DD277468A1 - Verfahren zur herstellung von stabilen rekombinanten plasmiden - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem stabile rekombinante Plasmide mit hoher Kopienzahl hergestellt werden, durch die bei gentechnischen Manipulationen und Produktsynthesen mittel Bacillus-Wirtsstaemmen, vor allem von Enzymen, deren Brauchbarkeit verbessert wird und die kein physiologisches Risiko darstellen, wenn sie industriell verwertet werden. Dazu wird ein strukturell stabiles, segregativ aber instabiles Ausgangsplasmid ohne Kopien-Kontrollregion in vitro mit einem Vektorplasmid hybridisiert, das Gene zur segregativen Stabilitaet und eine aktive Kopien-Kontrollregion hat, die deletiert wird. Bei den entstandenen kleinen Hybridplasmiden werden die Antibiotika-Resistenz-Gene inaktiviert und durch "food grade"-Selektionsmerkmale ersetzt. Die Erfindung kann vor allem bei der Herstellung von neutraler Protease verwendet werden. Fig. 1

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilen rekombinanten Plasmiden mit hoher Kopienzahl durch In-vitro-Rekombination eines instabilen rekombinanten Ausgangsplasmids mit einem Vektroplasmid pDB 101 oder einem verwandten Vektorplasmid mittels kleinschneidender Restriktasen oder durch die Einführung von Genen zur segretativen Stabilität aus dem Vektorplasmid pDB 101 in das Ausgangsplasmid oder in andere Plasmide zur stabilen Amplifiktation von klonierten Produkt-Genen und zur Verbesserung der Effektivität gentechnischer Verfah.-ensschritte und Produktsynthesen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Ein wesentliches Merkmal der Gentechnik ist es, Klonierungsvektoren mit mehrfacher Kopienzahl zu benutzen, die die Amplifikation von klonierten Genen gestatten. Werden Plasmide als Vektoren eingesetzt, so ist jedoch häufig - besonders nach der Klonierung der Gene - zu beobachten, daß diese Plasmide instabil sind, so daß die Klonierung der Gene begrenzt und die Nutzung der rekombinanten Plasmide erschwert oder ganz unmöglich ist /1/; 121; /3/; /4/; /5/. Eine solche Instabilität z*>igt sich in der Plasmid-Segregation (segregative Instabilität) und in Strukturveränderungen (strukturelle Instabilität) einschließlich einem Verlust oder einer Inaktivierung von klonierten Genen. Die Stabilität der Plasmide wird von mehreren plasmidalen, zellulären und physiologischen Funktionen und Bedingungen beeinflußt, deren zunehmende Aufklärung in wachsendem Umfang gezielte Maßnahmen zur Stabilisierung der Plasmide gestattet.

Strukturelle Instabilität bei Plasmiden berührt auf illegitimer/6/; /7/; /8/; /9/; /10/; /11/; /12/; /13/oder genereller/14/; /15/; /16/; /17/ Rekombination. Demzufolge kann strukturelle Stabilität durch Vermeidung von rekombinationsfördernden DNS-Strukturen (Repeats, Einzelstränge) und homologer DNS in Plasmiden oder durch die Nutzung von rekombinationsdefekten Wirtsstämmnri erreicht werden.

Die häufiger zu beobachtende segregative Instabilität ist meist mit der Anwendung von konstruierten Vektroplasmiden, kleinen' Plasmiden, hoher Kopienzahl, Klonierung großer DNS-Fragmente und hoher Produktbildung korreliert. Dagegen besitzen natürliche, an den jeweiligen Wirtsstamm adaptierte Plasmide weitgehend eine hohe segregative Stabilität, was auf eine strenge Regulation der Replikation, die Monomerisierung und Partition der Plasmide und auf Plasmidfunktionen zurückgeht, die die Abtötung plasmidfreier Zellen herbeiführen. Unter „Partition" wird hier eine aktive, gleichmäßige Verteilung von Plasmid-Kopien in die Tochterzelkn verstanden, so daß jede Tochterzelle bei Zellteilung wenigstens eine Plasmidkopie erhält. Genetische Determinanten und Mechanismen solcher stabilisierender Funktionen konnten bei einigen Plasmiden von Escherichia coli teilweise bis ins Datail - aufgeklärt werden; unklar ist - unter anderem - weiterhin der Mechanismus der Partition /18/; /19/; /20/; /21 /; /22/; /23/. Relativ gering ist demgegenüber das Wissen um die stabilisierenden Funktionen bei Plasmiden von Bacillus. Erste Ergebnisse wurden durch Klonierung und molekulare Charakterisierung eines Partitions-Gens - im folgenden kurz par-Gen genannt - für ein natürlich vorkommendes Plasmid pLS 11 (= Plasmid pTA 1060 erhalten und beschrieben /24/; /25/. Dieses par-Gen hat eine stabilisierende Wirkung auf verschiedene Plasmide, auch wenn zusätzliche DNS kloniert worden ist. Es ist jedoch noch völlig unbekannt, ob das par-Gen aus Plasmid pLS 11 auch unter der-selektiven- Bedingung einer hohen Produktbildung noch die gleiche stabilisierende Wirkung hat, nunmehr in bezug auf rekombinante Plasmide mit hochexprimierten Produkt-Genen. Eine solche stabilisierende Wirkung ist zumindest ungewiß, weil par-Gene in ihrer Expression durch physiologische Bedingungen beeinflußt werden/26/.

Wegen der Mitwirkung von mehreren plasmidalen und zellulären Stabilisierungs-Funktionen, ihrer unvollständigen Aufklärung und ihrer Abhängigkeit von physiologischen Randbedingungen versprechen einzelne Maßnahmsn zur Herbeiführung der Stabilität nur begrenzten Erfolg; eine hinreichende Stabilität erfordert einen unangemessen hohen Aufwand. Ganz unerwartet wurde bei Bacillus empirisch eine hohe segregative Stabilität von rekombinanten Plasmiden /27/; /28/ durch Reklonierung in ein Vektorplasmid pDB 101 /29/ erzielt, das im Unterschied zu anderen Plasmiden ein großes invertiertes DNS-Repeat besitzt. Es ist mit 17,85 Kilo-Basen überdurchschnittlich groß und weist eine geringe Kopienzahl von 5 bis 6 pro Zelle auf. Außergewöhnlich hoch ist der Grad der Stabilität bei rekombinanten Derivaten des Vektorplasmids pDB 101, so daß sich bei Langzeitkultivierung ohne Selektionsdruck durch Antibiotika sogar unter den sonst destabilisierenden Bedingungen einer hohen Produktbildung und der Homologie von rekombinanten Produkt-Gep jn mit dem bakteriellen Chromosom rekombinationsfähiger Wirtsstämme eine hohe Stabilität erreicheri läßt. Dies ist durchaus nicht zu erwarten, weil das Vektorplasmid pDB 101 von einem Sti eptococcus-Plasmid abstammt und deshalb eine evolutionäre Anpassung an Wirtsstämme von Bacillus sehr unwahrscheinlich ist.

Zu den Ursachen dieses Phänomens liegen bisher nur wenige Ergebnisse vor. Auf Grund von Deletions- und Rekonstruktions-Experimenten wird angenommen/30/, daß ein je Plasmid-Molekül (wenigstens teilweise) zweifaches Vorkommen der Replikations-Kontroll-Repion - nachfolgend kurz Rep genannt - stabilisierend wirkt. Alternativ oder zusätzlich könnte die Flasmid-Stabilität aber auch die langen, homologen DNS-Sequenzen des invertierten DNS-Repeats in Vektorplasmid pDB 101 zurückgehen, wofür die stabilisierende Wirkung von Gen-Duplikationen nach Klonierung in eine von den beiden DNS-Sequenzen des DNS-Repeats spr.cht/28/. Offenbar ist diese Wirkung mit der „rescue"-Funktion /31/; /32/; /33/; /34/ homologer DNS bei Plasmid-Transformation in kompetente Zellen von Bacillus subtilis 168 vergleichbar.

Gegenüber diesem unbestreitbar bedeutenden Vorteil des Vektorplasmids pDB 101 hinsichtlich seiner Verwendbarkeit für die Erzeugung von hochstabilen rekombinanten Plasmiden bestehen aber auch gravieronde Mangel.

Das Vektorplasmid pDB 101 hat eine niedrige Kopienzahl, die einen Gendosiseffekt für rekombinante Produkt-Gene und DNS-Ausbeuten bei Plasmid-Isolierungen begrenzt. Es ist überdurchschnittlich groß, was die Effektivität von Plasmidtransformationen und -ligationen ungünstig beeinflußt. Die plasmidalen Funktionen in dem Vetorplasmid pDB 101 sind nur ungenügend aufgeklärt, so daß - unter Beachtung der Größe des Vektorplasmids pDB 101 - DNS-Sequenzen für unerwünschte Funktionen und rodundanto DNS-Ser uenzen einkalkuliert werden müssen. Die Benutzung von Antibiotika-Resistenzen als Selektionsmerkmale ist wegen der Gefahr der epidemiologischen Verbreitung bedenklich, insbesondere bei industrieller Fermentation. Schließlich führt die geringe Kenntnis von den Ursachen d >r hohen Stabilität dazu, daß das Vektorplasmid pDB 101 nur begrenzt und empirisch für die Erzeugung von stabilen rekombinanten Plasmiden genutzt werden kann.

Zur Überwindung dieser Mängel ist es bekannt, von einem dem beschriebenen Vektorplasmid pDB 101 ähnlichen Ausgangsplasmid durch in-vitro-Deletion und -Rekonstruktion verkleinerte Plasmid-Derivate mit 10fach erhöhter Kopienzahl zu erzeugen, die auf eine kleine Deletion innerhalb der Kopien-Kontroll-Region zurückgeht/30/. Ei, solches Vektorplasmid pDB 1021 wurde als Klonierungsvektor in Bacillus subtilis 168 erprobt und erwies sich als ungeeignet, dd keine stabilen rekombinanten Plasmide abgeleitet werden konnten/35/.

Mögliche Ursachen für diese Instabilität sind eine zu starke Deletion des Ausgangsplasmids, so daß für die hohe Stabilität des Ausgangsplasmids notwendige Funktionen eliminiert werden oder eine für die Stabilisierung kritische Länge des invertierten QNS-Repeats unterschritten wird, und/oder eine Störung der strukturellen Kontinuität des Ausgangsplasmids und damit auch von stabilisierenden Funktionen beziehungsweise der Homologie des DNS-Repeats; dies kann auf Grund der angewandten Art der vollständigen Restriktasespaltung und der anschließenden zufälligen Rekonstruktion geschlossen werden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, stabile rekombinante Plasmide mit hoher Kopienzahl bereitzustellen, um die Effektivität gentechnischer Manipulationen und von Produktsynthesen mittels BacHlus-Wirtsstämmen zu verbessern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, ausgehend von den allseits bekannten Vorteilen der Gentechnik die Nachteile des bekannten Standes der Technik zu beseitigen und rekombinante Plasmide herzustellen, die den Vorteil einer hohen Kopienzahl mit der Verbesserung der Wirtschaftlichkeit und mit einer Verringerung das toxikologischen und epidemiologischen Risikos bei ihrer experimentellen und industriellen Verwertung verbinden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das strukturell stabile Ausgangsplasmid eine segregative Instabilität aufweist und keine Kopien-Kontrollregion besitzt, das Vektorplasmid Gene zur scgregativen Stabilität und eine aktive Kopien-Kontroll-ftagion besitzt, das Ausgangsplasmid und das Vektorplasmid so in vitro rekombiniert werden, daß ein stabiles rekombinantes Hybridplasmid entsteht, vor oder nach der Rekombination die Kopien-Kontroll-Region des Vektorplasmids deletiert wird, vor und nach der Rekombination zusätzliche nichtessentielle Teile des Ausgangsplasmids und des Vektorplasmids so deletiert werden, daß das Hybridplasmid möglichst klein ist, die Rekombination und Deletion durch partielle Verdauung des Ausgangsplasmids und des Vektorplasmids mittels einer kleinschneidenden Restriktase und nachfolgender Ligation ausgeführt wird, bei der eine Schar von unterschiedlichen Hybridplasmiden entsteht, aus der die geeigneten Hybridplasmide ausgewählt werden, und Antibiotika-Resistenz-Gene der Hybridplasmide inaktiviert und durch „food grade"-Selektionsmerkmale ersetzt werden. Dieses Verfahren wird als Deletions-Puzzle-Methode bezeichnet.

Es ist vorteilhaft, wenn ein Plasmid pSB92 als Ausgangsplasmid verwendet wird und durch „shot gun"-Klonierung des Gens für neutrale Protease von Bacillus amyloliquefnciens in ein Vektorplasmid pGB354/36/ erhalten wird. Im einzelnen ist es zweckmäßig, wenn das Plasmid pSB92 und das Vektorplasmid pDB 101 mittels der Restriktase Sau3 Adeletiert und rekombiniert werden, wobei stabile rekombinante Hybridplasmide pSB 116 und pSB 128 mit hoher Kopienzahl entstehen. Es ist ferner vorteilhaft, wenn ein Gen für die Chloramphenikol-Resistenz in den Hybridplasmiden pSB 116 und pSB 128 durch Insertion inaktiviert wird, wobei stabile rekombinante Hybridplasmide pSB 176 und pSB 183 entstehen, in die „food grade"-Selektionsmerkmale inseriert werden und wobei ein Gen für die Erythromyzin-Resistenz inaktiviert wird. Zur Ausnutzung der Hybridplasmide ist es möglich, daß in den erhaltenen Derivaten nichtessentiolle DNS deletiert wird und die entstandenen kleinen Hybridplasmide für die Herstellung von neutraler Protease oder als Vektoren für andere Produkt-Gene als die von neutraler Protease verwendet werden. Schließlich ist es denkbar, daß Gene zur segregativen Stabilität aus dem Vektorplasmid pDB 101 oder aus einem geeigneten Hybridplasmid isoliert und charakterisiert und zur Stabilisierung anderer Plasmide verwendet werden.

Durch die Erfindung werden die Nachteile des Standes der Technik weitgehend beseitigt. Besonders hervorzuheben sind der Nachweis und die Isolierung und Charakterisierung der in Vektorplasmid pDB 101 enthaltenen Gene zur segregativen Stabilität, deren Funktion unter verschiedenen physiologischen Bedingungen auch eine hohe Stabilität für rekombinante Plasmide mit hochexperimierten Produkt-Genen sichert. Durch Insertion dieser Gene in andere Plasmide können sie im Vergleich zur vorherigen Plasmidrekombination nun viel umfangreicher und ganz gezielt zur Plasmidstabilisierung genutzt werden. Bei der bisher gebräuchlichen Verfahrensweise zur Konstruktion von Plasmiden und Vektorplasmiden, bei der kurze DNS-Sequenzen für einzelne, charakterisierte Funktionen aus verschiedenen nativen Plasmiden isoliert und in mehr oder weniger willkürlicher struktureller Anordnung zu einem nquen Plasmid vereinigt werden, bleiben noch unbekannte, aber für ein komplexes Merkmal wie die Plasmid-Stabilität notwendige Gene und die natürliche, durch Evolution optimierte Plasmidstruktur unberücksichtigt, so daß eine hinreichende Stabilität der Konstrukte nicht erwartet werden kann. Dem wird durch die Erfindung begegnet, indem zunächst annähernd vollständige Plasmide oder große Plasmid-Fraymente rokombiniert werden und dadurch komplexe genetische Informationen und native Plasmidstrukturen in genügendem Umfang erhalten bleiben. Diese konservierende Komponente des neuen Verfahrens wird durch verändernde Maßnahmen ergänzt, indem durch zufallsgemäße Deletion von redundanter DNS - unter anderem für unerwünschte Merkmale - und Kombination verschiedene Hybridplasmide erzeugt und solche mit ausschließlich erwünschten Eigenschaften ausgelesen werden.

Die erfahrungsgemäße destabilisierende Wirkung durch klonierte DNS-Fragmente, insbesondere durch hochexprimierte Produkt-Gene, wird berücksichtigt, indem oin rekombinantes Ausgangsplasmid mit hochexpimiertem Produkt-Gen angewendet wird, unter dessen Einfluß von vornherein alle genetischen Manipulationen zur Plasmid-Deletion und -Rekombination sowie die Selektion von Plasmidhybriden erfolgen.

Schließlich erfüllen die Verwendung von „food graae"-Selektionsmerkmalen und die Deletion von redundanter Plasmid-DNS die Forderungen nach toxikologischer und epidemiologischer Unbedenklichkeit. Ds hei wird durch schrittweise Deletion nicht nur redundante DNS mit potentiell toxikologischer Wirkung eliminiert. Es können vielmehr so auch Plasmide mit minimaler Größe erzeugt werden, die nur noch Gene für essentielle Plasmidfunktionen und Produktsynthesen enthalten, einer detaillierten strukturellen und funktioneücn Charakterisierung auf molekularer Ebene besser zugänglich und demzufolge biologisch sehr sicher wird. Außerdem werden die Wirtszellen in ihrer Biosyntheseleistung entlastet.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: die Erzeugung von Plasmiden pSB 176 und pSB 183 in schematischer Darstellung, Fig. 2: die Restriktionskarte für ein durch primäre Klonierung gewonnenes rekombinantes Plasmid pSB92, Fig. 3: den Nachweis extrazellulärer Enzyme im Kulturüberstand durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese für

verschiedene Wirtsstämme bei Probenahme nach 36h Kultivierung in PM-Fermentermedium, Fig.4: die Restriktionskarte für das Plasmid pSB 176, wobei das chromosomale BstE ll-lnsert zur Insertionsaktivierung der

Cm-Resistenz und ihr Insertionsort durch das externe BstE Il-Fragment bzw. einen senkrechten Pfeil markiert sind und Fig. 5: analog zu Fig.4 die Restriktionskarte für das Plasmid pSB 183.

In der Zeichnung werden folgende Abkürzungen und Symbole verwendet:

lnFig.1,4und5: All = Asu II; Bl = BcI I; BGII = BgIII; BSII = BstE II; El = EcoRI; EV = EcoRV; Hill = Hind III; Pl = Pvu II; Pll = Pvu II; SI = Sph I; MLS' = Resistenz gegen Makrolid-, Lincomyzin- und Streptogramin Antibiotika, unteranderem gegen Em. C, H, D, H', C und B' bezeichnen Hind Ill-Fragmente eines VaktorplasmidspDB101.

lnFig.3: 1 = ATCC23844; 2 = IA20; 3 = IA20(pSB 176); NPR = neutrale Protease.

1. Herstellung stabiler rekornbinanter Plasmide mit hochexprimiertem Gen für neutrale Protease von Bacillus amyloliquefaciens gemäß Fig. 1

1.1. Primäre Klonierung des Gens für neutrale Protease

Die primäre Klonierung eines Gens für neutrale Protease- im folgenden kurz nprA-Gen genannt-wird in bekannter Weise durch „shot gun" unter Benutzung eines Gendonorstammes ATCC23844, eines Rezipientenstammes Bacillus subtilis GSB26, eines Vektorplasmids pGB354 und der Restriktase BcI I und unter den bereits ausführlich beschriebenen Bedingungen/28/ der Restriktase-Spaltung, der Ligation und der Plasmidtransformation ausgeführt. Als Substrat zum Nachweis von extrazellulärer neutraler Protease wird den Selektionsplatten 1 Gewichtsprozent Magermilch-Pulver zugesetzt.

Bei einer solch hohen Substrat-Konzentration sind Kolonien von rekombinanten Transformanten mit hochexprimiertem nprA-Gen durch einen großen und schon nach relativ kurzer Inkubationszeit von 18 Stunden sichtbaren Verdauungshof von chromosomal sehr niedrig exprimierenden nichtrekombinanten Transformanten unterscheidbar, so daß bei der Selektion -trotz der Benutzung eines Protease bildenden Rezipientonstammes - eine hohe Plattierungsdichte (bis zu 1000 Transformanten pro Platte von 10cm Durchmesser) möglich ist.

Die Transformanten werden mit einer Häufigkeit von 7 χ 10~⁴ pro regenerierten Protoplasten selektiert, von denen etwa 5 χ 10~⁴ eine stark erhöhte Bildung von neutraler Protease aufweisen und als potentiell rekombinante Transformanton isoliert werden können. Eine nachfolgende rein orientierende Charakterisierung nach den weiter unten beschriebenen Methoden ergibt, daß alle Transformanten ein gleich erhöhtes Niveau der Bildung von neutraler Protease erreichen und für andere extrazelluläre Enzyme eine unverändert niedrige Bildung aufweisen, daß ferner alle Transformanten ein rekombinantes Plasmid mit unterschiedlich erhöhtem Molekulargewicht enthalten, diese Plasmide nur unter Selektionsdruck von Chloramphenicol - im folgenden mit Cm bezeichnet- segregatiν stabil sind, und daß sie schließlich eine mit dem Vektorplasmid pGB354 vergleichbare hohe Kopienzahl von etwa 50 pro Zelle aufweisen.

Ein repräsentatives rekombinantes Plasmid mit einem minimalen Molekulargewicht wird nun für die weitere Bearbeitung ausgewählt und erhält die Bezeichnung pSB92; die zugehörige Transformante erhält die Bezeichnung Bacillus subtilis GSB26 (pSB92).

Die routinemäßige Kultivierung erfolgt im NBY-Flüssigmed>um (1,5% Nährbouillon von GERMED-Immunpräparate Berlin-Weißensee); 0,25% Hefeextrakt; pH = 7,2) oder auf NBY-Agar (2% Agar-Agar) bei 37°C. Flüssigkulturen werden als 10ml-Kulturen in eOml-Steilbrustflaschen auf einem Reziprok-Schüttler mit der Frequenz f = 120min"¹ ausgefühlt. Zur Selektion auf plasmid-kodierte Resistenz gegen Antibiotika werden den Medien 10 Mikrogramm/Milliliter Cm oder 5 Mikrogramm/Milliliter Erytrhomyzin - im folgenden mit Em bezeichnet - zugesetzt.

1.2. Charakterisierung des durch primäre Klonkirung gewonnenen rekombinanten Plasmids pSB92 1.2.1. Restriktionsanalyse

Nach einem gebräuchlichen und ausführlich beschriebenen Verfahren/37/ isolierte Plasmid-DNS wird in ebenfalls bekannter Weise/38/ mit verschiedenen Ros'.riktasen ein- und zweifach gespalten und in Agarose- und Polyacrylamid-Gelen gelelektrophoretisch getrennt. Di'j Einzelheiten dazu sind fachgemäß und brauchen nicht ai sführlich dargelegt zu werden. Nach den auf diese Weise erhaltenen Mestriktionsdaten entsteht eine Rostriktionskarte entsprechend Fig. 2 mit folgendem wesentlichem Ergebnis:

- Das nprA-Gen ist in einem 2 3-kb-Bcl l-lnsert enthalten.

- Im Bereich zwischen den Reitriktionsorten BgI Il - über Pvu I - und BcI I stimmt das Restriktionsmuster des Plasmids pSB92 mit dem beroits bekannten /39/; /40/ Restriktionsmuster bei sequenzierten nprA-Genon von Bacillus amyloliquefaciens überein, so daß die Länge und die Richtung der Transkription des isolierten nprA-Gens in dem Plasmid pSB92 durch einen Pfeil gemäß Fig. 2 markiert werden können.

- Durch Vergleich mit den fius der zitierten Literatur bekannten Daten kann farner geschlußfolgert werden, daß mit dem Plasmid

pSB92 neben dem Strukturteil für das reife Enzym auch der Promotor, die Signalsfrequenz, die Prosequenz und derTerminator des nprA-Gens bei der primären Klonierung vollständig isoliert worden sind.

- Bemerkenswert ist schließlich die bei dem Plasmid pSB92 enge Kopplung des nprA-Gens mit dem Gen für die Chloramphinicol-Resistenz - nachfolgend mit dem Cm' bezeichnet.

1.2.2. Nachweis der erhöhten Bildung von neutraler Portease als plasmid-kodiertes Enzym durch die Transformanie GSB26 (pSB92)

Zusätzlich zum restriktionsanalycischen Nachweis gemäß 1.2.1. des nprA-Gens im Plasmid pSB92 ergibt sich dabei folgendes:

- Durch das Plasmid pSB92 wird in dem Rezipientenstamrn Bacillus subtilis GSB 26 die Bildung von extrazellulärer neutraler Protease um das 50- bis lOtache über das (niedrige) Niveau der chromosomal kodierten Bildung von neutraler Protease durch den gleichen Rezipientenstamm erhöht, während das Niveau der Bildung von alkalischer Protease erwartungsgemäß auf niedrigem Niveau vei bleibt (siehe hierzu unter 2.3.).

- Die durch das Plasmid pSB92 im Rezipientenstamm GSB26 oder durch abgeleitete Hybridplasmide (beispielsweise Plasmid pSB176, siehe 1.3. und 1.4.) in anderen Wirtsstämmen von Bacillus subtilis (beispielsweise IA20) zusätzlich kodierte neutrale Protease ist in SDS-Polyacrylamid-Gelen/41 / übereinstimmend mit der chromosomal kodierten neutralen Protease des Gendonorstammes ATCC 23844 bei einem Molekulargewicht von etwa 47 000/40/ nachweisebar (Fig. 3).

- Bei der Retransformation von Plasmid pSB92 in plasmidfreie Wirtsstämme von Bacillus subtilis ist in allen Fällen das Merkmal der stark erhöhten Bildung neutraler Protease mit der plasmid-kodierten Cm' und mit dem gelelektrophoretischen Nachweis von Plasmid pSB92 korreiiert; diese Korrelation wird auch bei der spontanen Segregation (siehe 1.2.3.) von Plasmid pSB92 bei Kultivierung der Transformante GSB26 (pSB92) ohne Cm-Selektionsdruck beobachtet.

Zur quantitativen Testung auf die Bildung neutraler Protease werden Plasmid-Transformanten des amylase-defekten Rezipientenstammes GSB26 in dem (stärkefreien) NBY-Flüssigmedium mit Zusatz von 5mM Ca²⁺ als Enzym-Stabilisator/42/ kultiviert. Ca²* wird auch dem PM-Fermentermedium (siehe 2.) beigefügt. Durch den Zusatz von 2,5 bis 1OmM Ca²⁺ kann die Ausbeute an neutraler Protease um 20 bis 50% gesteigert werden. Die extrazelluläre Aktivität für Protease in Kulturüberständen wird quantitativ in vorbeschriebener Weise/43/ mit Azokasein als Substrat bestimmt und mittels Vergleichsmessungen nach standardisiertem Verfahron/44/ in ΤΕ_ω, umgerechnet. Die Messung der Teilaktivitäten für die neutrale (Metallo-) Protease und die alkalische (Serin-) Protease erfolgt auf Grund ihrer unterschiedlichen Hemmbarkeit/42/ mittels Ethylendiamintetraessigsäure EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid PMSF.

1.2.3. Einfluß des Selektionsdrucks auf die Stabilität des Plasmid pSB92 und die Bildung von neutraler Protease durch die Transformante GSB 26 (pSB 92)

Unter Selektionsdruck durch Cm wird das Plasmid pSB92 im Rezipientenstamm GSB26 stabil repliziert und weist eine mit einem Vektorplasmid pGB354 vergleichbar hohe, in vorbekannter Weise/45/ ermittelte Kopienzahl von 50 pro Zelle auf. Eine solch hohe Kopienzahl ist auf eine Deletion der Kontrollregion Cop- nachfolgend Cop-Region - im Vektorplasmid pGB354 zurückzuführen, so daß die Kopienzahl nicht mehr regulier» wird/36/. Während einer Kultivierung von 24 Stunden in NBY-Flüssigmedium bildet die Transformant6 GSB26 (pSB92) 2TE_MS/ml neutrale Protease, die die chromosomal-kodierte Bildung von neutraler Protease des Rezipientenstarnmes GSB26 um das 50- bis lOOfache und diejenige des Gendonorstimmes ATCC 23844 um das 1,3- bis 1,5fache übertrifft. Die alkalische Protease erreicht in der Transformante GSB26 (pSB92) und im plasmidfreien Rezipientenstamm übereinstimmend 0,02 bis 0,03TE_ca,/ml.

Bei Langzeitkultivierung ohne Selektionsdruck erweist sich das Plasmid pSB92 dagegen bei struktureller Stabilität als segregativ instabil, wie es für rekombinante Derivate des Vektorplasmids pGB354 typisch ist/28/. Nach 50 Generationen ergibt sich eine Plasmid-Segregation von 30 bis 85% (bestimmt nach der üblichen Replikatechnik an Hand des korrelieren Verlustes der plasmidkodierten Cm' und der erhöhten Bildung von neutraler Protease) und eine entsprechend reduzierte Bildung von neutraler Protease.

Hinsichtlich seiner Plasmidstabilität, hohen Kopienzahl und hohen plasmid-kodierten Enzymbildung erfüllt das Plasmid pSB92 die wesentlichsten Anforderungen für gentechnische Manipulationen und zur Steigerung von Produktsynthesen mittels rekombinanter Produktionsstämme; wegen seiner segregativen Stabilität kann es jedoch dafür nicht ohne weiteres in industriellen Überproduktionsstämmen genutzt werden, da in der Industrie auf den Einsatz von Antibiotika zur Plasmidstabilisierung verzichtet werden muß.

1.3. Herstellung stabiler Plasmid-Derivate nach der Deletions-Puzzle-Methode Für die Herstellung hochexprimierter und zugleich stabiler rekombinanter Plasmide für neutrale Protease von Bacillus amylollquefactens wird die Deletions-Puzzle-Methode als eine geeignete Variante der Puzzle-Methode/28/ angewendet, wobei das Plasmid pSB92, ein Vektorplasmid pDB101, der Rezipientens'amm GSB26 und die kleinschneidende Restriktase Sau3A eingesetzt werden (Fig. 1).

Im Unterschied zur Puzzle-Methode/28/ erfolgt die Spaltung durch die Restriktase Sau 3A für beide Plasmide partiell und in gleichem Grade, so daß pro Plasmidmolekül durchschnittlich 20 bis 50% der DNS deletiert werden. Die geeignete Dosis von Restriktase Sau 3 A wird durch Vorversuche ermittelt, weil Rostriktasnn erfahrungsgemäß in Abhängigkeit von der Charge erhebliche Unterschiede ihrer Aktivität aufweisen können.

Nach der Spaltung mit der Restriktase Sau 3 A wird die Gesamt-DNS zur Ligation verwendet (es können auch keine DNS-Fragmente vor der Ligation entfernt werden, um komplexe, unübersichtliche Ligationsprodukte zu vermeiden). Nach Transformation der Ligationsgemische in den Rezipientenstfamm GSB26 werder^bei Selektion auf Erythromyzin-Resistenznachfolgend Em' genannt - verschiedene rekombinante Transformanten isoliert, die in Hinblick auf das jeweilige Niveau der Bildung neutraler Protease und der Plasmidstabilität wiederum/28/ vier Gruppen zugeordnet werden können. Zwei rekombinante Transformanten GSB26(pSB 116) und GSB26(pSB 128) haben eine mit der Transformante GSB26(pSB92) vergleichbare hohe Bildung von neutraler Protease, ihre rekombinantan Plasmide pSB116 und pSB 128 verhalten sich aber im Unterschied zu dem Plasmid pSB92 segregativ stabil: mittels Replikstechnik (siehe 1.2.) ist keine Plasmid-Instabilität nachweisbar und entsprechend dem experimentellen Umfang kann sie mit einer Wahrscheinlichkeit gleich oder kleiner 10 ⁶ ausgeschlossen werden.

Die Plasmide pSB 116 und pSB 128 werden für die weitere Bearbeitung bereitgestellt, und ihre Charakterisierung wird analog derjenigen durchgeführt, wie sie oben unter 1.1.2. für das Plasmid pS392 beschrieben ist. Die in Fig.3 und 4 dargestellten Ergebnisse erlauben es, beide Plasmide in ihren wesentlichen Merkmalen von stabilen Plasmid-Derivaten für alpha-Amylase/28/ zu unterscheiden:

- An d;t Zusammensetzung der Plasm'; Je pSB 116 und pSB 128 sind große Anteile sowohl des Plasmids pSB92 als auch des Vektorplasmids pDB 101 beteiligt, so daß beide Plasmide eher Plasmid-Hybride beider Plasmide als durch Reklonierung erzeugte räkombinante Plasmid-Derivate des Vektorplasmids pDB101 darstellen.

- Die unikale Sequenz US₁ und Teilsequenzen des invertierten Repeats IR des Vektorplasmids pDB 101 sind in den Plasmiden pSB 116 und pSB 128 deletiert; im Plasmid pSB 128 ist sine Hälfte des Repeats IR deletiert, so daß nur noch unikale Sequenzen vorliegen.

- Mit der Sequenz US) sind auch die Cop-Region für die Kopienzahl und die Replikationsregion Rep - nachfolgende Rep-Region genannt-des Vektorplasmids pDB 101 deletiert; da auch im Plasmid pSö92 die Cop-Region deletiert ist (siehe 1.2.3.) enthalten die Plasmide pSB 116 und pSB 128 keine Cop-Region.

- Korreliert mit dem Fehlen der Cop-Region haben die Plasmide pSB 116 und pSB 128 eine unkontrollierte, mit dem Plasmid pSB92 bzw. dem Vektorplasmid pGB354 vergleichbare hohe Kopienzahl (vgl.1.2.3.).

- Die Rep-Region und das CnV-Gen in den Plasmiden pSB 116 und pSB 128 stammen aus dem Plasmid pSB92 und haben mit dem nprA-Gen eine identisch enge Kopplung wie im Plasmid pSB92.

- Zusätzlich zum Cm'-Gen enthalten die Plasmide pSB 116 und pSB 128 das Gen für die Resistenz gegen MLS-Antibiotika, unter anderem für die Em^r, aus dem Vektorplasmid pDB 101.

- Der Anteil an Plasmid pSB92 hat in dem Plasmid pSB 116 eine gegenläufige Orientierung im Vergleich zum Plasmid pSB 128. Durch ihre hohe Expression in der Bildung von neutraler Protease und ihre Plnsmid-Stabilität erfüllen die Plasmide pSB 116 und pSB 128 die wesentlichen Anforderungen an eine Nutzung in rekombinanten Produktionsstämmen. Hinoichtlich epidemiologischer und toxikologischer Gefahren sowie der biosynthetischen Belastung der Wirtszelle sind aber noch ihre beiden Antibiotika-Resistenzen und ihre überdurchschnittliche Größe nachteilig.

1.4. Eliminierung der Cm' aus den hybriden Plasmiden pSB 116 und pSB 128 Das in den Plasmiden pSB116 und pSB 128 enthaltene und aus dem Vektorplasmid pGB354/36/ stammende Cm'-Gen enthält eine BstEII-Spaltstelle, die zur Insertions-Inaktivierung der Cm' in beiden hybriden Plasmiden genutzt wird. Die Insertions-Inaktivierung - Fig. 1 - erfolgt durch die bekannte „shot gun"-Klonierung, so daß zufällige DNS-Fragmente in die BstE Il-Spaltstelle der Plasmide inseriert werden. Dazu wird BstE ll-gespaltene chromosomale DNS des Gendonorstammes ATCC23844 mit BstEII-linearisietter DNS der Plasmide pSB 116 und pSB 128 ligiert und nach Transformation in den Rezipientenstamm GSB26 auf Em-resistente Plasmid-Transformanten selektiert; danach werden mittels dor fachüblichen Replikatechnik Cm-sensible Transformanten ausgelesen.

Für jedes hybride Plasmid wird eine repräsentative Cm-sensible Transformante mit unverändert hoher Bil'jiinq von neutraler Protease und Plasmid-Stabilität für die weitere Bearbeitung ausgewählt. Aus den erhaltenen Transformanten GSB26 (pSB 176) und GSB26/pSB 183 werden die Plasmide pSB 176 bzw. pSB 183 isoliert, die erwartungsgemäß in ihrer BstE Il-Spaltstelle ein zusätzliches chromosomales (1,2kb-) Insert aufweisen (Fig.4 und 5). Nach der „Southem"-Hybridisierungmethode/46/) und durch Restriktionsanalyse (Fig.4 und 5) kann man nachweisen, daß diese BstE Il-DNS-Fragmente in den Plasmiden pSB 176 und pSB 183 identisch und auch in gleicher Richtung inseriert sind.

2. Stabilität und Expression der Hybridplasmide pSB 176 und pSB 183 in verschiedenen Bacillus Wirtsstämmen Durch Transformation der Hybridplasmide pSB 176 und pSB 183 in verschiedene Wirtsstämme von Bacillus subtüis 168 und anderer Bacillus-Species sowie durch Charakterisierung der erhaltenen Transformanten kann untersucht werden, ob und in welchem Maße die für den Rezipientenstamm GSB 26 ermittelte hoheTransformierbarkeit, Plasmid-Stabilität und zugleich hohe Expression des Monierten nprA-Gens wirtsstamm-spezifisch ist. Bei Plasmidtransformation in Rezipientenstämme von Bacillus amyloliquefaciens werden zum NBY-Medium 1 mM MgCI₂ und zum SMMPA-Medium 0,1 M Saccharose und 0,3% Rii.dorserumalbumin zusätzlich supplementiert sowie das DM3-Agar-Medium durch Austausch von ¹A Anteil Succinat gegen Saccharose modifiziert. Auf diese Weise wird eine Stabilisierung sowie eine erhöhte Regeneration der Protoplasten und dadurch eine bessere Ausbeute an Plasmidtransformanten erzielt.

Zur Untersuchung des Einflusses unterschiedlicher physiologischer Bedingungen und hoher Proteasebildung auf die Plasmid-Stabilität erfolgt die Kultivierung der Plasmidtransformanten zusätzlich (zu NBY-Medium) in

- supplementiertem Minimalmedium SMSM:

Mineralsalzmedium/47/ mit 0,5% Glukose, 0,1 % Kaliumeitrat, 0,006M MgSO₄ und 0,02% Kaseinhydrolysat (Difco) mit pH = 7,0 und in

- PM-Fermentermedium/48/:

3% Maisstärke, 3% Weizenfeinschrot, 1,5% Maisquellwassor, 0,2% Hefe, 0,5% (NH₄I₂HPO₄,0,1 % KCL und 0,05% MgSO₄ mit pH = 7,2

Im wesentlichen erhält man folgende Ergebnisse:

- Andere Rezipientenstämme von Bacillus »übtilis 168, wie BL29, IA20/49/ und QB09/50/ zeigen eine gleichhohe Transformierbarkeit, Kopienzahl, Plasmid-Stabilität und plasmid-kodierte Bildung von neutraler Protease wie der Rezipientenstamm GSB 26, unabhängig vom verwendeten Medium (der letztere kann nicht in dem stärkehaltigen PM-Fermentermedium getestet werden, da er wegen seines genetischen Defektes in der Bildung von alpha-Amylase keine Stärke abbauen und als Kohlenstoffquelle verwerten kann).

- Bei dem Rezipientenstamm Bacillus subtllls QB112 sacU^h32/51 / wird im Gegensatz zu anderen Bacillus-Stämmen eine deutliche Plasmid-Instabilität festgestellt (10% Plasmidsegregation nach 10 Generationen Kultivierung ohne Selektionsdruck im PM-Fermentermedium). Diese Ergebnisse bestätigen frühere Befunde zur Plasmid-Instabilität von rekombinanten Plasmiden mit hochexprimiertem alpha-Amylase-Gen in dem Rezipientenstamm QB112/35/ und in einem anderen von Bacillus subtllls mit einer vergleichbaren chromosomalen Mutation sacU9/52/.

- Der Rezipiontenstamm Bacillus natto ATCC15245/D3/ ist im Vergloich zu solchen von Bacillus subtilis etwa 10fach weniger effektiv transformierbar, seine Plasmidtransformanten verhalten sich aber wie jene (außer dem Rezipientenstamm QB112).

- Rezipientenstämmo von Bacillus amyloliquefaciens sind unter vergleichbaren experimentellen Voraussetzungen grundsätzlich weit weniger effektiv transformierbar (nur Viobis Vioo der Transformanten-Häufigkoit) als solche von Bacillus subtilis 168, was auf eine entsprechend reduzierte Regeneration der Protoplasten zurückgeht.

- Rezipientenstämme von Bacillus amylollquefaciens mit insgesamt hoher chromosomal kodierter Bildung von mehreren extrazellulären Enzymen (alpha-Amylase, neutrale und alkalische Protease, RNase, beta-Glukanase) sind entweder nicht transformierbar wie ZF178/53/ oder ergeben Plasmidtransformanten mit stark veränderter Kolonie-Morphologie und reduzierter Bildung von neutraler Protease im Vergleich mit dem plasmidfreien Rezipientenstamm wie bei ATCC23844.

- Rezipientenstämme von Bacillus amylollquefaciens mit chromosomal kodierter Enzymbildung auf einem mittleren Niveau, wie ATCC23350, ATCC23042 oder ATCC23845/49/ ergeben Plasmidtransformanten mit 1,5- bis 2fach erhöhter Bildung im Vergleich zu den plasmidfreien Rezipientenstämmen und dem Gendonorstamm ATCC23844. Kopienzahl und Plasmid-Stabilität der Hybridplasmide sind bei diesen Transfomanten vergleichbar hoch wie bei dem Rezipientenstamm Bacillus subtilis 168. Bei Langzeitkultivierung ab 25 Generationen werden unter Bedingungen hoher Proteasebildung im PM-Fermentermedium niedrigproduzierende Derivate mit unterschiedlich veränderter Kolonie-Morphologie auf 2% bis 10% angereichert, die aber unter Laborbedingungen die Ausbaute an neutraler Protease nicht meßbar beeinflussen.

- Bei den niedrigproduzierenden Derivaten der Plasmidtransformanten von Bacillus amyloliquefaciens sind die Hybridpiasmide meist unverändert nachweisbar; bei etwa 5% der Derivate wurde in einem Kontrollversuch Plasmidsegregation ermittelt. Da sich die zellulären Änderungen als stabil erweisen, sind sie auf chromosomale Mutationen des Rezipientenstammes zurückzuführen, die sekundär unter anderem eine segregative Instabilität der Hybridpiasmide verursachen.

- Stabilere Plasmidtransformanten (0,5% niedrigproduzierende Derivate nach 25 Generationen Kultivierung im PM-Fermentermedium mit maximal bis auf das 3fache im Vergleich zum Gendonorstamm erhöhter Bildung von neutraler Protease werden von einer Mutante GSB155/35/ des Gendonorstammes ATCC23844 erhalten, bei der die Bildung von alpha-Amylase auf Vs des (hohen) Ausgangsniveaus reduziert ist.

- Transformierbarkeit, aber eine extrem hohe segregative Instabilität (>S0% Segregation nach 7 Generationen Wachstum im PM-Fermentermedium) der Hybridpiasmide zeigt e.n Rezipientenstamm Bacillus amyloliquefaciens BE 71 /54/; eine derartig hohe segregative Instabilität ist auch für andere Plasmide feststellbar.

Die Ergebnisse zur Charakterisierung der Hybridpiasmide pSB 176 und pSB 183 gestatten folgende Schlußfolgerungen hinsichtlich ihrer Vorteile für eine industrielle Verwertung:

- Die Hybridpiasmide pSB 176 und pSB 183 vereinigen alia erwünschten Eigenschaften des rekombinanten Ausgangsplasmids pSB92- hochexprimiertes Produkt-Gen, hohe Kopienzahl und strukturelle Stabilität-und des Vektorplasmids pDB 101 -segregative Stabilität-, haben aber nicht mehr die nicht erwünschten Eigenschaften des Ausgangsplasmids pSB92 -segregative Ir Stabilität- und des Vektorplasmids pDB 101 - geringe Kopienzahl.

- Die erwünschten Eigenschaften der Hybridpiasmide pSB 176 und pSB 183 werden in verschiedenen Rezipientenstämmen von Bacillus und unter verschiedenen physiologischen Bedingungen exprimiert, so daß sie allgemein zur Steigerung der Effektivität und der Reproduzierbarkeit vnn gentechnischon Manipulationen und Produktsynthesen nutzbar sind.

- Die für wenige Rezipientenstämme wie QB112 und BE 71 ermittelte segregative Instabilität ist als wirtsstammspezifisch anzusehen und ist für die Anwendbarkeit der Hybridpiasmide ohne Bedeutung.

- Die Anreicherung von niedrigproduzierenden Mutanten bei rekombinanten Stämmen von Bacillus amyloliquetaciens läßt daraufschließen, daß die hohe Kopienzahl der Hybridpiasmide unter den gegebenen Verhältnissen - hochexprimiertes Produkt-Gen, hemmende Wirkung durch erhöhte Proteasekonzentration, hohes Niveau der Bildung anderer extrazellulärer Enzyme, begrenzte Leistungsfähigkeit und Toleranz der Wirtszelle gegen einseitig erhöhte Produktsynthesen und Produktkonzentrationen - bereits eine kritische Grenze für das Wachstum der Wirtszellen erreicht hat und dadurch ein selektiver Druck gegen hochproduzierende Wirtszellen erzeugt wird.

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/54/ Hersteller: VEB Prowiko Schönebeck, DD.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von stabilen rekombinanten Plasmiden mit hoher Kopienzahl durch in-vitro-Rekombination eines instabilen rekombinanten Ausgangsplasmids mit einem Vektorplasmid pD3101 oder einem verwandten Vektorplasmid mitteis kleinschneidender Restriktasen oder durch die Einführung von Genen zur segregativen Stabilität aus dem Vektorplasmid pDB 101 in das Ausgangsplasmid oder in andere Plasmide zur stabilen Amplifikation von klonierten Produkt-Genen und zur Verbesserung der Effektivität gentechnischer Verfahrensschritte und Produktsynthesen, dadurch gekennzeichnet, daß

- das strukturell stabile Ausgangsplasmid eine segregative Instabilität aufweist und keine Kopien-Kontrollregion besitzt,

- das Vektorplasmid Gene zur segregativen Stabilität und eine aktive Kopien-Kontrollregion besitzt,

- das Ausgangsplasmid und das Vektorplasmid so in vitro rekombiniert werden, daß ein stabiles rekombinantes Hybridplasmid entsteht,

- vor oder nach der Rekombination die Kopien-Kontrollregion des Vektorplasmids deletiert wird,

- vor und nach der Rekombination zusätzliche nichtessentielle Teile des Ausgangsplasmids und des Vektorplasmids so deletiert werden, daß das Hybridplasmid möglichst klein ist,

- die Rekombination und Deletion durch partielle Verdauung des Ausgangsplasmids und des Vektorplasmids mittels einer kleinschneidenden Restriktase und nachfolgender Ligation ausgeführt wird, bei der eine Schar von unterschiedlichen Hybridplasmiden entsteht, aus der die. geeigneten Hybridplasmide ausgewählt werden und

- Antibiotika-Resistenz-Gene der Hybridplasmide inaktiviert und durch „food grade"-Selektionsmerkmale ersetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Plasmid pSB 92 als Ausgangsplasmid verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pSB92 durch „shot gun"-Klonierung des Gens für neutrale Protease von Bacillus amyloliquefaciens in ein Vektorplamid pGB354 erhalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pSB92 und das Vektorplasmid pDB 101 mittels der Restriktase Sau 3 A deletiert und rekombiniert werden, wobei stabile rekombinante Hybridplasmide pSB 116 und pSB 128 mit hoher Kopienzahl entstehen.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gen für die Chloramphenikol-Resistenzin den Hybridplasmiden pSB116und pSB 128 durch Insertion inaktiviert wird, wobei stabile rekombinante Hybridplasmide pSB 176 und pSB 183 entstehen (hinterlegt in einer Transformante GSB26 (pSP 176) unter der Registriernummer IMET 11332 und in einer Transformante GSB26 (pSB183) unter der Registriernummer IMET 11329 bei der Hinterlegungsstelle Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena).

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in die Hybridplasmide pSB 176 und pSB183 „food grade"-Selektionsmerkmale inserviert werden und ein GenfürdieErythromyzin-Resistenz inaktiviert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in den erhaltenen Derivaten nichtessentielle DNS deletiert wird und die entstandenen kleinen Hybridplasmide für die Herstellung von neutraler Protease verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridplasmide als Vektoren für andere Produkt-Gene als die von neutraler Protease verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Gene zur segregativen Stabilität aus dem Vektroplasmid pDB101 oder aus einem geeigneten Hybridplasmid isoliert und charakterisiert und zur Stabilisierung anderer Plasmide verwendet werden.

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