスクシノニトリル(succinonitrile)を経る化学合成法によ
り生産される。
われている(非特許文献4)。
カダベリンの生合成と分解、吸収と放出により調節される(非特許文献6)。
カダベリンは、1,5-ペンタンジアミン(1,5-pentanediamine)またはペンタメチレンジアミン(pentamethylenediamine)と命名され、リジンを前駆体として生成することが
できる。前記のようなジアミンはポリアミンナイロン、ポリアミドやポリウレタンのよう
な高分子で合成することができる原料物質として重要な価値のある、産業応用性を有する基盤化合物である。
在するタンパク質であり、QWA_00075とも命名される。前記タンパク質は、コリネバクテリウムの膜タンパク質であるNCgl2522とは41%の相同性を有し、アルカノバクテリウム・ヘモリティクムのARCH_0271とは42%の相同性を有することが見出された。本発明の一実施例では、前記QWA_00075タンパク質がジアミン生産能を有する菌株内にジアミンの排出能を有し、ジアミンの生産能を顕著に増加させることが明らかになった。
れるタンパク質が挙げられる。ただし、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドンの縮退性により、または前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に様々な改変がなされることが可能であり、前記配列番号22または24で表されるヌクレオチド配列以外にも、様々なヌクレオチド配列によってコードされ得る。このうち、前記配列番号24で表されるヌクレオチド配列は、QWA_00075遺伝子(配列番号22)に対してコリネバクテリウム・グルタミクムのコドンの使用頻度に合わせてコドン最適化した配列であり、それに限定されるのもではない。
及び類似度(similarity)などの媒介変数(parameter)を計算するための標準ソフトウ
ェア、具体的には、BLAST2.0を利用したり、定義された厳格な条件の下でサザンハイブリタイゼーション実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切なハイブリタイゼーション条件は、該当技術の範囲内であり(例えば、Sambrook et al., 1989, infraを参照)、当業者に公知の方法により決定できる。
ルニチンをオルニチンに変換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ(ArgJ)、アセチルグルタメートをアセチルグルタミルホスフェート(N-acetylglutamyl phosphate)に転換するアセチルグルタメートキナーゼ(ArgB)、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタメートセミアルデヒド(N-acetylglutamate semialdehyde)に変換
するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ(ArgC)、またはアセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチン(N-acetylornithine)に変換するア
セチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(ArgD)の活性を、内在的活性に比べて増加させるように改変することができ、プトレシンの生合成前駆体として用いられるオルニチンの生産性を向上させるように改変されたものであってもよいが、それに限定されるものではない。
、ArgF)、グルタメートの排出に関与するタンパク質(NCgl1221)、及び/また
はプトレシンをアセチル化させるタンパク質(NCgl469)の活性を内在的活性に比べて弱化させるように変異され/変異されたり、オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase、ODC)の活性を導入するように改変されたものであってもよい。
の生産を高めるためにリジンの生産能を向上させた微生物であってもよい。リジンの生産能を向上させるための方法は、従来公知の方法を活用して当業者が十分に予想可能であり、活用することができる。
たはさらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交換することによって行うことができる。
)が処理された環境では、選択マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または異なる表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に
必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
に比べて弱化したものであってもよい。
わせによっても達成することができるが、前記例により特に限定されるものではない。
換することによって行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類に応じて異なるが、具体的には、1~300個、好ましくは1~100個、さらに好ましくは1~50個である。
ター属(Citrobacter sp.)、サルモネラ属(Salmonella sp.)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)エルシニア属(Yersinia sp.)、クレブシエラ属(Klebsiella sp.)
、エルウイニア属(Erwinia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium sp.)、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)
、セレノモナス属(Selenomanas sp.)、ビブリオ属(Vibrio sp.)、シュードモナス属
(Pseudomonas sp.)、ストレプトマイセス属(Streptomyces sp.)、アルカノバクテリ
ウム属(Arcanobacterium sp.)、アルカリゲネス属(Alcaligenes sp.)などに属する
微生物であってもよいが、それらに限定されない。具体的には、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する微生物またはエシェリキア属微生物であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムまたは大腸菌(Escherichia coli)であるが、それらに限定されない。
ン及びセルロース)、油脂及び脂肪(例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸)、アルコール(例えば、グリセロール及びエタノール)及び有機酸(例えば、酢酸)などを含むが、これらに限定されず、個別にまたは混合して用いることができる。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物(例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア)、または無機化合物(例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム)などを含むが、これらに限定されず、個別に用いたり、または混合して用いることができる。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相当するナトリウム含有塩などを含むが、これらに限定されず、個別にまたは混合して用いることができる。その他の金属塩(例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄)、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。本明細書における前記培地は、培養液と同じ意味で用いられる。
プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物であって、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032ベースのプトレシン生産菌株KCCM11240P(特許文献6)、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13869ベースのプトレシン生産菌株DAB12-a△NCgl1469(argF欠損、NCgl1221欠損、大腸菌speC導入、argオペロンプロモーター置換、NCgl1469欠損; DAB12-bと命名、 特許文献6)からMFS(major facilitator superfamily)に属する
パーミアーゼ(permease)であるNCgl2522を欠失させたとき、プトレシン生産量が減少したことを確認した。
母エキス5g/l、牛肉エキス5g/l、NaCl 2.5g/l、ウレア2g/l、pH6.
8)に接種し、30℃で8時間振とう培養し、それぞれ10-4から10-10まで順次希釈した後、X-gal含有固体培地に塗抹し、培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーのうち、相対的に低い割合で現われる白色のコロニーを選択し、NCgl2522をコードする遺伝子が欠失してプトレシンの生産性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を作製した。このように製作されたプトレシン排出能が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株をKCCM11240P△NCgl2522と命名した。
ーを用いて、前記に明記された方法によりDAB12-b菌株のNCgl2522をコードする遺伝子が欠失してプトレシンの生産性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を作製した。このように製作されたプトレシン排出能が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株をDAB12-b△NCgl2522と命名した。
参照例1で確認したところによると、NCgl2522がコードする膜タンパク質がプトレシンを細胞外に排出する機能があることを示した。そこで、本発明者は、NCgl2522のアミノ酸配列に基づいて、米国国立生物情報センター(NCBI、www.ncbi.nlm.noj.gov)のBlastPプログラムを通じて、相同性があるコリネバクテリウム属以外の遺伝子のうち、56%の相同性を有するアルカノバクテリウム・ヘモリティクムDSM 20595のARCH_0271塩基配列(配列番号5)及びアミノ酸配列(配列番号6)を確保した。
酸配列(配列番号23)と52%の相同性を示すステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)D457由来のSMD_2351の塩基配列(配列番号25)及びアミノ酸配列(配列番号26)を確保した。前記QWA_00075のアミノ酸配列とSMD_2351のアミノ酸配列は、ARCH_0271アミノ酸配列とは、下記表2に示すように、それぞれ42%、47%の相同性を示す。
<2-1> ATCC13032ベースのプトレシン生産菌株における染色体内トランスポゾン遺伝子内へのARCH_0271、QWA _00075、SMD_2351導入
参照例1で作製したプトレシン排出能が減少したKCCM11240P△NCgl2522において、ARCH_0271、QWA_00075またはSMD_2351遺伝子を染色体内に挿入することによるプトレシン排出効果を確認するために、ARCH_0271、QWA_00075、またはSMD_2351を下記のような過程でトランスポゾン遺伝子内に導入した。
ネス・フェカリスsubsp.フェカリスNCIB 8687由来のQWA_00075とステノトロホモナス・マルトフィリアD457由来のSMD_2351もそれぞれコリネバクテリウム・グルタミクムのコドン使用頻度(codon usage)に合うように塩基配列
(配列番号24、配列番号27)を合わせて合成した。遺伝子合成は、pGEM B1にクローニングされた形で得た。
B1-QWA_00075、pGEM B1-SMD_2351と命名した。
それぞれ導入することによって形質転換体を得た。その後、前記形質転換体をCM培地(グルコース10g/l、ポリペプトン10g/l、酵母エキス5g/l、牛肉エキス5g/l、NaCl 2.5g/l、ウレア2g/l、pH6.8)で振とう培養(30℃、
8時間)し、それぞれ10-4から10-10まで順次希釈した後、X-gal含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。
参照例1で作製したプトレシン排出能が弱化したDAB12-b△NCgl2522において、ARCH_0271遺伝子を染色体内に挿入することによるプトレシン排出効果を確認するために、先に製作したpDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、pDZTn-P(cj7)-QWA_00075、pDZTn-P(cj7)-SMD_2351を実施例<2-1>と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミクムDAB12-b△NCgl2522に形質転換し、トランスポゾン内ARCH_0271、QWA_00075またはSMD_2351が導入されたことを確認した。
Tn:P(cj7)-SMD_2351と命名した。
プトレシン生産菌株において、ARCH_0271導入時にプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例<2-1>及び<2-2>で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株を対象に、プトレシン生産能を比較した。
n: P(cj7)-SMD_2351; DAB12-b; DAB12-b△NCgl252
2; DAB12-b△NCgl2522 Tn:P(cj7)-ARCH_0271; DAB12-b△NCgl2522 Tn:P(cj7)-QWA_00075、DAB12-b△
NCgl2522 Tn:P(cj7)-SMD_2351)を、それぞれ1mMアルギニ
ン含有CM平板培地(グルコース1%、ポリペプトン1%、酵母エキス0.5%、牛肉エキス0.5%、NaCl 0.25%、ウレア0.2%、50%NaOH 100μl、寒天2%、pH6.8、1L基準)に塗抹し、30℃で24時間培養した。これより培養された各菌株を25 mlの力価培地(グルコース8%、大豆タンパク質0.25%、トウモロコシ固形0.50%、(NH4)2SO4 4%、KH2PO4 0.1%、MgSO4・7H2O 0.05%、ウレア0.15%、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩3
mg、カルシウム-パントテン酸3mg、ニコチン酸アミド3mg、CaCO3 5%、pH7.0、1L基準)に一白金耳程度接種した後、これを30℃にて200rpmで98時間振とう培養した。すべての菌株の培養時培地に1mMアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表5に示した。
11240P△NCgl2522またはDAB12-b△NCgl2522よりもプトレシンが増加することが分かった。このような結果は、QWA_00075またはSMD_2351がプトレシン排出能を有していることを示すものである。
<3-1> L-リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016Pにおける染色体内トランスポゾン遺伝子内へのARCH_0271導入
Tn:P(cj7)-ARCH_0271と命名した。
実施例<3-1>で製作されたARCH_0271が導入されたL-リジン生産菌株KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271にカダベリンを生成するための大腸菌由来のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子をプラスミドの形で導入した。大腸菌由来のリジンデカルボキシラーゼldcCの塩基配列(配列番号32)及びアミノ酸配列(配列番号33)をNCBIのデータベースから確保した。
製した。
DNA lligase(NEB)を用いてクローニングした。前記実験で得られた大腸
菌ldcCをコードしているプラスミドをpECCG117-Pcj7-ldcCと命名した。
117-Pcj7-ldcC、KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117、KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcCと命名した(合計4種)。
カダベリン生産菌株において、ARCH_0271導入時にカダベリン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例<3-2>で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株を対象に、カダベリン生産能を比較した。
pECCG117; KCCM11016P pECCG117-Pcj7-ldcC; KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117; KCCM11016P Tn:P(cj7)-ARCH_0271 pECCG117-Pcj7-ldcC )を下記の方法で培養してカダベリン生産能を比較した。
H2O 0.05%、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、カルシウム
-パントテン酸2000μg、ニコチン酸アミド2000μg、pH7.0、1L基準)25mlを含有する250mlのコーナー-バプルフラスコに接種し、30℃で20時間、200rpmで振とう培養した。
<3-1> W3110にARCH_0271、QWA_00075、またはSMD_2351導入した菌株の製作
プトレシン生成能とカダベリン生合成経路を有する大腸菌野生型菌株W3110において、アルカノバクテリウム・ヘモリティクムDSM 20595のARCH_0271、アルカリゲネス・フェカリス由来のQWA_00075またはステノトロホモナス・マルトフィリア由来のSMD_2351を発現させる場合、プトレシンとカダベリンの生産を増加させることができるかどうかを確認するために、W3110のコリネバクテリウムと大腸菌シャトルベクターベースのpDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、pDZTn-P(cj7)-QWA_00075、またはpDZTn-P(cj7)-SMD_2351をそれぞれ導入した。
5g、Nacl 10g、寒天 2%、1 Lを基準)に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これより形成されたコロニーをそれぞれW3110 pDZTn-P(cj7)-ARCH_0271、W3110 pDZTn-P(cj7)-QWA_00075、W3110 pDZTn-P(cj7)-SMD_2351と命名した。
前記で得られた菌株を対象に、プトレシンとカダベリン生産能を確認した。
において37℃で24時間培養した。微量金属溶液(Trace metal solution)は、1リッ
トル当たり5M HCl: FeSO4・7H2O 10 g、ZnSO4・7H2O 2.25g、CuSO4・5H2O 1g、MnSO4・5H2O 0.5g、Na2B4O7・10H2O 0.23g、CaCl2・2H2O 2g、 (NH4)6Mo7O2・4H2O 0.1g を含む。
受託番号:KCCM11476P
受託日:2013年11月15日
しているが、排出能の低いコリネバクテリウム属菌株に、前記タンパク質の活性を導入してプトレシン排出能を強化させることを確認した。また、プトレシンとカダベリン生産経路を有している大腸菌にも、前記タンパク質の活性を導入すると、プトレシンとカダベリンの生産が同時に増加することを確認した。従って、アルカノバクテリウム・ヘモリティクム由来のARCH_0271タンパク質をジアミン生産能を有する微生物に適用することにより、ジアミンの効果的な生産をもたらすことができる。
Claims (5)
- (i)配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が導入または強化された、カダベリン生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップ、及び
(ii)前記培養された微生物または培養物からカダベリンを回収するステップ
とを含む、カダベリンの生産方法。 - (i)配列番号6と42%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が導入または強化された、カダベリン生産能を有する微生物であって、前記配列番号6と42%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号23または26である、微生物を培養して培養物を得るステップ、及び
(ii)前記培養された微生物または培養物からカダベリンを回収するステップ
とを含む、カダベリンの生産方法。 - 前記微生物中のジアミンアセチルトランスフェラーゼ活性が内在的活性に比べてさらに弱化したものである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ジアミンアセチルトランスフェラーゼは、配列番号12、13、及び14からなるグループから選択されたアミノ酸配列を有するものである、請求項3に記載の方法。
- 前記微生物は、コリネバクテリウム(Corynebacteirum)属微生物またはエシェリキア(Escherichia)属微生物である、請求項1または2に記載の方法。
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