CN108642100B

CN108642100B - 一种在钝齿棒杆菌中合成l-鸟氨酸的方法

Info

Publication number: CN108642100B
Application number: CN201810468484.0A
Authority: CN
Inventors: 徐美娟; 饶志明; 舒群峰; 李静; 杨套伟; 张显
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN108642100A

Abstract

本发明公开了一种在钝齿棒杆菌中合成L‑鸟氨酸的方法，属于基因工程和代谢工程领域。本发明利用表达质粒pDXW10质粒，将N‑乙酰鸟氨酸脱乙酰酶、N‑乙酰谷氨酸合酶进行表达并且对其RBS进行优化同时对起始密码子进行替代。5‑L发酵罐发酵培养重组钝齿棒杆菌SYPO/pDXW10‑EcargA_HY‑SmargE_b 72h，L‑鸟氨酸的产量达到46.2g/L，比出发菌株钝齿棒杆菌，L‑鸟氨酸的产量提高了62.2％，生产强度达到0.642g/L/h，并且糖酸转化率为0.414g/g。

Description

一种在钝齿棒杆菌中合成L-鸟氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种在钝齿棒杆菌中合成L-鸟氨酸的方法，尤其是一种以线型合成途径在钝齿棒杆菌中合成L-鸟氨酸的方法，属于基因工程和代谢工程领域。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)是一种重要的碱性氨基酸，虽然其不属于组成蛋白质的二十种氨基酸，但其在生物体中有着重要作用，广泛用于食品，医药的添加剂中。目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。近年来微生物发酵法生产L-鸟氨酸受到越来越多的关注，各国科学家相继开展这方面的工作。

N-乙酰鸟氨酸乙酰转移酶作为L-鸟氨酸循环合成途径中的第四步反应所需的催化酶，其催化N-乙酰鸟氨酸与L-谷氨酸生成L-鸟氨酸与N-乙酰谷氨酸该酶具有强大的转乙酰基功能，但是该酶受到L-鸟氨酸的反馈抑制，对于L-鸟氨酸合成有一点的影响。线型合成L-鸟氨酸途径中不存在该酶，该酶的功能被N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)以及N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAOD)所替代，在高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌中，引入线型合成L-鸟氨酸的途径，具有较好的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种用于生产L-鸟氨酸的重组菌，以钝齿棒杆菌或者大肠杆菌为宿主，以穿梭质粒pDXW-10为表达载体，串联表达了来源于大肠杆菌的N-乙酰谷氨酸合酶以及来源于粘质沙雷氏菌的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶。

所述N-乙酰谷氨酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

编码所述N-乙酰谷氨酸合酶的基因序列是在SEQ ID NO.1的基础上，将编码第26位氨基酸的密码子替换为编码组氨酸的密码子、将编码第35位氨基酸的密码子替换为编码酪氨酸的密码子，同时将第一个核苷酸由G替换为A。

编码所述N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因序列如SEQ ID NO.2的基础上，将第一个核苷酸由G替换为A。

编码所述N-乙酰谷氨酸合酶的基因连接SEQ ID NO.3所示的RBS序列之后。

编码所述N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因连接SEQ ID NO.4所示的RBS序列之后。

编码N-乙酰谷氨酸合酶的基因插入载体pDXW-10的酶切位点EcoR I、Sac I之间，编码N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因插入到载体pDXW-10的酶切位点Bgl II、Xba I之间。

本发明还提供了应用所述重组钝齿棒杆菌发酵生产L-鸟氨酸的方法，是将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28～31℃，pH为6.8～7.0，搅拌转速为550～600r/min。发酵过程中，通过补加氨水维持pH稳定。所述发酵培养基成分：葡萄糖100～120g/L，硫酸铵30～40g/L，酵母提取物10～15g/L，七水合硫酸镁0.1～1g/l，氯化钾0.1～1g/L，磷酸二氢钾0.1～1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02～0.5g/L，一水合硫酸锰0.02～0.5g/L，0.01～0.05mM L-精氨酸，pH 6.8～7.0。

在本发明一种实施方式中，在装液量为2.5L的5L发酵罐中将种子液按6％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为31℃，pH为7.0，搅拌转速为600r/min，培养72h。发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50％氨水维持稳定。

所述发酵培养基成分：葡萄糖120g/L，硫酸铵30g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，0.05mM L-精氨酸，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min。

所述宿主钝齿棒杆菌，还可以进一步敲除L-脯氨酸的代谢支路，L-鸟氨酸的代谢支路，并在染色体上整合解除L-精氨酸的抑制N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)。

本发明利用分子技术将来源于通过利用pDXW10穿梭质粒对来源粘质沙雷氏菌的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰化酶进行克隆表达，并且利用RBS计算器对其RBS预测优化，同时将起始密码子G1A替换；同时，对来源大肠杆菌的N-乙酰谷氨酸合酶克隆表达，对26位和35位氨基酸进行复合突变解除L-精氨酸对其的反馈抑制作用，并进行RBS优化和起始密码子替换。将优化好的两个酶进行串联表达于钝齿棒杆菌中，重组菌株在5-L发酵罐发酵72h，L-鸟氨酸的产量达到46.2g/L，比出发菌株，L-鸟氨酸的产量提高了62.2％，生产强度达到0.642g/L/h，并且糖酸转化率为0.414g/g。

本发明的优点和积极效果是：

(1)本发明对来源S.marcescens Y213的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶进行RBS优化，起始密码子G1A替换；对来源E.coli BL21(DE3)的N-乙酰谷氨酸合酶进行RBS优化，起始密码子G1A替换，并通过复合突变解除L-精氨酸对N-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制。

(2)本发明采用5-L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终C.crenatum SYPO/pDXW-10-EcargA_HY-SmargE_b发酵至72h，L-鸟氨酸产量达到46.2g/L，外源引入新型线型L-鸟氨酸合成途径对L-鸟氨酸产量具有促进效果。

具体实施方式

实施例1：N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)的克隆与表达

利用大肠杆菌的基因组DNA为模板，引物argAF/R进行PCR扩增，得到大小为1332bp(SEQ ID NO.1)编码443个氨基酸的基因片段，连接至pMD18-T载体上，测序，通过DNAMAN进行序列比对表明基因序列无误。将T-argA用EcoR I，Sac I双酶切，回收argA片段后，与利用相同酶线性化的pDXW10(+)连接后转化，挑取阳性转化子提取质粒，利用质粒为模板，进行PCR验证，结果表明pDXW10-argA构建成功。将重组质粒pDXW10-argA转化入大肠杆菌BL21，得到重组菌BL21/pDXW10(+)-argA，将重组菌BL21/pDXW10(+)-argA经诱导培养后收集细胞，将细胞利用超声破碎仪进行破碎，离心后收集上清液，通过SDS-PAGE分析，得到49kDa大小的特异性条带。

实施例2：定点突变解除L-精氨酸对N-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制

对N-乙酰谷氨酸合酶进行定点突变，获得K26H/E35Y双突变体，N-乙酰谷氨酸合酶K26H/E35Y双突变体的L-精氨酸的半抑制常数从0.2mM提高到8.5mM，这使得L-精氨酸对N-乙酰谷氨酸合酶的反馈抑制得到解除，为L-鸟氨酸的产量提高提供有力基础。K26H/E35Y双突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例3：N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAOD)的克隆与表达

来自粘质沙雷氏菌的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶具有适合鸟氨酸发酵的酶学性质，以粘质沙雷氏菌基因组DNA为模板，引物P1F/R进行PCR扩增，得到大小1152bp(SEQ IDNO.2)编码383个氨基酸的基因片段，连接至pMD18-T载体测序，将T-argE用EcoR I、Sac I双酶切，回收argE片段后，与线性化pDXW10(+)连接后转化，阳性转化子提取质粒经EcoR I、Sac I酶切验证，释放8531bp和1152bp大小的片段，分别对应pDXW10(+)和Sm argE的大小，结果表明质粒pDXW10-argE构建成功。将质粒pDXW10-argE转化入大肠杆菌BL21，得到重组菌BL21/pDXW10(+)-argE。重组菌BL21/pDXW10(+)-argE经诱导培养后收集细胞，细胞经过超声破碎后，取上清进行SDS-PAGE分析，得到分子量为39kDa的特异性条带

实施例4：优化N-乙酰谷氨酸合酶与N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的RBS序列以及起始密码子替换

将上面实施例2中的N-乙酰谷氨酸合酶K26H/E35Y双突变体与实施例3中的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶通过酶切串联于大肠杆菌-棒杆菌穿梭表达载体pDXW10(+)，酶切位点分别EcoR I、Sac I,和Bgl II、Xba I，将所得重组质粒分别在大肠杆菌、钝齿棒杆菌中诱导表达，测定重组大肠杆菌的破碎上清液的酶活，结果表明，在大肠杆菌中，串联后的NAGS与NAOD的酶活分别为21.9U/mL，38.3U/mL；在钝齿棒杆菌中，串联后的NAGS的酶活为6.4U/mL，NAOD酶活则为9.9U/mL。

通过RBS计数器(https://www.denovodna.com/software/doLogin)计算出N-乙酰谷氨酸合酶K26H/E35Y双突变体的原始RBS序列的强度为1698au，采用计数器预测筛选强度为4500的RBS序列进行替换原始RBS序列，并同时替换argA的起始密码子G1A。测定经过RBS替换以及起始密码子优化后的菌株的酶活，结果表明携带重组质粒pDXW10-argA₄₅₀₀的大肠杆菌所产的N-乙酰谷氨酸合酶的比酶活最高，达到99.76U/mg，比优化前提高95.74％。强度为4500au的RBS序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

运用同样的策略，对粘质沙雷氏菌来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(SmNAOD)中的原始RBS强度进行测定(1890au)，利用预测得到的强度4500au RBS序列替换原始RBS序列，并替换argE的起始密码子G1A。测定经过RBS替换以及起始密码子优化后的菌株的酶活，结果表明携带质粒pDXW10-argE₄₅₀₀的大肠杆菌所产的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的比酶活最高，达到828.71U/mg，比优化前提高将近5倍。强度为4500au的RBS序列的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

将RBS优化以及起始密码子替换后的argA与argE基因重新串联于大肠杆菌-棒杆菌穿梭表达载体pDXW10(+)，酶切位点分别EcoR I、Sac I,和Bgl II、Xba I，将所得重组质粒电转入钝齿棒杆菌中诱导表达，测定酶活，NAGS的酶活、NAOD的酶活相比优化前都提高了两倍以上，分别为14.5U/mL，27.4U/mL。

实施例5：重组菌株C.crenatum SYPO/pDXW-10-EcargA_HY-SmargE_b发酵罐实验

(1)种子培养

从活化平板上挑取单菌落接种于10mL含卡那霉素的BHI培养基中，30℃振荡培养24h，然后全部转接于150ml种子培养基中，30℃培养24h，种子培养基组成：葡萄糖50g/L，硫酸铵25g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，去离子水配置，pH7.0。

(2)发酵培养

初始发酵培养体积为2.5L，采用的发酵培养基成分如下：

发酵培养基成分：葡萄糖120g/L，硫酸铵30g/L，酵母提取物15g/L，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾1g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水合硫酸亚铁0.02g/L，一水合硫酸锰0.02g/L，0.05mM L-精氨酸，去离子水配置，pH 7.0。将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在121℃下高温灭菌30min。

发酵条件：将上述培养好的种子液按6％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为31℃，pH为7.0，搅拌转速为600r/min。培养72h。

发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50％氨水维持稳定。从第24h起，每12h取样一次，采用分光光度仪在A₅₆₂下测定细胞OD值，葡萄糖用生物传感分析仪测定(SBA-50，山东省科学院生物研究所)。

L-鸟氨酸和其他各种氨基酸采用HPLC测定(安捷伦1100，美国)。结果表明，相比于出发菌，重组菌生长的更好，糖耗更快，发酵至72h，重组菌的L-鸟氨酸产量达到46.2g/L，较出发菌株C.crenatum SYPO提高了62.2％，生产强度达到0.642g/L/h，并且糖酸转化率为0.414g/g，实现了引入新型线型L-鸟氨酸合成途径使L-鸟氨酸的合成有显著提升效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种在钝齿棒杆菌中合成L-鸟氨酸的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1332

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<400> 1

gtggtaaagg aacgtaaaac cgagttggtc gagggattcc gccattcggt tccctatatc 60

aatacccacc ggggaaaaac gtttgtcatc atgctcggcg gtgaagccat tgagcatgag 120

aatttctcca gtatcgttaa tgatatcggg ttgttgcaca gcctcggcat ccgtctggtg 180

gtggtctatg gcgcacgtcc gcagatcgac gcaaatctgg ctgcgcatca ccacgaaccg 240

ctgtatcaca agaatatacg tgtgaccgac gccaaaacac tggaactggt gaagcaggct 300

gcgggaacat tgcaactgga tattactgct cgcctgtcga tgagtctcaa taacacgccg 360

ctgcagggcg cgcatatcaa cgtcgtcagt ggcaatttta ttattgccca gccgctgggc 420

gtcgatgacg gcgtggatta ctgccatagc gggcgtatcc ggcggattga tgaagacgcg 480

atccatcgtc aactggacag cggtgcaata gtgctaatgg ggccggtcgc tgtttcagtc 540

actggcgaga gctttaacct gacctcggaa gagattgcca ctcaactggc catcaaactg 600

aaagctgaaa agatgattgg tttttgctct tcccagggcg tcactaatga cgacggtgat 660

attgtctccg aacttttccc taacgaagcg caagcgcggg tagaagccca ggaagagaaa 720

ggcgattaca actccggtac ggtgcgcttt ttgcgtggcg cagtgaaagc ctgccgcagc 780

ggcgtgcgtc gctgtcattt aatcagttat caggaagatg gcgcgctgtt gcaagagttg 840

ttctcacgcg acggtatcgg tacgcagatt gtgatggaaa gcgccgagca gattcgtcgc 900

gcaacaatca acgatattgg cggtattctg gagttgattc gcccactgga gcagcaaggt 960

attctggtac gccgttctcg cgagcagctg gagatggaaa tcgacaaatt caccattatt 1020

cagcgcgata acacgactat tgcctgcgcc gcgctctatc cgttcccgga agagaagatt 1080

ggggaaatgg cctgtgtggc agttcacccg gattaccgca gttcatcaag gggtgaagtt 1140

ctgctggaac gcattgccgc tcaggcgaag cagagcggct taagcaaatt gtttgtgctg 1200

accacgcgca gtattcactg gttccaggaa cgtggattta ccccagtgga tattgattta 1260

ctgcccgaga gcaaaaagca gttgtacaac taccagcgta aatccaaagt gttgatggcg 1320

gatttagggt aa 1332

<210> 2

<211> 1152

<212> DNA

<213> Serratia marcecens JNB5-1

<400> 2

gtgaagatga aattacctcc atttattgag ctgtaccggg cgttgatcgc aacgaagtcg 60

atcagcgcca ccgatgccgg cctcgatcag agcaatgagg cgttaatcaa cttgctggcc 120

ggctggtttg ccgacctggg ctttcgcgtc gacgtgcagc cggtgccgga atcgcgccac 180

aaattcaacc tgctggccag catcggcgaa ggcagcggcg gcctgctgct ggccggccat 240

accgatacgg tgccttacga cgaaggccgc tggacgcgcg atcccttcac cctgaccgag 300

cacgacaaca agctctacgg cctgggcacc gccgacatga aaggcttctt cgcctttatt 360

ctggatgcgg tgcgcgacat cgacgcgagc aaattgacca agccgctgta cattctggct 420

accgcagatg aagaaacgac gatggccggc gcgcgttatt tcgccgcttc caccgccatt 480

cgtccggatt tcgccatcat cggcgaaccg acctcgctgc agccggtgcg tgcgcacaag 540

ggccacatgg ccaacgccat tcgcatcgtc ggccagtccg gccactccag cgatccggcg 600

cgcggcgtca acgccatcga tctgatgcac gaatccatcg gccgcctgat ggagctgcgc 660

aaaaccctgc aggagcgcta caacaatccg gcgttcgccg tgccttatcc caccatgaac 720

ttcggccata tcagcggcgg cgacgcggcc aaccgcatct gcgcctgctg cgagctgcac 780

ctggatatcc gcccgctgcc tggcatgacg ctagacaaca tcaacgagct gatgcatcag 840

gcattggagc cggtgagcca acgctggccg ggccgcctga ccatcgaaga gctgcacgcg 900

tcggtgccgg gttacgaatg cccgaccgac caccgcatgg tggcggtgat cgaggagctg 960

ctgggcaccc gcacgcaggt ggtcaactac tgcaccgaag cgccgttcgt acagcaggtc 1020

tgcccgacgt tggtgctcgg gcccggttcc atcgatcagg cccaccagcc ggacgaatac 1080

atcgacaccg cgtttatcga accgacgcgc aaactgctgg gccagctggt caatcacttt 1140

tgccggcagt aa 1152

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaaggacga taag 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaaagacaa atac 14

<210> 5

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Val Val Lys Glu Arg Lys Thr Glu Leu Val Glu Gly Phe Arg His Ser

1 5 10 15

Val Pro Tyr Ile Asn Thr His Arg Gly His Thr Phe Val Ile Met Leu

20 25 30

Gly Gly Tyr Ala Ile Glu His Glu Asn Phe Ser Ser Ile Val Asn Asp

35 40 45

Ile Gly Leu Leu His Ser Leu Gly Ile Arg Leu Val Val Val Tyr Gly

50 55 60

Ala Arg Pro Gln Ile Asp Ala Asn Leu Ala Ala His His His Glu Pro

65 70 75 80

Leu Tyr His Lys Asn Ile Arg Val Thr Asp Ala Lys Thr Leu Glu Leu

85 90 95

Val Lys Gln Ala Ala Gly Thr Leu Gln Leu Asp Ile Thr Ala Arg Leu

100 105 110

Ser Met Ser Leu Asn Asn Thr Pro Leu Gln Gly Ala His Ile Asn Val

115 120 125

Val Ser Gly Asn Phe Ile Ile Ala Gln Pro Leu Gly Val Asp Asp Gly

130 135 140

Val Asp Tyr Cys His Ser Gly Arg Ile Arg Arg Ile Asp Glu Asp Ala

145 150 155 160

Ile His Arg Gln Leu Asp Ser Gly Ala Ile Val Leu Met Gly Pro Val

165 170 175

Ala Val Ser Val Thr Gly Glu Ser Phe Asn Leu Thr Ser Glu Glu Ile

180 185 190

Ala Thr Gln Leu Ala Ile Lys Leu Lys Ala Glu Lys Met Ile Gly Phe

195 200 205

Cys Ser Ser Gln Gly Val Thr Asn Asp Asp Gly Asp Ile Val Ser Glu

210 215 220

Leu Phe Pro Asn Glu Ala Gln Ala Arg Val Glu Ala Gln Glu Glu Lys

225 230 235 240

Gly Asp Tyr Asn Ser Gly Thr Val Arg Phe Leu Arg Gly Ala Val Lys

245 250 255

Ala Cys Arg Ser Gly Val Arg Arg Cys His Leu Ile Ser Tyr Gln Glu

260 265 270

Asp Gly Ala Leu Leu Gln Glu Leu Phe Ser Arg Asp Gly Ile Gly Thr

275 280 285

Gln Ile Val Met Glu Ser Ala Glu Gln Ile Arg Arg Ala Thr Ile Asn

290 295 300

Asp Ile Gly Gly Ile Leu Glu Leu Ile Arg Pro Leu Glu Gln Gln Gly

305 310 315 320

Ile Leu Val Arg Arg Ser Arg Glu Gln Leu Glu Met Glu Ile Asp Lys

325 330 335

Phe Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Thr Thr Ile Ala Cys Ala Ala Leu

340 345 350

Tyr Pro Phe Pro Glu Glu Lys Ile Gly Glu Met Ala Cys Val Ala Val

355 360 365

His Pro Asp Tyr Arg Ser Ser Ser Arg Gly Glu Val Leu Leu Glu Arg

370 375 380

Ile Ala Ala Gln Ala Lys Gln Ser Gly Leu Ser Lys Leu Phe Val Leu

385 390 395 400

Thr Thr Arg Ser Ile His Trp Phe Gln Glu Arg Gly Phe Thr Pro Val

405 410 415

Asp Ile Asp Leu Leu Pro Glu Ser Lys Lys Gln Leu Tyr Asn Tyr Gln

420 425 430

Arg Lys Ser Lys Val Leu Met Ala Asp Leu Gly

435 440

Claims

1.一种用于生产L-鸟氨酸的重组菌，其特征在于，以钝齿棒杆菌或者大肠杆菌为宿主，以穿梭质粒pDXW-10为表达载体，串联表达了来源于大肠杆菌的N-乙酰谷氨酸合酶以及来源于粘质沙雷氏菌的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶；编码所述N-乙酰谷氨酸合酶的基因序列是在SEQ ID NO.1的基础上，将编码第26位氨基酸的密码子替换为编码组氨酸的密码子、将编码第35位氨基酸的密码子替换为编码酪氨酸的密码子，同时将第一个核苷酸由G替换为A；编码所述N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因序列在SEQ ID NO.2的基础上，将第一个核苷酸由G替换为A；编码所述N-乙酰谷氨酸合酶的基因连接在SEQ ID NO.3所示的RBS序列之后；编码所述N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因连接在SEQ ID NO.4所示的RBS序列之后。

2.根据权利要求1所述的一种用于生产L-鸟氨酸的重组菌，其特征在于，所述宿主为钝齿棒杆菌，所述钝齿棒杆菌进一步敲除L-脯氨酸的代谢支路，L-鸟氨酸的代谢支路，并在染色体上整合解除L-精氨酸抑制的N-乙酰谷氨酸激酶（NAGK）。

3.一种应用权利要求1或2所述重组菌发酵生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，是将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为28~ 31 ℃，pH为6.8~7.0，搅拌转速为550~600 r/min；所述发酵培养基成分：葡萄糖 100~120 g/L，硫酸铵 30~40 g/L，酵母提取物 10~15 g/L，七水合硫酸镁 0.1~1 g/l，氯化钾 0.1~1 g/L，磷酸二氢钾0.1~1.5 g/L，七水合硫酸亚铁 0.02~0.5 g/L，一水合硫酸锰0.02~0.5 g/L，0.01~0.05mM L-精氨酸，pH6.8~7.0。

4.根据权利要求3所述的发酵生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，在装液量为2.5L的5L发酵罐中将种子液按6 %接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为31 ℃，pH为7.0，搅拌转速为600 r/min，培养72 h。发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50 %氨水维持稳定。

5.根据权利要求3或4所述生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分：葡萄糖 120 g/L，硫酸铵 30 g/L，酵母提取物 15 g/L，七水合硫酸镁 0.5 g/l，氯化钾 1 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，七水合硫酸亚铁 0.02 g/L，一水合硫酸锰0.02 g/L，0.05mM L-精氨酸，去离子水配置，pH 7.0。