WO1999036515A1

WO1999036515A1 - Verfahren zur isolierung neuer stoffwechselleistungen in mikroorganismen durch in situ-gentransfer ('gen-schwämme')

Info

Publication number: WO1999036515A1
Application number: PCT/EP1998/000169
Authority: WO
Inventors: Wolfgang Piepersberg
Original assignee: Biotecon Gesellschaft Für Biotechnologische Entwicklung Und Consulting Gmb
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1998-01-13
Publication date: 1999-07-22
Also published as: DE19629271A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Isolierung neuer Stoffwechselleistungen in Mikroorganismen durch in situ Gentransfer, insbesondere zur biotechnischen Nutzung der Biodiversität nicht-kultivierbarer Mikroorganismen. Dabei werden für die Aufnahme von neuen Genen, die Selektion aus komplexen Mikroorganismen-Gemeinschaften und die Fermentation besonders geeigneter Bakterienstämme, insbesondere aus der Gattung Streptomyces, hergestellt und als Empfänger ('Gen-Schwämme') verwendet. Der in situ Gentransfer findet in Mikrokosmen, bestehend aus natürlichen Proben (z.B. Erdproben), durch Beimpfung mit dem Gen-Schwamm statt. Die Häufigkeit des Gentransfers wird durch die Wahl der genetischen Eingenschaften des Gen-Schwamms, sowie durch die Wahl verschiedener veränderter Milieubedingungen in den Mikrokosmen optimiert.

Description

Beschreibung

Verfahren zur Isolierung neuer Stoffwechsel-Leistungen in Mikroorganismen durch in situ-Gentrans er ("Gen-Schwämme")

Die vorliegende Patentanmeldung bezieht sich auf Verfahren zur Isolierung neuer Stoffwechselleistungen in Mikroorganismen durch in situ-Gentransfer ("Gen-Schwämme"), insbesondere zur biotechnischen Nutzung der Biodiversität nicht-kultivierbarer Mikroorganismen.

In den vergangenen Jahren haben sich die Hinweise darauf vermehrt, daß sich eine erhebliche Anzahl - wahrscheinlich die Mehrheit - aller Mikroorganismen (MO) in der Biosphäre nicht kultivieren lassen (Abb. 1; Atlas, R.M. und Bartha, R. (1981) Microbial Ecology, Addison-Wesley Publishing Co., Inc., Reading, USA.). Derzeitige Schätzungen besagen, daß beispielsweise ca. 100 000 verschiedene MO-Spezies in einem Gramm Boden vorkommen, von denen nur ganz wenige kultivierbar sind. Ebenso ergibt eine Abschätzung der Artenvielfalt und Kultivierbarkeit von MO des Pikoplankton (0,2 - 2 Mikrometer Durchmesser) im Meeresoberflächenwasser einen Wert von 1 kultivierbarer MO pro 100 000 vorhandene lebensfähige MO (Pace, N.R., Angert, E.R., DeLong, E.F., Schmidt, T.M. und Wickham, G.S. (1993) New Perspective on the Natural Microbial World. In: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics (Baltz, R.H., Hegemann, G.D. und Skatrud, P.L., Hrsg.), pp. 77-84. American Society for Microbiology, Washington DC, USA. ) . Die Kultivierbarkeit ist vielfach deswegen prinzipiell nicht möglich, da viele MO nur in engen und essentiellen Assoziationen mit anderen MO leben können. Andere MO lassen sich deshalb nicht im Labor züchten, weil die natürlichen Lebensbedingungen im Labor nicht nachgeahmt werden können. So entsteht ein prinzipielles Defizit in der Zugänglichkeit der vielfältigen Stoffwechselleistungen (vor allem niedermolekulare Naturstoffe als Produkte des Energiestoffwechsels oder des primären und sekundären Anabolismus, sowie katabolische Funktionen z.B. der Bioremediation, aber auch Enzyme und andere Zellbestandteile) der nicht-kultivierbaren MO-Populationen. Daher werden derzeit Überlegungen angestellt, wie der Genpool der nicht- kultivierbaren MO verfügbar gemacht werden kann, um die entsprechenden Produkte durch Genexpression in kultivierbaren MO nutzbar zu machen.

Die Größe und Strukturierung der den MO verfügbaren und der von MO tatsächlich verwendeten Genpools sind noch sehr unvollkommen abschätzbar. Der Genomumfang der Bakterien beträgt pro Zelle zwar nur z. B. ca. 1800 Gene in Haemophilus influenzae (Fleischmann, R.D., Adams, M.D., White, 0., Clayton, R.A. , Kirkness, E.F., Kerlavage, A.R., Bult, C.J., Dougherty, B.A., Merrick, J.M. et al. (1995) Whole-genome rando sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269(5223): 496- 512.), ca. 4200 Gene/Zelle in Bacillus subtilis (Itaya, M. und Tanaka, T. (1991) Complete physical map of the Bacillus subtilis 168 chromosome constructed by a gene directed mutagenesis method. J. Mol. Biol. 220:631-648.), ca. 5000 Gene/Zelle in Escherichia coli (Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, USA.; Neidhardt, F.C. (1996) Escherichia coli and Salmonella. Molecular and Cellular Biology. ASM Press, Washington DC, USA.), ca. 6500 Gene in Pseudomonas aeruginosa (Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.), ca. 9000 Gene in Myxococcus xanthus (Chen, H., Keseler, l.M. und Shimkets, L.J. (1990) Genome size of Myxococcus xanthus determined by pulsed-field gel electrophoresis . J. Bacteriol. 172:4206-4213.) und ca. 8000 Gene in Streptomyces coelicolor (Kieser, H.M., Kieser, T. und Hopwood, D.A. (1992) A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3 (2) chromosome. J. Bacteriol. 174:5496-5507.; Lin, Y.-S., Kieser, H.M., Hopwood, D.A. und Chen, C.W. (1993), The chromosomal DNA of Streptomyces lividans 66 is linear. Mol. Microbiol. 10:923- 933.). In Pilzen und Protozoen ist bereits ein wesentlich größerer Genomumfang vorhanden. Dabei fällt auf, daß die Genome von MO, die im Boden leben, meist umfangreicher sind und eine große Menge variabler, übertragbarer Gene beherbergen, als diejenigen anderer MO, die in nährstoffreichen und konstant homogenen Habitaten wohnen. Der individuelle Genbestand wird dabei ständig durch viele verschiedene Möglichkeiten der Genübertragung (Konjugation, Transduktion bzw. Prophagenbildung, Transformation, Transposition) und Rekombination verändert und nimmt so die Struktur von "Mosaikgenomen" an (Syvanan, M. (1994) Horizontal gene transfer: evidence and possible consequences . Ann. Rev. Genet. 28: 237-261.; Neidhardt, F.C. (1996) Escherichia coli and Salmonella. Molecular and Cellular Biology. ASM Press, Washington DC, USA.). Das bedeutet, daß der Gesamtumfang des natürlich verfügbaren Genpools einer MO-Spezies durchaus das 10- bis 1000-fache des in einer einzelnen Biovarietät gefundenen Genbestandes annehmen kann und die in einer Biovarietät der MO-Spezies zum Zeitpunkt der Isolierung gefundenen Gene nur eine Momentaufnahme eines dynamischen Genaustauschprozesses darstellt.

Die Mehrzahl der Gene, die von MO zur Anpassung an variierende Umweltbedingungen genutzt werden, gehören dem variablen und horizontal übertragbaren Genpool an. Aber gerade unter diesen Adaptationsgenen befinden sich wiederum die Mehrzahl aller biotechnisch interessanten Erbanlagen, z.B. solche für: Exoenzyme (z.B. Hydrolasen) und intrazelluläre Biotransformationsenzyme (z.B. Oxidoreduktasen, spezif. Hydroxylasen, Esterasen, etc.), spezifische anabolische (z.B. Sekundärmetabolismus) und katabolische Stoffwechselwege (z.B. Biodegradation von Xenobiotika) , Antibiotikaresistenzen, Toxinproduktion, Restriktionsenzyme, u.v.a.m..

Besonders die MO-Gattungen, die in komplexen und in ihren Bedingungen stark variablen Biotopen (z.B. in Boden-Habitaten) leben, wie z.B. Actino yceten, Bacillaceen, Pseudomonaden und Pilze, zeigen durch ihr häufig sehr variables Muster an Sekundärstoffproduktion an, daß sie große Mengen an Genmaterial verändern bzw. austauschen können. Die Gene für Sekundärstoffproduktionen sind dabei nicht taxonomisch verbreitet und auch nicht immer gleichförmig angeordnet in den entsprechenden Genclustern, was ihren häufigen horizontalen Transfer und ihre häufige Rekombination ebenfalls beweist (Mehling, A., Wehmeier, U. und Piepersberg, W. (1995) Nucleotide sequence of Streptomyces 16S ribosomal DNA: towards a specific identification system for strepto ycetes using PCR. Microbiol. 141: 2139-2147). In Streptomyceten gibt es darüberhinaus eine große Anzahl weiterer Phänomene der spontanen genetischen Instabilität, z.B. Deletionen großer DNA-Segmente (weit über 1 Mbp Länge) oder Amplifikationen kürzerer DNA-Segmente bis zu fünfhundert Kopien pro Chromosom (Mehling, A. , Wehmeier, U. und Piepersberg, W. (1995) Nucleotide sequence of Streptomyces 16S ribosomal DNA: towards a specific identification System for streptomycetes using PCR. Microbiol. 141: 2139-2147.; Altenbuchner, J. (1994), Hohe genetische Instabilität von Streptomyceten durch chromosomale Deletionen und DNA- Amplifikationen. BioEngineering 3/94: 33-46.), die hohe Anteile von 50% und mehr des Genbestands einer Zelle als Teile des variablen, austauschbaren Genpools (sekundärer Genpool) ausweisen. Viele Gene dieser instabilen Genomanteile befinden sich an den Enden der linearen Streptomyceten-Chromosomen in kompakten Genclustern (Kieser, H.M., Kieser, T. und Hopwood, D.A. (1992) A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3 (2) chromosome. J. Bacteriol. 174: 5496-5507.; Vining, L.C. und Stuttard, C. (1995) Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production. Butterworth-Heinemann, Boston, USA. ) . Dabei sind die Gene für die Biosynthese komplexer niedermolekularer Naturstoffe, wie Antibiotika und andere Sekundärmetabolite, dennoch besonders schwierig in funktioneller Form auf einem einzigen DNA-Fragment zu isolieren, da sie zur Kodierung der Produktionsenzyme oft sehr umfangreiche Genomsegmente (ca. 20 bis 200 kb) benötigen (Piepersberg, W. (1993), Streptomycetes and corynebacteria. In: Biotechnology, (2nd Edition), Vol. 1 (Rehm, H.-J., Reed, G., Pühler, A. , and Stadler, P., Eds . ) , pp. 433-468. VCH-Verlag, Weinheim, FRG.; Vining, L.C. und Stuttard, C. (1995) Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production. Butterworth-Heinemann, Boston, USA.). Daraus ergibt sich die Frage, wie diese Biodiversität der nicht- kultivierbaren MO durch Übertragung der Erbanlagen auf bekannte, kultivierbare Rezipienten-MO praktikabel genutzt werden kann.

Prinzipiell sind zur Übertragung der Erbanlagen nicht- kultivierbarer MO auf bekannte, kultivierbare Rezipienten-MO zwei Wege beschreitbar: (A) durch in vitro Klonierung der direkt aus dem Biotop isolierten Gesamt-DNA in bekannten Rezipienten-MO oder (B) durch Nutzung der natürlichen Möglichkeiten des in situ Gentransfers auf einen dafür geeigneten, meist speziell entwickelten Rezipienten-MO (= "engineerten" Genschwamm, d.h. ein prinzipiell "leerer" Organismus, der sich unter Selektionsdruck mit neuem Erbmaterial füllt) in einem Mikrokosmos. Diese beiden Strategien sind in den Abbildungen 1 und 2 graphisch erläutert und gegenübergestellt. Eine Diskussion über entsprechende Möglichkeiten der Problemlösung, bzw. erste Ansätze zur Realisierung der Strategie A (direkte Klonierung in bekannte Wirts-MO) findet derzeit bereits international statt. In der hier beschriebenen Erfindung wird der Weg B genutzt, da er erhebliche Vorteile bei der Übertragung, Etablierung und phänotypischen Selektion der neuen Stoffwechselleistungen bietet :

(1) Ein hervorragender Fermentationsorganismus kann als Rezipient (Genschwamm) ausgewählt werden, ohne große Abweichungen von der klassischen Methodik des Screenings nach neuen Produktionsorganismen vornehmen zu müssen;

(2) Alle Parameter der Selektion - mit Ausnahme des DNA- Gehaltes einer Probe, aber insbesondere der spezielle Selektionsdruck - kann bei der Sreeningprozedur kontrolliert, gemessen oder so vorbestimmt werden, daß der Genschwamm zur Aufnahme neuen Genmaterials gezwungen wird, um in der gegebenen Umgebung zu überleben;

(3) Die Anwendung von gentechnischen Methoden zur Herstellung der Genschwämme ist nicht unbedingt erforderlich, da notwendige Eigenschaften auch durch klassische Mutagenese eingebracht werden können;

(4) Die Anwendung nicht-effizienter Methoden für das in vitro Klonieren von großen DNA-Segmenten bzw. in schwierigen Rezipienten wird vermieden;

(5) Die analytische Molekulargenetik ist auf den genetisch veränderten Genschwamm nach der Selektion neuer Stoffwechseleigenschaften genauso einfach anwendbar, wie bei der Analyse von in vitro rekombinierten MO-Stämmen oder Zellkulturen;

(6) Die Genschwamirt-Methodik kann einfach auf jede andere Form und Zielrichtung eines Stamm-Screenings adaptiert werden, z. B. Kombination mit dem klassischen Screening, Suche nach komplementierenden Genen in Mutanten (biologische Kombinatorik) zur Gewinnung hybrider Biosynthese-Produkte oder Abbau-Spezifitäten gegenüber Xenobiotika, oder auch zur Suche nach Enzymen zur Biotransformation oder zur Synthese von organischen Bausteinen für Wirkstoff- oder

PolymerSynthesen;

(7) In fortgeschritteneren Stadien der Entwicklung von Genschwämmen und der geeigneten Selektionsmethodik kann dieses Verfahren auch auf die direkte Selektion bestimmter Wirkstofftypen angewendet werden, z.B. durch Schaffung einer für den Genschwamm toxischen Konkurrenz durch pathogene Target-MO oder durch den Einbau Rezeptor-vermittelter Selektionsmarker in den Genschwamm.

Die hier vorgestellte Erfindung basiert auf dem oben genannten Weg B (vgl. Abb. 2B) , d.h auf der Nutzung der natürlichen Mechanismen des Gentransfers in einem Biotop durch Einimpfen eines Rezeptor-MO (Genschwamm) , ohne daß der genaue Mechanismus des Zustandekommens einer neuen genetischen Kombination im Genschwamm berücksichtigt werden müßte. Hauptziel der Erfindung ist es daher:

(1) geeignete MO als Rezipienten herzustellen, die hochfrequent DNA von anderen MO übernehmen, sozusagen "aus dem Biotop aufsaugen" können (daher die Bezeichnung "Genschwämme") und

(2) die Bedingungen in den Mikrokosmen für den Gentransfer zu optimieren. In den Abbildungen 3 und 4 sind Eigenschaften und Variationsmöglichkeiten der beiden Komponenten dargestellt. Hauptaufgabe der Variation der Bedingungen im Mikrokosmos ist es dabei, den Gentransfer so stark wie möglich zu beschleunigen und die Etablierung bestimmter aufgenommener Gene möglichst gezielt durch Selektion zu beeinflussen.

Als Beispiel wird die Verwendung von Actinomyceten, z.B. Streptomyceten, als Genschwämme für das Screening und die Selektion neuer Produktionseigenschaften für Naturstoffe aus der Gruppe der Sekundärmetabolite mit WirkstoffCharakter (Antiinfektiva, Antimetabolite, Enzyminhibitoren, Cytostatika) beschrieben. In MO dieser Gruppe liegt ein besonders großer und variabler sekundärer Genpool vor, der aber auch offensichtlich mit Mosaikgenen aus anderen taxonomischen MO-Gruppen angereichert werden kann. Auch wegen ihrer jahrzehntelangen und vielfältigen Verwendung als Fermentations-MO (Williams, S.T., Goodfellow, M. und Alderson, G. (1989) , Genus Streptomyces Waksman and Henrici 1943, 339AL, in: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, (Williams, S.T., Sharpe, M.E., Holt, J.G, Murray, R.G.E., Brenner, D.J., Krieg, N.R., Moulder, J.M., Pfennig, N., Sneath, P.H.A. und Staley, J.T., Hrsg.), Vol. 4, pp. 2452 - 2492. Williams and Wilkins, Baltimore.; Piepersberg, W. (1993) Streptomycetes and corynebacteria . In: Biotechnology, (2nd Edition), Vol. 1 (Rehm, H.-J., Reed, G., Pühler, A. , und Stadler, P., Eds . ) , pp. 433-468. VCH-Verlag, Weinheim, FRG. ; Korn-Wendish, F. und Kutzner, H.J. (1991) The Family Streptomycetaceae, in: The Prokaryotes, 2nd. Ed. (Balows, A, Trüper, H.G., Dworkin, M., Härder, W. und Schleifer, K.-H., Hrsg.), pp. 921 - 995. Springer-Verlag, New York.) und wegen ihrer gut untersuchten Genetik (Hopwood, D.A., Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. und Schrempf, H. (1985) Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich.; Kieser, H.M., Kieser, T. und Hopwood, D.A. (1992) A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3 (2) chromosome. J. Bacteriol. 174: 5496-5507.) ist diese Organismengruppe besonders geeignet als Empfänger (Genschwämme) für die Aufnahme von Genen aus anderen Bodenorganismen .

Ebenso sind alle Mechanismen und Vektoren (Plasmide, Bacteriophagen) des natürlichen Gentransfers auch in dieser MO- Gruppe nachgewiesen worden (Hütter, R. und Eckhardt, T. (1988) Genetic manipulation, in: Actinomycetes in Biotechnology (Goodfellow, M., Williams, S.T. und Mordarski, M. , Hrsg.), pp. 89-184. Academic Press, London, GB . ) und eine hohe Rate genetischen Austausches in Bodenhabitaten ist gezeigt worden (Wellington, E.M.H., Herron, P.R. und Cresswell, N. (1993) Gene transfer in terrestrial environments and the survival of bacterial inoculants in soil; Ch. 6. In: Monitoring genetically manipulated microorganisms in the environment (Edwards, C, Ed.), pp. 137-170. J. Wiley & Sons, Chichester, GB. ; Marsh, P. und Wellington, E.M.H. (1994), Molecular ecology of filamentous actinomycetes in soil. In: Molecular Ecology of Rhizosphere Microorganisms. Biotechnology and the Release of GMOs (O'Gara, F., Dowling D.N., und Boesten, B., Hrsg.), pp. 133-149. VCH- Verlag, Weinheim, FRG. ) . Prinzipiell kann daher bereits jeder Wildstamm als Genschwamm Verwendung finden, wenn die geeigneten Selektionskriterien vorhanden sind.

Als Genschwämme werden z.B. Actinomyceten mit den folgenden Eigenschaften ausgewählt bzw. durch Mutagenese oder auch durch gentechnische Methoden hergestellt:

(1) Verlust eines Teils oder aller Sekundärstoff- Biosynthesegene;

(2) chromosomale Resistenz gegenüber Antibiotika (s. Punkt 6., Beispiel 5) ; (3) Verlust der Restriktions- und anderen Hsd-Faktoren (s. Punkt 6. , Beispiel 4 ) ;

(4) Überlebensfähigkeit im jeweiligen Mikrokosmos, z.B. für eine Periode von 10 bis 50 Tagen.

Die Vorteile der vorgeschlagenen Methode sind vielfältig; sie könnten sich als so gravierend herausstellen, daß vom einzig gangbaren Weg zur Verfügbarmachung nicht-kultivierbarer Biodiversität gesprochen werden kann:

(1) Es wird keine Gentechnik (in vitro Manipulation von Nucleinsäuren, Vektormoleküle, etc.) benötigt;

(2) Die Methode vermeidet alle Nachteile der in vitro Rekombination von DNA, z.B. die geringe Ausbeute und die geringe Größe aus natürlichen Materialien extrahierbarer DNA (z.B. Boden), die Schwierigkeiten des in vitro Gentransfers (Transformation, etc.) und der Expression in einer begrenzten Anzahl geeigneter Wirte;

(3) Die enorme Variationsbreite der einsetzbaren Genschwämme und der Bedingungen im Mikrokosmos, sowie der Screening- Methoden und -Materialien (vgl. Abb. 2, 3) ;

(4) Ein übergangsloser Ausbau der Methodik zu intelligenteren Selektionsverfahren ist möglich (z.B. Rezeptor-vermittelte Selektion im Genschwamm, direkte Selektion auf bestimmte Stoffwechselleistungen, Biotransformationen, Produktion bestimmter biologischer Moleküle wie Wirkstoffe, Proteine, Enzyme oder Auswirkungen auf externe Indikatorsysteme) ;

(5) Kombinatorische Ergänzung teilweise vorhandener Stoffwechselwege zu komplexen Pathways noch unbekannter Zusammensetzung und mit unbekannten Endprodukten sind ebenfalls planbar. Die Erfindung wird nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele näher erläutert ohne darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Als Genschwämme, d.h. als Rezipienten-MO für die Aufnahme neuen Genmaterials für biotechnisch nutzbare Stoffwechselleistungen direkt aus einem Mikrokosmos, dienen alle gut charakterisierten kultivierbaren und fermentierbaren MO (Bakterien, Pilze, Protozoen) . Die Konstruktion von besonders geeigneten Genschwämmen (erste Generation) ist charakterisiert durch die gezielte oder ungerichtete Einführung von Mutationen oder zusätzlicher Gene, die die Aufnahme von neuem Erbmaterial und die Reisolierbarkeit aus dem Mikrokosmos fördern (siehe Beispiele 4 bis 6) . Der Mikrokosmos ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe Materials aus einem beliebigen Teil der Biosphäre (z.B. Proben aus Boden, Gewässern, Klär- und Kompostieranlagen, Sedimenten und Schlämmen, Pflanzen oder Tieren) aus ihrem natürlichen Habitat in das Labor überführt wird und dort durch Einimpfen lebender Zellen des Genschwamms verändert und unter bestimmten Bedingungen inkubiert wird (siehe Beispiele 7 bis 10) .

Beispiel 2

Die Genschwämme (Rezipienten-MO) werden so ausgewählt, daß sie folgende Eigenschaften besitzen:

(i) sie haben eine ausreichende Überlebenschance im Mikrokosmos nur dann, wenn sie sich an die Bedingungen der Inkubation im Mikrokosmos angepaßt haben;

(ii) sie sind in der Lage, fremdes Erbmaterial durch horizontalen Gentransfer (Konjugation, Transduktion) oder Transformation mit nackter DNA aufzunehmen und stabil in das eigene Erbgut zu integrieren;

(iii) sie sind durch einfache Selektionsverfahren (z.B. selektive Nährmedien, spezifische und/oder multiple Hemmstoffresistenz) aus dem Mikrokosmos reisolierbar.

Das Verfahren zur Entwicklung geeigneter Genschwämme ist in den folgenden Beispielen zur Herstellung eines Bakterienstammes als Genschwamm für die Aufnahme neuen Genmaterials für die Produktion von niedermolekularen Stoffen aus der Gruppe der Sekundärmetabolite beschrieben.

Beispiel 3

Die bakteriellen Genschwämme (z.B. Actinomyceten, Bacillaceen, Pseudomonaden, Myxobakterien) werden von Sekundärstoff- Biosynthesegenen befreit. Dies wird durch gezielte (gentechnische) oder ungerichtete (Mutagenese) Mutation (Deletion) bewerkstelligt (Hopwood, D.A. , Bibb, M.J., Chater, K.F., Kieser, T., Bruton, C.J., Kieser, H.M., Lydiate, D.J., Smith, C.P., Ward, J.M. und Schrempf, H. (1985) Genetic manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich.; Neidhardt, F.C. (1996) Escherichia coli and Salmonella. Molecular and Cellular Biology. ASM Press, Washington DC, USA. ) . Verfahren und Bedingungen dazu sind in vielfältiger Form bekannt, z.B. gerichtete Mutagenese über Transformation und Einrekombination modifizierter Biosynthesegene oder Induktion von großen genomischen Rearrangements wie Deletionen, Duplikationen, Transpositionen, Amplifikationen (bei Actinomyceten z.B. durch Wachstum auf bestimmten Medien, durch DNA-bindende Hemmstoffe, oder durch Protoplastierung und Regeneration induzierbar) . Mutanten mit Verlust der Sekundärstoff-Biosynthese (phänotypische und genotypische Charakterisierung) werden ausgewählt und gegebenenfalls nach den Bedingungen der Beispiele 4 bis 6 weiterentwickelt .

Beipsiel 4

Die Genschwämme (Rezipienten-MO) werden zur Optimierung der Genaufnahme so ausgewählt, daß sie entweder natürlicherweise mit hoher Frequenz Gene aufnehmen und etablieren können oder sie werden von den Hsd-Faktoren (Hsd = "host specific defense") befreit. Als Hsd-Faktoren kommen in erster Linie Restriktionsenzyme in Betracht, deren Gene durch Mutation ausgeschaltet werden können. In der Literatur (Seno, E.T. und Baltz, R.H. (1989), Structural organization and regulation of antibiotic biosynthesis and resistance genes in actinomycetes, in: Regulation of Secondary Metabolism in Actinomycetes (Shapiro, S., Ed.), pp. 1-48. CRC Press Inc., Boca Raton, USA.; Miller, J. H. (1992) A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.) sind Verfahren zur Selektion solcher Mutanten beschrieben.

Beispiel 5

Die Genschwämme (Rezipienten-MO) werden zur einfachen Reisolierung aus dem Mikrokosmos durch Einführung von

(Antibiotika-) Resistenz-Mutationen oder-Genen positiv selektierbar gemacht (Hopwood et al. (1985); Miller, J.H.

(1992). A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.; Neidhardt, F.C. (1996) Escherichia coli and Salmonella. Molecular and Cellular Biology. ASM Press, Washington DC, USA.). Als Mutationen sind z.B. geeignet: Mutation zur

Streptomycinresistenz des bakteriellen Gens für das ribosomale Protein S12 (rpsL) , Mutation zur Rifampicinresistenz des bakteriellen Gens für die beta-Untereinheit der RNA-Polymerase

(rpoB) , Mutation zur Nalidixinsäureresistenz in einem der bakteriellen Gene für die Gyrase (gyrA und gyrB) . Als Resistenzgene sind z.B. geeignet: alle Plasmid-codierten Antibiotikaresistenzgene .

Beispiel 6

Die Genschwämme (Rezipienten-MO) werden für die Aufnahme von DNA kompetent gemacht. Dies geschieht z.B. durch partiellen Abbau der Zellwand durch Zellwand-auflösende Enzyme (z.B. Lysozyme) oder durch Behandlung mit Calcium oder Lithium-Salzen (Hopwood et al. (1985); Sambrook, J. , Fritch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual . 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, USA.; Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.), oder durch die mutative oder gentechnische Veränderung bzw. Klonierung von sogen. Kompetenzgenen der DNA- Aufnahme .

Beispiel 7

Zur Herbeiführung der Bedingungen des optimierten Gentransfers von den Donor- zu den Rezeptor-MO bzw. der optimierten oder spezifischen Kriterien der Selektion bestimmter

Stoffwechselleistungen im Genschwamm wird der Mikrokosmos durch verschiedene Behandlungsmethoden verändert. Dazu werden z.B. Stressfaktoren wie Temperatur (Hitze, Kälte) , Feuchtigkeitsgrad (Erhöhung oder Erniedrigung der Wasserkonzentration) , Strahlung (Weißlicht, Dunkelhaltung, Lichtwechsel, UV- oder Gammastrahlung) , Hemmstoffe (z.B. Antibiotika, Xenobiotika, Schwermetallsalze), pH-verändernde Stoffe (z.B. Säuren, Basen), Redox-verändernde Stoffe und Bedingungen (reduzierende oder oxidierende Agentien; Anaerobiose oder Aerobiose) , Zugabe von einzelnen Nährstoffen oder Nährstoffgemischen in verschiedenen Verhältnissen (z.B. Kohlenhydrate, Alkohole, organische Säuren und andere typische Nährstoffe von MO; Aminosäuren und Peptide; Purine, Pyrimidine und Nukleinsäuren; Fette, Öle, und Vitamine; bestimmte Verhältnisse von C- zu N-Quellen im Gemisch; anorganische Nährsalze), Einimpfen von konkurrierenden MO (z.B. Nährstoff-Konkurrenten mit Bezug zum Biotop oder mit Verwandtschaft zum Genschwamm; (human-, tier-, pflanzen-) pathogene Organismen oder Genschwamm-fressende MO) .

Beispiel 8

Die teilweise oder vollständige in situ Freisetzung der DNA der Donor-MO im Mikrokosmos wird vor oder während der Inkubation zusammen mit dem Genschwamm durch Zugabe von Zellwand- auflösenden Enzymen (z.B. Lysozyme) oder von Calcium oder Lithium-Salzen oder von Zell-zerstörenden Antibiotika (z.B. Penicilline) und Detergentien (z.B. Natriumdodecylsulfat) oder durch Auslösung von osmotischem Schock durch Zugabe entsprechender Konzentrationen von geeigneten Soluten (Zucker, Polyole, Salze) bewerkstelligt (Hopwood et al (1985) ; Hütter, R. und Eckhardt, T. (1988) Genetic manipulation, in: Actinomycetes in Biotechnology (Goodfellow, M., Williams, S.T. und Mordarski, M., Hrsg.), pp. 89-184. Academic Press, London, GB.; Sambrook et al. (1989); Miller (1992); Neidhardt (1996).

Beispiel 9

Zur Erhöhung des horizontalen Gentransfers werden bekannte Vektoren wie Plasmide oder Viren (Bacteriophagen) mit möglichst bekanntem oder sehr breitem Wirtsbereich (Hopwood et al. 1985; Hütter, R. und Eckhardt, T. (1988) Genetic manipulation, in: Actinomycetes in Biotechnology (Goodfellow, M., Williams, S.T. und Mordarski, M., Hrsg.), pp. 89-184. Academic Press, London, GB.; Sambrook et al. 1989; Miller 1992; Neidhardt 1996) zusätzlich in den Mikrokosmos eingebracht. Beispiel 10

Zur Erstellung eines Variationsmusters im Mikrokosmos mit dem Ziel der Beeinflussung der in situ Gentransferrate und der Selektionskriterien im Genschwamm werden Proben natürlicher Materialien aufgeteilt auf eine standardisierte Serie von verändernden Bedingungen nach Maßgabe der Beispiele 7 bis 9, bevor der Genschwamm hinzugefügt wird. Die jeweils höchste Übertragungsrate von übertragenen und genetisch neu festgelegten (Stoffwechsel- bzw. Produktions-) Eigenschaften aus den (nicht- kultivierbaren) Donor-MO auf die Genschwämme wird so ermittelt und in nachfolgenden Variationen in der Dauer der Einwirkung, der Konzentrationen von Zusätzen (etc.) weiter verfeinert.

Beispiel 11

Als ein spezielles Beispiel werden die Derivate der folgenden Streptomyceten-Stämme mit den folgenden Eigenschaften als Genschwämme zur Aufnahme von Sekundärstoffgenen aus Bodenproben verwendet: Streptomyces (S.) lividans 66, S. griseus DSM40236 und N2-3-11, S. glaucescens ETH22794, S. galbus DSM40480 und S. Iincolnensis NRRL2936. Die Derivate sind gekennzeichnet durch

(i) den Verlust kleinerer oder größerer DNA-Mengen in der Nähe der Enden der linearen Chromosomen (Kieser, H.M., Kieser, T. und Hopwood, D.A. (1992) A combined genetic and physical map of the Streptomyces coelicolor A3 (2) chromosome. J. Bacteriol. 174: 5496-5507.; Lin, Y.-S., Kieser, H.M., Hopwood, D.A. und Chen, C.W. (1993), The chromosomal DNA of Streptomyces lividans 66 is linear. Mol. Microbiol. 10: 923-933.) und an anderen Stellen der Chromosomen, die die Sekundärstoff-Biosynthesegene enthalten (Piepersberg, W. (1993), Streptomycetes and corynebacteria. In: Biotechnology, (2nd Edition), Vol. 1 (Reh , H.-J., Reed, G., Pühler, A., und Stadier, P., Eds . ) , pp. 433-468. VCH- Verlag, Weinheim, FRG. ; Vining, L.C. und Stuttard, C. (1995) Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production. Butterworth-Heinemann, Boston, USA.); durch

(ii) mutative chromosomale Resistenz gegenüber den Antibiotika Streptomycin, Rifampicin und/oder Nalidixinsäure (s. Beispiel 5) ; (iii) Selektion auf Bakteriophagen-Sensitivität oder Plasmid- Transformierbarkeit zur Beseitigung der Produktion von Restriktionsenzymen (s. Beispiel 4; Seno, E.T. und Baltz, R.H. (1989), Structural organization and regulation of antibiotic biosynthesis and resistance genes in actinomycetes, in: Regulation of Secondary Metabolism in Actinomycetes (Shapiro, S., Ed.), pp. 1-48. CRC Press Inc., Boca Raton, USA.); und

(iv) durch Überlebensfähigkeit im jeweiligen Mikrokosmos

(speziell isolierte Varianten, die eine Periode von 10 bis 50 Tagen in einem gegebenen Boden überleben) . Die Überlebenden werden auf Produktion von Wirkstoffen, wie Antibiotika, Antimycotika, antiviraie Stoffe, Cytostatika und/oder Enzyminhibitoren mit üblichen Testverfahren des mikrobiellen Naturstoffscreenings getestet (Baumberg, S., Hunter, I. und Rhodes, M. (1989) Microbial Products: New Approaches. Cambridge University Press, Cambridge, GB.; Demain, A.L., Somkuti, G.A. und Hunter-Creva, J.C. (1989) Novel Microbial Products for Medicine and Agriculture. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, NL.).

Beispiel 12

Sekundärstoff-produzierende Bakterienstämme (z. B. Beispiel 11) werden alternativ über das Genschwamm-Verfahren zur kombinatorischen Produktion von hybriden Antibiotika und anderen Naturstoffen gebracht. Dazu werden im ausgesuchten Genschwamm nur ein Teil der Sekundärstoff-Biosynthesegene durch Deletion oder andere Formen der Mutation (Basenaustausch, Insertion) inaktiviert. Auf diese Weise wird im Genschwamm ein neues Muster an Biosyntheseenzymen durch Aufnahme neuer Gene hergestellt. Bei Selektion auf einen bestimmten Wirkstofftyp oder eine bestimmte chemische Substanzklasse wird so ebenfalls eine Erweiterung der bekannten Vielfalt mikrobieller Syntheseprodukte erreicht ("Pathway Engineering"; Piepersberg, W. (1994), Pathway engineering in secondary metabolite-producing actinomycetes. Crit. Rev. Biotechnol. 14: 251-285.).

Beispiel 13

Fortgeschrittene Genschwämme werden durch Einbau von positiv selektierbaren Eigenschaften konstruiert, die es erlauben, das neu aufgenommene Erbgut oder eine neu erworbene Stoffwechsel- Eigenschaft (Enzyme, Produkte, Abbauleistungen, Speicherung von Stoffen) direkt zu selektieren (zweite Generation von Genschwämmen) . Beispiele sind Rezeptor-gekoppelte Systeme, die auf die aktive Produktion und Ausschleusung eines bestimmten Wirkstofftyps reagieren und im Genschwamm eine selektierbare Reaktion auslösen.

Figurenlegenden

Abbildung 1: Pools von Mikroorganismen sind als überlappende Ellipsoide dargestellt. Es wird angenommen, daß der Pool der nicht-kultivierbaren MO (Bakterien, Pilze) größer ist als derjenige der kultivierbaren. Die Routen A (in vitro Genklonierung) und B (in situ Gentransfer) stellen die existierenden Möglichkeiten der Übertragung metabolischer Eigenschaften in bekannte, kultivierbare MO dar.

Abbildung 2: Alternative Strategien zur Klonierung von

Stoffwechseleigenschaften nicht-kultivierbarer MO am Beispiel des Sekundärmetabolismus (SeMe) von Bodenorganismen (s. Text). Die für die Strategie B geeigneten Rezipienten werden als "Genschwämme" bezeichnet .

Abbildung 3: Generelle Eigenschaften des Genschwamms (Rezipienten-MO) . Die Situation für einen SekundärstoffProduzenten ist als Beispiel angeführt. Der MO hat die Gene für Sekundärmetabolismus (Sem) ganz oder teilweise verloren, darüberhinaus sind folgende andere Eigenschaften vorhanden: gute Kompetenz für die DNA-Aufnahme (Com) , die Rekombinationsfähigkeit (Rec) , positive Selektierbarkeit (Sei), sowie der Verlust der Abwehreigenschaften gegenüber Fremd-DNA (Hsd = "host- specific defense"; z.B. Restriktionsenzyme). Die Donor- Eigenschaft (Don) im umgebenden Biotop ist optimal eingestellt (s. Abb. 4).

Abbildung 4: Die Optimierbarkeit des Mikrokosmos. Die den Gen- Transfer und die Genetablierung bestimmenden Faktoren können fast beliebig variiert werden. Wichtigste Ziele dabei sind die Erhöhung der Frequenz des Gentransfers und die Ausübung eines Selektionsdrucks durch Stressfaktoren, um vorwiegend bestimmte, gewünschte Eigenschaften auf den Genschwamm zu übertragen. Das Impfgut kann homogen oder heterogen ("solid Supports", etc.) beigemischt werden; eine große Zahl von Möglichkeiten besteht, die Nährstoffzufuhr (nicht- ) selektive Mono-/Polymere; C/N-Verhältnis; +/- Wasser, Sauerstoff, etc., oder die sonstigen chemischphysikalischen Bedingungen (T, pH, Redoxverhältnisse, etc.) zu variieren; Stressfaktoren (z.B. toxische Bedingungen: Antibiotika, Xenobiotika, kurzwellige, elektromagnetische Strahlen wie z.B. Röntgenstrahlen, Toxine) oder kompetitive MO (z.B. pathogene oder ernährungsphysiologische Konkurrenz-MO, Fressfeinde) können benutzt werden, um den Selektionsdruck in bestimmte Bahnen zu lenken; die DNA-Mobilisierung kann ebenfalls über verschiedene Faktoren beeinflußt werden, z.B. durch Vorhandensein oder Inocculation von Vektoren (Tra+-Plasmide, Viren, etc.) oder generelle Faktoren der schonenden DNA-Freisetzung (z.B. Lysozym od. andere Enzyme, etc. ) .

Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Isolierung von DNA aus Mikroorganismen durch in situ-Gentransfer, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) geeignete Mikroorganismen als Rezipient herstellt, die hochfrequent DNA von anderen Mikroorganismen übernehmen können und b) die Bedingungen für den Gentransfer optimiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezipient ein gut charakterisierter, kultivierbarer und fermentierbarer Mikroorganismus ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Pilzen und Protozoen ausgewählt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezipient ein Actinomycet ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Actinomycet ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:

a) Actinomycet mit Verlust eines Teils oder aller Sekundärstoff-Biosynthesegene ; b) Actinomycet mit chromosomaler Resistenz gegenüber Antibiotika; c) Actinomycet mit Verlust der Restriktions- und anderen Hsd- Faktoren; d) Actinomycet mit einer Überlebensfähigkeit im jeweiligen Mikrokosmos für eine Periode von 10 bis 50 Tagen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezipient ein Streptomycet ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Streptomycet ausgewählt wird aus der Gruppe Streptomyces lividans 66, Streptomyces griseus (DSM40236) und N 2-3-11), Streptomyces glaucescens (ETH 22794), Streptomyces galbus (DSM40480) und Streptomyces lincolnensis (NRRL 2936) .

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagte "andere Mikroorganismen" nicht-kultivierbare Mikroorganismen aus dem Boden, Meeresoberflächenwasser, anderen Gewässern, Kläranlagen, Kompostieranlagen, Sedimenten, Schlämmen, Pflanzen und Tieren stammen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Optimierung der Bedingungen für den Gentransfer erreicht wird durch Variation einer oder mehrerer Bedingungen ausgewählt aus der Gruppe:

a) Zumischung des Impfguts homogen oder heterogen; b) Zugabe von selektiven oder nichtselektiven Nährstoffen; c) Zugabe von Nährstoffen in Form von Polymeren und/oder Monomeren; d) Zugabe von Nährstoffen mit bestimmtem Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis; e) Wassergehalt; f) Sauerstoffgehalt; g) Temperatur; h) pH-Wert; i) Redoxverhältnisse; j ) Schaffung toxischer Bedingungen durch Zugabe von

Antibiotika, Xenobiotika, Toxinen, Schwermetallsalzen; k) Bestrahlung; 1) Zugabe von kompetitiven Mikroorganismen als pathogene oder ernährungs-physiologische Konkurrenz; m) Vorhandensein oder Inoculation von Vektoren wie Tra+Plasmide oder Viren zur DNA-Mobilisierung; n) Zugabe von Enzymen wie Lysozym zur schonenden DNA- Freisetzung; o) Zugabe von Calcium- oder Lithium-Salzen; p) Gentechnische oder mutative Veränderung von Kompetenzgenen der DNA-Aufnahme .

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß dem Rezipienten die Sekundärstoff- Biosynthesegene durch gentechnische oder ungerichtete Mutagenese ausgeschaltet werden.

11. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Actinomycet mit chromosomaler Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus

a) Actinomycet mit Mutation zur Streptomycinresistenz des Gens für das ribosomale Protein S12 (rpsL) ; b) Actinomycet mit Mutation zur Rifampicinresistenz des Gens für die ß-Untereinheit der RNA-Polymerase (rpoB) ; c) Actinomycet mit Mutation zur Nalidixinsäureresistenz in einem der Gene für die Gyrase (gyrA und gyrB) ; d) Actinomycet, in den ein oder mehrere gängige Antibiotikaresistenzgene eingeführt worden sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß neu aufgenommenes Erbgut oder eine neu erworbene Stoffwechsel-Eigenschaft direkt zu selektieren, indem man Rezeptor-gekoppelte Systeme verwendet, die auf die aktive Produktion und Ausschleusung eines bestimmten Wirkstofftyps reagieren und im Genschwamm eine selektierbare Reaktion auslösen.