JP2017195860A - 枯草菌変異株及びそれを用いたジピコリン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ジピコリン酸を高生産することができる枯草菌変異株の提供。
【解決手段】 枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現が強化されており、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
【選択図】なし

Description

本発明は、ジピコリン酸生産能を有する枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いたジピコリン酸又はその塩の製造方法に関する。

ジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸、ＤＰＡ）は、天然物であり生分解性の高いキレート剤として知られており、産業用の用途として洗剤組成物や金属隠蔽剤、酸化防止剤などとして利用できることが報告されている。

ジピコリン酸は、２，６−ルチジンから酸化反応によって合成されることが知られている。すなわち、ニッケル化合物の存在下で次亜ハロゲン酸塩を酸化剤として用いる方法や、電解酸化法、空気酸化法などにより合成できることが知られている。しかし、これらの方法では、反応の転化率や選択率が不十分であり、原料である２，６−ルチジンや反応中間体である６−メチル−２−ピリジンカルボン酸等のアルキルピリジンが反応液中に残存し、２，６−ピリジンジカルボン酸（ジピコリン酸）中に不純物として混入するため、高純度のジピコリン酸を製造することは困難であった。

一方、微生物を使用するジピコリン酸の製造方法によれば、アルキルピリジンを含有することなくジピコリン酸を高純度に製造できると期待される。微生物を用いたジピコリン酸の製造方法としては、胞子を形成する微生物であるバシラス（Bacillus）属を用いた発酵法による製造方法（特許文献１及び２）及びカビを用いた製造方法（特許文献３）が知られている。

また、遺伝子工学的に改変した微生物を用いたジピコリン酸の製造方法が知られている。特許文献４には、遺伝子組換えリジン生産菌を利用したジピコリン酸の製造方法が開示されている。特許文献５には、ジピコリン酸合成経路に関与する遺伝子の発現パターンを改変したバシラス（Bacillus）属又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物を利用したジピコリン酸の製造方法が開示されている。また、特許文献６には、ゲノムの大領域を欠失させて得られた枯草菌変異株に対してジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化し、且つアセトイン合成に関わる遺伝子の発現を欠失させた枯草菌変異株がジピコリン酸の生産性に優れていることが記載されている。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、ＡＴＰの加水分解エネルギーを利用し、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）を脱炭酸してホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の合成を触媒する酵素で、糖新生に必須な酵素である。
これまでに、枯草菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子（ｐｃｋＡ遺伝子）を破壊した場合に、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの生産性が向上すること（特許文献７）、またＰｃｋＡ活性を増強させた変異微生物においてコハク酸の生産量が向上すること（特許文献８）が報告されている。
しかしながら、枯草菌においてｐｃｋＡ遺伝子の発現がＤＰＡの生産に如何なる影響を及ぼすかは不明である。

特開２００４−２７５０７５号公報 独国特許第２３０００５６号公報 米国特許第３３３４０２１号公報 特開２００２−３７１０６３号公報 特開２００８−０４８７３２号公報 特開２０１５−２１３４７１公報 中国特許出願公開第１０５２３８７２４号明細書 特開２０１４−１５０７４８号公報

本発明は、ジピコリン酸（２，６−ピリジンジカルボン酸、以下の本明細書において、ＤＰＡとも称する）を高生産することができる枯草菌変異株、当該枯草菌変異株の製造方法、及び当該枯草菌変異株を用いたＤＰＡ又はその塩の製造方法に関する。

本発明者らは、ＤＰＡを効率良く生産することができる微生物株の開発を進めた。その結果、ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株において、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化することと、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子を欠失又は不活性化することにより、得られた枯草菌変異株が顕著に高いＤＰＡ生産能を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明は、一態様において、以下を提供する：
枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現が強化されており、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。

別の態様において、本発明は以下を提供する：
枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において
ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化し、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する、ことを含む、方法。

また別の態様において、本発明は、上記枯草菌変異株を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法を提供する。

本発明の枯草菌変異株は高いＤＰＡ生産能を有する。本発明の枯草菌変異株を用いることによりＤＰＡ又はその塩を効率よく製造することが可能になる。

枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。 枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。 枯草菌変異株へのジピコリン酸シンターゼ遺伝子の導入手順及び導入位置に関する一実施形態を示す模式図。 ｍａｚＦカセットを使用したマーカーフリー欠失法にて枯草菌変異株から特定の遺伝子を欠失させる手順を示す模式図。

本明細書に記載の枯草菌の各遺伝子及びゲノム領域の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ．，Ｐｅａｒｓｏｎ．ＷＲ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ Ｖｅｒ.１１（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸又はヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」の「数個」とは、例えば、対象となるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の総アミノ酸残基数又は総ヌクレオチド数の２０％以下の最大整数、好ましくは同じく１０％以下の最大整数、より好ましくは同じく５％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく４％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく３％以下の最大整数、さらに好ましくは同じく２％以下の最大整数、さらにより好ましくは同じく１％以下の最大整数を意味する。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。

本明細書において、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」とは、配列同一性が約８０％以上若しくは約９０％以上のヌクレオチド配列を有する遺伝子の確認を可能にする条件である。「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの当業者は、プローブのヌクレオチド配列や濃度、長さ等に応じて、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより、ストリンジェントな条件を適切に作り出すことができる。一例を示せば、上記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション条件としては、５×ＳＳＣ、７０℃以上が好ましく、５×ＳＳＣ、８５℃以上がより好ましく、洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。上記ＳＳＣ及び温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、適切なストリンジェンシーを実現することが可能である。

本明細書において、遺伝子又は領域の上流及び下流とは、それぞれ、対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側及び３’側に続く領域を示す。

本明細書において、遺伝子の制御領域とは、下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。本明細書において、遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００〜６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域を含む。転写開始制御領域は制御領域及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２−１３４６）。

本明細書において、特定の遺伝子を「制御領域の制御下に配置する」とは、制御領域による遺伝子の発現を制御する機能が特定遺伝子に作用するように、ＤＮＡ上で制御領域と特定遺伝子とを配置することをいう。特定遺伝子を制御領域の制御下に配置する方法としては、当該制御領域の制御の及ぶ下流に当該特定遺伝子を連結する方法が挙げられる。

（１．枯草菌変異株の製造）
（１−１．ゲノム欠失枯草菌変異株）
本発明の枯草菌変異株は、枯草菌野生株のゲノム上の大領域が欠失したゲノムを有し、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現が強化されており、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株である。好ましくは、本発明の枯草菌変異株は、該ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株に対して、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化する改変と、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させる改変とを加えることによって作製される。

上記ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株は、枯草菌野生株（Bacillus subtilis Marburg No.168；本明細書において以下、枯草菌１６８株又は単に１６８株、あるいは野生株と称する）のゲノムと比べて、そのゲノム中の大領域が欠失したゲノムを有する。すなわち、当該枯草菌変異株のゲノムにおいては、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失している。なお、領域とは特定の遺伝子に挟まれる遺伝子の領域をいい、領域が欠失しているとは特定の遺伝子に挟まれる領域の全てを欠失していることをいう。

当該枯草菌変異株としては、好ましくは、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域の全てを欠失しているＭＧＢ８７４株（特開２００７−１３００１３号公報）や、枯草菌野生株のゲノム中の、ｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ７（ｙｒｋＭ−ｙｒａＫ）領域からなる群より選択される領域の全てを欠失しているＯＡ１０５株が挙げられ、より好ましくはＭＧＢ８７４株である。

上記枯草菌変異株は、例えば、１６８株（たとえばＮＢＲＣ１１１４７０株）の任意の枯草菌株から上述のゲノム領域を欠失させることによって作製することができる。欠失させるべき目的のゲノム領域は、例えば、当該任意の枯草菌株のゲノムを、公開されている枯草菌１６８株のゲノムと対比することにより決定することができる。枯草菌１６８株の全ヌクレオチド配列及びゲノムの情報は、上述のＢＳＯＲＦ ＤＢ、又はＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２（[www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）から入手することができる。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報に基づいて、欠失させるべき目的のゲノム領域を決定することができる。ここで、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域のヌクレオチド配列に対して、１又は数個（例えば、１〜１００個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１〜５個）のヌクレオチドにおける天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含むヌクレオチド配列を有するゲノム領域であり得る。あるいは、欠失させるべきゲノム領域は、公開されている枯草菌１６８株における上述のゲノム領域に対して、ヌクレオチド配列において好ましくは８０％以上同一、さらにより好ましくは９０％以上同一、なお好ましくは９５％以上同一なゲノム領域であり得る。

あるいは、上記欠失させるべきゲノム領域は、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。表１記載の領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えばＳＯＥ−ＰＣＲ法（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ：Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）等により調製された欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。当該方法により枯草菌野生株から所定のゲノム領域が欠失した変異株を作製する手順は、特開２００７−１３００１３号公報に詳述されているが、以下に概要を説明する。

ＳＯＥ−ＰＣＲ法による欠失用ＤＮＡ断片の調製と当該欠失用ＤＮＡ断片を用いた２重交差法による目的領域の欠失の手順の概要を図１に示す。初めに、ＳＯＥ−ＰＣＲ法により、欠失させるべき目的領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ領域に対応する断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を調製する。好ましくは、目的領域の欠失を確認するために、当該上流断片と下流断片の間に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片をさらに連結したＤＮＡ断片を調製する。

まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じてマーカー遺伝子断片（図１中では、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片Ｃｍ）の３断片を調製する。上流断片及び下流断片のＰＣＲ増幅の際には、後に連結される断片の末端１０〜３０ヌクレオチドの配列を付加したプライマーを使用する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で連結させる場合、上流断片Ａの下流末端に結合するプライマーの５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に結合するプライマーの５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０ヌクレオチドに相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ’の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ’の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。

次に、１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ’、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ’を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に結合するプライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる。

上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドに挿入し、欠失導入用プラスミドを構築する。あるいは、上流断片及び下流断片を直接連結した欠失用ＤＮＡ断片を調製した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失導入用プラスミドを構築することができる。

上記手順で増幅した欠失用ＤＮＡ断片あるいは構築された欠失導入用プラスミドを、コンピテントセル形質転換法等の通常の手法により、ゲノム領域を欠失させたい枯草菌に導入する。プラスミドの導入により、当該プラスミド上の上流断片及び下流断片と、枯草菌ゲノムのそれらに相同な領域との間で２重交差の相同組換えが生じ、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在する薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子の発現を指標に行えばよい。例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子断片で形質転換処理をした菌を、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、生育したコロニーを回収することで、目的の領域が欠失しクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えられた形質転換体を取得することができる。さらに、形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる。

次に、得られた形質転換体から、ゲノムＤＮＡに挿入された上記マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、図２に示すような２段階相同組換え法を用いることができる（特開平２００９−２５４３５０号公報）。当該方法では、初めに第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべきマーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する領域に対応する約０．１〜３ｋｂ断片（下流断片）が結合した断片と、当該除去すべきマーカー遺伝子下流領域の断片とが連結したＤＮＡ断片を用いることができる。好適には、当該下流断片と除去すべき第１のマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる第２のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図２を参照）。

次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法等の通常の手法によって上記形質転換体に導入し、当該形質転換体ゲノム上の当該上流断片及び第１のマーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した第２のマーカー遺伝子の発現を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて第２のマーカー遺伝子、第１のマーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図２参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、第１のマーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。

ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択する手段としては、第１のマーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合は、薬剤耐性を持たない菌を選択する方法が挙げられる。ペニシリン系抗生物質は、増殖細胞に対して殺菌的に作用するが非増殖細胞には作用しない。したがって、薬剤とペニシリン系抗生物質の存在下で菌を培養すれば、薬剤存在下で増殖しない薬剤非耐性菌を選択的に濃縮することができる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ，１９７０）。別の手段としては、致死遺伝子を導入する方法が挙げられる。例えば、上記第２のマーカーとしてｃｈｐＡ（ｍａｚＦ）遺伝子等の致死遺伝子を菌に導入すれば、ゲノム内相同組換えが起こらなかった菌は当該致死遺伝子の作用で死滅するので、ゲノム内相同組換えを起こした形質転換体を選択することができる。選択された菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行うことで、目的の領域が欠失されていることを確認することができる（特開２００９−２５４３５０号公報）。

以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を欠失した枯草菌変異株を作製することができる。さらに、当該手順を繰り返すことにより、上述のゲノム領域が全て欠失した枯草菌変異株を作製することができる。

（１−２．ジピコリン酸シンターゼ遺伝子発現強化）
本発明においては、上記所定の領域を欠失した枯草菌変異株において、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現が強化されている。

本明細書において、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子とは、下記式（１）の化学反応を進行させる活性を有するジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子であり、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子及びそれに相当する遺伝子が包含される。

ジピコリン酸シンターゼは、サブユニットＡとサブユニットＢから構成されており、それぞれのサブユニットをコードする遺伝子が存在する。枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子としては、ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡをコードするｓｐｏＶＦＡと、ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢをコードするｓｐｏＶＦＢが挙げられる。枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子のヌクレオチド配列及び当該ｓｐｏＶＦＡ遺伝子によりコードされるジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子のヌクレオチド配列及び当該ｓｐｏＶＦＢ遺伝子によりコードされるジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。

枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢとともに働いて上述したジピコリン酸合成反応を触媒する活性（ジピコリン酸シンターゼ活性）を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。

あるいは、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子と少なくとも８０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡとともに働いて上述したジピコリン酸合成反応を触媒する活性（ジピコリン酸シンターゼ活性）を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。

さらに、枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌以外の微生物由来のジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ又はＢをコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、Bacillus licheniformis由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号５）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号６）、Bacillus clausii由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号７）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号８）、Clostridium stercorarium由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号９）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号１０）、ならびにBacillus amyloliquefaciens由来のｓｐｏＶＦＡ（配列番号１１）及びｓｐｏＶＦＢ（配列番号１２）等を挙げることができる。

本発明の枯草菌変異株においては、上述したジピコリン酸シンターゼ遺伝子のうちのいずれか１つ、又はいずれか２つ以上が発現強化されていればよい。好ましくは、上述した枯草菌ジピコリン酸シンターゼのサブユニットＡをコードする遺伝子又はこれに相当する遺伝子と、上述した枯草菌ジピコリン酸シンターゼのサブユニットＢをコードする遺伝子又はこれに相当する遺伝子とが組み合わせて発現強化されているとよい。より好ましくは、上述した枯草菌ジピコリン酸シンターゼのサブユニットＡとサブユニットＢをコードする遺伝子とが組み合わせて発現強化されているとよい。

本発明の枯草菌変異株において発現強化される枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子の好ましい例としては、以下の（i）及び（ii）に記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つが挙げられる。
（i）下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、数個とは５９個、好ましくは４４個、より好ましくは２９個、より好ましくは１４個、より好ましくは５個、より好ましくは２個である；及び、
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ii）下記（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、数個とは４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個、より好ましくは１０個、より好ましくは４個、より好ましくは２個である；及び、
（ｏ）配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

より好ましくは、本発明の枯草菌変異株においては、上記（i）及び（ii）に記載の遺伝子が組み合わせて発現強化される。さらに好ましくは、本発明の枯草菌変異株においては、上記（i）（ａ）の遺伝子と、上記（ii）（ｊ）〜（ｏ）の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせ、又は上記（i）（ａ）〜（ｆ）の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ii）（ｊ）の遺伝子との組み合わせが発現強化される。なお好ましくは、本発明の枯草菌変異株においては、上記（i）（ａ）の遺伝子と上記（ii）（ｊ）の遺伝子との組み合わせが発現強化される。

本発明の枯草菌変異株において発現強化されるジピコリン酸シンターゼ遺伝子の別の好ましい例としては、上述した枯草菌のｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus licheniformisのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus clausiiのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Clostridium stercorariumのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、ならびにBacillus amyloliquefaciensのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つが挙げられ、このうち、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つがより好ましい。

本発明の枯草菌変異株において発現強化されるジピコリン酸シンターゼ遺伝子のなお別の好ましい例としては、枯草菌のｓｐｏＶＦＡ遺伝子、Bacillus licheniformisのｓｐｏＶＦＡ遺伝子、Bacillus clausiiのｓｐｏＶＦＡ遺伝子、Clostridium stercorariumのｓｐｏＶＦＡ遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのｓｐｏＶＦＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、枯草菌のｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus licheniformisのｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus clausiiのｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Clostridium stercorariumのｓｐｏＶＦＢ遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせが挙げられ、このうち、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子と枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子との組み合わせがより好ましい。

本発明において、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現強化とは、改変前と比較して当該遺伝子の発現を増強させることを意味する。上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化する手段としては、例えば、宿主ゲノム上の枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子を、野生型に比較し該遺伝子の発現を強化できる制御領域（強発現制御領域）の制御下に配置すること、及び制御領域、好ましくは強発現制御領域の制御下に配置された枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子を、宿主が本来有するジピコリン酸シンターゼ遺伝子に加えて、細胞内のゲノム中若しくはプラスミド中に導入すること、などが挙げられる。

例えば、本発明の枯草菌変異株は、上述のゲノム領域が１つ以上、好ましくは全て欠失した枯草菌変異株を宿主として、そのゲノム上の枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の制御領域配列を強発現制御領域に置換することによって作製することができる。あるいは、本発明の枯草菌変異株は、強発現制御領域の制御下に配置された枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子を当該宿主のゲノム中若しくはプラスミド中に導入することによって作製することができる。またあるいは、複数の枯草菌ジピコリン酸シンターゼ遺伝子又はこれに相当する遺伝子を当該宿主中に作動可能に存在させる改変により、該目的遺伝子の発現を強化することもできる。

ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現強化のための詳細な手順の例を以下に記載する。まず、制御領域及びジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、当該制御領域の制御下に当該遺伝子が発現されるように配置され、さらに宿主ゲノムとの相同領域と結合されたＤＮＡ断片として構築され得る。例えば、上流から、制御領域（例えば、後述するｓｐｏＶＧ遺伝子制御領域）、ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子、ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子の順で配置した断片を作製し、さらにその断片に宿主ゲノムの一部との相同領域を結合してＤＮＡ断片を調製する。次いで、このＤＮＡ断片を上述した宿主に導入すれば、宿主ゲノム中に当該ＤＮＡ断片が挿入されて、宿主を形質転換することができる。形質転換法としては、宿主となる枯草菌に応じて適切な、且つ一般的な方法を採用することができる。得られた形質転換体は、形質転換前の宿主と比べてジピコリン酸シンターゼ遺伝子を多数保有しているため、該遺伝子の発現量が増加する。

本発明においてジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現強化に使用され得る制御領域しては野生型の制御領域に比較して、発現を増強することができる制御領域であれば特に限定されず、バシラス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｌＳ遺伝子等）の制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、又はｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域；Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域；Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域、又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域等（いずれも、特開２００９−０８９７０８号公報を参照）が例示される。

（１−３．ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の欠失又は不活性化）
本発明の枯草菌変異株においては、ｐｃｋＡ遺伝子が欠失又は不活性化されている。

枯草菌ｐｃｋＡ遺伝子はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子である。
枯草菌においてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰｃｋＡ）はＡＴＰの加水分解エネルギーを利用し、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）を脱炭酸してホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の合成を触媒する酵素で、糖新生に必須な酵素である。ｐｃｋＡ遺伝子のＢＳＯＲＦ ＤＢにおける登録番号、コードするタンパク質及びその機能を以下の表２に示す。当業者は、当該ＢＳＯＲＦ ＤＢの情報に基づいて、親株における上記遺伝子を同定することができる。
すなわち、本発明においてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子は配列番号１３に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして同定することができる。

遺伝子を欠失又は不活性化させる手段としては、該遺伝子のヌクレオチド配列上の１つ以上のヌクレオチドに対する突然変異導入、又は該ヌクレオチド配列に対する別のヌクレオチド配列の置換若しくは挿入、あるいは該遺伝子の配列の一部若しくは全部の削除などが挙げられる。遺伝子の転写を阻害する変異を導入する手段としては、該遺伝子のプロモーター領域に対する突然変異導入や、別のヌクレオチド配列での置換若しくは挿入による、当該プロモーターの不活性化が挙げられる。上記突然変異導入や、ヌクレオチド配列の置換若しくは挿入のための具体的な手法としては、紫外線照射、部位特異的変異導入、及び上記（１−１．ゲノム領域欠失枯草菌変異株）にて説明したＳＯＥ−ＰＣＲ法や相同組換え法、などを挙げることができる。欠失又は不活性化させる遺伝子の枯草菌ゲノム上での位置やヌクレオチド配列は、上述したＢＳＯＲＦ ＤＢにて確認することができる。

（２．枯草菌変異株を用いたＤＰＡ生産）
本発明の枯草菌変異株は、後記実施例に示すように、変異前の親枯草菌株に比べて極めて高いＤＰＡ生産能を有している（実施例２参照）。
したがって、上述した枯草菌変異株を培養することによって当該菌体外に効率よくＤＰＡを生産することができ、本発明の別の態様は、上述した枯草菌変異株を用いるＤＰＡ又はその塩の製造方法に係るものである。

本発明のＤＰＡ又はその塩の製造方法においては、先ず、上記本発明の枯草菌変異株を培養する。培養する方法に特に制限はなく、通常の微生物の培養方法を用いることができる。すなわち、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含む通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷん及びセルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロール、エタノール、ソルビトール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物等の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水、尿素、グルタミン酸、リジン、グリシン、アラニン、メチオニン、アスパラギン酸、アルギニン等を用いることができる。有機微量栄養源として、ビタミン類、アミノ酸等の要求物質、又は、必要に応じて酵母エキス、コーンスティープリカー等を含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、銅イオン、鉄イオン、マンガンイオン等を添加することが望ましい。場合によっては、消泡剤等も添加される。

培地のｐＨは、枯草菌が生育し得る範囲、好ましくは６．０〜８．０に調節すればよく、ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行えばよい。培養は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で、６〜９６時間、好ましくは２〜４日間行い、必要により通気や攪拌を加えてもよい。

以上のように、本発明の枯草菌変異株を培養することによって、培養上清中にＤＰＡが生産される。あるいは、上記のように培養した微生物を、アスパラギン酸及び/又はピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させることで、反応上清液中にＤＰＡを産生させることも可能である。このとき、エネルギー源として上記培地に添加されるような物質を共存させることで、さらに効率よくＤＰＡを産生させることが可能である。

次いで、生産されたＤＰＡを、培養物中から回収する。ＤＰＡの回収は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、上記培養上清又は反応上清液からのＤＰＡの単離は、公知の方法、例えばイオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理による不純物の除去等、又はそれらを組み合わせることで実施することができる。この方法により、容易にジピコリン酸の結晶又は沈殿を得ることができる。

また、上記イオン交換樹脂処理などによって得られたＤＰＡを含有する溶液に、目的に応じた量のアルカリを添加することで、ＤＰＡの塩を得ることができる。具体的な例としては、ＮａＯＨ又はＫＯＨ等を添加することにより、それぞれジピコリン酸ナトリウム塩又はジピコリン酸カリウム塩等を得ることができる。

本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物及び製造方法を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

＜１＞枯草菌変異株であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現が強化されており、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。

＜２＞枯草菌変異株の製造方法であって、
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において
ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化し、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子を欠失又は不活性化することを含む、方法。

＜３＞上記＜１＞〜＜２＞のいずれか１において、好ましくは、上記枯草菌変異株は、ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノムを有する。

＜４＞上記＜１＞〜＜３＞のいずれかにおいて、好ましくは、上記各領域は、表１に記載の各オリゴヌクレオチドセットにより挟まれる領域である。

＜５＞上記＜１＞〜＜４＞のいずれかにおいて、好ましくは、上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子は、下記（i）及び（ii）に記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである：
（i）下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、数個とは５９個、好ましくは４４個、より好ましくは２９個、より好ましくは１４個、より好ましくは５個、より好ましくは２個である；
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ii）下記（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
（ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、数個とは４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個、より好ましくは１０個、より好ましくは４個、より好ましくは２個である；
（ｏ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

＜６＞上記＜５＞において、好ましくは、上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子は、以下の遺伝子である：
上記（i）記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ii）記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせ；
上記（i）（ａ）の遺伝子と、上記（ii）（ｊ）〜（ｏ）の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせ；
上記（i）（ａ）〜（ｆ）の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、上記（ii）（ｊ）の遺伝子との組み合わせ；又は
上記（i）（ａ）の遺伝子と上記（ii）（ｊ）の遺伝子との組み合わせ。

＜７＞上記＜１＞〜＜６＞のいずれかにおいて、上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子は：
好ましくは、枯草菌のｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus licheniformisのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus clausiiのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Clostridium stercorariumのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子、ならびにBacillus amyloliquefaciensのｓｐｏＶＦＡ遺伝子及びｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである；
より好ましくは、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである。

＜８＞上記＜７＞において、上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子は：
好ましくは、枯草菌のｓｐｏＶＦＡ遺伝子、Bacillus licheniformisのｓｐｏＶＦＡ遺伝子、Bacillus clausiiのｓｐｏＶＦＡ遺伝子、Clostridium stercorariumのｓｐｏＶＦＡ遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのｓｐｏＶＦＡ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つと、枯草菌のｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus licheniformisのｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Bacillus clausiiのｓｐｏＶＦＢ遺伝子、Clostridium stercorariumのｓｐｏＶＦＢ遺伝子、及びBacillus amyloliquefaciensのｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つとの組み合わせである；
より好ましくは、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子との組み合わせである。

＜９＞上記＜１＞〜＜８＞のいずれかにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子は、配列番号１３に示すヌクレオチド配列又は配列番号１３に示すヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる。

＜１０＞上記＜１＞〜＜９＞のいずれかにおいて、好ましくは、上記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現の強化が、以下からなる群より選択される制御領域の制御下に配置された当該遺伝子の、ゲノム中又はプラスミド中への導入である：
バシラス属細菌由来のα−アミラーゼ遺伝子の制御領域、プロテアーゼ遺伝子の制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子（ｒｐｌＳ遺伝子等）の制御領域、ａｐｒＥ遺伝子の制御領域、又はｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域；Bacillus sp．ＫＳＭ−Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の制御領域；及び、Staphylococcus aureus由来のカナマイシン耐性遺伝子の制御領域又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域。

＜１１＞上記＜１＞及び＜３＞〜＜１０＞のいずれかに記載の枯草菌変異株を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法。

＜１２＞上記＜２＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法で製造された枯草菌変異株を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法。

＜１３＞上記枯草菌変異株を培養することと、培養物中からジピコリン酸を回収することとを含む、＜１１＞又は＜１２＞記載の方法。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）菌株の構築
（１−１）トリプトファン要求性解除株の作製
枯草菌野生株ゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４株；特開２００７−１３００１３号公報）におけるトリプトファン要求性を解除した。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株の元株である枯草菌１６８株は、遺伝子型としてｔｒｐＣ２を所持している。つまり１６８株はトリプトファン合成に関与するインドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードするｔｒｐＣ遺伝子変異のためトリプトファン合成要求性である。また、枯草菌ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株はトリプトファン非要求性であることが知られている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．＆Ｇａｌｉｚｚｉ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４５（Ｐｔ１２）：３３１９−３３２０）。枯草菌１６８株とＡＴＣＣ６０５１Ｔ株のｔｒｐＣ遺伝子を比較したところ、３２８番目から３３０番目のヌクレオチドＡＴＴが枯草菌１６８株では存在しないことがわかった。そこで、ＡＴＣＣ６０５１Ｔ株ゲノムを鋳型とし、表３記載のプライマーｔｒｐＣ＿Ｆ１（配列番号６０）及びｔｒｐＣ＿Ｒ１（配列番号６１）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を構築した。このＰＣＲ産物を用いて枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株をコンピテント法で形質転換し、トリプトファン非添加のＳＭＡ寒天培地（０．２％硫酸アンモニウム、１．４％リン酸水素２カリウム、０．６％リン酸２水素カリウム、０．１％クエン酸３ナトリウム-２水和物、０．５％グルコース、０．０３５％硫酸マグネシウム７水和物、１．５％寒天）に生育したコロニーを形質転換体として分離した。こうしてトリプトファン非要求性ＭＧＢ８７４Ｔ株を得た。

（１−２）ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株）の構築
上記（１−１）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ株を宿主として、ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株）の構築を行った。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３記載のプライマーｓｐｏＶＦＡ−Ｆ１（配列番号６２）及びｓｐｏＶＦＡ−Ｒ１（配列番号６３）を用いて、断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。この断片（Ａ）はｓｐｏＶＦＡ遺伝子（配列番号１）の開始コドンの上流に隣接する領域である。また、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３記載のプライマーｓｐｏＶＦＡ−Ｆ２（配列番号６４）及びｓｐｏＶＦＡ−Ｒ２（配列番号６５）を用いて、断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。この断片（Ｂ）は、ｓｐｏＶＦＡ遺伝子の開始コドンから下流の領域である。さらに、同ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３記載のプライマーｓｐｏＶＧｐｒｏ−Ｆ（配列番号６６）及びｓｐｏＶＧｐｒｏ−Ｒ（配列番号６７）を用いて、ｓｐｏＶＧ制御領域配列を含む断片（Ｃ）をＰＣＲにより増幅した。さらに、プラスミドｐＤＬＴ３（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，Ｐｔ１１：３５３９−３５５２）を鋳型とし、表３記載のプライマーＣｍ−Ｆ（配列番号６８）及びＣｍ−Ｒ（配列番号６９）を用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子とその制御領域を含む断片（Ｄ）をＰＣＲにより増幅した。
次に、得られた断片（Ａ）、断片（Ｄ）、断片（Ｃ）及び断片（Ｂ）をこの順となる様に表３記載のプライマーｓｐｏＶＦＡ−Ｆ１（配列番号６２）及びｓｐｏＶＦＡ−Ｒ２（配列番号６５）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法によって結合させ、約２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９６０，８１：７４１−７４６）により枯草菌ＭＧＢ８７４Ｔ株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した（以下、分離した形質転換体をＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と称する）。ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株は、生来のｓｐｏＶＦＡＢ遺伝子が導入したＰｓｐｏＶＧの制御により、ｓｐｏＶＦＡＢ遺伝子の発現が強化された枯草菌変異株である。
ＰＣＲ及びそれに続くサンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８２，７４：５４６３−５４６７）によるシークエンシングによって、構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株のゲノム上のｓｐｏＶＦＡ制御領域とｓｐｏＶＦＡ遺伝子の間に、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びｓｐｏＶＧ遺伝子制御領域が挿入されていることを確認した。本実施例で得られた枯草菌変異株へのジピコリン酸シンターゼ遺伝子の導入手順及び導入位置を図３に示す。

（１−３）ｐｃｋＡ遺伝子が欠失された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ＿ΔｐｃｋＡ株）の構築
上記（１−２）で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株を宿主として、ｐｃｋＡ遺伝子が欠失された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ＿ΔｐｃｋＡ株）の構築を行った。
図１に示したように、枯草菌８７４株ゲノム中のｐｃｋＡ遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／））を薬剤耐性遺伝子（エリスロマイシン耐性遺伝子）に置換して欠失株を作製した。枯草菌８７４株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したｐｃｋＡＦＷ（配列番号７０）及びｐｃｋＡ／ＥｍＲ（配列番号７１）のプライマーセットを用いて、ゲノム中のｐｃｋＡ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｐｃｋＡ／ＥｍＦ（配列番号７２）及びｐｃｋＡＲＶ（配列番号７３）のプライマーセットを用いて、ゲノム中のｐｃｋＡ遺伝子の下流に隣接する１．０ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。更に、プラスミドｐＭｕｔｉｎ３（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４４，３０９７−３１０４，１９９８）鋳型とし、表３に示したｅｍｆ２（配列番号７４）及びｅｍｒ２（配列番号７５）のプライマーセットを用いて、１．３ｋｂのエリスロマイシン（Ｅｍ）耐性遺伝子領域（Ｃ）をＰＣＲにより調製した。

次に、得られた１．０ｋｂ断片（Ａ）、１．０ｋｂ断片（Ｂ）及びＥｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）の３断片を混合して鋳型として、表３に示すｐｃｋＡＦＷ２（配列番号７６）及びｐｃｋＡＲＶ２（配列番号７７）のプライマーセットを用いたＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，１９８９）によって、３断片が（Ａ）、（Ｃ）、（Ｂ）の順で含まれる３．３ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。

更に、得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いて、コンピテントセル形質転換法により（１−２）で構築したジピコリン酸シンターゼ遺伝子が発現強化された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株）の形質転換を行った。形質転換後、エリスロマイシン（２μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。

得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってｐｃｋＡ遺伝子がＥｍ耐性遺伝子で置換されていることを確認した。以上の操作により、ｐｃｋＡ遺伝子が欠失された枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ＿ΔｐｃｋＡ株と称する）を構築した。

（実施例２）ＤＰＡ生産性評価
実施例１で構築したＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ＿ΔｐｃｋＡ株を、５ｍＬの合成培地（５．０質量％グルコース、０．６質量％塩化アンモニウム、０．１５質量％リン酸水素２カリウム、０．０３５質量％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５質量％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属）で３０℃において一晩振盪培養を行い、得られた培養液を、合成培地（５．０質量％グルコース、０．６質量％塩化アンモニウム、０．１５質量％リン酸水素２カリウム、０．０３５質量％硫酸マグネシウム７水和物、０．００５質量％硫酸マンガン５水和物、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（モノホリノプロパンスルホン酸）緩衝剤（ｐＨ７．０）、その他微量金属、４．０質量％炭酸カルシウム）３０ｍＬに接種し、３７℃、２００ｒｐｍで２日間、振盪培養を行った。
培養終了後、下記に示す分析条件にてＤＰＡ生産量を測定し、ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株の生産量を１００％とした場合の相対値を求めた。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子を欠失した枯草菌変異株ＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ＿ΔｐｃｋＡ株は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が欠失前の株であるＭＧＢ８７４Ｔ＿ＰｓｐｏＶＧ−ｓｐｏＶＦＡＢ株と比較して、ＤＰＡ生産量１２０％まで増加した（表４）。

ＤＰＡの定量
培養終了後の培養液試料を、室温にて１４，８００ｒｐｍで３０分間の遠心分離（日立工機、ｈｉｍａｃＣＦ１５ＲＸ）に供し、得られた遠心分離後の試料上清中に含まれるＤＰＡについて、ＨＰＬＣ法にて定量を行った。ＨＰＬＣ装置は、送液ポンプ（島津、ＬＣ−９Ａ）、オートサンプラー（日立計測機器、ＡＳ−２０００）、カラムオーブン（島津、ＣＴＯ−６Ａ）、ＵＶ検出計（島津、ＳＰＤ−１０Ａ）、脱ガス装置（ＧＬサイエンス、ＤＧ６６０Ｂ）及びクロマトデータ解析装置（日立計測機器、Ｄ−２５００）を接続したものを用いた。分析カラムは、Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ ６０（Å）４μｍ ４．６×２５０ｍｍ ＨＰＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｂｏｎｄｅｄ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ）（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。溶離液としては、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む濃リン酸でｐＨ３．４に合わせた水溶液とアセトニトリル溶液とを１：１に混合した溶液を用いた。測定条件は、検出波長を２７０ｎｍとし、流速を１ｍＬ／分とした。ＨＰＬＣ分析に供するサンプルは、不溶物を除くため、ＭＵＬＴＩ ＳＣＲＥＥＮ ＭＮＨＶ４５（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、０．４５μｍデュラポア膜）にてフィルターろ過により前処理した。濃度検定は、２，６−Ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｌｉｃ ａｃｉｄ：ＤＰＡ，９９％（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いて作成した検量線に基づいて行った。

Claims (8)

1. 枯草菌変異株であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有し、
   ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現が強化されており、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている、枯草菌変異株。
2. ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失したゲノムを有する、請求項１記載の枯草菌変異株。
3. 前記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、下記（i）及び（ii）に記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１又は２項記載の枯草菌変異株：
   （i）下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
   （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ii）下記（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
   （ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｌ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｍ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｎ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｏ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
4. 前記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項記載の枯草菌変異株。
5. 枯草菌変異株の製造方法であって、
   ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域からなる群より選択される１以上の領域が欠失したゲノムを有する枯草菌変異株において、
   ジピコリン酸シンターゼ遺伝子の発現を強化し、且つホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子を欠失又は不活性化することを含む、方法。
6. 前記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、下記（i）及び（ii）に記載の遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５記載の方法：
   （i）下記（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＡ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
   （ａ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｃ）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（ii）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ii）下記（ｊ）〜（ｏ）からなる群より選択される少なくとも１つの枯草菌ジピコリン酸シンターゼ・サブユニットＢ遺伝子又はこれに相当する遺伝子：
   （ｊ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｋ）配列番号３に示すヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｌ）配列番号３に示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｍ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｎ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
   （ｏ）配列番号４に示すアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ（i）に記載の遺伝子がコードするタンパク質の存在下でジピコリン酸シンターゼ活性を発揮するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
7. 前記ジピコリン酸シンターゼ遺伝子が、枯草菌ｓｐｏＶＦＡ遺伝子及び枯草菌ｓｐｏＶＦＢ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項５〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 請求項１〜４のいずれか１項記載の枯草菌変異株を用いるジピコリン酸又はその塩の製造方法。