JP2022522758A - Ｌ－トレオニン生産能が強化された微生物及びそれを用いたトレオニン生産方法 - Google Patents

Ｌ－トレオニン生産能が強化された微生物及びそれを用いたトレオニン生産方法 Download PDF

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Abstract

本出願は、Ｌ－トレオニン生産能が強化された微生物及びそれを用いたトレオニン生産方法に関する。

Description

本出願は、Ｌ－トレオニン生産能が強化された微生物及びそれを用いたトレオニン生産方法に関する。
トレオニンは、必須アミノ酸の一種であり、飼料、食品添加剤及び動物成長促進剤として広く用いられており、医薬用に輸液剤、医薬品の合成原料としても用いられている。微生物を用いたトレオニン生産方法において、収率を向上させるためにトレオニン生合成遺伝子（ｅｘ．ｐｐｃ，ａｓｐＣ，ｔｈｒＡＢＣ）を強化すると共にトレオニン分解経路を遮断する方法が知られている（非特許文献１）。トレオニン分解経路の遺伝子としては、ｔｄｈ、ｔｄｃＢ、ｇｌｙＡ、ｉｌｖＡなどが挙げられるが、それらのうちｉｌｖＡ（トレオニンデアミナーゼ，Threonine deaminase）が最も主要なトレオニン分解遺伝子として知られている。分解遺伝子のうちｉｌｖＡ遺伝子が欠損すると、トレオニンの収率は大幅に向上するが、高価なイソロイシン（isoleucine）に対する要求が生じるという問題があるので、一般にはｉｌｖＡの活性弱化及びｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅに対する高感受性変異が用いられている（Akhverdian Valery Z, et al.）。
一方、トレオニンとグリシンの関係については、グリシン合成に関与するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの主な前駆体はセリンであり、酵素活性は、トレオニンを前駆体として用いるものより、セリンを用いるものの方が２４倍高い（非特許文献２）ことが知られている。しかし、グリシン取り込みとトレオニン生産能については開示されていない。
韓国登録特許第１０－０６２００９２号公報 国際公開第２００６／０６５０９５号 国際公開第２００９／０９６６８９号 韓国登録特許第１０－０９２４０６５号公報 韓国登録特許第１０－１９４７９５９号公報 韓国登録特許第１０－１１２６０４１号公報 韓国登録特許第１０－１３３５８５３号公報
Kwang-Ho Lee, et al., Molecular System Biology 2007 Simic et al., Appl Environ Microbiol. 2002 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60: 874-879 Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980) Uhlman及びPeyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990) J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) Methods Enzymol., 183, 63, 1990 http://www.ncbi.nlm.nih.gov John E. Cronan, Microbiology and Molecular Biology Reviews., 13 April 2016 Journal of Biotechnology 104, 5-25 Jorn Kalinowski et al, 2003 Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991 Microbiology, 141(Pt 1); 133-40, 1995
本発明者らは、細胞外に放出されたグリシンを取り込んで用いることのできる微生物を開発するために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシントランスポーターｃｙｃＡを導入することにより、高い収率でＬ－トレオニンを生産する菌株を完成した。
本出願は、グリシントランスポーター活性が強化された、Ｌ－トレオニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本出願は、本出願の微生物を含むＬ－トレオニン生産用組成物を提供する。
本出願は、本出願の微生物を培養するステップを含むＬ－トレオニン製造方法を提供する。
本出願は、グリシントランスポーター活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－トレオニン生産における使用を提供する。
本出願のＬ－トレオニン生産用微生物は、優れたトレオニン生産能を有するので、効率的なＬ－トレオニンの大量生産に活用することができる。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
本出願の一態様は、グリシントランスポーター活性が強化された、Ｌ－トレオニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本出願における「グリシントランスポーター（glycine transporter）」は、細胞内にグリシンを取り込む機能を有するタンパク質であればいかなるものでもよく、具体的にはＤ－セリン／Ｄ－アラニン／グリシントランスポーター（D-serine/D-alanine/glycine transporter）である。前記グリシントランスポーターは、Ｄ－セリン／Ｄ－アラニン／グリシントランスポーター又はグリシン取り込みタンパク質と混用される。
前記「Ｄ－セリン／Ｄ－アラニン／グリシントランスポーター（D-serine/D-alanine/glycine transporter）」は、セリン、アラニン及びグリシン輸送の全てに関与するタンパク質であり、公知のデータベースであるＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋなどでＤ－Ｓｅｒｉｎｅ／Ｄ－Ａｌａｎｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ配列を検索すればその情報が得られる。前記トランスポーターは、具体的にはＣｙｃＡ、ＡａｐＡであり、より具体的にはＣｙｃＡタンパク質であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「ＣｙｃＡタンパク質」とは、セリン、アラニン及びグリシン取り込み（uptake）に関与するタンパク質を意味する。ＣｙｃＡタンパク質は、ｃｙｃＡ遺伝子によりコードされ、ｃｙｃＡ遺伝子は、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）などの微生物に存在することが知られている。
本出願の目的上、本出願のＣｙｃＡタンパク質は、トレオニン生産能を強化することができるものであればいかなるものでもよい。具体的には、前記ＣｙｃＡタンパク質はコリネバクテリウム属微生物由来のものであり、より具体的にはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のものであるが、これらに限定されるものではない。前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）は、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）と同種であり、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、ブレビバクテリウム・スタティオニス（Brevibacterium stationis）と同一分類群（taxon）に分類されている（非特許文献３）。また、前記ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスはコリネバクテリウム・スタティオニスともいう。
よって、本出願において、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・スタティオニス、ブレビバクテリウム・スタティオニスは混用されてもよい。
本出願のＣｙｃＡタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むものであってもよく、それと７０％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
具体的には、前記ＣｙｃＡタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、前記相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
さらに、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリペプチドをコードする塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、セリン、アラニン及びグリシン取り込み活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよい。
すなわち、本出願において「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはポリペプチド」又は「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。
本出願における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を包括する意味で用いられ、ポリヌクレオチドにおける基本構成単位であるヌクレオチドには、天然ヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形したアナログも含まれる（非特許文献４、５参照）。
前記ポリヌクレオチドは、本出願のＣｙｃＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよく、本出願のＣｙｃＡタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又は同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、例えば配列番号１６又は配列番号１６と７０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１７又は配列番号１７のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
また、コドンの縮退（codon degeneracy）により、配列番号１６もしくは配列番号１６と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、又はそれと相同性もしくは同一性を有するタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。あるいは、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイドリダイズすることにより、配列番号１６のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献６、７）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性の高い遺伝子同士、７０％以上、８０％以上、具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、一層具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似するポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
前記ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の相同性又は同一性は、例えば文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献８］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献９）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸというプログラムが開発されている（参照：非特許文献１０）。また、任意のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献６、７）で決定されてもよい。
本出願における「タンパク質の活性強化」とは、微生物が有するタンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記活性強化は、外来タンパク質の導入と、内在性タンパク質の活性強化の両方を含むものである。すなわち、特定タンパク質の内在性活性のある微生物に外来タンパク質を導入することや、内在性活性のない微生物に前記タンパク質を導入することも含まれる。前記「タンパク質の導入」とは、特定タンパク質の活性が微生物内に導入されて発現するように改変することを意味する。これを当該タンパク質の活性強化ともいう。
本出願における「内在性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた状態を意味する。
本出願における活性強化は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変、３）前記タンパク質の活性を強化する染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、又は５）それらの組み合わせにより強化する改変などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞に導入されることより行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞内に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行われる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターが連結され、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター（特許文献１及び２）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献３）、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うことができる。
さらに、４）外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド、又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行うことができる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。また、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、導入された前記外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化して宿主細胞に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、タンパク質が産生されてその活性が増加してもよい。
最後に、５）前記１）～４）の組み合わせにより強化する改変は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現を増加させる発現調節配列の改変、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの改変の少なくとも１つの方法を共に適用することにより行うことができる。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
本出願のベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的にはｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本出願における「作動可能に連結」されたものとは、本願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「Ｌ－トレオニンを生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、自然にＬ－トレオニン生産能を有する微生物、又はＬ－トレオニン生産能のない親株にＬ－トレオニン生産能が付与された微生物を意味する。外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするＬ－トレオニン生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物であってもよい。
例えば、前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、グリシントランスポーター活性が強化された微生物であってもよい。あるいは、それに加えて、トレオニン生合成経路における酵素のフィードバック阻害を解除するか、トレオニン生合成経路に関与する酵素を強化又は抑制することにより、トレオニンを生産する微生物であってもよい。あるいは、トレオニン生合成に影響を及ぼさない酵素又はタンパク質の活性を不活性化し、トレオニン生合成経路への代謝を円滑にすることにより、トレオニンを生産する微生物であってもよい。あるいは、トレオニン生合成経路における中間体、補因子、又はエネルギー源を消費する経路におけるタンパク質もしくは酵素の活性を不活性化した微生物であってもよい。
より具体的には、ｌｙｓＣ（aspartate kinase）、ｈｏｍ（homoserine dehydrogenase）ポリペプチドを変異させてトレオニン生合成経路のフィードバック阻害を解除するか、トレオニン生産増加に関与するタンパク質の発現を強化するか、トレオニン分解経路の酵素を不活性化した微生物であってもよい。
しかし、これらの例に限定されるものではなく、様々な公知のＬ－トレオニン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるか、分解経路の酵素を不活性化した微生物であってもよい。前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物は、公知の様々な方法を用いて製造することができる。
本出願における「タンパク質活性の不活性化」とは、酵素又はタンパク質の発現が天然の野生型菌株、親株、又は当該タンパク質が改変されていない菌株に比べて全く発現しないことや、発現してもその活性がなくなるか、減少することを意味する。ここで、前記減少は、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異、発現調節配列の改変、遺伝子の一部又は全部の欠損などによりタンパク質の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性より減少した場合や、それをコードする遺伝子の発現阻害、翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的なタンパク質の活性の程度が天然の菌株又は改変前の菌株より低下した場合や、それらの組み合わせを含む概念である。本出願における前記不活性化は、当該分野で公知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、１）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、２）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変する方法、３）前記タンパク質の活性が欠失又は弱化するようにタンパク質をコードする前記遺伝子配列を改変する方法、４）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、５）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、６）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering, RTE）などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
本出願の目的上、本出願の微生物は、前記グリシントランスポーターをはじめとする、Ｌ－トレオニンを生産する微生物であればいかなるものでもよい。
本出願における前記「Ｌ－トレオニンを生産する微生物」は、「Ｌ－トレオニンを生産できる微生物」、「Ｌ－トレオニン生産能を有する微生物」、「Ｌ－トレオニン生産用微生物」と混用されてもよい。
本出願のトレオニンを生産する微生物は、グリシン分解タンパク質の活性がさらに強化されたものであってもよい。前記「トレオニンを生産する微生物」、「タンパク質の活性強化」については前述した通りである。
本出願における「グリシン分解タンパク質」は、グリシン分解経路に直接又は間接的に関与するタンパク質であり、「グリシン開裂系（glycine cleavage system; GCV）」を構成する各タンパク質もしくは前記タンパク質の複合体（complex）、又は前記グリシン開裂系自体を意味するものとして用いられる。
具体的には、前記グリシン分解タンパク質は、グリシン開裂系を構成するＴ－タンパク質（ＧｃｖＴ）、Ｐ－タンパク質（ＧｃｖＰ）、Ｌ－タンパク質（ＧｃｖＬ）、Ｈ－タンパク質（ＧｃｖＨ）及び前記グリシン開裂系の補酵素であるＬｉｐＢ、ＬｉｐＡからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない（非特許文献１１）。前記グリシン分解タンパク質は、コリネバクテリウム属微生物由来のもの、具体的にはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のものであるが、これらに限定されるものではない。前記ＧｃｖＰタンパク質は配列番号３８、ＧｃｖＴタンパク質は配列番号３９、ＧｃｖＨタンパク質は配列番号４０、ＬｉｐＡタンパク質は配列番号４１、ＬｉｐＢタンパク質は配列番号４２のアミノ酸配列を含むタンパク質であるか、前記タンパク質とそれぞれ７０％以上の相同性又は同一性を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記ＧｃｖＰタンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記相同性又は同一性については、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＬｉｐＡ、ＬｉｐＢにおいても同様である。また、前記相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
さらに、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリペプチドをコードする塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、グリシン分解活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよい。
前記相同性又は同一性については前述した通りである。
本出願における「Ｌ－トレオニンを生産するコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）微生物」とは、Ｌ－トレオニンを生産する微生物であって、コリネバクテリウム属に属する微生物を意味する。前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物については前述した通りである。具体的には、本出願におけるＬ－トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、本出願のグリシントランスポーターの活性が強化されるか、又は前記グリシントランスポーターをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上したＬ－トレオニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。また、それに加えて、グリシン分解タンパク質の活性が強化されるか、又は前記グリシン分解タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上したＬ－トレオニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。前記「向上したＬ－トレオニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」とは、形質転換前の親株又は非改変微生物に比べてＬ－トレオニン生産能が向上した微生物を意味する。前記「非改変微生物」とは、天然のコリネバクテリウム属菌株自体、前記グリシントランスポーターをコードする遺伝子を含まない微生物、又は前記グリシントランスポーターをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」は、コリネバクテリウム属微生物であればいかなるものでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムである。
本出願の他の態様は、本出願のＬ－トレオニン生産用微生物を含むＬ－トレオニン生産用組成物を提供する。
前記Ｌ－トレオニン生産用組成物とは、本出願のＬ－トレオニンを生産する微生物によりＬ－トレオニンを生産する組成物を意味する。前記組成物は、前記Ｌ－トレオニンを生産する微生物を含み、前記菌株を用いてトレオニンを生産することができるさらなる構成であればいかなるものでもよい。前記トレオニンを生産することができるさらなる構成は、例えば発酵用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤、又は培地の構成成分をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、前記微生物を培養するステップを含むＬ－トレオニン製造方法を提供する。
本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、具体的には好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性又は嫌気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、糖アルコール、グリセリンなどのアルコール、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
それ以外に、前記培地は、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを含有してもよい。前記培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができるが、これらに限定されるものではない。
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に好適な方法で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよい。
培養物の温度は、２５℃～４０℃、より具体的には２８℃～３７℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１時間～１００時間であるが、これに限定されるものではない。
前記Ｌ－トレオニン製造方法は、前記培養ステップの後に、前記微生物、前記培地、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び前記微生物の破砕物から選択される少なくとも１つの物質からＬ－トレオニンを回収するステップを含んでもよい。
前記回収ステップは、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて培養液から標的物質であるＬ－トレオニンを回収することができる。例えば、前記Ｌ－トレオニンの回収には、沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、結晶化などの方法が用いられる。一例として、培養物を低速で遠心分離することによりバイオマスを除去し、得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができるが、これに限定されるものではない。
前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。
本出願のさらに他の態様は、グリシントランスポーター活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－トレオニン生産における使用を提供する。
前記「グリシントランスポーター（glycine transporter）」、「活性強化」又は「コリネバクテリウム属微生物」については前述した通りである。
以下、実施例及び実験例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
野生型コリネバクテリウム属微生物を用いたＬ－トレオニン生産菌株の作製
実施例１－１：Ｌ－トレオニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物菌株の作製
野生種コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－トレオニン生産菌株を開発した。具体的には、トレオニン生合成経路において最初の重要な酵素として作用するａｓｐａｒｔａｔｅｋｉｎａｓｅ（ｌｙｓＣ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解除するために、ｌｙｓＣの３７７番目のアミノ酸であるロイシン（Leucine）をリシン（Lysine）に置換した菌株を作製し（配列番号１）、その菌株に基づいて、トレオニン生合成経路において重要なｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ｈｏｍ）のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解除するために、ｈｏｍの３９８番目のアミノ酸であるアルギニン（Arginine）をグルタミン（Glutamine）に置換してトレオニン生産菌株を作製した（配列番号６）。
実施例１－１－１：ｌｙｓＣ変異の導入
具体的には、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号２及び配列番号３、又は配列番号４及び配列番号５のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｌｙｓＣ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の５１５ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の５３８ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号２及び配列番号５のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、３７７番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするｌｙｓＣ遺伝子の変異を含む１０２３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺ（特許文献４）ベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｌｙｓＣ（Ｌ３７７Ｋ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｌ３７７Ｋを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各塩基変異が変異型塩基に置換された菌株が得られた。これをＣＪＰ１と命名した。
実施例１－１－２：ｈｏｍ変異の導入
ＣＪＰ１菌株をベースとしてｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）変異を導入した菌株を作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号７及び配列番号８、又は配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｈｏｍ遺伝子の変異を中心に、５’末端上流の６６８ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の６５９ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号７及び配列番号１０のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、３９８番目のアルギニンがグルタミンに置換されたｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ変異体をコードするｈｏｍ遺伝子の変異を含む１３２７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｈｏｍ（Ｒ３９８Ｑ）変異を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ－Ｒ３９８Ｑを作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションにより、前述したように得られたコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＰ１に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上で各変異型塩基に置換された菌株が得られた。この菌株をＣＪＰ１－Ｒ３９８Ｑと命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２１２０Ｐとして国際寄託した（特許文献５）。
実施例１－２：Ｄ－ａｌａｎｉｎｅ／Ｄ－ｓｅｒｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子を導入したＬ－トレオニン生産菌株の作製
実施例１－１で作製した微生物においてコリネバクテリウム・グルタミカム染色体内にＤ－ａｌａｎｉｎｅ／Ｄ－ｓｅｒｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子を挿入するための実験を行った。
実施例１－２－１：コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシントランスポーター（ＣｙｃＡ（Ｃａｍ））導入菌株の作製
グリシントランスポータータンパク質をコードする遺伝子ｃｙｃＡを挿入するために、トランスポゾン（Transposon）をコードするＮｃｇｌ２１３１遺伝子を挿入サイトとして用いた（特許文献６、非特許文献１２の方法を利用）（配列番号１１）。トランスポゾン挿入用ベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号１２及び配列番号１３、又は配列番号１４及び配列番号１５のプライマーを用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれＮｃｇｌ２１３１遺伝子から５’末端上流の２０４１ｂｐのＤＮＡ断片と、３’末端下流の２０４０ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、配列番号１２及び配列番号１５のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の重合を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、中心部位にＳｐｅＩとＸｈｏＩの２つの制限酵素の認識部位を含む４０６６ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクターと、前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｎｃｇｌ２１３１遺伝子の位置への挿入用ベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１を作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションにより、実施例１－１で得られたＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でＮｃｇｌ２１３１遺伝子が欠損した菌株が得られた。これをＫＣＣＭ１２１２０Ｐ－Ｎ２１３１と命名した。
一方、Ｄ－ａｌａｎｉｎｅ／Ｄ－ｓｅｒｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ活性を有する遺伝子断片を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、配列番号１８及び配列番号１９のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１５９５ｂｐのｃｙｃＡ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号１７）。
公知のコリネバクテリウム属微生物由来のプロモーターｃｊ７を含むｐ１１７－ｃｊ７－ｇｆｐを鋳型とし、ＰＣＲを行った（特許文献１）。ここで、「ｐ１１７」は、大腸菌－コリネバクテリウムシャトルベクター（E. coli-Corynebacterium shuttle vector）であるｐＥＣＣＧ１１７（非特許文献１３）を示すものである。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で３分間の重合反応を行うものとした。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて、増幅されたＰＣＲ結果物を精製すると、３５０ｂｐのサイズのｃｊ７断片が得られた（配列番号２０）。
前述したように得られたｃｊ７断片とｃｙｃＡ断片を鋳型とし、配列番号２１及び配列番号１９のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１９４５ｂｐのｃｊ７－ｃｙｃＡ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、前述したように作製したｐＤＺ－Ｎ２１３１ベクターを制限酵素ｘｈｏＩで処理し、６５℃で２０分間熱処理し、その後得られたｃｊ７－ｃｙｃＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｎｃｇｌ２１３１の位置にｃｙｃＡ遺伝子を挿入することのできるベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）を作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でＮｃｇｌ２１３１の位置がｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）の形態に置換された菌株が得られた。これをＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）と命名した。
実施例１－２－２：大腸菌由来グリシントランスポーター（ＣｙｃＡ（Ｅｃｏ））導入菌株の作製
一方、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡ遺伝子とその活性を比較するために、既に公知の大腸菌Ｋ－１２由来のｃｙｃＡ遺伝子を前述したものと同様にＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に導入した（非特許文献１４）。具体的には、大腸菌Ｋ－１２Ｗ３１１０染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２５及び配列番号２６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１５４４ｂｐのｃｙｃＡ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号２３）。
前述したように得られたｃｊ７断片とｃｙｃＡ断片を鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２６のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１８９４ｂｐのｃｊ７－ｃｙｃＡ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、前述したように作製したｐＤＺ－Ｎ２１３１ベクターを制限酵素ｘｈｏＩで処理し、６５℃で２０分間熱処理し、その後得られたｃｊ７－ｃｙｃＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｎｃｇｌ２１３１の位置にｃｙｃＡ遺伝子を挿入することのできるベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）を作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でＮｃｇｌ２１３１の位置がｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）の形態に置換された菌株が得られた。これをＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）と命名した。
実施例１－３：ＣｙｃＡを導入した菌株のＬ－トレオニン生産能の評価
実施例１－２で作製した菌株のＬ－トレオニン生産能試験を行った。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前述したように得られた菌株をそれぞれ接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。後述するＬ－トレオニン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃にて２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
Ｌ－トレオニン生産培地（ｐＨ７．２）
グルコース３０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，Ｕｒｅａ ３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ，Ｐｅｐｔｏｎｅ２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，Ｌｅｕｃｉｎｅ４００ｍｇ，ＣａＣＯ３２０ｇ（蒸留水１リットル中）
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、生産された各アミノ酸の生産量を測定した。その結果を表１に示す。
Figure 2022522758000001
Ｌ－トレオニンの生産量が増加するにつれてＬ－リシンの生産量は減少するのに対して、Ｌ－トレオニン生産量が増加するにつれてＬ－トレオニン生合成経路の副産物であるＬ－イソロイシン（Ｉｌｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）は増加するので、これらの生産量を共に確認した。また、ｃｙｃＡ遺伝子のｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒとしての機能を確認するために、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）の生産量も共に確認した。
表１の結果が示すように、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡ遺伝子を導入したＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、親株であるＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に比べて、Ｌ－トレオニンの生産量が１２．５％増加したのに対して、Ｌ－リシンの生産量は約４％減少した。また、ｃｙｃＡ遺伝子を導入した効果により、グリシンは親株に比べて１８．５％減少し、セリン、バリンは親株に比べてわずかに減少し、アラニンは大幅に減少して培養液から検出されなくなることが確認された。
一方、大腸菌由来ｃｙｃＡ遺伝子を導入したＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株は、親株に比べてＬ－トレオニンの生産量が１４．９％減少したのに対して、Ｌ－リシンの生産量は６．９％、グリシンの生産量は約１０％増加する結果が確認された。このように、大腸菌由来ｃｙｃＡ遺伝子とコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡ遺伝子の導入効果は大きく異なるものであったが、共通して培養液中のアラニンの濃度は大幅に減少する様相を示した。また、大腸菌由来ｃｙｃＡを導入したものと、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡを導入したものの両方において、イソロイシン（Ｉｌｅ）の生産量には変化がなかった。
これらの結果から、Ｌ－トレオニン生産においてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡ遺伝子の導入が効果的であることが確認された。
前記ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株をＣＡ０９－０９０２と命名し、これをブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１９年４月１０日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４８４Ｐとして国際寄託した。
実施例１－４：Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍにおける遺伝子を導入したＬ－トレオニン生産菌株の作製
実施例１－４－１：グリシン分解タンパク質導入のためのベクターの作製
前述したように、トレオニン生産能の向上にグリシントランスポーターの活性が影響を及ぼすことが確認されたので、細胞内に取り込まれたグリシンの細胞内利用能をさらに増加させた場合のトレオニン生産能について確認した。具体的には、グリシン開裂系（Glycine Cleavage System, 以下、ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍ）を導入した。コリネバクテリウム・グルタミカム菌株内には、ＧＣＶｓｙｓｔｅｍを構成する６種のタンパク質のうちＬ－タンパク質、ＬｉｐＢ、ＬｉｐＡをコードする遺伝子が知られているだけであり、他の３種のタンパク質をコードする遺伝子については知られていない。よって、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＧＣＶｓｙｓｔｅｍを導入するために、ｇｃｖＰ（配列番号２７）、ｇｃｖＴ（配列番号２８）、ｇｃｖＨ（配列番号２９）、ｌｉｐＡ（配列番号３０）、ｌｉｐＢ（配列番号３１）導入ベクターを作製した。次の実験を行った。ＧｌｙｃｉｎｅＣｌｅａｖａｇｅＳｙｓｔｅｍ（以下、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍ）における遺伝子のうちｇｃｖＰＴ遺伝子断片を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、配列番号３２及び配列番号３３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で５分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、プロモーターを含む４９３６ｂｐのｇｃｖＰＴ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号２７，２８）。
他のｇｃｖ ｓｙｓｔｅｍにおける遺伝子であるｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ遺伝子断片を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、配列番号３４及び配列番号３５のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、プロモーターを含む３３２１ｂｐのｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号２９，３０，３１）。
前述したように得られたｇｃｖＰＴ断片とｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ断片を鋳型とし、配列番号３２及び配列番号３５のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１０分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１２分間の重合反応を行うものとした。その結果、８２５７ｂｐのｇｃｖＰＴＨ－ｌｉｐＢＡ遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、実施例１－２で作製したｐＤＺ－Ｎ２１３１ベクターを制限酵素ｓｐｅＩ及びｘｈｏＩで処理し、その後得られたｇｃｖＰＴＨ－ｌｉｐＢＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｎｃｇｌ２１３１の位置にｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子を挿入することのできるベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｇｃｖＰＴＨ－ｌｉｐＢＡを作製した。
実施例１－４－２：グリシン分解タンパク質導入菌株の作製
実施例１－２で得られたｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ベクターを鋳型とし、配列番号３６及び配列番号３７のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１９４４ｂｐのｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）遺伝子断片が得られた。ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔを用いて増幅産物を精製し、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、前述したように作製したｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｇｃｖＰＴＨ－ｌｉｐＢＡベクターを制限酵素ｘｈｏＩで処理し、６５℃で２０分間熱処理し、その後得られたｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、Ｎｃｇｌ２１３１の位置にＤ－ａｌａｎｉｎｅ／Ｄ－ｓｅｒｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子とｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子を挿入することのできるベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）を作製した。
作製したベクターをエレクトロポレーションによりＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でＮｃｇｌ２１３１の位置がｇｃｖＰＴＨ－ｌｉｐＢＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）の形態に置換された菌株が得られた。これをＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）と命名した。
実施例１－４－３：グリシントランスポーター及びグリシン分解タンパク質導入菌株のトレオニン生産能の評価
実施例１－２及び１－４－２で作製した菌株のＬ－トレオニン生産能試験を行った。前述した種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前述したように得られた菌株をそれぞれ接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。前述したＬ－トレオニン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃にて２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、生産された各アミノ酸の生産量を測定した。その結果を表２に示す。
Figure 2022522758000002
表２の結果が示すように、Ｄ－ａｌａｎｉｎｅ／Ｄ－ｓｅｒｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子とｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子を共に導入したＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、親株であるＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に比べてＬ－トレオニン生産量が２６．７％増加したが、これはｃｙｃＡ遺伝子のみ導入したＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株に比べても１２．７％増加した値である。これらの結果から、ｃｙｃＡ遺伝子を単独で導入したものより、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子と共に導入した菌株のＬ－トレオニン生産量の方が大きく増加することが確認された。
ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株のＬ－リシン生産量は、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐに比べて１３．６％減少し、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株においては、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐに比べて１４．３％減少した。Ｌ－イソロイシン生産量は、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株においてＫＣＣＭ１２１２０Ｐより増加する様相を示したが、これは実施例１－３の結果を考慮すると、Ｌ－トレオニン生産量の増加により生合成経路の副産物であるＬ－イソロイシンが共に増加したものと解釈される。
グリシン生産量は、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株にｃｙｃＡ遺伝子のみ導入したものにおいて１８．５％減少し、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子を共に導入したものにおいて、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株に比べて５１．９％減少した。アラニンは、ｃｙｃＡ遺伝子の導入だけでも大幅に減少し、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍの導入による逆効果はないことが確認された。セリン及びバリン生産量は極少量であるが、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株と、ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株の両方において、親株ＫＣＣＭ１２１２０Ｐに比べて減少することが確認された。
前記ＫＣＣＭ１２１２０Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株をＣＡ０９－０９０５と命名し、これをブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１９年４月１０日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４８５Ｐとして国際寄託した。
これらの結果から、コリネバクテリウム属Ｌ－トレオニン生産菌株をベースとしてコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来Ｄ－ａｌａｎｉｎｅ／Ｄ－ｓｅｒｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ遺伝子であるｃｙｃＡ遺伝子を導入すると、Ｌ－トレオニン生産量が増加することが確認された。また、ｃｙｃＡ遺伝子と共にｇｃｖｓｙｓｔｅｍにおける遺伝子を導入すると、Ｌ－トレオニン生産量が大幅に増加することが確認された。
ｃｙｃＡとＧｌｙｃｉｎｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍを導入したＬ－トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１１２２２ＰのＬ－トレオニン生産能の確認
実施例１と同様に、ＣｙｃＡとｇｃｖ ｓｙｓｔｅｍを従来のトレオニン生産菌株に導入した効果を確認する実験を行った。
実施例２－１：Ｌ－トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株へのＣｙｃＡ導入
実施例１で用いた形質転換ベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１、ｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）をそれぞれＬ－トレオニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２２２Ｐ（特許文献７）菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でＮｃｇｌ２１３１の位置がそれぞれ欠失、ｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）の形態に置換された菌株が得られた。これらをそれぞれＫＣＣＭ１１２２２Ｐ－Ｎ２１３１、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）と命名した。
作製した菌株のＬ－トレオニン生産能試験を行った。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前述したように得られた菌株をそれぞれ接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。後述するＬ－トレオニン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃にて２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
Ｌ－トレオニン生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース１００ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，Ｕｒｅａ ３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ，Ｐｅｐｔｏｎｅ２．５ｇ，ＣＳＬ（Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ），ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ１０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド３０００μｇ，ＣａＣＯ３３０ｇ（蒸留水１リットル中）
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、生産された各アミノ酸の生産量を測定した。その結果を表３に示す。
Figure 2022522758000003
表３に示すように、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、親株であるＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べて、Ｌ－トレオニン生産量が１５．２％増加したのに対して、Ｌ－リシン生産量は１４．９％減少した。グリシンとアラニンは、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べてそれぞれ２１．５％、９８．３％減少する結果となり、実施例１のＫＣＣＭ１２１２０Ｐ菌株ベースでの評価結果と類似の様相が確認された。イソロイシンは、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株においては、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べて約３％減少し、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株においては、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べて約４％増加したので、イソロイシン生産量にｃｙｃＡタンパク質導入が大きな影響を与えないことが確認された。特に、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡ遺伝子を導入した菌株においては、イソロイシン生産量が減少することが確認された。
一方、大腸菌由来ｃｙｃＡ遺伝子を導入したＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株は、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株に比べて、Ｌ－トレオニン生産量が１２．７％減少し、Ｌ－リシン生産量が２０．１％増加した。よって、大腸菌由来ｃｙｃＡ遺伝子は、Ｌ－トレオニン生産増加に効果がないことが確認された。
これらの結果から、トレオニン生産能を有する変異株にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡタンパク質を導入すると、トレオニン生産能が向上することが分かる。
実施例２－２：Ｌ－トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株へのＣｙｃＡ及びｇｃｖ ｓｙｓｔｅｍの導入
実施例１と同様に、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）遺伝子とｇｃｖ ｓｙｓｔｅｍ遺伝子の組み合わせの効果を確認するために、作製したベクターｐＤＺ－Ｎ２１３１／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）をエレクトロポレーションによりＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、Ｎｃｇｌ２１３１の位置がｇｃｖＰＴＨ－ｌｉｐＢＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）の形態に置換された菌株が得られた。これをＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）と命名した。
作製した菌株のＬ－トレオニン生産能試験を行った。前述した種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、前述したように得られた菌株をそれぞれ接種し、その後３０℃にて２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。前述したＬ－トレオニン生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃にて２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて、生産された各アミノ酸の生産量を測定した。その結果を表４に示す。
Figure 2022522758000004
表４の結果が示すように、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、親株であるＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べてＬ－トレオニン生産量が３５．１％増加したが、これはｃｙｃＡ遺伝子のみ導入したＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株に比べても１７．０％増加した値である。これらの結果から、実施例１と同様に、組換えＬ－トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐベースにおいても、ｃｙｃＡ遺伝子を単独で導入したものより、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子と共に導入した菌株のＬ－トレオニン生産量の方が大きく増加することが確認された。
ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株のＬ－リシン生産量は、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べて１４．３％減少したのに対して、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株においては、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べて１５．９％減少した。Ｌ－イソロイシン生産量は、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株において、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べて３．４％増加する様相を示したが、これは実施例２－１の結果を考慮すると、Ｌ－トレオニン生産の増加による付随的な効果であると解釈される。
グリシン生産量は、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株にｃｙｃＡ遺伝子のみ導入したものにおいて２１．２％減少し、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍ遺伝子を共に導入したものにおいて、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株に比べて５６．８％減少した。アラニンは、ｃｙｃＡ遺伝子導入だけでも大幅に減少し、ｇｃｖｓｙｓｔｅｍの導入によりさらに減少し、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株においては測定されなかった。ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ／ｇｃｖ－ｌｉｐ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株におけるセリン及びバリン生産量は、親株ＫＣＣＭ１１２２２Ｐに比べてそれぞれ４３．７％、３１．１％減少することが確認された。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Figure 2022522758000005
Figure 2022522758000006

Claims (12)

  1. グリシントランスポーター活性が強化された、Ｌ－トレオニンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
  2. 前記グリシントランスポーターは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）由来のものである、請求項１に記載の微生物。
  3. 前記グリシントランスポータータンパク質はＣｙｃＡタンパク質である、請求項１に記載の微生物。
  4. 前記タンパク質は、配列番号１６又はそれと９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の微生物。
  5. 前記微生物は、グリシン分解タンパク質の活性がさらに強化されたものである、請求項１に記載の微生物。
  6. 前記グリシン分解タンパク質は、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＬｉｐＢ及びＬｉｐＡからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質である、請求項１に記載の微生物。
  7. 前記グリシン分解タンパク質は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のものである、請求項６に記載の微生物。
  8. 前記ＧｃｖＰは配列番号３８、ＧｃｖＴタンパク質は配列番号３９、ＧｃｖＨは配列番号４０、ＬｉｐＡタンパク質は配列番号４１、ＬｉｐＢタンパク質は配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、又は前記配列番号とそれぞれ９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項６に記載の微生物。
  9. 前記Ｌ－トレオニンを生産するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載の微生物。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の微生物を含むＬ－トレオニン生産用組成物。
  11. 請求項１～９のいずれか一項に記載の微生物を培養するステップと、
    前記微生物又は培地からＬ－トレオニンを回収するステップとを含む、Ｌ－トレオニン製造方法。
  12. グリシントランスポーター活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－トレオニン生産における使用。
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