CN114645051A - 分泌型免疫球蛋白A(sIgA)结合核酸分子、sIgA分析用传感器和sIgA分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分泌型免疫球蛋白A(sIgA)结合核酸分子、sIgA分析用传感器和sIgA分析方法。具体地,本发明提供了一种可用于检测sIgA的新型分子。这种分泌型免疫球蛋白A(sIgA)结合核酸的特征在于它是对sIgA的解离常数为37.7nM以下的核酸分子。例如,该核酸优选包括具有SEQ ID NO.1‑12中任一个的碱基序列的多核苷酸,或具有其部分序列的多核苷酸。本发明的核酸分子可用于检测唾液中的sIgA。
Description
本申请是国际申请日2017年4月20日、国际申请号 PCT/JP2017/015934于2019年3月14日进入中国国家阶段、申请号 201780056678.3、发明名称“分泌型免疫球蛋白A(sIgA)结合核酸分子、 sIgA分析用传感器和sIgA分析方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及sIgA结合核酸分子、sIgA分析用传感器和sIgA分析方法。
背景技术
近年来,从压力可导致疲劳和抑郁的事实来看,压力检查非常重要。然而,问题在于,由于例如人自己可能没有意识到压力或者压力是主观事件,因此检查一个人是否处于压力之下对于其他人来说很难。在这些情况下,对于确立客观地检查压力的方法存在着需求。
已知当人感到压力时,唾液中sIgA的分泌增加。于是,已有试图通过测量唾液中的sIgA来间接评价压力的方法。具体地,已经报告了使用针对作为抗原的sIgA的抗体的ELISA方法(非专利文献1)。
然而,抗体是蛋白质,因而有稳定性的问题。因此,在能够以低成本简易进行的测试方法中,难以使用抗体。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:磯和勅子,“看护师职务中的压力、疲惫和身体健康问题之间的关联:从问卷和免疫指标的检查”,行动医学研究, Vol.10,No.1,25-33页
发明内容
发明要解决的问题
着眼于上述情况,本发明旨在提供可用于检测sIgA的新型分子。
解决问题的手段
本发明提供了分泌型免疫球蛋白A(sIgA)结合核酸分子,其以 37.7nM以下的解离常数与sIgA结合。
本发明还提供了sIgA分析用传感器,其包括本发明的sIgA结合核酸分子。
本发明还提供了sIgA分析方法,所述方法包括使样本和核酸分子彼此接触以检测所述样本中的sIgA的步骤,其中所述核酸分子是本发明的sIgA结合核酸分子,并且
在所述检测步骤中,使所述核酸分子与所述样本中的sIgA结合,并通过检测所述结合来检测所述样本中的sIgA。
发明的效果
本发明的sIgA结合核酸分子可以以上述解离常数与sIgA结合。因而,本发明的sIgA结合核酸分子可以,例如,基于与sIgA结合的有无,以高准确度检测样本中的sIgA。因此,可以说本发明的sIgA结合核酸分子是在例如预防医学、健康管理、感染病诊断、压力诊断等领域中用于检测sIgA的非常有用的工具。
附图说明
[图1A]图1A是显示实施例3中适配体对sIgA的结合能力的图。
[图1B]图1B是显示实施例3中其它适配体对sIgA的结合能力的图。
[图1C]图1C是显示实施例3中其它适配体对sIgA的结合能力的图。
[图1D]图1D是显示实施例3中其它适配体对sIgA的结合能力的图。
[图1E]图1E是显示实施例3中另一种适配体对sIgA的结合能力的图。
[图1F]图1F是显示实施例3中其它适配体对sIgA的结合能力的图。
[图2A]图2A是显示实施例3的适配体与sIgA的结合量的相对值(相对单位)的图。
[图2B]图2B是显示实施例3的其它适配体与sIgA的结合量的相对值(相对单位)的图。
[图2C]图2C是显示实施例3的另一种适配体与sIgA的结合量的相对值(相对单位)的图。
[图2D]图2D是显示实施例3的其它适配体与sIgA的结合量的相对值(相对单位)的图。
[图3]图3是显示实施例3的适配体的结合量的相对值的图。
[图4]图4是显示实施例4中SDS-PAGE结果的照片。
具体实施方式
本发明的sIgA结合核酸分子包含,例如,下述多核苷酸(a)或由其部分序列组成的多核苷酸:
(a)由SEQ ID NO:1至12的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸。
在本发明的sIgA结合核酸分子中,由所述部分序列组成的多核苷酸是,例如,选自下述多核苷酸(a1)、(a2)、(a3)和(a4)的至少一种多核苷酸:
(a1)由SEQ ID NO:13、14和15的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;
(a2)由SEQ ID NO:16和17的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;
(a3)由SEQ ID NO:18和19的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;以及
(a4)由SEQ ID NO:20和21的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸。
本发明的sIgA结合核酸分子可以包含,例如,修饰碱基,所述修饰碱基是被修饰基团修饰的碱基。
在本发明的sIgA结合核酸分子中,所述修饰碱基是,例如,经修饰的嘌呤碱基,所述经修饰的嘌呤碱基是被修饰基团修饰的嘌呤碱基。所述修饰基团优选是腺嘌呤残基。
在本发明的sIgA结合核酸分子中,所述修饰碱基是,例如,经修饰的胸腺嘧啶,所述经修饰的胸腺嘧啶是被修饰基团修饰的胸腺嘧啶碱基。所述修饰基团优选是腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基。
在本发明的sIgA结合核酸分子中,例如,所述多核苷酸可以是 DNA。
在本发明的sIgA分析方法中,例如,所述样本可以是选自唾液、尿液、血浆和血清的至少一种。
以下,具体描述本发明。
(1)sIgA结合核酸分子
如上所述,本发明的sIgA结合核酸分子(以下也简称为“核酸分子”)的特征在于它以37.7nM以下的解离常数与sIgA结合。
如上所述,本发明的核酸分子可以与sIgA结合。本发明的核酸分子可以结合至,例如,构成sIgA的免疫球蛋白的重链、所述免疫球蛋白的轻链、它们两者、两个IgA的桥连部分(J-链)、或与sIgA结合的分泌成分。所述sIgA没有特别限制,所述sIgA可以来源于例如人类或非人类动物。所述非人类动物的例子包括小鼠、大鼠、猴、兔、狗、猫、马、牛和猪。关于人Igα-1链C区的氨基酸序列信息在例如UniProt (http://www.uniprot.org/)以登记号P01876注册。关于人Ig α-2链C区的氨基酸序列信息在例如UniProt(http://www.uniprot.org/)以登记号 P01877注册。
在本发明中,表述“与sIgA结合”(及其语法变体)也称为,例如,“具有对sIgA的结合能力”或“具有对sIgA的结合活性”。例如,本发明的核酸分子与sIgA之间的结合可以通过表面等离子共振(SPR)分析等来确定。所述分析可以,例如,使用ProteON(商品名,BioRad)进行。由于本发明的核酸分子与sIgA结合,因此它可以用于例如检测 sIgA。
本发明的核酸分子以例如37.7nM以下、10nM以下、8nM以下或5nM以下的解离常数与sIgA结合。通过本发明的核酸分子,所述 sIgA的最小可检测浓度为,例如,50nM、20nM或10nM。
本发明的核酸分子可以是,例如,包含下述多核苷酸(a)的核酸分子,其例子在下表1中显示。
(a)由SEQ ID NO:1至12的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;
[表1]
本发明的核酸分子可以是,例如,包含由多核苷酸(a)中任一个的部分序列组成的多核苷酸的核酸分子。
由所述部分序列组成的多核苷酸可以是,例如,选自下述多核苷酸(a1)、(a2)、(a3)和(a4)的至少一种多核苷酸。
(a1)由SEQ ID NO:13、14和15的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;
(a2)由SEQ ID NO:16和17的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;
(a3)由SEQ ID NO:18和19的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸;以及
(a4)由SEQ ID NO:20和21的碱基序列中的任何一个组成的多核苷酸。
所述多核苷酸(a1)定义了SEQ ID NO:5的部分序列的例子。所述多核苷酸(a2)定义了SEQ ID NO:8的部分序列的例子。所述多核苷酸 (a3)定义了SEQ ID NO:11的部分序列的例子。所述多核苷酸(a4)定义了SEQ ID NO:12的部分序列的例子。这些序列在下表2中显示。
[表2]
SEQ ID NO: | 修饰碱基 | 碱基序列 |
13 | NG7 | 5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATC<u>T</u>GC<u>T</u>GA<u>T</u>G<u>TTT</u>G<u>T</u>A<u>TTT</u>CAAA<u>TT</u>AGCCGCAG-3’ |
14 | NG7 | 5’-GCAATCTCCCTAATC<u>T</u>GC<u>T</u>GA<u>T</u>G<u>TTT</u>G<u>T</u>A<u>TTT</u>CAAA<u>TT</u>AGCCGCAG-3’ |
15 | NG7 | 5’-GCAATCTCCCTAATC<u>T</u>GC<u>T</u>GA<u>T</u>G<u>TTT</u>G<u>T</u>A<u>TTT</u>CAAA<u>TT</u>AGC-3’ |
16 | KS9 | 5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCG<u>T</u>A<u>T</u>A<u>T</u>CAAGCAGA<u>T</u>G<u>T</u>G<u>TT</u>CAC<u>TT</u>GGGGAG-3’ |
17 | KS9 | 5’-GCAATCTCCCTAATCG<u>T</u>A<u>T</u>A<u>T</u>CAAGCAGA<u>T</u>G<u>T</u>G<u>TT</u>CAC<u>TT</u>GGGGAG-3’ |
18 | KS9 | 5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATCAAAGA<u>T</u>A<u>T</u>GC<u>T</u>AAGA<u>T</u>AGA<u>T</u>AG<u>TTT</u>GGC<u>TT</u>G-3’ |
19 | KS9 | 5’-GCAATCTCCCTAATCAAAGA<u>T</u>A<u>T</u>GC<u>T</u>AAGA<u>T</u>AGA<u>T</u>AG<u>TTT</u>GGC<u>TT</u>G-3’ |
20 | KS9 | 5’-GGTTTGGACGCAATCTCCCTAATC<u>TTT</u>A<u>T</u>ACG<u>T</u>A<u>T</u>GGAC<u>TT</u>AGGC<u>TTT</u>G<u>TT</u>A<u>T</u>AGAAAC-3’ |
21 | KS9 | 5’-GCAATCTCCCTAATC<u>TTT</u>A<u>T</u>ACG<u>T</u>A<u>T</u>GGAC<u>TT</u>AGGC<u>TTT</u>G<u>TT</u>A<u>T</u>AGAAAC-3’ |
在本发明的结合核酸分子中,所述多核苷酸包括,例如,选自下述多核苷酸(b)至(d)的至少一种多核苷酸:
(b)由通过在多核苷酸(a)的碱基序列的任一个中缺失、替换、插入和/或添加一个或多个碱基而获得的碱基序列组成并与所述sIgA结合的多核苷酸;
(c)由与多核苷酸(a)的碱基序列的任一个具有至少80%序列同一性的碱基序列组成并与所述sIgA结合的多核苷酸;以及
(d)由在严格条件下与多核苷酸(a)的碱基序列的任一个杂交的多核苷酸的互补碱基序列组成并与所述sIgA结合的多核苷酸。
关于所述多核苷酸(b),术语“一个或多个”没有限制,只要例如,它在所述多核苷酸(b)与sIgA结合的范围内即可。所述“一个或多个”碱基的数量是,例如,1至10个、1至7个、1至5个、1至3个、或者1或2个。在本发明中,关于碱基数、序列数等的数值范围公开了例如落入该范围内的所有正整数。也就是说,例如,“1至5个碱基”的描述公开了“1、2、3、4和5个碱基”中的全部(以下同样适用)。
关于所述多核苷酸(c),“序列同一性”没有限制,只要例如,它在所述多核苷酸(c)与sIgA结合的范围内即可。所述序列同一性是,例如,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%。所述序列同一性,例如,可以用分析软件例如BLAST或FASTA使用缺省参数计算(以下同样适用)。
关于所述多核苷酸(d),“与...杂交的多核苷酸”可以是,例如,与所述多核苷酸(a)完全或部分互补并与所述sIgA结合的多核苷酸。所述杂交可以例如,通过各种类型的杂交测定来检测。所述杂交测定没有特别限制,例如,可以采用Sambrook等编辑的“分子克隆:实验室手册第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed)”(Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))中记载的方法等。
关于所述多核苷酸(d),所述“严格条件”可以是例如低严格条件、中等严格条件和高严格条件中的任何一种。“低严格条件”是,例如,使用5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS和50%甲酰胺、在32℃的条件。“中等严格条件”是,例如,使用5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS和50%甲酰胺、在42℃的条件。“高严格条件”是,例如,使用5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5%SDS和50%甲酰胺、在 50℃的条件。本领域技术人员可以通过例如酌情设定诸如温度、盐浓度,探针的浓度和长度、离子强度、时间等条件来设定严格的程度。作为“严格条件”,也可以采用,例如,上述Sambrook等编辑的“分子克隆:实验室手册第二版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed)”(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))中记载的条件等。
所述多核苷酸(a1)至(a4)各自是所述多核苷酸(a)的部分序列。因而,可以说,例如,它们各自定义所述多核苷酸(b)、(c)或(d)的例子。当本发明的核酸分子由多核苷酸(a1)至(a4)组成时,所述多核苷酸(b)至 (d)中所述多核苷酸(a)的碱基序列是所述多核苷酸(a1)至(a4)的相应碱基序列。在所述多核苷酸(b)至(d)的描述中,“多核苷酸(a)的碱基序列的任一个”和“多核苷酸(a)”可以解读为“多核苷酸(a1)的碱基序列的任一个”和“多核苷酸(a1)的任一个”、“多核苷酸(a2)的碱基序列的任一个”和“多核苷酸(a2)的任一个”、“多核苷酸(a3)的碱基序列的任一个”和“多核苷酸(a3)的任一个”、或“多核苷酸(a4)的碱基序列的任一个”和“多核苷酸(a4)的任一个”,并且这些的描述可以通过引用并入“多核苷酸(a)的碱基序列的任一个”和“多核苷酸(a)”中。
在本发明的核酸分子中,所述多核苷酸的结构单元是例如核苷酸残基,其例子包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。如下所述,所述多核苷酸是,例如,由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA或包含脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基的DNA,并且所述多核苷酸还可以包含非核苷酸残基。以下,本发明的sIgA结合核酸分子也被称为例如适配体。
本发明的核酸分子,例如,可以由上述多核苷酸的任一个组成,或者可以包含上述多核苷酸的任一个。在后一种情况下,如下所述,本发明的核酸分子可包含,例如,选自上述多核苷酸的两种以上多核苷酸。所述两种以上多核苷酸可以是具有相同序列或不同序列的多核苷酸。此外,在后一种情况下,本发明的核酸分子还可以包含例如接头和/或附加序列。所述接头是例如存在于多核苷酸之间的序列。所述附加序列是例如添加到末端的序列。
当本发明的核酸分子包含,例如,选自上述多核苷酸的多个多核苷酸时,优选所述多个多核苷酸序列彼此连接形成单链多核苷酸。例如,所述多个多核苷酸序列可以直接彼此连接,或者可以通过接头间接彼此连接。优选所述多核苷酸序列在它们的末端直接或间接地彼此连接。当本发明的核酸分子包含所述多个多核苷酸序列时,所述序列的数量没有特别限制,并且是例如2以上、2至20、2至10、或者2 或3。
所述接头的长度没有特别限制,并且是,例如,1至200碱基长, 1至20碱基长,3至12碱基长、或5至9碱基长。所述接头的结构单元是例如核苷酸残基,其例子包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。所述接头没有特别限制,其例子包括多核苷酸,例如由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA和包含核糖核苷酸残基的DNA。所述接头的具体例子包括聚脱氧胸腺嘧啶(poly[dT])、聚脱氧腺嘌呤(poly[dA])、以及具有由A和T组成的重复序列的poly(dA-dT)。优选地,所述接头是poly(dT)或poly(dA-dT)。
在本发明的核酸分子中,所述多核苷酸优选是单链多核苷酸。例如,优选所述单链多核苷酸通过自退火形成茎结构和环结构。例如,优选所述多核苷酸可以形成茎-环结构、内环结构和/或凸起结构。
本发明的核酸分子可以是例如双链。当所述核酸分子是双链时,例如,一条单链多核苷酸包含所述多核苷酸(a)、其部分序列、或多核苷酸(b)至(d)的任一者,而另一条单链多核苷酸没有限制。所述另一条单链多核苷酸可以是,例如,包含与多核苷酸(a)至(d)的任一者互补的碱基序列的多核苷酸。当本发明的核酸分子是双链时,优选在使用前通过例如变性等将双链解离成单链多核苷酸。此外,所述解离的包含多核苷酸(a)至(d)的任一者的单链多核苷酸,优选形成例如如上所述的茎结构和环结构。
在本发明中,表述“可以形成茎结构和环结构”包括,例如,实际形成茎结构和环结构,以及,即使没有形成茎结构和环结构,也能够取决于条件形成茎结构和环结构。表述“可以形成茎结构和环结构(及其语法变体)”包括,例如,通过实验确认其形成和通过使用计算机等模拟预测其形成这两种情况。
本发明的核酸分子的结构单元是例如核苷酸残基。所述核苷酸残基的例子包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。本发明的核酸分子可以是,例如,仅由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA或包含一个或多个核糖核苷酸残基的DNA。在后一种情况下,“一个或多个”没有特别限制。例如,所述多核苷酸中核糖核苷酸残基的数量是,例如, 1至91个、1至30个、1至15个、1至7个、1至3个、或者1或2 个。
所述多核苷酸可包含天然碱基或修饰碱基作为核苷酸残基中的碱基。所述天然碱基(非人工碱基)没有特别限制,并且可以是,例如,具有嘌呤骨架的嘌呤碱基或具有嘧啶骨架的嘧啶碱基。所述嘌呤碱基没有特别限制,其例子包括腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)。所述嘧啶碱基没有特别限制,其例子包括胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)。其中,胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)是优选的。
当所述多核苷酸包含所述修饰碱基时,所述修饰碱基的位置和数量没有特别限制。当所述多核苷酸(a)的部分序列具有修饰碱基时,例如表1和2的多核苷酸中,下划线的腺嘌呤和胸腺嘧啶的一部分或全部是修饰碱基。当所述下划线的腺嘌呤是修饰碱基时,所述修饰碱基是经修饰的嘌呤碱基,所述经修饰的嘌呤碱基是被修饰基团修饰的嘌呤碱基。当所述下划线的胸腺嘧啶是修饰碱基时,所述修饰碱基是经修饰的胸腺嘧啶,所述经修饰的胸腺嘧啶是被修饰基团修饰的胸腺嘧啶碱基。
所述修饰碱基是例如被修饰基团修饰的碱基。所述待被修饰基团修饰的碱基(以下也简称为“待修饰碱基”)是例如天然碱基。所述天然碱基没有特别限制,可以是例如嘌呤碱基或嘧啶碱基。所述修饰碱基没有特别限制,可以是,例如,经修饰的腺嘌呤、经修饰的鸟嘌呤、经修饰的胞嘧啶、经修饰的胸腺嘧啶、或经修饰的尿嘧啶。
在所述修饰碱基中,所述待修饰碱基可以例如被所述修饰基团直接或间接修饰。在后一种情况下,所述待修饰碱基可以例如经由接头被所述修饰基团修饰。所述接头没有特别限制。
在所述待修饰碱基中,被所述修饰基团修饰的位点没有特别限制。当所述碱基是嘌呤碱基时,所述嘌呤碱基中的修饰位点可以是,例如,嘌呤骨架的7位或8位,优选7位。当所述嘌呤碱基中的修饰位点是嘌呤骨架的7位时,7位的氮原子优选被碳原子取代。当所述碱基是嘧啶碱基时,所述嘧啶碱基中的修饰位点可以是,例如,嘧啶骨架的5- 位或6-位,优选5-位。胸腺嘧啶具有与5-位的碳结合的甲基基团。因此,当所述嘧啶碱基的5-位被修饰时,例如,所述修饰基团可以直接或间接地与5-位的碳结合,或者所述修饰基团可以直接或间接地与5- 位的碳所结合的甲基基团中的碳结合。当所述嘧啶骨架具有与4位的碳结合的“=O”并且5位的碳与“-CH3”或“-H”以外的基团结合时,所述修饰碱基可被称为经修饰的尿嘧啶或经修饰的胸腺嘧啶。
当所述修饰碱基是经修饰的嘌呤碱基时,所述修饰基团优选是腺嘌呤残基。即,所述经修饰的嘌呤碱基是例如被腺嘌呤残基修饰的碱基。在所述待修饰碱基中,被所述腺嘌呤残基修饰的位点(所述腺嘌呤残基与所述待修饰碱基的结合位点)没有特别限制,并且可以是例如与所述腺嘌呤残基的6位碳结合的氨基基团。所述待被腺嘌呤残基修饰的碱基没有特别限制,例如,优选为嘌呤碱基,并优选嘌呤碱基7位的原子被所述腺嘌呤残基修饰。当所述修饰碱基是经修饰的胸腺嘧啶碱基时,所述修饰基团优选是腺嘌呤残基或鸟嘌呤碱基。即,所述修饰碱基是例如被腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基修饰的碱基。在所述待修饰碱基中,待被所述腺嘌呤残基修饰的位点没有特别限制,并且可以是例如与所述腺嘌呤残基的6位碳结合的氨基基团。在所述待修饰碱基中,待被所述鸟嘌呤残基修饰的位点没有特别限制,并且可以是例如与所述鸟嘌呤残基的2位碳结合的氨基基团。待被腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基修饰的碱基没有特别限制,例如,优选为胸腺嘧啶,并优选与胸腺嘧啶的5位碳结合的甲基中的碳被所述腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基修饰。
当所述修饰基团是所述腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基时,优选,例如如下所示,所述待修饰的碱基经由接头被所述修饰基团修饰。
[核苷酸残基]-[接头]-[腺嘌呤残基]
[核苷酸残基]-[接头]-[鸟嘌呤残基]
所述接头没有特别限制,并且例如如下所示,可以由存在于所述核苷酸残基和所述腺嘌呤残基/鸟嘌呤残基之间的各式表示。然而,应注意,所述接头不限于此。在各式中,(CH2)n中的数值“n”为例如1 至10、2至10、或2。
[核苷酸残基]=C-C(=O)-NH-(CH2)n-[腺嘌呤残基]
[核苷酸残基]=C-C(=O)-NH-(CH2)n-[鸟嘌呤残基]
[核苷酸残基]-C=C-C(=O)-NH-(CH2)n-[腺嘌呤残基]
[核苷酸残基]=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-[腺嘌呤残基]
[核苷酸残基]=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-[鸟嘌呤残基]
[核苷酸残基]-C=C-C(=O)-NH-CH2-CH2-[腺嘌呤残基]
在各式中,所述接头的一端[=C]和[-C]例如分别与所述核苷酸残基中待修饰碱基的碳形成双键和单键,而所述接头的另一端[CH2-]例如与腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基中的胺(-NH)结合。
在所述多核苷酸中被所述腺嘌呤残基修饰的腺苷(其中7位氮原子被碳原子取代的嘌呤衍生物)核苷酸残基的具体例子包括由下面化学式 (1)表示的残基(以下也称为“MK4”)。在所述多核苷酸中被所述腺嘌呤残基修饰的胸苷核苷酸残基的具体例子包括由下面化学式(2)表示的残基(以下也称为“KS9”)。在所述多核苷酸中被所述鸟嘌呤残基修饰的胸苷核苷酸残基的具体例子包括由下面化学式(3)表示的残基(以下也称为“NG7”)。然而应注意,本发明不限于此。
在上表1中所示的多核苷酸中,例如,优选下划线的腺嘌呤是核苷酸残基MK4。在上表1和2中所示的多核苷酸中,例如,优选下划线的胸腺嘧啶是核苷酸残基KS9和NG7中的至少一者。在上表1和2 中所示的多核苷酸中,例如,优选由SEQ ID No:5至7和13至15的相应碱基序列组成的多核苷酸中的下划线胸腺嘧啶是核苷酸残基 NG7。在上表1和2中所示的多核苷酸中,例如,优选由SEQ ID No: 8至12和16至21的相应碱基序列组成的多核苷酸中的下划线胸腺嘧啶是核苷酸残基KS9。
当本发明的核酸分子包含腺苷核苷酸残基时,可以使用例如由以下化学式(4)表示的核苷酸三磷酸(以下也称为“MK4单体”)作为单体分子合成所述多核苷酸。当本发明的核酸分子包含胸苷核苷酸残基时,可以使用例如由以下化学式(5)表示的核苷酸三磷酸(以下也称为“KS9 单体”)或由以下化学式(6)表示的核苷酸三磷酸(以下也称为“NG7单体”)作为单体分子合成所述多核苷酸。在所述多核苷酸的合成中,例如,所述单体分子经由磷酸二酯键与另一个核苷酸三磷酸结合。所述 MK4单体和所述NG7单体的制造方法在下文描述。
所述修饰基团的其它例子包括甲基、氟基、氨基、硫基、苄氨基羰基、色氨基羰基和异丁氨基羰基。
所述经修饰的腺嘌呤的具体例子包括7’-脱氮腺嘌呤。所述经修饰的鸟嘌呤的具体例子包括7’-脱氮鸟嘌呤。所述经修饰的胞嘧啶的具体例子包括5’-甲基胞嘧啶(5-Me-dC)。所述经修饰的胸腺嘧啶的具体例子包括5’-苄氨基羰基胸腺嘧啶、5’-色氨基羰基胸腺嘧啶和5’-异丁氨基羰基胸腺嘧啶。所述经修饰的尿嘧啶的具体例子包括5’-苄氨基羰基尿嘧啶(BndU)、5’-色氨基羰基尿嘧啶(TrpdU)和5’-异丁氨基羰基尿嘧啶。以上例示的经修饰的尿嘧啶也可以称为经修饰的胸腺嘧啶。
所述多核苷酸可以,例如,只包含一种类型或两种以上类型的所述修饰碱基。
本发明的核酸分子可以是,例如,经修饰的核苷酸。所述经修饰的核苷酸可以是具有上述修饰碱基的核苷酸、具有通过糖残基修饰获得的修饰糖的核苷酸、或具有所述修饰碱基和所述修饰糖的核苷酸。
所述糖残基没有特别限制,例如,可以是脱氧核糖残基或核糖残基。所述糖残基中的修饰位点没有特别限制,可以是例如所述糖残基的2’位或4’位。可以修饰所述2’位和4’位之一或二者。所述修饰糖中的修饰基团的例子包括甲基、氟基、氨基和硫基。
当所述经修饰的核苷酸残基中的碱基是嘧啶碱基时,优选修饰例如所述糖残基的2’位和/或4’位。所述经修饰的核苷酸残基的具体例子包含其中脱氧核糖残基或核糖残基的2’位被修饰的经修饰的核苷酸残基,例如2’-甲基化-尿嘧啶核苷酸残基、2′-甲基化-胞嘧啶核苷酸残基、 2’-氟化-尿嘧啶核苷酸残基、2’-氟化-胞嘧啶核苷酸残基、2’-胺化-尿嘧啶核苷酸残基、2’-胺化-胞嘧啶核苷酸残基、2’-硫化-尿嘧啶核苷酸残基和2’-硫化-胞嘧啶核苷酸残基。
所述经修饰的核苷酸的数量没有特别限制。例如,所述多核苷酸中所述经修饰的核苷酸的数量是,例如,1至100个、1至90个、1至 80个、或1至70个。此外,在包含所述多核苷酸的全长核酸分子中所述经修饰的核苷酸的数量没有特别限制,并且是例如1至91个、1至78个,或者在上文作为所述多核苷酸中所述经修饰的核苷酸数量例示的数值范围内。
本发明的核酸分子可包含,例如,一个或多个人工核酸单体残基。术语“一个或多个”没有特别限制,并且例如,在多核苷酸中可以是例如1至100个、1至50个、1至30个或1至10个。所述人工核酸单体残基的例子包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)和2’-O,4’-C-乙烯桥连核酸(ENA)。所述单体残基中的核酸,例如,与上述相同。
优选本发明的核酸分子,例如,对核酸酶具有抗性。为了使本发明的核酸分子具有核酸酶抗性,例如,优选本发明的核酸分子包含所述经修饰的核苷酸残基和/或所述人工核酸单体残基。此外,为了使本发明的核酸分子具有核酸酶抗性,本发明的核酸分子可以具有,例如,与其5’末端或3’末端结合的数十kDa的聚乙二醇(PEG)、脱氧胸苷等。
本发明的核酸分子还可以包含,例如,附加序列。优选地,所述附加序列,例如,与所述核酸分子的5’末端和3’末端中的至少一个结合,更优选与3’末端结合。所述附加序列没有特别限制。所述附加序列的长度没有特别限制,例如,为1至200碱基长、1至50碱基长、1至25碱基长或18至24碱基长。所述附加序列的结构单元是例如核苷酸残基,其例子包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。所述附加序列没有特别限制,并且其例子包括多核苷酸,例如由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA和包含核糖核苷酸残基的DNA。所述附加序列的具体例子包括poly(dT)和poly(dA)。
本发明的核酸分子可以,例如,以固定化在载体上的状态使用。例如,优选固定化本发明核酸分子的5’末端或3’末端,更优选3’末端。当本发明的核酸分子被固定化时,例如,可以将所述核酸分子直接或间接固定化在所述载体上。在后一种情况下,例如,优选经由所述附加序列来固定化所述核酸分子。
本发明的核酸分子的制造方法没有特别限制。例如,可以通过已知方法,例如:利用化学合成的核酸合成方法;和基因工程程序,来合成本发明的核酸分子。本发明的核酸分子也可以通过例如所谓的SELEX法获得。在这种情况下,靶标优选是sIgA。
如上所述,本发明的核酸分子表现出对sIgA的结合性。因此,本发明的核酸分子的用途没有特别限制,只要是利用所述核酸分子对 sIgA的结合性的用途即可。本发明的核酸分子可以作为例如抗sIgA抗体的替代物,用于各种方法中。
(2)sIgA分析用传感器
如上所述,本发明的分析用传感器是sIgA分析用传感器,其特征在于它包含本发明的核酸分子。只要求本发明的分析用传感器包含本发明的核酸分子,其它构造没有特别限制。通过使用本发明的分析用传感器,可以通过例如如上所述使所述核酸分子与sIgA结合,来检测 sIgA。
本发明的分析用传感器可以被构造成使得,例如,它还包括载体,并且将所述核酸分子布置在所述载体上。优选地,将所述核酸分子固定化在所述载体上。例如,所述核酸分子在所述载体上的固定化如上所述。本发明的分析用传感器的使用方法没有特别限制,本发明的核酸分子和分析方法的描述可以通过引用并入本发明的分析用传感器的描述中。
(3)分析方法
如上所述,本发明的分析方法是包括以下步骤的方法:使样本和核酸分子彼此接触以检测所述样本中的分泌型免疫球蛋白A(sIgA),其中所述核酸分子是本发明的sIgA结合核酸分子,并且在所述检测步骤中,使所述核酸分子与所述样本中的sIgA结合,并通过检测所述结合来检测所述样本中的sIgA。本发明的分析方法特征在于,它使用本发明的核酸分子,而其它步骤、条件等没有特别限制。在本发明的分析方法中,本发明的sIgA分析用传感器可以用作本发明的核酸分子。
本发明的核酸分子特异性结合sIgA。因此,例如,在本发明中,通过检测sIgA和核酸分子之间的结合来特异性检测样本中的sIgA是可能的。具体而言,例如,由于本发明可以分析样本中sIgA的有无或量,可以说本发明也可以进行sIgA的定性或定量分析。
在本发明中,所述样本没有特别限制。所述样本的例子包括唾液、尿液、血浆和血清。
例如,所述样本可以是液体样本或固体样本。例如,从易于处理的观点来看,所述样本优选是液体样本,因为液体样本可以更容易与所述核酸分子接触。在固体样本的情况下,可以使用例如利用溶剂制备的固体样本的液体混合物、液体提取物、溶液等。所述溶剂没有特别限制,例如,可以是水、生理盐水或缓冲液。
上述检测步骤包括,例如:使所述样本和所述核酸分子彼此接触以使所述核酸分子与所述样本中的sIgA结合的接触步骤;以及检测所述sIgA和所述核酸分子之间的结合的结合检测步骤。所述检测步骤还可以包括,例如,基于在所述结合检测步骤中获得的结果,分析所述样本中sIgA的有无或量的分析步骤。
在所述接触步骤中,使所述样本和所述核酸分子彼此接触的方法没有特别限制。例如,所述样本和所述核酸分子之间的接触优选在液体中实行。所述液体没有特别限制,可以是例如水、生理盐水或缓冲液。
在所述接触步骤中,使所述样本与所述核酸分子之间接触的条件没有特别限制。接触温度是例如,4℃至37℃,或18℃至25℃,接触时间是例如,10分钟至120分钟或30分钟至60分钟。
在所述接触步骤中,所述核酸分子可以是例如固定化在载体上的固定化核酸分子或游离状态的未固定化核酸分子。在后一种情况下,例如,使所述核酸分子在容器内与所述样本接触。从处理性有利的观点来看,所述核酸分子优选是例如固定化核酸分子。所述载体没有特别限制,并且可以是例如基板、珠子或容器。所述容器可以是例如微孔板或试管。所述核酸分子的固定化例如如上所述。
所述结合检测步骤是如上所述,检测样本中的sIgA与所述核酸分子之间的结合的步骤。通过检测sIgA和所述核酸分子之间结合的有无,可以例如分析所述样本中sIgA的有无(定性分析)。此外,通过检测sIgA 和所述核酸分子之间结合的程度(结合量),可以例如分析所述样本中 sIgA的量(定量分析)。
在不能检测到所述sIgA和所述核酸分子之间的结合的情况下,可以判断所述样本中不存在sIgA。在检测到所述结合的情况下,可以判断所述样本中存在sIgA。
所述sIgA和所述核酸分子之间结合的分析方法没有特别限制。例如,可以采用检测物质之间的结合的常规公知方法作为该方法,并且该方法的具体例子包括上述SPR。例如,所述结合的检测可以是所述 sIgA和所述核酸分子的复合物的检测。
(4)检测试剂盒
本发明的检测试剂盒的特征在于,它包含本发明的sIgA结合核酸分子。只要求本发明的检测试剂盒包含本发明的核酸分子,而其它构造并没有限制。通过使用本发明的检测试剂盒,如上所述,例如,可以进行sIgA的检测等。
本发明的检测试剂盒可以,例如,包含本发明的传感器作为本发明的核酸分子。除了本发明的核酸分子之外,本发明的检测试剂盒还可以包含例如任何组分。所述组分的例子包括上述载体、缓冲液和使用说明书。
实施例
接着,下面描述本发明的实施例。然而,应注意,本发明不受以下实施例的限制。除非另有说明,否则实施例中的市售试剂按照其规程使用。
[实施例1]
通过以下合成例制备MK4。
电喷雾离子化质谱(ESI-MS)用质谱仪(API2000,出售商:Applied Biosystems)以正或负离子模式实施。1H NMR光谱用核磁共振仪 (JNM-ECS400,JEOL制造)获得。化学位移表示为内标四甲基硅烷 (Me4Si)的相对值δ(ppm)。离子交换色谱用色谱系统(ECONO系统,Bio-Rad制造)实施。在离子交换色谱中,使用填充有二乙氨基乙基 (DEAE)A-25-Sephadex的玻璃柱(Amershambiosciences 制造)。
(合成例1)MK1的合成
方案1
将AZ6(290mg,9.06×10-4mol)真空干燥并溶于无水DMF(N,N- 二甲基甲酰胺,3mL)中。向该溶液添加HOBt·H2O(1-羟基苯并三唑一水合物,176mg,1.15×10-5mol,1.2eq.)、(六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻,579mg,1.15×10-5mol,1.2eq.)和DIPEA (N,N-二异丙基乙胺,4.6mL,2.72×10-2mol,30eq.),并进一步添加溶于无水DMF(1mL)中的NK1(493mg,9.48×10-4mol,1.1eq.)并搅拌。从所述搅拌开始40分钟后,减压蒸馏除去溶剂,将残渣溶于水中,并通过抽滤回收沉淀物。将滤液通过反相柱色谱法粗纯化,得到MK1。 MK1的物理特性如下所示。
收量:261mg,收率:60%
ESI-MS(正离子模式)m/z,[(M+H)+]的实测值=481.2,计算值=481.2
[(M+Na)+]的实测值=503.1,计算值=503.2
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.22(1H,m),8.11(1H,s),8.10 (1H,s),7.87(1H,s),7.63(1H,d),6.52(1H,q),6.35(1H,d),5.27 (1H,s),3.82(1H,m),2.18(1H,m)
(合成例2)MK2的合成
方案2
将MK1(108mg,2.25×10-4mol)真空干燥,并用氩气(Ar)置换气氛。随后,使MK1和无水DMF之间两次共沸(第一次:40mL,第二次:4mL),并且使MK1和无水MeCN(乙腈)之间三次共沸(第一次:9mL,第二次:5mL,第三次:5mL)。将生成的共沸混合物悬浮在无水磷酸三甲酯(6mL)中,然后向其添加无水三丁胺(130μL,5.44×10-4mol, 2.5eq.)。然后,添加磷酰氯(42μL,4.50×10-4mol,2eq.)并在冰冷却下搅拌。从所述搅拌开始40分钟后,再次添加无水三丁胺(250μL, 1.05×10-3mol,5eq.)和磷酰氯(84μL,4.50×10-4mol,4eq.)并在冰冷却下搅拌1小时。搅拌后,添加冷却的1mol/L TEAB(三乙基碳酸氢铵)缓冲液(5mL),搅拌5分钟,并淬灭。然后,减压蒸馏除溶剂,在乙醚中结晶化,并进行抽滤,得到黄色固体。将所述黄色固体溶于水中,通过阴离子交换色谱法纯化,并冷冻干燥,得到MK2。MK2的物理性质如下所示。
收量:30.0μmol,收率:13.4%
ESI-MS(负离子模式)m/z,[(M-H)-]的实测值=559.1,计算值= 559.2
(合成例3)MK3的合成
方案3
将MK2(30.03μmol)真空干燥,并使MK2和无水吡啶(10mL)之间三次共沸,并将共沸混合物真空干燥过夜。所述干燥后,用Ar置换气氛,并将MK2溶于无水DMF(2mL)和无水TEA(三乙胺,28μL,1.98× 10-4mol,6.6eq.)中。进一步添加咪唑(16mg,14.02×10-4mol,4eq.)、 2,2’-二硫二吡啶(17mg,7.72×10-4mol,1.6eq.)和三苯基膦(20mg, 7.63×10- 4mol,1.6eq.),并在室温下搅拌。从所述搅拌开始6.5小时后,将生成的反应溶液添加到高氯酸钠(39mg,3.19×10-4mol,10eq.) 在无水丙酮(18mL)、无水乙醚(27mL)和无水TEA(2mL)中的溶液,并使其在4℃静置30分钟。将沉淀物用无水乙醚(12mL)滗析5次,然后真空干燥,得到MK3,为粗产物。
理论收量:30.03μmol
(合成例4)MK4的合成
方案4
将MK3(30.03μmol)真空干燥,用Ar置换气氛,然后使MK3和无水吡啶(5mL)之间两次共沸,然后将共沸混合物悬浮在无水 DMF(1mL)中。进一步向所述悬液添加无水正三丁胺(30μL,1.25×10-4 mol,4eq.)和0.5mol/L正三丁胺焦磷酸盐的DMF溶液(310μL,1.53 ×10-4mol,5eq.),然后在室温下搅拌。从所述搅拌开始6.5小时后,添加1mol/L TEAB缓冲液(5mL)并搅拌30分钟,然后减压蒸馏除去溶剂。加水,将水层用乙醚分离两次,通过阴离子交换柱色谱法纯化,并冷冻干燥,得到MK4。MK4的物理性质如下所示。
收量:3.33μmol,收率:11.1%
ESI-MS(负离子模式)m/z,[(M-H)-]的实测值=719.0,计算值= 719.1
[实施例2]
通过以下合成例制备NG7。
电喷雾离子化质谱(ESI-MS)用质谱仪(API2000,出售商:Applied Biosystems)以正或负离子模式实施。1H NMR光谱用核磁共振仪 (JNM-ECS400,JEOL制造)获得。化学位移表示为内标四甲基硅烷 (Me4Si)的相对值δ(ppm)。离子交换色谱用色谱系统(ECONO系统,Bio-Rad制造)实施。在离子交换色谱中,使用填充有二乙氨基乙基 (DEAE)A-25-Sephadex的玻璃柱(Amershambiosciences 制造)。
(合成例1)NH1的合成
方案5
将溶解有二碳酸叔丁酯(5g,22.9mmol,0.2eq.)的CHCl3(20mL) 在搅拌下滴加到溶解有乙二胺(7mL,105mmol,1eq.)的CHCl3(120 mL)中。自所述滴加24小时后,将溶液进行抽滤,减压蒸馏除去溶剂,得到NH1。NH1的物理性质如下所示。
收量:3.573g,收率:97.4%
ESI-MS(正离子模式)m/z,[(M+H)+]的实测值=161.4,计算值= 161.1
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.13(2H,q)2.76(2H,t)1.41(9H, s)
(合成例2)NG1的合成
方案6
用Ar(氩)置换2,6-二氯嘌呤(1000mg,5.29×10-3mol,10eq.)的气氛,将2,6-二氯嘌呤溶解在氢氧化钠水溶液(10.6mL,2.12×10-2mol, 2N)中并在90℃下回流,以进行反应。所述反应后,将温度恢复至室温,对所述溶液进行抽滤。回收所得的过滤物,溶于最少量的水中,将pH调节至3至4,并通过抽滤回收沉淀的过滤物,得到NG1。NG1 的物理性质如下所示。
收量:720mg,收率:79%
ESI-MS(正离子模式)m/z,[(M+H)+]的实测值=171.0,计算值= 171.0
实测值=193.1,计算值[(M+Na)+]=193.0
实测值=209.1,计算值[(M+K)+]=209.0
ESI-MS(负离子模式)m/z,实测值=169.0,计算值[(M-H)-]= 518.0
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(1H,s)
(合成例3)NG2的合成
方案7
将NG1(870mg,5.10×10-3mol)和NH1(3.281g,2.05×10-2mol, 4eq.)各自真空干燥,并用Ar置换NG1和NH1的气氛。将NG1悬浮在甲氧基乙醇(5mL)中,并将NH1溶解在甲氧基乙醇(1mL)中。将得到的NH1溶液转移到含有NG1的回收烧瓶中,然后在130℃下回流,以进行反应。所述反应后,将温度恢复至室温,并减压蒸馏除去溶液中的溶剂。将所述溶液进一步用氯仿再沉淀,并抽滤沉积物,回收滤液,得到NG2。NG2的物理性质如下所示。
收量:1.117mg,收率74%。
ESI-MS(正离子模式)m/z,[(M+H)+]的实测值=171.0,计算值= 171.0,
[(M+Na)+]的实测值=193.1,计算值=193.0,
[(M+K)+]的实测值=209.1,计算值=209.0,
ESI-MS(负离子模式)m/z,[(M-H)-]的实测值=169.0,计算值= 518.0
1HNMR(400MHz,CD3OD)δ7.73(1H,s),3.45(2H,m),3.30(2H, s),1.39(9H,s)
(合成例4)NG3的合成
方案8
将NG2(500mg,1.70×10-3mol)悬浮在甲醇(3mL)中,添加三氟乙酸(15mL)并在室温下搅拌,以进行反应。所述反应后,减压蒸馏除去混合物中的溶剂,悬浮于乙醚中,进行抽滤,并回收过滤物,得到 NG3。NG3的物理性质如下所示。
收量:467mg,收率:89.1%
ESI-MS(正离子模式)m/z,[(M+H)+]的实测值=195.1,计算值= 195.1,
[(M+Na)+]的实测值=217.2,计算值=217.1,
[(M+K)+]的实测值=233.0,计算值=233.1
1HNMR(400MHz,D2O)δ7.83(1H,s),3.55(2H,t),3.11(2H, t)
(合成例5)NG4的合成
方案9
将(E)-5-(2-羧乙烯基)-2’-脱氧尿苷(101mg,3.39×10-4mol)和搅拌棒放入回收烧瓶A。将NG3(171mg,4.12×10-4mol,1.2eq.)和搅拌棒放入回收烧瓶B。然后将回收烧瓶A和B真空干燥。随后,用Ar 置换回收烧瓶A的内部,然后添加HOBt·H2O(68mg,4.44×10-4mol,1.3eq.)和(六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻,229 mg,4.40×10- 4mol,1.3eq.),并将生成的混合物溶于无水DMF(N,N- 二甲基甲酰胺,1mL)。进一步,用Ar置换回收烧瓶B的内部,将NG3 溶于无水dmf(0.5mL)中。将DIPEA(N,N-二异丙基乙胺,回收烧瓶A: 0.79mL,4.51×10-3mol,13.3eq.;回收烧瓶B:0.79mL,4.51×10-3 mol,6.7eq.)添加到每个回收烧瓶A和B,然后,将回收烧瓶B的内容物迅速添加到收烧瓶A中,在室温下搅拌,以进行反应。所述反应后,减压蒸馏除去所述溶液中的溶剂,将生成物悬浮在CDCl3(氘代氯仿)中。将所得的悬液进一步超声处理并过滤。回收所得的过滤物,悬浮在MeOH中,超声处理,然后过滤。回收所得的过滤物,得到NG4。 NG4的物理性质如下所示。
收量:147mg,收率:91%
ESI-MS(正离子模式)m/z,[(M+H)+]的实测值=475.1,计算值= 475.2,
[(M+Na)+]的实测值=497.2,计算值=497.2,
ESI-MS(负离子模式)m/z,[(M-H)-]的实测值=473.1,计算值= 473.2
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(1H,s),8.20(1H,s),7.10 (1H,s),7.05(1H,s),6.13(1H,t),5.25(1H,d),5.16(1H,m),4.09 (1H,m),3.79(1H,m),3.60(2H,m),3.16(2H,d),2.14(2H,m)
(合成例6)NG5的合成
方案10
将NG4(101mg,2.13×10-4mol)真空干燥,然后在Ar气氛下使 NG4和无水吡啶(30mL)之间两次共沸。随后,将共沸混合物悬浮在无水磷酸三甲酯(21mg)中,并在冰浴下向所述悬液添加磷酰氯(400μL, 4.29×10-3mol,20eq.),然后搅拌2.5小时。搅拌后,追加磷酰氯(200 μL,2.15×10-3mol,10eq.),然后搅拌8.5小时。搅拌后,添加冷水(10ml) 淬灭,然后搅拌10分钟。然后添加TEA(三乙胺,2.7mL,1.94×10-2mol, 90eq.),然后搅拌15分钟。然后减压蒸馏除去溶剂,通过乙醚和 MeCN(乙腈)进行结晶化,将得到的晶体过滤,回收黄色沉淀物。将获得的黄色沉淀物溶于水中,通过阴离子交换柱色谱法纯化,并冷冻干燥,得到NG5。NG5的物理性质如下所示。
收量:41.49μmol,收率:19.5%
ESI-MS(负离子模式)m/z,[(M-H)-]的实测值=553.1,计算值= 553.1
(合成例7)NG6的合成
方案11
将NG5(78.65μmol)真空干燥,之后使NG5和无水吡啶(5mL)之间三次共沸,然后将共沸混合物在真空中进一步干燥过夜。干燥后,用Ar置换其气氛,然后将其溶于无水DMF(2mL)和无水TEA(72μL, 5.19×10-4mol,4eq.)中,并进一步添加咪唑(24mg,3.53×10- 4mol, 4eq.)、2,2’-二硫二吡啶(29mg,1.32×10-4mol,1.6eq.)和三苯基膦(36 mg,1.37×10-4mol,1.6eq.)并在室温下搅拌。从所述搅拌开始8小时后,将生成的反应溶液添加到高氯酸钠(97mg,7.92×10-4mol,10eq.) 在无水丙酮(18mL)、无水乙醚(27mL)和无水TEA(2mL)中的溶液,并使其在4℃静置30分钟。将沉淀物用无水乙醚(12mL)滗析5次,然后真空干燥,得到NG6,为粗产物。
理论收量:78.65μmol
(合成例8)NG7的合成
方案12
将真空干燥的NG6(78.65μmol)的气氛用Ar置换,然后使NG6和无水吡啶(5mL)之间两次共沸,并将共沸混合物悬浮在无水DMF(1mL) 中。进一步向所述悬液添加无水正三丁胺(75μL,3.15×10-4mol,4eq.) 和0.5mol/L正三丁胺焦磷酸盐(0.8μL,3.93×10-4mol,5eq.)的DMF 溶液,然后在室温下搅拌。从所述搅拌开始9小时后,添加1mol/L TEAB(三乙基碳酸氢铵)缓冲液(5mL)并搅拌30分钟,然后减压蒸馏除去溶剂。加水,将水层用乙醚分离两次,通过阴离子交换柱色谱法纯化,并冷冻干燥,得到NG7。NG7的物理性质如下所示。
收量:19.55μmol,收率:24.9%
ESI-MS(负离子模式)m/z,[(M-H)-]的实测值=712.9,计算值= 713.1
[实施例3]本实施例通过SPR考查了由SEQ ID NO:1至21表示的每个适配体与sIgA的结合能力和动力学参数。
(1)适配体
合成以下多核苷酸作为实施例的适配体。在SEQ ID NO:1至4 的适配体(以下也称为“MK4适配体”)中,下表3中含有下划线的腺苷的核苷酸残基是由化学式(1)表示的核苷酸残基。在SEQ ID NO:8 至12和16至21的适配体(以下也称为“KS9适配体”)中,下表3中含有下划线的胸腺嘧啶的核苷酸残基是由化学式(2)表示的核苷酸残基。在SEQ ID NO:5至7和13至15的适配体(以下也称为“NG7适配体”)中,下表3中含有下划线的胸腺嘧啶的核苷酸残基是由化学式(3)表示的核苷酸残基。
[表3]
向每个所述MK4适配体的3’末端添加20碱基长的多脱氧胸腺嘧啶(poly[dT])。每个如此获得的添加poly(dT)的适配体如下所述用于 SPR。向每个所述KS9适配体和所述NG7适体的3’末端添加20碱基长的多脱氧腺嘌呤(poly[dA])。每个如此获得的添加poly(dA)的适配体如下所述用于SPR。
(2)样本
市售的人sIgA(IgA(分泌型),人类,MP Biomedicals,LLC-Cappel Products制造,目录号:#55905)在以下试验中用作样本。
(3)通过SPR分析结合能力
使用ProteON XPR 36(BioRad)按照其使用说明书进行结合能力的分析。
首先,作为专门为Proteon设计的传感器芯片,在ProteON XPR 36 中设置链霉亲和素固定化的芯片(商品名:ProteOn NLC传感器芯片, BioRad)。使用超纯水(DDW)将5μmol/L的生物素化poly(dA)注入所述传感器芯片的流动池中,并且使结合进行直至信号强度(RU:共振单位) 达到约900RU。所述生物素化的poly(dA)通过将20碱基长的脱氧腺苷的5’末端生物素化而制备。然后,使用SPR缓冲液以25μL/min的流速将200nmol/L的所述添加poly(dT)的MK4适配体注射到所述芯片的流动池中80秒,并使结合进行直到信号强度达到约800RU。该结果与指示固定化在所述传感器芯片上的适配体量的信号相对应,被称为“适配体固定化测定值(A)”。随后,使用SPR缓冲液以50μL/min的流速注射样本120秒,然后通过使SPR缓冲液在相同条件下流动300秒进行洗涤。所述样本中人sIgA的浓度被设定为400nmol/L。在注射所述样本和用所述SPR缓冲液洗涤的同时进行信号强度测量。以开始注射时为0秒,求出从115秒到125秒的信号强度平均值。该结果与指示所述适配体和蛋白质之间的结合量的信号相对应,被称为“蛋白质结合测定值(B)”。然后,求出将蛋白质结合测定值(B)除以适配体固定化测定值(A)而得到的值(B/A),作为相对值(相对单位)。所述KS9适配体和所述NG7适配体以与上述相同的方式进行测量,不同之处在于通过将20碱基长的脱氧胸苷的5’末端生物素化而制备的生物素化的poly dT用作所述生物素化的poly dA的替代物,并且所述KS9适配体或所述NG7适配体用作所述MK4适配体的替代物。此外,在比较例3-1 和3-2中,以与上述相同的方式测量信号强度,不同之处在于在比较例 3-1中使用未表现出对sIgA的结合性的阴性对照核酸分子(SEQ ID NO: 22)作为所述MK4适配体的替代物,并且在比较例3-2中使用含有 BSA(牛血清白蛋白,SIGMA制造,目录号:#A7906)的样本用作人sIgA 的替代物。
阴性对照核酸分子(N30-0库)
5’-GGTAACGCCCAGTCTAGGTCATTTG-(N)30-GTTACGGGAGCCTG CACTTAATG-3’(SEQ IDNO:22)
图1A至1F显示了各适配体和sIgA之间结合的结果。图1A至1F 是显示所述适配体对sIgA的结合能力的图。在图1中,横轴表示注射样本后经过的时间,纵轴表示结合亲和力的相对单位(RU)。如图1A至 1F所示,所有适配体都与sIgA结合。
然后,图2A至2D显示各自通过将蛋白质结合测定值(B)除以适配体固定化测定值(A)获得的值(B/A),作为相对值(相对单位)的结果。图2A至2D是显示各适配体与sIgA的结合量的相对单位(RU)的图。在图2中,横轴表示适配体的类型,纵轴表示相对值。如图2A至2D所示,在使用BSA的比较例3-2中未发现结合。此外,在使用阴性对照核酸分子的比较例3-1中未发现与sIgA的结合。相反,所有的所述适配体都与sIgA结合。特别地,SEQ ID NO:15和21的核酸分子表现出优异的结合特性。
(4)解离常数的测定
除了各试样中的sIgA浓度为12.5、25、50、100或200nmol/L之外,以与上述第(3)项中所述相同的方式测定结合量的相对值(RU)。然后,基于所述结合量的相对值,计算各个sIgA结合核酸分子和sIgA的解离常数。得到的结果显示在下表4中。如下表4所示,所有适配体的解离常数为37.7nM以下。特别地,发现SEQ ID NO:2、3、9、11、 15、19和21的核酸分子具有8nM以下的解离常数并具有对sIgA的优异结合能力。
[表4]
SEQ ID NO: | 解离常数(Kd(nM)) |
1 | 8.6 |
2 | 7.6 |
3 | 7.6 |
4 | 17.4 |
5 | 11.8 |
6 | 11.6 |
7 | 37.7 |
8 | 10 |
9 | 4.8 |
10 | 30.2 |
11 | 1.3 |
12 | 9 |
14 | 10 |
15 | 2.59 |
17 | 12.9 |
19 | 8 |
21 | 2.1 |
(5)交叉反应性的确定
除了使用SEQ ID NO:3、5和9的适配体,以及含有400nmol/L 的sIgA、人IgG-Fc(比较例3-3,BETHYL制造,目录号:P-80-104)、未标记的人IgG(比较例3-4,BECKMAN COULTER制造,目录号: 731696)、未标记的人IgG-Fc(比较例3-5,BECKMAN COULTER制造,目录号:731703)、或人IgG1κ(比较例3-6,Southern Biotech制造,目录号:0151K-01)的样本用作样本之外,以与上述第(3)项相同的方式测定结合量的相对值。
得到的结果在图3中显示。图3是显示结合量的相对值的图。在图3中,横轴表示样本的类型,纵轴表示结合量的相对值(RU)。如下表3所示,所述适体都不与sIgA以外的免疫球蛋白结合。从这些结果发现,本发明的核酸分子是sIgA特异性的。
[实施例4]
本实施例通过使用磁珠的下拉测定考查了SEQ ID NO:5、9和11 的适配体对sIgA的结合能力。
(1)适配体结合珠
提供SA珠(Invitrogen Corporation,商品名:MyOne-SA C1),其是表面结合有链霉亲和素(SA)的磁珠,并且使SEQ ID NO:5、9或11 的适配体与所述SA珠结合以制备适配体结合珠。更具体地,以下述方式制备所述适配体结合珠。首先,制备与所述适配体100%互补的互补链。另一方面,提供所述适配体的5’区域序列(SEQ ID NO:23, 5’-GGATACCTTAACGCCGCCTATTG-3’),并将其5’末端生物素化以制备生物素化的引物。然后,以互补链为模板使用所述生物素化引物进行PCR扩增,从而合成其5’末端被生物素化的适配体。由所述合成的适配体和所述互补链组成的双链与所述SA珠反应,从而使所述双链中的生物素与所述SA珠中的亲和素结合。随后,通过用NaOH对所述双链和所述SA珠的复合物进行碱处理,将各双链解离以除去所述互补链。通过上述过程,制备所述适配体结合珠,其是所述生物素化适配体经由生物素-亲和素结合而与其结合的SA珠。
(2)样本
在下面描述的实验中,使用5μg的人sIgA或人唾液作为样本。
(3)下拉测定
将所述适配体结合珠(终浓度:10mg/mL)和所述样本(sIgA的最终浓度:50μg/mL,唾液的终浓度:90%)在SB1T缓冲液(40mmol/L HEPES,125mmol/L NaCl,5mmol/L KCl,1mmol/L MgCl2,和0.01%20,pH 7.4)中混合在一起。使该反应溶液在室温下反应30分钟。将所述反应溶液离心以回收所述珠子,并将所述珠子用SB1T缓冲溶液离心洗涤三次。在所述适配体与sIgA结合的情况下,所述珠子经由所述适配体携带与其结合的sIgA。因此,通过将所述珠子混合在SDS 缓冲液中并在95℃下热处理所述SDS缓冲液10分钟,从所述珠子释放sIgA。然后,在热处理后从所述SDS缓冲溶液中除去珠子,并使用 PAGEL(C520L,ATTO Corporation)对所述SDS缓冲溶液进行 SDS-PAGE。使用所述SDS缓冲液作为电泳用缓冲液。所述SDS缓冲液的组成如下:25mmol/L Tris,192mmol/L甘氨酸,和0.1%SDS。
接下来,使用GelCode蓝染试剂(Thermo SCIENTIFIC)对经过 SDS-PAGE后的凝胶进行染色。使用Bench Mark蛋白梯(Invitrogen Corporation)作为分子量标记。此外,作为对照1,以相同的方式进行 SDS-PAGE和检测,不同之处在于使用结合有生物素化引物的SA珠代替所述适配体结合珠。此外,作为对照2,对人sIgA进行SDS-PAGE 和检测。
获得的结果显示在图4中。图4(A)和4(B)是显示关于从所述适配体结合珠释放的蛋白质的SDS-PAGE结果的照片。图4(A)显示了通过使用含有sIgA的样本获得的结果,图4(B)显示了通过使用唾液获得的结果。在图4(A)和4(B)中,分子量显示在照片的左侧,泳道M显示分子量标记(M),泳道1显示当使用结合有SEQ ID NO:5的适配体的适配体结合珠时获得的结果,泳道2显示当使用结合有SEQ ID NO:9 的适配体的适配体结合珠时获得的结果,泳道3显示当使用结合有SEQ ID NO:11的适配体的适配体结合珠时获得的结果,泳道C1显示当使用结合有所述引物的SA珠时获得的结果,以及泳道IgA显示人sIgA 的结果。
从图4(A)和4(B)可以看出,在显示当使用所述适配体结合珠时获得的结果的泳道1至3中,在与泳道IgA中相同的位点观察到条带,显示了当使用sIgA时获得的结果(参见图中箭头所示的条带)。另一方面,当使用所述引物结合珠时,在与使用sIgA时相同的位点未观察到条带。
从这些结果发现,本发明的适配体表现出对人sIgA的结合性。
尽管以上参考实施方式和实施例描述了本发明,但本发明不限于此。在本领域技术人员可以理解的本发明范围内可以进行各种修改。
本申请基于并要求2016年9月15日提交的日本专利申请号 2016-180892的优先权权益,并且该日本专利申请的全部公开内容通过引用整体以并入本文。
工业实用性
本发明的sIgA结合核酸分子可以以上述解离常数与sIgA结合。因而,本发明的sIgA结合核酸分子可以,例如,基于与sIgA结合的有无,以高准确度检测样本中的sIgA。因此,可以说本发明的sIgA结合核酸分子是在例如预防医学、健康管理、感染病诊断、压力诊断等领域中用于检测sIgA的非常有用的工具。
Claims (4)
2.一种分泌型免疫球蛋白A(sIgA)分析用传感器,其包含:根据权利要求1所述的sIgA结合核酸分子。
3.一种用于分析sIgA的sIgA分析方法,所述方法包括使样本和核酸分子彼此接触以检测所述样本中的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的步骤,其中
所述核酸分子是根据权利要求1所述的sIgA结合核酸分子,并且
在所述检测步骤中,使所述核酸分子与所述样本中的sIgA结合,并通过检测所述结合来检测所述样本中的sIgA。
4.根据权利要求3所述的sIgA分析方法,其中所述样本是选自唾液、尿液、血浆和血清的至少一种。
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