ES2249464T3 - Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen sahh. - Google Patents
Secuencias de nucleotidos que codifican para el gen sahh.Info
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Abstract
Cepa DH5amcr/pEC-XK99sahHalex de Escherichia coli depositada como DSM 14316 en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Cultivo de Células y Microorganismos], Braunschweig, Alemania. b) concentración del L-amino ácido en el medio o en las células de las bacterias, y c) aislamiento de dicho amino ácido. 3. Proceso de acuerdo a las Reivindicación 2, donde dicha enzima tiene la secuencia de amino ácidos de la SEQ
Description
Secuencias de nucleótidos que codifican para el
gen sahH.
La invención proporciona un proceso para la
preparación fermentativa de amino ácidos usando bacterias en las
cuales el gen sahH es mejorado.
Los L-amino ácidos, en particular
la L-lisina y la L-metionina, son
usados en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la
industria alimenticia y muy particularmente en la nutrición
animal.
Es conocido que los amino ácidos son preparados
por fermentación a partir de cepas de bacterias coryneform, en
particular la Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran
importancia, el trabajo es constantemente retomado para mejorar el
proceso de preparación. Las mejoras al proceso pueden estar
relacionadas con las medidas de fermentación, tales como, por
ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición
del medio nutriente, tal como, por ejemplo, la concentración de
azúcar durante la fermentación, o el trabajo hasta la conformación
del producto, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico,
o las propiedades de rendimiento intrínsecas del propio
microorganismo.
Métodos de mutagénesis, selección y selección de
mutante son usados para mejorar las propiedades de rendimiento de
estos microorganismos. Las cepas que son resistentes a los
antimetabolitos o que son auxotróficas para los metabolitos de
importancia regulatoria y que producen amino ácidos son obtenidas de
esta forma.
Los métodos de la técnica de ADN recombinante han
sido también empleados durante algunos años para mejorar la clase de
las cepas Corynebacterium que producen
L-amino ácidos, amplificando los genes de
biosíntesis de amino ácidos individuales e investigando el efecto
sobre la producción de amino ácidos.
Los inventores tuvieron el objetivo de
proporcionar nuevas medidas para mejorar la preparación fermentativa
de amino ácidos.
Cuando los L-amino ácidos o los
amino ácidos son mencionados a continuación, significan uno o más
amino ácidos, incluyendo sus sales, seleccionadas del grupo que
consiste de L-asparagina,
L-treonina, L-serina,
L-glutamato, L-glicina,
L-alanina, L-cisteina,
L-valina, L-metionina,
L-isoleucina, L-leucina,
L-tirosina, L-fenilalanina,
L-histidina, L-lisina,
L-triptofano y L-arginina. La
L-lisina y la L-metionina son
particularmente preferidos.
Cuando la L-lisina o la lisina
son mencionados a continuación, significan no sólo las bases sino
también las sales, tales como por ejemplo monohidrocloruro de lisina
o sulfato de lisina.
Cuando la L-metionina o la
metionina son mencionados a continuación, significan también las
sales, tales como por ejemplo hidrocloruro de metionina o sulfato de
metionina.
La invención además se relaciona con un proceso
para la preparación fermentativa de L-lisina usando
bacterias coryneform las cuales en particular ya producen amino
ácidos y en las cuales las secuencias de nucleótidos que codifican
para el gen sahH son mejoradas, en particular
sobre-expresadas.
Los polinucleótidos que comprenden las secuencias
de acuerdo a la invención son apropiados como sondas de hibridación
para el ARN, cADN y ADN, con vistas a aislar, en toda la longitud,
los ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que codifican para la
adenosil homocisteinasa o aislar aquellos ácidos nucleicos o
polinucleótidos o genes que tienen una alta similitud de secuencia
con aquella del gen sahH.
Los polinucleótidos que comprenden las secuencias
de acuerdo a la invención son además apropiados como cebadores con
la ayuda de los cuales el ADN de los genes que codifican para la
adenosil homocisteinasa puede ser preparado mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
Tales oligonucleótidos que sirven como sondas o
cebadores comprenden al menos 30, preferiblemente al menos 20, de
manera muy particular preferiblemente al menos 15 nucleótidos
sucesivos. Los oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos
40 o 50 nucleótidos son también apropiados. Los oligonucleótidos con
una longitud de al menos 100, 150, 200, 250 o 300 nucleótidos son
también opcionalmente apropiados.
"Aislado" significa separado de su medio
natural.
"Polinucleótido" en general se refiere a
polirribonucleótidos y polideoxirribonucleótidos, siendo posible que
estos sean ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado.
Los polinucleótidos de acuerdo a la invención
incluyen un polinucleótido de acuerdo a la SEQ ID No. 1 o un
fragmento preparado a partir de la misma y también aquellos que son
al menos el 70%, preferiblemente al menos 80% y en particular al
menos de 90% al 95% idénticos al polinucleótido de acuerdo a la SEQ
ID No. 1 o un fragmento preparado de la misma.
"Polipéptidos" es entendido como péptidos o
proteínas que comprenden dos o más amino ácidos enlazados por medio
de enlaces peptídicos.
Los polipéptidos de acuerdo a la invención
incluyen un polipéptido de acuerdo a la SEQ ID No. 2, en particular
aquellos con la actividad biológica de la adenosil homocisteinasa, y
también aquellas que son al menos el 70%, preferiblemente al menos
80% y en particular al menos de 90% al 95% idénticos al polipéptido
de acuerdo a la SEQ ID No. 2 y tienen la actividad mencionada.
El término "mejoramiento" en este contexto
describe el incremento en la actividad intracelular de una o más
enzimas (proteínas) en un microorganismo las cuales son codificadas
por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de
copias del gen o los genes, usando un promotor potente o usando un
gen o alelo que codifica para una enzima (proteína) correspondiente
que tiene una alta actividad, y opcionalmente combinando estas
medidas.
Por las medidas de mejoramiento, en particular la
sobre-expresión, la actividad o concentración de la
proteína correspondiente es en general incrementada en al menos 10%,
25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo
de 1000% o 2000%, basado en el microorganismo de partida.
Los microorganismos que proporciona la presente
invención pueden producir L-amino ácidos a partir de
glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón,
celulosa o a partir de glicerol y etanol. Ellos pueden ser
representativos de bacterias coryneform, en particular del género de
la Corynebacterium. Del género de la Corynebacterium,
puede ser mencionada en particular la especie Corynebacterium
glutamicum, la cual es conocida entre los expertos por su
capacidad para producir L-amino ácidos.
Cepas apropiadas del género
Corynebacterium, en particular de la especie
Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), son en
particular las cepas naturales conocidas
- Corynebacterium glutamicum ATCC13032
- Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
- Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
- Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
- Corynebacterium melassecola ATCC17965
- Brevibacterium flavum ATCC14067
- Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y
- Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y mutantes que producen
L-amino ácidos o cepas preparadas a partir de los
mismos.
Para aislar el gen sahH o también otros genes de
C. glutamicum, una biblioteca de genes de este
microorganismo es primero establecida en Escherichia coli
(E. coli). El establecimiento de bibliotecas de genes es
descrito en los libros de textos y manuales generalmente conocidos.
El libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in
die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990), o el
manual de Sambrook y otros: Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) pueden ser mencionados
como un ejemplo. Una biblioteca de genes bien conocida es aquella de
la cepa W3110 K-12 de E. coli establecida en
vectores \lambda por Kohara y otros (Cell 50,
495-508 (1987)). Bathe y otros (Molecular and
General Genetics, 252: 255-265, 1996) describen una
biblioteca de genes de C. glutamicum ATCC13032, la cual fue
establecida con la ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl y
otros, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84:2160-2164) en la cepa NM554 K-12
de E. coli (Raleigh y otros, 1988, Nucleic Acids Research
16:1563-1575).
Börmann y otros (Molecular Microbiology
6(3), 317-326) (1992)) a su vez describen una
biblioteca de genes de C. glutamicum ATCC13032 usando el
cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298
(1980)).
Para preparar una biblioteca de genes de C.
glutamicum en E. coli es también posible usar plásmidos
tales como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25,
807-818 (1979)) o pUC9 (Vieira y otros, 1982, Gene,
19:259-268). Hospederos apropiados son, en
particular, aquellas cepas de E. coli las cuales son
defectivas de restricción y recombinación. Un ejemplo de estas es la
cepa DH5\alphamcr, la cual ha sido descrita por Grant y otros
(Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990)
4645-4649). Los fragmentos largos de ADN clonados
con la ayuda de cósmidos pueden a su vez ser subclonados en los
vectores comunes apropiados para secuenciar y luego secuenciados,
tal como es descrito por ejemplo por Sanger y otros (Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America,
74:5463-5467, 1977).
Las secuencias de ADN resultantes pueden entonces
ser investigadas con algoritmos o programas de análisis de
secuencias conocidos, tales como por ejemplo aquel de Staden
(Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), o
el programa GCG de Butler (Methods of Biochemical análisis 39,
74-97 (1998)).
La nueva secuencia de ADN de C. glutamicum
que codifica para el gen sahH y la cual, como la SEQ ID No. 1, que
es un constituyente de la presente invención ha sido encontrada. La
secuencia de amino ácido de la proteína correspondiente además ha
sido derivada de la presente secuencia de ADN por medio de los
métodos descritos anteriormente. La secuencia de amino ácidos
resultante del producto del gen sahH es mostrada en SEQ ID No.
2.
Las secuencias de ADN que codifican las cuales
resultan de la SEQ ID No. 1 por la degeneración del código genético
son también un constituyente de la invención. De la misma manera,
las secuencias de ADN que hibridan con SEQ ID No. 1 o partes de SEQ
ID No. 1 son un constituyente de la invención. Intercambios de amino
ácidos conservativos, tales como por ejemplo el intercambio de
glicina por alanina o de ácido aspártico por ácido glutámico en
proteínas, son además conocidos entre los expertos como
"mutaciones en el sentido" las cuales no conllevan a un cambio
fundamental en la actividad de la proteína, es decir son de función
neutral. Es además conocido que cambios en el terminal N o C de una
proteína no pueden deteriorar sustancialmente la función de la misma
e incluso pueden estabilizarla. Información en este contexto puede
ser encontrada por el experto, entre otros, en
Ben-Bassat y otros (Journal of Bacteriology
169:751-757 (1987)), en O'Regan y otros (Gene
77:237-251 (1989)), en Sahin-Toth y
otros (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), en
Hochuli y otros (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988))
y en los libros de textos de genética y biología molecular. Las
secuencias de amino ácidos que resultan de una manera
correspondiente a partir de la SEQ ID No. 2 son también un
constituyente de la invención.
De la misma manera, las secuencias de ADN que
hibridan con la SEQ ID No. 1 o partes de la SEQ ID No. 1 son un
constituyente de la invención. Finalmente, las secuencias de ADN que
son preparadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
usando cebadores que resultan de la SEQ ID No. 1 son un
constituyente de la invención. Tales oligonucleótidos típicamente
tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos.
Las instrucciones para identificar las secuencias
de ADN por medio de la hibridación pueden ser encontradas por el
experto, entre otros, en el manual "The DIG System User's Guide
for Filter Hibridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim,
Alemania, 1993) y en Liebl y otros (International Journal of
Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). La
hibridación tiene lugar bajo condiciones astringentes, eso quiere
decir que solamente son formados híbridos en los cuales la sonda y
la secuencia diana, es decir los polinucleótidos tratados con la
sonda, son al menos 70% idénticos. Es conocido que la astringencia
de la hibridación, incluyendo los pasos de lavado, está influenciada
o determinada variando la composición del buffer, la temperatura y
la concentración de la sal. La reacción de hibridación es
preferiblemente llevada a cabo bajo astringencia relativamente baja
comparada con los pasos de lavado (Hybaid Hybridization Guide,
Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Un buffer 5x SSC a una temperatura de
aproximadamente 50ºC - 68ºC, por ejemplo, puede ser empleado para
la reacción de hibridación. Las sondas pueden también hibridarse
aquí con polinucleótidos que son menos del 70% idénticos a la
secuencia de la sonda. Tales híbridos son menos estables y son
removidos por el lavado bajo condiciones astringentes. Esto puede
ser logrado, por ejemplo, disminuyendo la concentración de sal a 2x
SSC y subsecuentemente de manera opcional a 0.5x SSC (The DIG System
User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Alemania, 1995) siendo establecida una temperatura de
aproximadamente 50ºC - 68ºC. Es opcionalmente posible disminuir la
concentración de la sal a 0.1x SSC. Los fragmentos de
polinucleótidos que son, por ejemplo, al menos 70% o al menos 80% o
al menos 90% a 95% idénticos a la secuencia de la sonda empleada
pueden ser aislados incrementando la temperatura de hibridación de
manera escalonada desde 50ºC a 68ºC en pasos de aproximadamente 1 -
2ºC. Instrucciones adicionales sobre la hibridación son obtenibles
en el mercado en forma de los llamados kits (por ejemplo DIG Easy
Hyb de Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Catálogo No.
1603558)
Las instrucciones para la amplificación de las
secuencias de ADN con la ayuda de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) pueden ser encontradas por el experto, entre otros,
en el manual de Gait: Oligonukleotide Synthesis: A Practical
Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y en Newton y Graham: PCR
(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994).
Ha sido encontrado que bacterias coryneform
producen amino ácidos en una manera mejorada después de la
sobre-expresión del gen sahH.
Para lograr una sobre-expresión,
el número de copias de los genes correspondientes puede ser
incrementado, o la región de regulación o del promotor o el sitio de
enlace del ribosoma aguas arriba del gen estructural puede ser
mutado. Casetes de expresión que son incorporados aguas arriba del
gen estructural actúan del mismo modo. Por los promotores
inducibles, es adicionalmente posible incrementar la expresión en el
curso de la producción fermentativa de amino ácidos. La expresión es
de esta forma mejorada por medidas para prolongar la vida del
m-ARN. Además, la actividad de la enzima es también
incrementada previniendo la degradación de la proteína de la enzima.
Los genes o el gen construido pueden tanto estar presentes en
plásmidos con un número de copias variable, o pueden ser integrados
y amplificados en el cromosoma. Alternativamente, una
sobre-expresión de los genes en cuestión puede
además ser lograda cambiando la composición del medio y el
procedimiento de cultivo.
Las instrucciones en este contexto pueden ser
encontradas por el experto, entre otros, en Martin y otros
(Bio/
Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero y otros (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns y otros (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Descripción de la Patente Europea 0 472 869, en la Patente US 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid y otros (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre y otros (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres y otros (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Descripción Japonesa a disposición del público JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en los libros de textos de genética y biología molecular conocidos.
Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero y otros (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns y otros (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Descripción de la Patente Europea 0 472 869, en la Patente US 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid y otros (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre y otros (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres y otros (Gene 134, 15-24 (1993)), en la Descripción Japonesa a disposición del público JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en los libros de textos de genética y biología molecular conocidos.
A modo de ejemplo, para el mejoramiento el gen
sahH de acuerdo a la invención fue sobre-expresado
con la ayuda de plásmidos episomales. Plásmidos adecuados son
aquellos que son replicados en bacterias coryneform. Numerosos
vectores plásmidos conocidos, tales como por ejemplo pZ1 (Menkel y
otros, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:
549-554), pEKEx1 (Eikmanns y otros, Gene
102:93-98 (1991)) o pHS2-1 (Sonnen y
otros, Gene 107:69-74 (1991)) están basados en los
plásmidos crípticos pHM1519, pBL1 o pGA1. Otros vectores plásmidos,
tales como por ejemplo aquellos basados en pCG4
(US-A 4,489,160), o pNG2
(Serwold-Davis y otros, FEMS Microbiology Letters
66, 119-124 (1990)), o pAG1 (US-A
5,158,891), pueden ser usados de la misma manera.
Los vectores plásmidos que son además apropiados
son también aquellos con la ayuda de los cuales el proceso de la
amplificación del gen por integración en el cromosoma puede ser
usado, como ha sido descrito, por ejemplo, por Reinscheid y otros
(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132
(1994)) para la duplicación o la amplificación del operón
hom-thrB. En este método, el gen completo es clonado
en un vector plásmido que puede replicarse en un hospedero
(típicamente E. coli), pero no en C. glutamicum. Posibles
vectores son, por ejemplo, pSUP301 (Simon y otros, Bio/Technology 1,
784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Schäfer y
otros, Gene 145, 69-73 (1994)),
pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA),
pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269:32678-84; US-A
5,487,993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard y
otros, Journal of Molecular Biology, 234: 534-541
(1993)), pEM1 (Schrumpf y otros, 1991, Journal of Bacteriology
173:4510-4516) o pBGS8 (Spratt y otros, 1986, Gene
41: 337-342). El vector plásmido que contiene el gen
a ser amplificado es entonces transferido dentro de la cepa deseada
de C. glutamicum por conjugación o transformación. El método
de conjugación es descrito, por ejemplo, por Schäfer y otros
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759
(1994)). Métodos para la transformación son descritos, por ejemplo,
por Thierbach y otros (Applied Microbiology and Biotechnology 29,
356-362 (1988)), Dunican y Shivnan (Bio/Technology
7, 1067-1070 (1989)) y Tauch y otros (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)).
Después de la recombinación homóloga por medio de un evento de
"cruzamiento", la cepa resultante contiene al menos dos copias
del gen en cuestión.
En adición, puede ser ventajoso para la
producción de L-amino ácidos mejorar, en particular
sobre-expresar, una o más enzimas de la ruta de la
biosíntesis particular, de la glicólisis, de la anaplerosis, del
ciclo del ácido cítrico, del ciclo de la fosfato pentosa, de la
exportación de amino ácidos y de las proteínas regulatorias
opcionalmente, en adición al gen sahH.
Así, para la preparación de
L-amino ácidos, en adición al mejoramiento del gen
sahH, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de
- \bullet
- el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335),
- \bullet
- el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- \bullet
- el gen tip que codifica para la triosa fosfato isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
- \bullet
- el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- \bullet
- el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa (JP-A-09224661),
- \bullet
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa (DE-A-198 31 609),
- \bullet
- el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa (Molenaar y otros, European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
- \bullet
- el gen lysC que codifica para una aspartato quinasa resistente a la regeneración (Acceso No.P26512),
- \bullet
- el gen lysE que codifica para la exportación de lisina (DE-A-195 48 222),
- \bullet
- el gen hom que codifica para la homoserina dehidrogenasa (EP-A 0131171),
- \bullet
- el gen ilvA que codifica para la treonina dehidratasa (Möckel y otros, Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)) o el alelo ilvA(Fbr) que codifica para una treonina dehidratasa "resistente a la regeneración" (Möckel y otros, (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
- \bullet
- el gen ilvBN que codifica para la acetohidroxi-ácido sintasa (EP-B 0356739),
- \bullet
- el gen ilvD que codifica para la dihidroxi-ácido dehidratasa (Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
- \bullet
- el gen zwa1 que codifica para la proteína Zwa1 (DE: 19959328.0, DSM 13115),
pueden ser mejorados, en particular
sobre-expresados.
Puede ser además ventajoso para la producción de
L-amino ácidos, en adición al mejoramiento del gen
sahH, que uno o más genes seleccionados del grupo que consiste
de:
- \bullet
- el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa (DE 199 50 409.1; DSM 13047),
- \bullet
- el gen pgi que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa (US 09/396,478; DSM 12969),
- \bullet
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa (DE: 1995 1975.7; DSM 13114),
- \bullet
- el gen zwa2 que codifica para la proteína Zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113)
sea atenuado, en particular para
que la expresión del mismo sea
reducida.
El término "atenuación" en este contexto
describe la reducción o la eliminación de la actividad intracelular
de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo las cuales son
codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo usando un
promotor débil o usando un gen o alelo que codifica para una enzima
con una baja actividad o inactiva la enzima (proteína) o gen
correspondiente, y opcionalmente combinando estas medidas.
Por medio de las medidas de atenuación, la
actividad o concentración de la proteína correspondiente es en
general reducida de 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% o 0 a 5% de la
actividad o concentración de la proteína natural.
En adición a la sobre-expresión
del gen sahH puede ser ventajoso además para la producción de amino
ácidos eliminar reacciones colaterales indeseadas (Nakayama:
"Reproducción de Microorganismos que Producen Amino Ácidos",
en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982).
La invención también proporciona los
microorganismos preparados de acuerdo a la invención, y estos pueden
ser cultivados continuamente o discontinuamente en el proceso por
lotes (cultivo por lotes) o en el de alimentación por lote (proceso
de alimentación) o procesos por lotes de alimentación repetida
(proceso de alimentación repetitivo) para el propósito de la
producción de amino ácidos. Un resumen de los métodos de cultivo
conocidos son descritos en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a ser usado debe satisfacer
los requisitos de las cepas particulares de una manera apropiada.
Descripciones del medio de cultivo para varios microorganismos están
contenidas en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington
D.C., USA, 1981).
Azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo
glucosa, sucrosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y
celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo aceite de soya,
aceite de girasol, aceite de maní y grasa de coco, ácidos grasos,
tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido
linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo glicerol y etanol, y
ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético, pueden ser
usados como fuente de carbono. Estas sustancias pueden ser usadas
individualmente o como una mezcla.
Compuestos orgánicos que contienen nitrógeno,
tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne,
extracto de malta, licor de maíz fermentado, harina del fríjol de
soya y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato
de amonio, pueden ser usados como la fuente de nitrógeno. Las
fuentes de nitrógeno pueden ser usadas individualmente o como una
mezcla.
Compuestos orgánicos e inorgánicos que contienen
azufre, tales como, por ejemplo, sulfuros, sulfitos, sulfatos y
tiosulfatos, pueden ser usados como una fuente de azufre, en
particular para la preparación de metionina.
El ácido fosfórico, fosfato de dihidrógeno
potasio o fosfato de hidrógeno dipotasio o las sales que contienen
sodio correspondientes pueden ser usadas como la fuente de fósforo.
El medio de cultivo debe además comprender sales de metales, tales
como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, los cuales
son necesarios para el crecimiento. Finalmente, las sustancias de
crecimiento esenciales, tales como amino ácidos y vitaminas, pueden
ser empleadas en adición a las sustancias antes mencionadas.
Precursores adecuados pueden además ser adicionados al medio de
cultivo. Las sustancias de partida mencionadas pueden ser
adicionadas al medio de cultivo en la forma de un lote simple, o
pueden ser alimentadas durante el cultivo en una forma
apropiada.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o amoníaco acuoso, o
compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico,
pueden ser empleados de una manera apropiada para controlar el pH.
Antiespumantes, tales como por ejemplo ésteres de poliglicol de
ácidos grasos, pueden ser empleados para controlar el desarrollo de
la espuma. Sustancias apropiadas que tienen una acción selectiva,
tales como por ejemplo antibióticos, pueden ser adicionados al medio
para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las
condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gases que contienen
oxígeno, tales como por ejemplo aire, son introducidas en el
cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 20ºC a 45ºC, y
preferiblemente de 25ºC a 40ºC. El cultivo es continuado hasta que
un máximo del producto deseado se ha formado. Este objetivo es
usualmente alcanzado en el rango de 10 horas a 160 horas.
Los caldos de fermentación obtenidos de esta
forma, en particular conteniendo L-metionina,
usualmente tienen un peso seco de 7.5 a 25% en peso y contienen
L-metionina. Es además también ventajoso que la
fermentación sea conducida en un procedimiento limitado en azúcar al
menos al final, pero en particular durante al menos el 30% de la
duración de la fermentación. Eso quiere decir, que la concentración
del azúcar utilizable en el medio de fermentación es reducida de
\geq 0 a 3 g/l durante este período.
El caldo de fermentación preparado de esta
manera, en particular conteniendo L-metionina, es
entonces adicionalmente procesado. Dependiendo de los
requerimientos, toda o parte de la biomasa puede ser removida del
caldo de fermentación por métodos de separación, tal como por
ejemplo centrifugación, filtración, decantación o una combinación de
los mismos, o dejarla completamente en él. Este caldo es entonces
espesado o concentrado por métodos conocidos, tal como por ejemplo
con la ayuda de un evaporador rotatorio, evaporador de película
delgada, evaporador de película descendente, por osmosis inversa, o
por nanofiltración. Este caldo de fermentación concentrado puede
entonces ser preparado por métodos de criodesecación, secado por
pulverización, granulación por pulverización o por otros procesos
para dar un polvo finamente dividido, de flujo libre.
Este polvo finamente dividido, de flujo libre
puede entonces a su vez ser convertido por procesos de granulación o
compactación apropiados en un producto de grano grueso, de fácil
flujo libre, almacenable y considerablemente libre de polvo. En la
granulación o la compactación es ventajoso emplear portadores o
sustancias auxiliares inorgánicas u orgánicas convencionales, tal
como almidón, gelatina, derivados de la celulosa o sustancias
similares, tales como son las convencionalmente usadas como
aglutinantes, agentes gelificantes o espesantes en el procesamiento
de productos alimenticios o piensos, o sustancias adicionales, tales
como, por ejemplo, sílices, silicatos o estearatos.
"Flujo libre" se entiende que significa
polvos los cuales fluyen sin dificultad fuera del frasco con la
abertura de 5 mm (milímetros) de una serie de frascos de evacuación
de cristal con aberturas de evacuación de varios tamaños (Klein,
Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).
Como está descrito aquí, "finamente
dividido" significa un polvo con un contenido predominante (>
50%) con un tamaño de partículas de 20 a 200 \mum de diámetro.
"De grano grueso" significa los productos con un contenido
predominante (> 50%) con un tamaño de partículas de 200 a 2000
\mum de diámetro. En este contexto, "libre de polvo"
significa que el producto contiene solamente pequeños contenidos
(< 5%) con tamaños de partículas de menos de
20 \mum de diámetro. La determinación del tamaño de las partículas puede ser llevada a cabo con métodos de espectrometría por difracción láser. Los métodos correspondientes son descritos en el libro de texto sobre "Teilchengrö\betaenmessung in der Laborpraxis" por R. H. Müller and R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998).
20 \mum de diámetro. La determinación del tamaño de las partículas puede ser llevada a cabo con métodos de espectrometría por difracción láser. Los métodos correspondientes son descritos en el libro de texto sobre "Teilchengrö\betaenmessung in der Laborpraxis" por R. H. Müller and R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) o en el libro de texto "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998).
"Almacenable" en el contexto de esta
invención significa un producto el cual puede ser almacenado por
hasta 120 días. Preferiblemente hasta 52 semanas, particularmente de
manera preferida 60 meses, sin una perdida sustancial
(< 5%) de la metionina existente.
(< 5%) de la metionina existente.
Alternativamente, sin embargo, el producto puede
ser absorbido en la sustancia portadora orgánica o inorgánica la
cual es conocida y convencional en el procesamiento de piensos,
tales como por ejemplo, sílices, silicatos, granos, salvados,
harinas, almidones, azucares u otros, y/o mezcladas o estabilizadas
con espesantes o aglutinantes convencionales. Procesos y ejemplos de
uso en este contexto son descritos en la literatura (Die Mühle +
Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817).
Finalmente, el producto puede ser llevado a un
estado en el cual este es estable para la digestión por los
estómagos de los animales, en particular el estomago de los
rumiantes, por procesos de recubrimiento ("recubrimiento")
usando agentes que forman películas, tales como, por ejemplo,
carbonatos de metal, sílices, silicatos, alginatos, estearatos,
almidones, éteres de celulosa y gomas, como es descrito en
DE-C-4100920.
Si la biomasa es separada durante el proceso,
sólidos inorgánicos adicionales, por ejemplo adicionados durante la
fermentación, son en general removidos. En adición, el aditivo para
pienso animal de acuerdo a la invención comprende al menos la
proporción predominante de otras sustancias, en particular
sustancias orgánicas, que son formadas o adicionadas y están
presentes en solución en el caldo de fermentación, donde estas no
han sido separadas por procesos adecuados.
En un aspecto de la invención, la biomasa puede
ser separada en una extensión de hasta 70%, preferiblemente hasta
80%, preferiblemente hasta 90%, preferiblemente hasta 95%, y
particularmente preferiblemente hasta 100%. En otro aspecto de la
invención, hasta 20% de la biomasa, preferiblemente hasta 15%,
preferiblemente hasta 10%, preferiblemente hasta 5%, particularmente
preferiblemente ninguna biomasa es separada.
Estas sustancias orgánicas incluyen subproductos
orgánicos los cuales son producidos opcionalmente, en adición a la
L-metionina, y opcionalmente descargados por los
microorganismos empleados en la fermentación. Estas incluyen
L-amino ácidos seleccionados de los grupos que
consisten de L-lisina, L-valina,
L-treonina, L-alanina o
L-triptofano. Ellas incluyen vitaminas seleccionadas
del grupo que consiste de vitamina B1 (tiamina), vitamina B2
(riboflavina), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6
(piridoxina), vitamina B12 (cianocobalamina), ácido
nicotínico/nicotinamida y vitamina E (tocoferol). Ellas incluyen
además ácidos orgánicos los cuales portan de uno a tres grupos
carboxílos, tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido láctico,
ácido cítrico, ácido málico o ácido fumárico. Finalmente, ellas
también incluyen azucares, tales como, por ejemplo, trealosa. Estos
compuestos son opcionalmente deseados si ellos mejoran el valor
nutricional del producto.
Estas sustancias orgánicas, incluyendo
L-metionina y/o D-metionina y/o la
mezcla racémica D,L-metionina, pueden también ser
adicionadas, dependiendo de los requerimientos, como una sustancia
pura o concentrada en forma líquida o sólida durante una etapa
apropiada del proceso. Estas sustancias orgánicas mencionadas pueden
ser adicionadas individualmente o como mezclas al caldo de
fermentación concentrado o resultante, o también durante el proceso
de granulación o secado. Es igualmente posible adicionar una
sustancia orgánica o una mezcla de varias sustancias orgánicas al
caldo de fermentación y una sustancia orgánica adicional o una
mezcla de varias sustancias orgánicas adicionales durante una etapa
posterior del proceso, por ejemplo granulación.
El producto descrito anteriormente es adecuado
como un aditivo para pienso, es decir un aditivo de alimentación,
para la nutrición animal.
El contenido de L-metionina del
aditivo para pienso animal es convencionalmente 1% en peso a 80% en
peso, preferiblemente 2% en peso a 80% en peso, particularmente
preferiblemente 4% en peso a 80% en peso y muy particularmente
preferiblemente 8% en peso a 80% en peso, basado en el peso seco del
aditivo para pienso animal. Contenidos de 1% en peso a 60% en peso,
2% en peso a 60% en peso, 4% en peso a 60% en peso, 6% en peso a 60%
en peso, 1% en peso a 40% en peso, 2% en peso a 40% en peso o 4% en
peso a 40% en peso son igualmente posibles. El contenido de agua del
aditivo para pienso es convencionalmente hasta 5% en peso,
preferiblemente hasta 4% en peso, y particularmente preferiblemente
menos que 2% en peso.
La invención correspondientemente también
proporciona un proceso para la preparación de un aditivo para pienso
animal que contiene L-metionina a partir de caldos
de fermentación, que comprenden las etapas
a) cultivo y fermentación de un microorganismo
que produce L-metionina en un medio de
fermentación;
b) remoción del agua del caldo de fermentación
que contiene L-metionina (concentración);
c) remoción de una cantidad de 0 hasta 100% en
peso de la biomasa formada durante la fermentación; y
d) secado del caldo de fermentación obtenido de
acuerdo a a) y/o b) para obtener el aditivo para pienso animal en
la forma en granulo o polvo deseada.
Si se desea, uno o más de las siguientes etapas
pueden adicionalmente ser llevadas a cabo en el proceso de acuerdo
a la invención:
e) adición de una o más sustancias orgánicas,
incluyendo L-metionina y/o
D-metionina y/o la mezcla racémica
D,L-metionina, a los productos obtenidos de acuerdo
a a), b) y/o c);
f) adición de sustancias auxiliares seleccionadas
del grupo que consiste de sílices, silicatos, estearatos, granos y
salvados a las sustancias obtenidas de acuerdo a a) hasta d) para
la estabilización e incrementar la capacidad de almacenamiento;
o
g) conversión de las sustancias obtenidas de
acuerdo a a) hasta e) en una forma estable para el estómago de un
animal, en particular un rumiante, por recubrimiento con agentes
que forman películas.
Los métodos para la determinación de
L-amino ácidos son conocidos del arte anterior. El
análisis puede ser de esta manera llevado a cabo, por ejemplo, como
es descrito por Spackman y otros (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) por cromatografía de intercambio iónico con una derivación de
ninhidrina subsiguiente, o puede llevarse a cabo por HPLC de fase
inversa, por ejemplo como es descrito por Lindroth y otros
(Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).
El proceso de acuerdo a la invención es usado
para la preparación fermentativa de amino ácidos.
La presente invención es explicada en más
detalles a continuación con la ayuda de los ejemplos de
realización.
El siguiente microorganismo ha sido depositado
como un cultivo puro el 18 de Mayo de 2001 en el Deutsche Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de
Cultivos de Células y Microorganismos, Braunschweig, Alemania) de
acuerdo con el Tratado de Budapest:
Escherichia coli
DH5\alphamcr/pEC-XK99sahHalex como DSM
14316.
El aislamiento del ADN plásmido a partir de la
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, Klenow
y tratamiento de fosfatasa alcalina fueron llevadas a cabo por el
método de Sambrook y otros (Molecular Cloning. A Laboratory Manual
(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,
USA). Los métodos para la transformación de la Escherichia
coli son también descritos en este manual.
La composición del medio nutriente usual, tal
como el medio LB o TY, puede también ser encontrada en el manual de
Sambrook y otros.
El ADN cromosomal de Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032 fue aislado como es descrito por Tauch y
otros (1995, Plasmid 33:168-179) y parcialmente
escindido con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Código no.
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
fueron desfoforilatados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP,
Código no. 1758250). El ADN del vector cósmido SuperCos1 (Wahl y
otros (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA
84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla,
USA, Descripción del Producto Kit del Vector Cósmido SuperCos1,
Código no. 251301) fue escindido con una enzima de restricción XbaI
(Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto
XbaI, Código no. 27-0948-02) e
igualmente desfosforilatado con fosfatasa alcalina de camarón.
El ADN cósmido fue luego escindido con la enzima
de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del Producto BamHI, Código no.
27-0868-04). El ADN cósmido tratado
de esta manera fue mezclado con el ADN ATCC13032 tratado y el lote
fue tratado con ligasa ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Alemania, Descripción del Producto
Ligasa-ADN-T4, Código
no.27-0870-04). La mezcla de
ligación fue entonces empacada en fagos con la ayuda del Extracto de
Empaque Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Descripción del
Producto Extracto de Empaque Gigapack II XL, Código no. 200217).
Para la infección de la cepa NM554 de E.
Coli (Raleigh y otros 1998, Nucleic Acid Research
16:1563-1575) las células fueron recogidas en 10 mM
de MgSO_{4} y mezcladas con una alícuota de la suspensión del
fago. La infección y titulado de la biblioteca del cósmido fueron
conducidas como es descrito por Sambrook y otros (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), las células
siendo depositadas en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con
100 mg/l de ampicillina. Después de la incubación toda la noche a
37ºC, clones individuales recombinantes fueron seleccionados.
El ADN cósmido de una colonia individual fue
aislado con un Kit Qiaprep Spin Miniprep (Producto No. 27106,
Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo a las instrucciones del
fabricante y parcialmente escindido con la enzima de restricción
Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del
Producto Sau3AI, Producto No.
27-0913-02). Los fragmentos de ADN
fueron desfosforilatados con fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP,
Producto No. 1758250). Después de la separación mediante
electroforesis en gel, los fragmentos cósmidos en un rango de tamaño
de 1500 a 2000 bp fueron aislados con el Kit de Extracción en Gel
QiaExII (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania).
El ADN del vector de secuenciación
pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda,
Descripción del producto Kit de Clonación Zero Background, Producto
No. K2500-01), fue escindido con la enzima de
restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania,
Descripción del Producto BamHI, Producto No.
27-0868-04). La ligación de los
fragmentos cósmidos en el vector de secuenciación
pZero-1 fue llevado a cabo como es descrito por
Sambrook y otros (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring, Harbor), la mezcla de ADN siendo incubada toda la noche con
ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Esta mezcla de
ligación fue entonces electroporada (Tauch y otros 1994, FEMS
Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa
DH5\alphaMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of the
National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) y
depositada sobre agar LB (Lennox, 1995, Virology, 1:190) con 50 mg/l
de zeocina.
La preparación del plásmido de los clones
recombinantes fue llevada a cabo con Biorobot 9600 (Producto No.
900200, Qiagen, Hilden, Alemania). La secuenciación fue llevada a
cabo por el método de terminación de la cadena de dideoxi de Sanqer
y otros (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences
U.S.A., 7:5463-5467) con modificaciones de acuerdo a
Zimmermann y otros (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). El
"Kit de Secuenciación del Ciclo Terminador de RR dRodamina" de
PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania)
fue usado. La separación por electroforesis en gel y el análisis de
la reacción de secuenciación fueron llevados a cabo en un gel de
"Acrilamida/Bisacrilamida de Rotaforesis NF" (29:1) (Producto
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI
Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania).
Los datos de la secuencia primaria obtenidos
fueron luego procesados usando el paquete de programa Staden (1986,
Nucleic Acids Research, 14:217-231) versión
97-0. Las secuencias individuales del pZero1
derivativas fueron reunidas en una secuencia contigua. Los análisis
asistidos por computadora de la región que codifica fueron
preparados con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids
Reseach, 14:217-231).
La secuencia de nucleótidos resultante es
mostrada en SEQ ID Nº. 1. El análisis de la secuencia de
nucleótidos mostró un marco de lectura abierto de 1497 pares de
bases, el cual fue llamado el gen sahH. El gen sahH codifica para un
polipéptido de 498 amino ácidos.
A partir de la cepa ATCC 13032, el ADN cromosomal
es aislado por el método de Eikmanns y otros (Microbiology 140:
1817-1828 (1994)). En base a la secuencia del gen
sahH conocida para C. glutamicum del ejemplo 2, los
siguientes oligonucleótidos fueron seleccionados por la reacción en
cadena de la polimerasa (ver SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4):
sahHex1:
- 5' gt ggt acc-ttc ggt gtc cac tcc aac at 3'
sahHex2:
- 5' ca tct aga-tag gcg ctg tcg gtg agg tc 3'
Los cebadores mostrados fueron sintetizados por
medio de MWG-Biotech AG (Ebersberg, Alemania) y la
reacción PCR fue llevada a cabo por el método PCR estándar de Innis
y otros (Protocolos de PCR. Una Guía para los Métodos y las
Aplicaciones, 1990, Academic Press) con
Pwo-Polimerasa de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim,
Alemania). Con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa,
los cebadores permitieron la amplificación de un fragmento de ADN de
aproximadamente 1.7 kb de tamaño, el cual porta el gen sahH. Además,
el cebador sahHex1 contiene la secuencia para el sitio de escisión
de la endonucleasa de restricción Kpn1, y el cebador sahHex2 el
sitio de escisión de la endonucleasa de restricción XbaI, las
cuales están marcadas por medio del subrayado en la secuencia de
nucleótidos mostrada anteriormente.
El fragmento sahH de aproximadamente 1.7 kb de
tamaño fue escindido con las endonucleasas de restricción KpnI y
XbaI y luego aislado a partir del gel de agarosa con el Kit de
Extracción de Gel QiaExII (producto No. 20021, Qiagen, Hilden,
Alemania)
El vector shuttle pEC-XK99E de
C. glutamicum - E. coli fue construido de acuerdo al
arte anterior. El vector contiene la región de replicación rep del
plásmido pGA1 incluyendo el efector de replicación per
(US-A- 5,175,108; Nesvera y otros, Journal of
Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), el gen
aph(3')-IIa resistente a la kanamicina de
E. coli (Beck y otros (1982), Gene 19:
327-336), el origen de replicación del promotor trc,
las regiones de terminación T1 y T2, el gen lacI^{q} (represor del
operón lac de E. coli) y un sitio de clonación múltiple (mcs)
(Norrander, J.M. y otros Gene 26, 101-106 (1983))
del plásmido pTRC99A (Amann y otros (1988, Gene 69:
301-315).
El vector shuttle pEC-XK99E de
C. glutamicum - E. coli construido fue transferido a
la C. glutamicum DSM5715 por medio de electroporación (Liebl
y otros 1989, FEMS Microbiology Letters,
53:299-303). La selección de los transformantes fue
llevada a cabo en agar LBHIS comprendiendo 18.5 g/l de caldo de
infusión de cerebro-corazón, 0.5 M de sorbitol, 5
g/l de Bacto-triptona, 2.5 g/l de extracto de
Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l de
Bacto-agar, el cual había sido suplementado con 25
mg/l de kanamicina. La incubación fue llevada a cabo por 2 días a
33ºC.
El ADN del plásmido fue aislado a partir de un
transformante por métodos convencionales
(Peters-Wendisch y otros, 1998, Microbiology, 144,
915 - 927), escindido con la endonucleosa de restricción HindIII, y
el plásmido fue chequeado por electroforesis subsiguiente en gel de
agarosa.
La construcción del plásmido obtenida de esta
forma fue llamada pEC-XK99E (figura 1). La cepa
obtenida por electroporación del plásmido pEC-XK99E
en la cepa DSM5715 de C. glutamicum fue llamada
DSM5715/pEC-XK99E y depositada como DSM13455 en el
Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ =
Colección Alemana de Cultivo de Células y Microorganismos,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest.
El vector suttle pEC-XK99E de
C. glutamicum - E. coli descrito en el ejemplo 3.2
fue usado como el vector. El ADN de este plásmido fue escindido
completamente con las enzimas de restricción KpnI y XbaI y luego
defosforilatado con fosfatasa alcalina de camarón (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP,
Producto No. 1758250)
El fragmento de sahH de 1.7 kb de tamaño descrito
en el ejemplo 3.1, obtenido por medio de PCR y restringido con las
enzimas de restricción KpnI y XbaI fue mezclado con el vector
pEC-XK99E preparado y el lote fue tratado con ligasa
de ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del
Producto T4-ADN-Ligasa, Codigo
no.27-0870-04). El lote de ligación
fue transformado en la cepa DH5ámcr de E. Coli (Hanahan, In:
DNA cloning. A Practical Approach Vol. I. IRL-Press,
Oxford, Washington DC, USA). La selección de las células que portan
plásmidos fue hecha por deposición del lote de transformación en
agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 mg/l de kanamicina.
Después de la incubación por una noche a 37ºC, clones recombinantes
individuales fueron seleccionados. El ADN del plásmido fue aislado a
partir de un transformante con el Kit Qiaprep Spin Miniprep
(Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y escindido con las enzimas de
restricción KpnI y XbaI para chequear el plásmido por electroforesis
subsiguiente en gel de agarosa. El plásmido resultante fue llamado
pEC-XK99EsahHa1ex. Es mostrado en la figura 2.
La cepa DSM5715 fue transformada con el plásmido
pEC-XK99EsahHalex usando el método de
electroporación descrito por Liebl y otros, (FEMS Microbiology
Letters, 53:299-303 (1989)). La selección de los
transformantes fue llevada a cabo en agar LBHIS comprendiendo 18.5
g/l de caldo de infusión de cerebro-corazón, 0.5 M
de sorbitol, 5 g/l de Bacto-triptona, 2.5 g/l de
extracto de Bacto-levadura, 5 g/l de NaCl y 18 g/l
de Bacto-agar, el cual había sido suplementado con
25 mg/l de kanamicina. La incubación fue llevada a cabo por 2 días a
33ºC.
El ADN del plásmido fue aislado a partir de un
transformante por métodos convencionales
(Peters-Wendisch y otros, 1998, Microbiology, 144,
915 - 927), escindido con la endonucleosa de restricción KpnI y
XbaI, y el plásmido fue chequeado por electroforesis subsiguiente en
gel de agarosa. La cepa obtenida fue llamada
DSM5715/pEC-XK99EsahHex1.
La cepa DSM5715/pEC-XK99EsahHalex
de C. glutamicum obtenida en el ejemplo 4 fue cultivada en
un medio nutriente apropiado para la producción de lisina y la
lisina contenida en el cultivo sobrenadante fue determinada.
Para esto, la cepa fue primero incubada sobre una
placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de
cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l)) por 24
horas a 33ºC. Comenzando a partir de este cultivo en placa de agar,
un precultivo fue sembrado (10 ml del medio en un matraz cónico de
100 ml). El medio completo CgIII fue usado como el medio para el
precultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
| NaCl | 2.5 g/l |
| Bacto-Peptona | 10 g/l |
| Extracto de Bacto-Levadura | 10 g/l |
| Glucosa (puesta en autoclave separadamente) | 2% (p/v) |
| El pH fue llevado a pH 7.4 |
\newpage
Kanamicina (25 mg/l) fue adicionada a esto. El
precultivo fue incubado durante 16 horas a 33ºC a 240 rpm en una
batidora. El cultivo principal fue sembrado a partir de este
precultivo de manera que el OD inicial (660nm) del cultivo
principal fuera 0.1. El medio MM fue usado para el cultivo
principal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| CSL (licor de maíz fermentado) | 5 g/l |
| MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) | 20 g/l |
| Glucosa (en autoclave separadamente) | 50 g/l |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 25 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 0.1 g/l |
| MgSO_{4} * 7 H_{2}O | 1.0 g/l |
| CaCl_{2} * 2 H_{2}O | 10 mg/l |
| FeSO_{4} * 7 H_{2}O | 10 mg/l |
| MnSO_{4} * H_{2}O | 5.0 mg/l |
| Biotina (estéril-filtrada) | 0.3 mg/l |
| Tiamina * HCl (estéril-filtrada) | 0.2 mg/l |
| L-Leucina (estéril-filtrada) | 0.1 g/l |
| CaCO_{3} | 25 g/l |
\vskip1.000000\baselineskip
El CSL, MOPS y la solución de la sal fueron
llevados a pH 7 con amoníaco acuoso y puestos en autoclave. El
sustrato estéril y las soluciones de vitaminas fueron luego
adicionadas, así como el CaCO_{3} puesto en autoclave en estado
seco.
El cultivo es llevado a cabo en un volumen de 10
ml en un matraz cónico de 100 ml con bafles. Kanamicina (25 mg/l)
fue adicionada. El cultivo fue llevado a cabo a 33ºC y 80% de
humedad atmosférica.
Después de 48 horas, el OD fue determinado a una
longitud de onda de medición de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann
Instruments GmbH, Munich). La cantidad de lisina formada fue
determinada con un analizador de amino ácido de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y derivación
post-columna con detección de ninhidrina.
El resultado del experimento es mostrado en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa | OD | Lisina HCl |
| (660 nm) | g/l | |
| DSM5715 | 11.3 | 13.02 |
| DSM5715/pEC-XK99EsahHa1ex | 12 | 13.57 |
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Mapa del plásmido
pEC-XK99E,
Figura 2: Mapa del plásmido
pEC-XK99EsahHalex.
\newpage
Las abreviaturas y designaciones usadas tienen el
siguiente significado.
- Kan:
- Gen aph(3')-IIa resistente a la kanamicina de Escherichia coli.
- HindIII
- Sitio de escisión de la enzima de restricción HindIII.
- XbaI:
- Sitio de escisión de la enzima de restricción XbaI.
- KpnI:
- Sitio de escisión de la enzima KpnI de restricción.
- Ptrc
- Promotor trc
- T1
- Región de terminación T1
- T2
- Región de terminación T2
- per
- Efector de replicación per
- rep
- Región de replicación del plásmido pGA1
- lacIq
- Represor lacIq del operón lac de la Escherichia coli
- sahH
- Gen sahH clonado
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Secuencia de nucleótidos que
codifican para el gen sahH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 000493 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1939
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (227)..(1720)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen sahH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium glutamicum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador sahHex1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtacctt cggtgtccac tccaacat
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador sahHex2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatctagata ggcgctgtcg gtgaggtc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (24)
1. Cepa
DH5\alphamcr/pEC-XK99sahHalex de Escherichia
coli depositada como DSM 14316 en el Deutsche
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Cultivo de Células y Microorganismos], Braunschweig, Alemania.
Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Cultivo de Células y Microorganismos], Braunschweig, Alemania.
2. Un proceso para la preparación de
L-lisina, que comprende llevar a cabo los
siguientes pasos:
- a)
- fermentación de las bacterias coryneform las cuales producen el L-amino ácido deseado y en las cuales al menos el gen sahH, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que es al menos el 90% idéntica a la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID NO: 2 y la cual es una enzima adenosil homocisteinasa, o secuencias de nucleótidos las cuales codifican para esta son sobre-expresadas;
- b)
- concentración del L-amino ácido en el medio o en las células de las bacterias, y
- c)
- aislamiento de dicho amino ácido.
3. Proceso de acuerdo a las Reivindicación 2,
donde dicha enzima tiene la secuencia de amino ácidos de la SEQ ID
NO: 2.
4. Un proceso de acuerdo a las Reivindicación 2 o
3, donde dicho ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos de
los nucleótidos 227 a 1720 de la SEQ ID NO: 1.
5. Un proceso de acuerdo a las reivindicación 2,
donde una cepa transformada con un vector plásmido es empleada, y
el vector plásmido porta la secuencia de nucleótidos que codifica
para el gen sahH.
6. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 2,
donde la expresión del (los) polinucleótido(s) que
codifica(n) para el gen sahH está
sobre-expresada, de manera de incrementar la
actividad o concentración de la enzima correspondiente en al menos
10%.
7. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 2,
donde bacterias coryneform en las cuales al mismo tiempo uno o más
de los genes seleccionados del grupo que consiste de
- 7.1
- el gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa,
- 7.2
- el gen gap que codifica para la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa,
- 7.3
- el gen tpi que codifica para la triosa fosfato isomerasa,
- 7.4
- el gen pgk que codifica para la 3-fosfoglicerato quinasa,
- 7.5
- el gen zwf que codifica para la glucosa 6-fosfato dehidrogenasa,
- 7.6
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,
- 7.7
- el gen mqo que codifica para la malato-quinona oxidoreductasa,
- 7.8
- el gen lysC que codifica para una quinasa aspartato resistente de regeneración,
- 7.9
- el gen lysE que codifica para la proteína para la exportación de lisina, y
- 7.10
- el gen zwal que codifica para la proteína Zwal
que es o son
sobre-expresados son
fermentados.
8. Proceso como el reivindicado en la
reivindicación 2, donde para la preparación de
L-amino ácidos, bacterias coryneform en las cuales
al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo que
consiste de
- 8.1
- el gen pck que codifica para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa,
- 8.2
- el gen pgi que codifica para la glucosa 6-fosfato isomerasa,
- 8.3
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa,
- 8.4
- el gen zwa2 que codifica para la proteína Zwa2,
que es o son eliminados son
fermentados.
9. Un proceso como el reivindicado en a una o más
de las reivindicaciones 2 a 8, donde los microorganismos de la
especie Corynebacterium glutamicum son empleados.
10. Un proceso como el reivindicado en la
reivindicación 9, donde la cepa
DSM5715/pEC-XK99EsahHalex es empleada.
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