JP6543758B2 - プトレシンまたはオルニチンの生産微生物及びそれを用いたプトレシンまたはオルニチンの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明はプトレシンまたはオルニチンを生産するための組み換え微生物及びそれを用いてプトレシンまたはオルニチンを生産する方法に関する。
バイオジェニックアミン（biogenic amines, BAs）は、アミノ酸の脱炭酸作用、アルデヒドとケトンのアミノ化とアミノ基転移反応により主に生成される窒素化合物である。このようなバイオジェニックアミンは低分子量であり、微生物、植物と動物の代謝過程で合成されるため、これら細胞でよく発見される構成要素として知られている。
その中でプトレシンは、グラム陰性バクテリアやカビで発見され、多様な種で高濃度で存在するため微生物の代謝に重要な役割をすると予測されている。一般的に、プトレシンはポリアミンナイロン‐４，６を合成する重要な原料物質として、主に化学合成法により生産される。前記化学合成法は触媒的酸化反応段階、シアン化物（cyanide）を用いる段階と高圧水素を用いる水素化反応段階などを含む３段階工程からなる。そこで、プトレシンの生産のためにより環境親和的であり、エネルギー消費を節減しうるバイオマスを活用する方法が求められている。
このような背景下、微生物を用いてプトレシンを生産する方法としては大腸菌とコリネバクテリウム属微生物を形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開された（特許文献１、特許文献２、非特許文献１〜３）。
一方、オルニチン（ornithine）は植物、動物、微生物で広く発見される物質であり、アルギニン、プロリン及びポリアミンの生合成に用いられる前駆体である。また、高等動物の生態内代謝でオルニチン回路を介して重要な役割をする。オルニチンは筋肉の生成と体脂肪の減少に効果があるため、栄養サプリメントとして用いられており、肝硬化と肝機能障害を改善する医薬品としても用いられている。このようなオルニチンを生産する方法としては、牛乳カゼイン（casein）を消化酵素で処理する方法及び形質転換された大腸菌またはコリネバクテリウム属微生物を用いた方法が知られている（特許文献３及び非特許文献４）。
大腸菌とコリネバクテリウム属微生物でプトレシンまたはオルニチンを生合成する経路は類似するが異なる点がある。まず、コリネバクテリウム属微生物はａｒｇＪ（bifunctional ornithine acetyltransferase/N-acetylglutamate synthase, EC 2.3.1.35）によりグルタミン酸（glutamic acid）がＮ‐アセチル‐Ｌ‐グルタミン酸（N‐acetyl‐L‐glutamic acid）に、Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐オルニチン（N‐acetyl‐L‐ornithine）がＬ‐オルニチン（L‐ornithine）に転換される「循環経路（cyclic pathway）」を有している。それに比べて、大腸菌はａｒｇＡ（ N-acetylglutamate synthase, EC 2.3.1.1）とａｒｇＥ（ Acetylornithine deacetylase, EC 3.5.1.16）がコリネバクテリウム属微生物のａｒｇＪを代わりにする「線形経路（linear pathway ）」を用いてプトレシンまたはオルニチンを生合成する。
コリネバクテリウム属微生物でＡｒｇＪは、オルニチン（ornithine）とグルタミン酸（glutamic acid）との間でアセチルグループがリサイクルするが、大腸菌ではＡｒｇＡがアセチルＣｏＡ（Acetyl‐CoA）のアセチル基（acetyl）をグルタミン酸（glutamate）に付加してＮ‐アセチルグルタミン酸（N‐acetyl‐glutamate）を生成し、ＡｒｇＥはＮ‐アセチルオルニチン（N‐acetyl‐ornithine）を分解してオルニチン（ornithine）とアセテート（acetate）を生成すると知られている（非特許文献５）。
一方、ｐｔａ‐ａｃｋＡ（pta、phosphotransacetylase; ackA、Acetate kinase）オペロン及びａｃｓ（Acetyl‐coenzyme A synthetase）は、アセテートを用いてアセチルＣｏＡを合成する遺伝子として知られている。
Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4): 651‐662, 2009
Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88(4): 859‐868, 2010
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Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 91, 17‐30., 2011
本発明者らはオルニチン及びプトレシン生産能の向上を目的に持続的に研究した結果、大腸菌由来のａｒｇＡ及びａｒｇＥをコリネバクテリウム属微生物に導入する場合にプトレシンとオルニチンの生産能が向上されることを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の目的は、プトレシンまたはオルニチンを高収率で生産することができる組み換え微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記微生物を用いてプトレシンまたはオルニチンを生産する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記微生物を用いてプトレシンまたはオルニチンを生産する方法を提供することにある。
本発明のプトレシンまたはオルニチンを生産するコリネバクテリウム属微生物に大腸菌由来のＡｒｇＡと大腸菌由来のＡｒｇＥを導入させた場合と、前記と共にさらにアセテートを用いる経路を強化した場合にプトレシン及びオルニチンの生産量が増加することを確認した。これにより、本発明の微生物はプトレシンまたはオルニチンを生産するのに広く活用することができ、これらの原料として用いられる様々な高分子製品の生産にも経済的な面及び環境的な面で効果的で好ましい原料提供の手段として広く活用されうる。
本発明の一様態は、大腸菌由来のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼ（N-acetylglutamate synthase）及び大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ（Acetylornithine deacetylase）の活性が導入された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記大腸菌由来のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼが、配列番号１のアミノ酸配列で構成されるものである、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列で構成されるものである、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）からなる群から選択されるものである、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase）及び酢酸キナーゼ（acetate kinase）オペロン（pta‐ackA operon）の活性が内在的活性に比べて強化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロンが、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列で構成されるものである、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらに大腸菌由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（acetyl‐CoA synthetase, acs）の活性が導入された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記アセチルＣｏＡ合成酵素が、配列番号９のアミノ酸配列で構成されるものである、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase, ODC）の活性が導入されるものである、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、ｉｉ）グルタミン酸エクスポーターまたはｉｉｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタミン酸エクスポーターの活性が内在的活性に比べて弱化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルトランスフェラーゼの活性が内在的活性より弱化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０または配列番号３１のアミノ酸配列で構成されるタンパク質である、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにプトレシンエクスポーターの活性が内在的活性より強化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明のもう一つの具体例は、 前記プトレシンエクスポーターが、配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列で構成されるタンパク質である、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本発明の他の様態は、
（ｉ）前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを回収する段階を含む、プトレシンまたはオルニチンの生産方法を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、プトレシンまたはオルニチンの生産方法を提供する。
（ｉ）前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを回収する段階を含む、プトレシンまたはオルニチンの生産方法を提供する。
本発明の一つの具体例は、前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、プトレシンまたはオルニチンの生産方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一様態は、大腸菌由来のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼ（N-acetylglutamate synthase）及び大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ（Acetylornithine deacetylase）の活性が導入された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物に関する。
本発明で使用される用語、「Ｎ‐アセチルグルタミン酸シンターゼ（N-acetylglutamate synthase）」は、グルタミン酸とアセチルＣｏＡからＮ‐アセチルグルタミン酸が生成される反応を媒介する酵素であって、生成されるＮ‐アセチルグルタミン酸はオルニチンとアルギニンとの前駆体として用いられる。
本発明でＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼとしての活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて、前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明でＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼは由来に限定されないが、例えば、大腸菌由来であってもよい。前記配列と相同性を有する配列として実質的に配列番号１のタンパク質と同一であるか、または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｎ‐アセチルグルタミン酸シンターゼタンパク質と同様の活性を有する限り、配列番号１のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、例示的には配列番号２のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明で使用される用語、「アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Acetylornithine deacetylase）」は、アセチルオルニチンの加水分解を媒介してアセテートとオルニチンが生成される反応を媒介する酵素である。
本発明でアセチルオルニチンデアセチラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルオルニチンからアセチル基とオルニチンとを分離させる活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて、前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明でアセチルオルニチンデアセチラーゼは由来に限定されないが、例えば、大腸菌由来であってもよい。前記配列と相同性を有する配列として実質的に配列番号３のタンパク質と同一であるか、または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードするポリヌクレオチドは前記アセチルオルニチンデアセチラーゼタンパク質と同様の活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、例示的には配列番号４のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
また、本発明のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２または４のポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチド配列から由来されたプローブ（probe）と厳格な条件（stringent conditions）で混成化されてもよく、正常的に機能するＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンデアセチラーゼをコードする変異型であってもよい。前記で用語「厳格な条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的な混成化を可能にする条件を意味する。例えば、このような厳格な条件は文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。
前記で用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と同一であるか、または同様の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と表示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にＢＬＡＳＴ ２．０を用いたり、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験により配列を比較することによって確認することができ、定義されている適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York）で決定されてもよい。
一方、本発明の微生物は天然型または変異型を両方含み、その例としては、 例としては、エシェリキア属（Escherichia sp.）、 赤痢菌属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）、エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、セレノマナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）などに属する微生物であってもよい。具体的に、本発明の微生物はコリネバクテリウム属に属する微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）からなる群から選択されるものであってもよく、さらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）であってもよいが、これに限定されない。
特に、本発明の用語、「プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物」は、コリネバクテリウム属微生物であって、プトレシンまたはオルニチンの生産能が天然的にあるか、プトレシンまたはオルニチンの生産能のない親菌株にプトレシンまたはオルニチンの生産能が付与された微生物を意味する。
前記プトレシンまたはオルニチン生産能が付与されるか、または生産する微生物は、特にこれに制限されないが、グルタミン酸からオルニチンまでの生合成経路を強化するために、グルタミン酸をアセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）に転換するアセチルグルタミン酸シンターゼ、またはアセチルオルニチンをオルニチンに転換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルリン酸（N‐acetylglutamyl phosphate）に転換するアセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルリン酸をアセチルグルタミン酸セミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に転換するアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチン（N‐acetylornithine）に転換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性を内在的活性に比べて増加させるように変形させてプトレシンの生合成原料として用いられるオルニチンの生産性が向上されたものであってもよい。
また、前記微生物はオルニチンにおいて、アルギニンの合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransfrase, ArgF）、グルタミン酸の排出に関与するタンパク質、及び/またはプトレシンをアセチル化させるタンパク質の活性を内在的活性に比べて弱化させるように変異されて/変異されるか、オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase, ODC）の活性を導入するように変形されたものであってもよい。
本発明の用語、「活性が導入」されることは、微生物内に存在しないか、または不備したタンパク質の活性が該当微生物に新たに導入されるか、または増大されることを意味することができ、具体的に微生物に存在しないタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に微生物内に挿入または伝達するか、微生物内で発現ができないか、またはほとんどできなかったタンパク質に対して発現を強化する変異を誘導することを含むが、前記例に制限されない。
一方、本発明で活性が導入されるか、活性化強化されるか、または活性が弱化されるなどの変異は、形質転換という過程を介して起ってもよく、本発明で用語、「形質転換」は、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドや活性が強いか弱いプロモーター配列などを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現するようにしたり、または宿主細胞の染色体の変異を誘導することを意味する。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現または変異を誘導することができるものであれば、どのような形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されて、必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
また、本発明で使用される用語、「作動可能に連結」されたというのは、本発明の特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本発明で使用される用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させられるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムに関係なく複製または機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組み換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。本発明で使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＺＴｎ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
このように、細菌内染色体挿入用ベクターを介して、染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組み換えにより行うことができるが、これに限定されない。本発明のベクターは、相同組み換えを起こして染色体に挿入されるため、前記染色体に導入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換した細胞を選択、すなわち目的ポリヌクレオチドが挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いてもよい。選択剤（selective agent）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または他の表現形質を示すので、形質転換した細胞を選別することができる。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase）及び酢酸キナーゼ（acetate kinase）オペロン（pta‐ackA operon）の活性が内在的活性に比べて強化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明でホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase）及び酢酸キナーゼ（acetate kinase）オペロン（pta‐ackA operon）は、グルコースやピルビン酸から生成されたアセチルＣｏＡがアセチルリンを経て、アセテートに転換される代謝経路とその反対方向の代謝経路を可逆的に媒介する遺伝子を含むオペロンである。
本発明で、ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロンは、配列番号５または７のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセテートからアセチルＣｏＡが生成される反応を媒介するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて、前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明でホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロンは由来に限定されない。前記配列と相同性を有する配列として実質的に配列番号５または７のタンパク質と同一であるか、または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロンをコードするポリヌクレオチドは配列番号５または７のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、最も具体的には配列番号６または８のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の用語、「活性が強化」されるのは、タンパク質自体の活性が新たに導入されたり増大され、本来の機能以上の効果を導出することを含むことだけではなく、内在的遺伝子活性の増加、内部または外部の要因から内在的遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子の導入、発現調節配列の変形、特にプロモーターの交替または変形及び遺伝子内の突然変異による酵素活性の増加などにより、その活性が増加されることを含む。
具体的には、本発明で活性増加は、
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行ってもよいが、これに限定されない。
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行ってもよいが、これに限定されない。
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行われてもよい。具体的に、本発明の酵素を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることによって行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることで前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するポリヌクレオチド配列に交替することによって行うことができる。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよく、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ‐Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあり、より具体的には、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）、あるいはＣＪ７プロモーター（特許文献５及び特許文献６）と作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良したポリヌクレオチド配列に交替することによって行うことができる。
特に、本発明で前記ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロン（pta‐ackA operon）の活性が内在的活性に比べて強化されることは、前記オペロンの細胞内コピー数の増加、前記オペロンの発現調節配列に変異を導入する方法、前記オペロン上の遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に交替する方法、前記オペロンを構成する酵素の活性が増加するように突然変異された遺伝子で染色体上の前記酵素を暗号化する遺伝子を代替する方法及び前記オペロンを構成する酵素の活性が強化されるように前記酵素を暗号化する染色体上の遺伝子に変異を導入させる方法で構成される群から選択されるいずれか一つ以上の方法を介してなすものであってもよい。具体的に、前記ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロン上の遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に交替する方法は、前記ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロンの内在的プロモーターの代わりに、例えば、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ‐Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどに交替してもよいが、これに限定されない。
本発明で使用される用語、「内在的活性」とは、本来微生物が変形されてない状態で有している酵素の活性状態を意味し、「内在的活性に比べて強化」されたことは、活性を示す遺伝子が導入されたり、または当該遺伝子のコピー数の増加、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失または発現調節配列の変形、例えば、改良されたプロモーターの使用などのような操作が行われる前の微生物が有する活性に比べて、操作が行われた以降の微生物が有する活性が増加した状態を意味する。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらに大腸菌由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（acetyl‐CoA synthetase, acs）の活性が導入された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明で、アセチルＣｏＡ合成酵素（acetyl‐CoA synthetase, acs）は、ＡＴＰ、アセテート及びＣｏＡからアセチルＣｏＡが生成される反応を媒介する酵素である。
本発明でアセチルＣｏＡ合成酵素は、配列番号９のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にアセチルＣｏＡ合成を媒介する活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。
また、微生物の種または菌株に応じて、前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に差が存在する場合があるため、本発明でアセチルＣｏＡ合成酵素は由来に限定されないが、例えば、大腸菌由来であってもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号９のタンパク質と同一であるか、相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
本発明のアセチルＣｏＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９のアミノ酸配列、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、最も具体的には、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性が導入されるものである、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明では、「オルニチンデカルボキシラーゼ」は、オルニチンのデカルボキシル化（decarboxylation）を媒介してプトレシン生産する酵素を意味する。コリネバクテリウム属微生物には、前記プトレシン生合成酵素がないが外部からオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）を導入するとプトレシン合成され、細胞外にプトレシンが排出される。外部から導入されうるオルニチンデカルボキシラーゼは、前記活性さえ有すれば微生物の由来に関係なく本発明で活用されうるが、具体的には、大腸菌由来が導入されうる。
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、ｉｉ）グルタミン酸エクスポーターまたはｉｉｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタミン酸エクスポーターの活性が内在的活性に比べて弱化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。コリネバクテリウム属において、グルタミン酸エクスポーターはＮＣｇｌ１２２１であってもよい。
また、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化された、プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
また、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにアセチルトランスフェラーゼの活性、具体的に、ＮＣｇｌ１４６９の活性が内在的活性より弱化された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
最後に、本発明のコリネバクテリウム属微生物は、さらにプトレシンエクスポーターの活性、具体的に、ＮＣｇｌ２５２２の活性が内在的活性より強化された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明の用語、「活性弱化」されることは、タンパク質自体の活性が減少されるか、または不活性化されて、本来の機能以下の効果を導出することを含むことだけではなく、内在的遺伝子活性の減少、前記遺伝子発現の抑制調節因子の活性化、遺伝子コピー数の減少、発現調節配列の変形、特にプロモーターの交替または変形及び遺伝子内の突然変異による酵素活性の不活性化または減少などによりその活性が弱化されることを含む。
具体的には、本発明の活性弱化は、例えば、
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が弱化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及び
４）これらの組み合わせから選択された方法によって達成することができ、これに限定されない。
１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が弱化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及び
４）これらの組み合わせから選択された方法によって達成することができ、これに限定されない。
具体的に、タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを、一部ポリヌクレオチド配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相異するが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、さらに具体的には、１〜５０個である。
また、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するポリヌクレオチド配列に交替することにより、行うことができる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含む。
さらに、染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、前記酵素の活性をさらに弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することにより、行うことができる。
それだけではなく、前記酵素のポリヌクレオチドの発現を抑制する調節因子を欠失する方法は、発現抑制因子のポリヌクレオチドを一部のポリヌクレオチド配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相異するが、具体的には、１〜３００個、より具体的には、１〜１００個、さらに具体的には、１〜５０個である。
ここで、前記アセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、グルタミン酸の排出に関与するタンパク質及びオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、特にこれに制限されないが、具体的にはそれぞれ配列番号３２、３３、３４、３５，３６，３７または３８のアミノ酸配列またはこれと７０％以上、より具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。また、プトレシンをアセチル化させるタンパク質は、特にこれに制限されないが、具体的には配列番号３０または３１のアミノ酸配列、またはこれと７０％以上、より具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
また、本発明でプトレシンエクスポーターは配列番号２６または２８のアミノ酸配列、またはこれと７０％以上、より具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
前記タンパク質の中で、アセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）及びプトレシンエクスポーターの活性強化は、例えば、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、前記酵素の活性が強化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、前記酵素のポリヌクレオチドの発現を抑制する調節因子の欠失及びこれらの組み合わせから選択される方法により、達成されてもよい。
また、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタミン酸の排出に関与するタンパク質、及びプトレシンをアセチル化させるタンパク質の活性弱化は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、前記タンパク質の活性が弱化されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、及びこれらの組み合わせから選択される方法により、達成されてもよい。
もう一つの様態として、本発明は、
（ｉ）前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを回収する段階を含む、プトレシンまたはオルニチンの生産方法を提供する。
（ｉ）前記プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを回収する段階を含む、プトレシンまたはオルニチンの生産方法を提供する。
前記の方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行ってもよい。ここで、培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよく、培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよい。前記培養によって生産されたプトレシンまたはオルニチンは培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
さらに、用いられる培養用培地で炭素共給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、プロクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール、及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊粉と尿素）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに制限されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これ対応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。また、その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
本発明の前記培養段階で生産されたプトレシンまたはオルニチンを回収する方法は培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野に公知された適切な方法を用いて培養液から目的物質を収集してもよい。
（実施例）
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥのプトレシン生産菌株内の導入及びそのプトレシン生産能の確認
１‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥを同時に導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株に大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子を挿入して、プトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、ａｒｇＡとａｒｇＥを前記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入した。
１‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥを同時に導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株に大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子を挿入して、プトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、ａｒｇＡとａｒｇＥを前記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入した。
コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて染色体内への遺伝子導入を可能にする形質転換用ベクターとしてはｐＤＺＴｎ（特許文献７）を用い、プロモーターは、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４、配列番号３９）を用いた。
具体的に、前記Ｎ‐アセチルグルタミン酸シンターゼ（N-acetylglutamate synthase）をコードする大腸菌由来の遺伝子であるａｒｇＡのポリヌクレオチド配列（配列番号２）を基にａｒｇＡ ＯＲＦ部位の相同組み換え断片を得るための配列番号１１及び１２のプライマー対を製作した。また、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Acetylornithine deacetylase）をコードする大腸菌由来の遺伝子であるａｒｇＥポリペプチド配列（配列番号４）をもとにａｒｇＥ ＯＲＦ部位の相同組み換え断片を得るための配列番号１５及び１６のプライマー対を製作し、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）のポリヌクレオチド配列（配列番号３９）を基にｌｙｓＣＰ１部位の相同組み換え断片を得るための配列番号１３及び１４のプライマー対を製作した（表１）。
まず、ａｒｇＡ遺伝子を得るために、大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型にし、配列番号１１及び１２のプライマー対を用いて約１.６ｋｂの遺伝子断片を増幅した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。その後、このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。
また、ＫＣＣＭ１０９１９Ｐ（特許文献４）菌株の染色体を鋳型にし、配列番号１３及び１４のプライマー対を用いて、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返し、ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位を収得した。
ｐＤＺＴｎベクターはＸｈｏＩを処理して、前記で収得した各ＰＣＲ産物を融合（Fusion）クローニングした。融合クローニングはＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡと命名した。
次に、ａｒｇＥ遺伝子を得るために、前記と同様の方法で大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型にし、配列番号１５及び１６のプライマー対を用いて、約１.４ｋｂの遺伝子断片を増幅してＰＣＲ産物を収得し、前記ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位と融合クローニングした。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥと命名した。
次に、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡをＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献８）に電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｉｎ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡが導入された菌株を選別した。
前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ‐ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によってａｒｇＡをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選別した。最終選別された菌株を対象に配列番号１２及び１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ａｒｇＡをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡと命名した。
前記製作されたａｒｇＡの導入菌株にａｒｇＥを導入するため、前記で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥを前記と同様の方法でＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡに形質転換し、最終選別された菌株を対象に配列番号１３及び１６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、トランソポゾン内にａｒｇＥが導入されたことを確認した。
これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥと命名した。
１‐２．ＡＴＣＣ１３８６９基盤のプトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥを同時に導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９基盤のプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２‐ａΔＮＣｇｌ１４６９（特許文献８）をＤＡＢ１２‐ｂと命名し、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥ遺伝子挿入がプトレシン生産能の向上に関与するかどうかを確認するために、ａｒｇＡとａｒｇＥをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９基盤のプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２‐ａΔＮＣｇｌ１４６９（特許文献８）をＤＡＢ１２‐ｂと命名し、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥ遺伝子挿入がプトレシン生産能の向上に関与するかどうかを確認するために、ａｒｇＡとａｒｇＥをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
前記で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡを前記実施例１‐１と同様にコリネバクテリウム・グルタミカムＤＡＢ１２‐ｂに形質転換し、トランスポゾン内にａｒｇＡが導入されたことを確認した。これからａｒｇＡが導入されたものと選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡと命名した。
その後、前記製作されたａｒｇＡ導入菌株にａｒｇＥを導入するため、前記で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥを前記実施例１‐１と同様の方法でＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡに形質転換し、トランスポゾン内にａｒｇＥが導入されたことを確認した。これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥと命名した。
１‐３．大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が導入されたプトレシン生産コリネバクテリウム菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株に大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの導入がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例１‐１及び１‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株に大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの導入がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例１‐１及び１‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
具体的に、前記実施例１‐１及び１‐２で製作した２種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）と２種の親菌株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ； ＤＡＢ１２‐ｂ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。
これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで５０時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表２に示した。
前記表２に示したように、大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が同時に導入された２種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株すべてでプトレシン生産量が９．８％以上増加したことを確認した。
実施例２：大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたプトレシン生産菌株のｐｔａ‐ａｃｋＡの強化及びそのプトレシン生産能の確認
２‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡ プロモーター置換菌株の製作
前記実施例１で製作した大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が導入されたプトレシン生産菌株に、さらにホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase）及び酢酸キナーゼ（acetate kinase）（pta‐ackA）活性を強化して、そのプトレシン生産能に及ぼす影響を確認した。
２‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡ プロモーター置換菌株の製作
前記実施例１で製作した大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が導入されたプトレシン生産菌株に、さらにホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase）及び酢酸キナーゼ（acetate kinase）（pta‐ackA）活性を強化して、そのプトレシン生産能に及ぼす影響を確認した。
そのため、染色体内のｐｔａ‐ａｃｋＡオペロンのプロモーターを内在的プロモーターより活性が強いプロモーター、具体的に開始コドンの前にｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）を導入した。
まず、ｌｙｓＣＰ１プロモーターを含み、前記プロモーターの両末端部位は染色体上のｐｔａ‐ａｃｋＡの元々の配列を有する相同組み換え断片を収得した。具体的に、ｌｙｓＣＰ１プロモーターの５’‐末端部位はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号１７及び１８のプライマー対を用いたＰＣＲを行って収得した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。
また、ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位は、配列番号１４及び１９のプライマー対を用いて同様の条件でＰＣＲを行って収得し、ｌｙｓＣＰ１プロモーターの３’‐末端部位はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号２０及び２１のプライマー対を用いて同様の条件でＰＣＲを行って収得した。前記プロモーター収得に用いたプライマーは、前記表１及び下記表３に示したとおりである。
前記で収得した各ＰＣＲ産物をＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングはＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺ‐ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ ａｃｋＡと命名した。
前記で製造したプラスミドｐＤＺ‐ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ ａｃｋＡをＫＣＣＭ１１２４０Ｐ及び実施例１‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｉｎ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ ａｒｇＡが導入された菌株を選別した。
前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ‐ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によって最終的にｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーターがｌｙｓＣＰ１に置換された菌株を選別した。
最終選別された菌株を対象に配列番号１９及び２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、染色体内のｐｔａ‐ａｃｋＡの開始コドン前にｌｙｓＣＰ１プロモーターが導入されたことを確認した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返した。
これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡと命名した。
２‐２．ＡＴＣＣ１３８６９Ｐ基盤のプトレシン生産のコリネバクテリウム菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーター置換菌株の製作
前記実施例２‐１に開示された方法を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｐｔａ‐ａｃｋＡをコードする遺伝子及びそこから発現されるタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号１７及び２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った（表３及び４）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３分の伸長過程を３０回繰り返した。
前記実施例２‐１に開示された方法を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｐｔａ‐ａｃｋＡをコードする遺伝子及びそこから発現されるタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号１７及び２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った（表３及び４）。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３分の伸長過程を３０回繰り返した。
ここから収得されたＰＣＲ産物を電気泳動で分離した後、配列分析を行った結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｐｔａ‐ａｃｋＡをコードする遺伝子は、配列番号８で記載されるポリヌクレオチド配列を含み、ここからコードされるタンパク質は配列番号７で記載されるアミノ酸配列を含むことを確認した。
一方、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のｐｔａ‐ａｃｋＡのアミノ酸配列（配列番号５）とコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のｐｔａ‐ａｃｋＡアミノ酸配列とを比較した結果、これらは９９．４％の配列相同性を有することを確認した。
まず、ｌｙｓＣＰ１プロモーターを含み、前記プロモーターの両末端部位は染色体上のｐｔａ‐ａｃｋＡの元々の配列を有する相同組み換え断片を収得した。具体的に、ｌｙｓＣＰ１プロモーターの５’‐末端部位はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号１７及び２３のプライマー対を用いたＰＣＲを行って収得した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。また、ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位は、配列番号１４及び１９のプライマー対を用いて同様の条件でＰＣＲを行って収得し、ｌｙｓＣＰ１プロモーターの３’‐末端部位はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型にし、配列番号２０及び２１のプライマー対を用いて同様の条件でＰＣＲを行って収得した。プロモーター置換に用いられたプライマーは、前記表１、表３及び表４に示したとおりである。
前記で収得した各ＰＣＲ産物をＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングはＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐２’ｐｔａ ａｃｋＡと命名した。
前記で製造したプラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐２’ｐｔａ ａｃｋＡを前記実施例２‐１と同様にＤＡＢ１２‐ｂ及び前記実施例１‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ形質転換して、染色体内のｐｔａ‐ａｃｋＡの開始コドン前にｌｙｓＣＰ１プロモーターが導入されたことを確認した。前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＤＡＢ１２‐ｂ ｌｙｓＣＰ１‐２’ｐｔａ‐ａｃｋＡ及びＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐２’ｐｔａ‐ａｃｋＡと命名した。
２‐３．ｐｔａ‐ａｃｋＡの強化菌株のプトレシン生産能の評価
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたプトレシン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡの強化が及ぼす効果を確認するために、前記実施例２‐１及び２‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたプトレシン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡの強化が及ぼす効果を確認するために、前記実施例２‐１及び２‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
具体的に、４種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡ； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡ； ＤＡＢ１２‐ｂ ｌｙｓＣＰ１‐２’ｐｔａ‐ａｃｋＡ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐２’ｐｔａ‐ａｃｋＡ）と４種の親菌株（ ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ； ＤＡＢ１２‐ｂ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表５に示した。
前記表５に示したように、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ及びＤＡＢ１２‐ｂにそれぞれｐｔａ‐ａｃｋＡを強化するとき、プトレシン生産量は同等の水準であった。しかし、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が同時に導入された２種（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株にそれぞれｐｔａ‐ａｃｋＡを強化したとき、プトレシン生産量は親菌株に比べて１４．３％以上増加したことを確認した。また、前記変異株の基準では４％以上増加したことを確認した。
ここで、本発明者は、プトレシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４０Ｐで大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの活性を導入してｐｔａ‐ａｃｋＡの活性を強化したプトレシン生産性が向上された前記コリネバクテリウム属微生物（Corynebacterium glutamicum KCCM11240P Tn:lysCP1‐argA Tn:lysCP1‐argE :lysCP1‐1'pta‐ackA）をＣＣ０１‐１１４５と命名し、ブダペスト条約下に２０１４年１１月２１日付で韓国微生物保存センター（ Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM）に寄託して、寄託番号ＫＣＣＭ１１６０６Ｐを付与された。
実施例３：大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたプトレシン生産菌株の大腸菌由来のａｃｓの導入及びそのプトレシン生産能の確認
３‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｃｓ導入菌株の製作
大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株で大腸菌由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（acetyl‐CoA synthetase、acs）遺伝子を導入してプトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、ｌｙｓＣＰ１プロモーターを用いて、ａｃｓをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
３‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｃｓ導入菌株の製作
大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株で大腸菌由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（acetyl‐CoA synthetase、acs）遺伝子を導入してプトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、ｌｙｓＣＰ１プロモーターを用いて、ａｃｓをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
具体的に、前記ａｃｓをコードする遺伝子の配列番号１０で記載されるポリヌクレオチド配列を基に、ａｃｓ ＯＲＦ部位の相同組み換え断片を得るための配列番号２４及び２５のプライマー対とｌｙｓＣＰ１部位の相同組み換え断片を得るための配列番号１３及び１４のプライマー対を、前記表１及び下記表６のように製作した。
具体的に、ａｃｓ遺伝子を収得するために、大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型にし、配列番号２４及び２５のプライマー対を用いて、約２ｋｂの遺伝子断片を増幅した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。その後、このＰＣＲ結果物を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、目的とするサイズのバンドを溶離して精製した。
また、ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位はＫＣＣＭ１０９１９Ｐ（特許文献４）菌株の染色体を鋳型にし、配列番号１３及び１４のプライマー対を用いて、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して収得した。
ｐＤＺＴｎベクターはＸｈｏＩを処理して、前記で収得した各ＰＣＲ産物を融合クローニングした。融合クローニングはＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓと命名した。
次に、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓをＫＣＣＭ１１２４０Ｐ及び実施例１‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｉｎ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓが導入された菌株を選別した。
前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ‐ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によってａｃｓをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選別した。最終選別された菌株を対象に配列番号１３及び２５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ａｃｓをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓと命名した。
３‐２．ＡＴＣＣ１３８６９基盤のプトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｃｓ導入菌株の製作
前記実施例３‐１のように、前記製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓを前記実施例３‐１と同様にＤＡＢ１２‐ｂ及び実施例１‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ形質転換し、トランスポゾン内にａｃｓが導入されたことを確認した。
前記実施例３‐１のように、前記製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓを前記実施例３‐１と同様にＤＡＢ１２‐ｂ及び実施例１‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ形質転換し、トランスポゾン内にａｃｓが導入されたことを確認した。
これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ及び ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓと命名した。
３‐３．大腸菌由来のａｃｓ導入菌株のプトレシン生産能の評価
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたプトレシン生産菌株におけるａｃｓの導入が及ぼす効果を確認するために、前記実施例３‐１及び３‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたプトレシン生産菌株におけるａｃｓの導入が及ぼす効果を確認するために、前記実施例３‐１及び３‐２で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
具体的に、４種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ）と４種の親菌株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ；ＤＡＢ１２‐ｂ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表７に示した。
前記表７に示したように、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ及びＤＡＢ１２‐ｂにそれぞれａｃｓを導入したとき、プトレシン生産量は同等の水準であった。しかし、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が同時に導入された２種（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ； ＤＡＢ１２‐ｂ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株にそれぞれａｃｓを導入したとき、プトレシン生産量は親菌株に比べて１３．５％以上増加したことを確認した。また、前記変異株よりは３．４％以上増加したことを確認した。
実施例４：プトレシン排出能が増加したプトレシン生産菌株における大腸菌由来のａｒｇＡ、ａｒｇＥの導入、ｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーターの置換及びそのプトレシン生産能の確認
４‐１．プトレシン排出能が増加した菌株における大腸菌由来のａｒｇＡ、ａｒｇＥの導入及びｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーター置換菌株の製作
プトレシン排出能が増加したＫＣＣＭ１１４０１Ｐ（特許文献９）菌株を基盤に大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの導入とコリネｐｔａ‐ａｃｋＡ の活性強化により、プトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、菌株を製作した。
４‐１．プトレシン排出能が増加した菌株における大腸菌由来のａｒｇＡ、ａｒｇＥの導入及びｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーター置換菌株の製作
プトレシン排出能が増加したＫＣＣＭ１１４０１Ｐ（特許文献９）菌株を基盤に大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの導入とコリネｐｔａ‐ａｃｋＡ の活性強化により、プトレシン生産能が向上するかどうかを確認するために、菌株を製作した。
具体的には、前記実施例１‐１で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡを前記実施例１‐１と同様にＫＣＣＭ１１４０１Ｐに形質転換してトランスポゾン内にａｒｇＡが導入されたことを確認して、これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡと命名した。
また、前記実施例１‐１で製作したａｒｇＡ導入菌株にａｒｇＥを導入するために、実施例１‐１で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥを同様にＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡに形質転換してトランスポゾン内にａｒｇＥが導入されたことを確認して、これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥと命名した。
次に、前記実施例２‐１で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡを前記実施例２‐１と同様にＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥに形質転換してトランスポゾン内にｐｔａ‐ａｃｋＡが導入されたことを確認して、これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡと命名した。
４‐２．プトレシン排出能が増加した菌株における大腸菌由来のａｒｇＡ、ａｒｇＥの導入及びｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーターの置換菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン排出能が増加したコリネバクテリウム・グルタミカム生産菌株に大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの導入及びｐｔａ‐ａｃｋＡの活性強化が及ぼす効果を確認するために、前記実施例４‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン排出能が増加したコリネバクテリウム・グルタミカム生産菌株に大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの導入及びｐｔａ‐ａｃｋＡの活性強化が及ぼす効果を確認するために、前記実施例４‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
具体的に、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡ）と親菌株（ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表８に示した。
前記表８に示したように、プトレシン排出能が増加したＫＣＣＭ１１４０１Ｐに大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥを導入したとき 、親菌株に比べて生産量が１１．９％増加し、さらにｐｔａ‐ａｃｋＡを強化したときは、親菌株に比べて生産量が１６．１％増加したことを確認した。
実施例５：オルニチン生産菌株における大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの導入、及びそのオルニチン生産能の確認
５‐１．ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ基盤のオルニチン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが同時に導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３７Ｐ（特許文献３）に大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子を挿入して、オルニチン生産能が向上するかどうかを確認するために、前記実施例１‐１で製作したベクターを用いて、ａｒｇＡとａｒｇＥをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
５‐１．ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ基盤のオルニチン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが同時に導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３７Ｐ（特許文献３）に大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子を挿入して、オルニチン生産能が向上するかどうかを確認するために、前記実施例１‐１で製作したベクターを用いて、ａｒｇＡとａｒｇＥをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
まず、実施例１‐１で製作したプラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡをＫＣＣＭ１１１３７Ｐに電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｉｎ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡが導入された菌株を選別した。
前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ‐ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によってａｒｇＡをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選別した。最終選別された菌株を対象に配列番号１２及び１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ａｒｇＡをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡと命名した。
前記製作されたａｒｇＡの導入菌株にａｒｇＥを導入するため、前記実施例１‐１で製作したｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥを同様の方法でＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡに形質転換し、トランソポゾン内にａｒｇＥが導入されたことを確認した。
これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥと命名した。
５‐２．大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が導入されたコリネオルニチン生産菌株のオルニチン生産能の評価
オルニチン生産菌株におけるａｒｇＡとａｒｇＥを導入するとき、オルニチン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例５‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にオルニチン生産能を比較した。
オルニチン生産菌株におけるａｒｇＡとａｒｇＥを導入するとき、オルニチン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例５‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にオルニチン生産能を比較した。
具体的に、１種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）と１種の親菌株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたオルニチン濃度を測定し、その結果を下記表９に示した。
前記表９に示したように、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が同時に導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、オルニチン生産量が親菌株に比べて１４．１％増加したことを確認した。
実施例６：大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたオルニチン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡの強化及びそのオルニチン生産能の確認
６‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーター置換菌株の製作
大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株において、ｐｔａ‐ａｃｋＡの活性強化によるオルニチン生産能が向上するかどうかを確認するために、染色体内のｐｔａ‐ａｃｋＡオペロンの開始コドンの前にｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）を導入した。
６‐１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーター置換菌株の製作
大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株において、ｐｔａ‐ａｃｋＡの活性強化によるオルニチン生産能が向上するかどうかを確認するために、染色体内のｐｔａ‐ａｃｋＡオペロンの開始コドンの前にｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）を導入した。
まず、実施例２‐１で製作したプラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡをＫＣＣＭ１１１３７Ｐ及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｉｎ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡが導入された菌株を選別した。
前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ‐ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によって最終的にｐｔａ‐ａｃｋＡプロモーターがｌｙｓＣＰ１に置換された菌株を選別した。最終選別された菌株を対象に配列番号１９及び２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、染色体内のｐｔａ‐ａｃｋＡ開始コドン前にｌｙｓＣＰ１プロモーターが導入されたことを確認した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返した。
これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡ及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡと命名した。
６‐２．ｐｔａ‐ａｃｋＡ強化菌株のオルニチン生産能の評価
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたオルニチン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡの強化が及ぼす効果を確認するために、前記実施例６‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にオルニチン生産能を比較した。
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたオルニチン生産菌株におけるｐｔａ‐ａｃｋＡの強化が及ぼす効果を確認するために、前記実施例６‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にオルニチン生産能を比較した。
具体的に、２種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡ；ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐１’ｐｔａ‐ａｃｋＡと）と２種の親菌株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ； ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたオルニチン濃度を測定し、その結果を下記表１０に示した。
前記表１０に示したように、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐにｐｔａ‐ａｃｋＡを強化したとき、オルニチン生産量は増加しなかったが、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が同時に導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにｐｔａ‐ａｃｋＡを強化したとき、オルニチン生産量がＫＣＣＭ１１１３７Ｐに比べて２０．５％増加し、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥに比べては５．６％増加したことを確認した。
実施例７：大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたオルニチン生産菌株の大腸菌由来のａｃｓの導入及びそのオルニチン生産能の確認
７‐１．ＡＴＣＣ１１１３７Ｐ基盤のオルニチン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｃｓ導入菌株の製作
大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３７Ｐ（特許文献３）において、大腸菌由来のａｃｓ遺伝子導入によるオルニチン生産能が向上するかどうかを確認するために、ｌｙｓＣＰ１プロモーターを用いて、ａｃｓをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
７‐１．ＡＴＣＣ１１１３７Ｐ基盤のオルニチン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来のａｃｓ導入菌株の製作
大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたＡＴＣＣ１３０３２基盤のオルニチン生産菌株であるＫＣＣＭ１１１３７Ｐ（特許文献３）において、大腸菌由来のａｃｓ遺伝子導入によるオルニチン生産能が向上するかどうかを確認するために、ｌｙｓＣＰ１プロモーターを用いて、ａｃｓをトランスポゾン遺伝子内に導入した。
まず、実施例３‐１で製作したプラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓをＫＣＣＭ１１１３７Ｐ及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにそれぞれ電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ/ｍｌ）とＸ‐ｇａｌ（５‐ｂｒｏｍｏ‐４‐ｃｈｌｏｒｏ‐３‐ｉｎｄｏｌｉｎ‐Ｄ‐ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ/Ｌ、ソルビトール９１ｇ/Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーの中で、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺＴｎ‐ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓが導入された菌株を選別した。
前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ/Ｌ、ポリペプトン １０ｇ/Ｌ、酵母エキス ５ｇ/Ｌ、牛肉エキス ５ｇ/Ｌ 、塩化ナトリウム ２．５ｇ/Ｌ、ウレア ２ｇ/Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０−４から１０−１０まで順次希釈した後、Ｘ‐ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から比較的低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によってａｃｓをコードする菌株を最終選別した。
最終選別された菌株を対象に配列番号１３及び２５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ａｃｓをコードする遺伝子が導入されたことを確認して、前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ及びＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓと命名した。
７‐２．大腸菌由来のａｃｓ遺伝子導入菌株のオルニチン生産能の評価
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたオルニチン生産菌株におけるａｃｓの導入が及ぼす効果を確認するために、前記実施例７‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にオルニチン生産能を比較した。
大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥが導入されたオルニチン生産菌株におけるａｃｓの導入が及ぼす効果を確認するために、前記実施例７‐１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にオルニチン生産能を比較した。
具体的に、２種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ；ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ ｌｙｓＣＰ１‐ａｃｓ）と２種の親菌株（ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ； ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有のＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５%、牛肉エキス ０．５% 、塩化ナトリウム ０．２５％、ウレア ０．２％、５０％水酸化ナトリウム１００μＬ、アガー２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質０．２５%、トウモロコシ固形物０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、ウレア ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度を接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたオルニチン濃度を測定し、その結果を下記表１１に示した。
前記表１１に示したように、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐにａｃｓを導入したとき、オルニチン生産量は増加しなかったが、大腸菌由来のａｒｇＡと大腸菌由来のａｒｇＥの遺伝子が同時に導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥにａｃｓを導入したときは、オルニチン生産量がＫＣＣＭ１１１３７Ｐに比べて１７．９％増加したことを確認した。また、ＫＣＣＭ１１１３７Ｐ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＡ Ｔｎ:ｌｙｓＣＰ１‐ａｒｇＥに比べては、３．４％増加したことを確認した。
前記の内容を総合すると、プトレシンまたはオルニチンを生産するコリネバクテリウム菌株において、大腸菌由来のａｒｇＡ及び大腸菌由来のａｒｇＥを導入することを介して、プトレシンとオルニチンの生産量が増加することを確認することができ、さらにコリネバクテリウム内部のｐｔａ‐ａｃｋＡ遺伝子の活性を強化させたり、大腸菌由来のａｃｓを導入する場合、プトレシンとオルニチンの生産量がさらに増加することを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (17)
- プトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であって、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）の活性を有する前記コリネバクテリウム属微生物に、大腸菌由来のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼ（N-acetylglutamate synthase）及び大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼ（Acetylornithine deacetylase）の活性が導入された、微生物。
- 前記大腸菌由来のＮ‐アセチルグルタミン酸シンターゼが、配列番号１のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記大腸菌由来のアセチルオルニチンデアセチラーゼが、配列番号３のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）である、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase）及び酢酸キナーゼ（acetate kinase）オペロン（pta‐ackA operon）の活性が内在的活性に比べて強化された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記ホスホトランスアセチラーゼ及び酢酸キナーゼオペロンが、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列で構成される、請求項５に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらに大腸菌由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（acetyl‐CoA synthetase, acs）の活性が導入されたものである、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記アセチルＣｏＡ合成酵素が、配列番号９のアミノ酸配列で構成される、請求項７に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase, ODC）の活性が導入されたものである、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）、ｉｉ）グルタミン酸エクスポーターまたはｉｉｉ）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ及びグルタミン酸エクスポーターの活性が内在的活性に比べて弱化された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにアセチルトランスフェラーゼの活性が内在的活性より弱化された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記アセチルトランスフェラーゼが、配列番号３０または３１のアミノ酸配列で構成されるタンパク質である、請求項１２に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、さらにプトレシンエクスポーターの活性が内在的活性より強化された、請求項１に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記プトレシンエクスポーターが、配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列で構成されるタンパク質である、請求項１４に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- （ｉ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載のプトレシンまたはオルニチン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；
及び
（ｉｉ）前記培養された微生物または培地からプトレシンまたはオルニチンを回収する段階を含む、プトレシンまたはオルニチンの生産方法。 - 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１６に記載のプトレシンまたはオルニチンの生産方法。
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