JPWO2020085511A1 - タンパク質の分泌生産法 - Google Patents
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Description
[1]
異種タンパク質の製造方法であって、
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および
分泌生産された異種タンパク質を回収することを含み、
前記コリネ型細菌が、LepBタンパク質の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
前記遺伝子構築物が、5’から3’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
[2]
前記LepBタンパク質が、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記方法:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質。
[3]
lepB遺伝子の発現を上昇させることにより、前記LepBタンパク質の活性が増大した、前記方法。
[4]
前記lepB遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および/または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、前記方法。
[5]
前記TorAシグナルペプチドが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のペプチドである、前記方法:
(a)配列番号46に示すアミノ酸配列を含むペプチド;
(b)配列番号46に示すアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド;
(c)配列番号46に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド。
[6]
前記TorAシグナルペプチドが、配列番号46に示すアミノ酸配列からなる、前記方法。
[7]
前記分泌生産された異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドが完全に除去された異種タンパク質である、前記方法。
[8]
前記コリネ型細菌が、さらに、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、前記方法。
[9]
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号29の302位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、前記方法。
[10]
前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、前記方法。
[11]
前記野生型PhoSタンパク質が、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記方法:
(a)配列番号29〜34のいずれかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号29〜34のいずれかに示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質;
(c)配列番号29〜34のいずれかに示すアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質。
[12]
前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される1種またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇するように改変されている、前記方法。
[13]
前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、前記方法。
[14]
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
[15]
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
[16]
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)に由来する改変株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869に由来する改変株である、前記方法。
[17]
前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が非改変株と比較して低下しているコリネ型細菌である、前記方法。
本発明の方法に用いられるコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌であって、且つ、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されたコリネ型細菌である。なお、本発明の方法に用いられるコリネ型細菌を「本発明の細菌」または「本発明のコリネ型細菌」ともいう。また、本発明の細菌が有する異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を「本発明に用いられる遺伝子構築物」ともいう。また、本発明の細菌またはそれを構築するために用いられる株を「宿主」ともいう。
本発明のコリネ型細菌は、異種タンパク質(具体的には、完全切断型の異種タンパク質)を分泌生産する能力を有する。本発明のコリネ型細菌は、少なくとも異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物(本発明に用いられる遺伝子構築物)を有することに依拠して、異種タンパク質を分泌生産する能力を有する。本発明のコリネ型細菌は、具体的には、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有することにより、または異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有することと他の性質との組み合わせにより、異種タンパク質を分泌生産する能力を有していてよい。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
本発明の細菌は、LepBタンパク質の活性が増大するように改変されている。本発明の細菌は、具体的には、LepBタンパク質の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている。本発明の細菌は、より具体的には、lepB遺伝子の発現が増大するように改変されていてよい。LepBタンパク質の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質の分泌生産におけるTorAシグナルペプチドの切れ残りを低減することができる。TorAシグナルペプチドの切れ残りの低減としては、TorAシグナルペプチドの切れ残り率の低下が挙げられる。「TorAシグナルペプチドの切れ残り率」とは、異種タンパク質の総分泌生産量に対する切れ残り型(mis-cleaved form)の異種タンパク質の分泌生産量の重量比をいう。「異種タンパク質の総分泌生産量」とは、完全切断型の異種タンパク質の分泌生産量と切れ残り型の異種タンパク質の分泌生産量との合計をいう。「切れ残り型の異種タンパク質」とは、TorAシグナルペプチドが部分的に除去された、すなわち、TorAシグナルペプチドのC末端側部分配列を保持する、異種タンパク質をいう。TorAシグナルペプチドのC末端側部分配列としては、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基のアミノ酸配列が挙げられる。TorAシグナルペプチドのC末端側部分配列として、具体的には、配列番号46の25〜39位のアミノ酸配列が挙げられる。本発明の方法におけるTorAシグナルペプチドの切れ残り率は、例えば、3%以下、1%以下、0.5%以下、0.3%以下、0.1%以下、または0%であってよい。また、本発明の方法におけるTorAシグナルペプチドの切れ残り率は、例えば、非改変株(ここではLepBタンパク質の活性が増大するように改変されていない株)を用いた場合のTorAシグナルペプチドの切れ残り率の、50%以下、30%以下、10%以下、5%以下、3%以下、1%以下、または0%であってよい。また、LepBタンパク質の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、TorAシグナルペプチドを利用する際の同細菌の異種タンパク質(具体的には、完全切断型の異種タンパク質)を分泌生産する能力を向上させることができる、すなわち、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質(具体的には、完全切断型の異種タンパク質)の分泌生産を増大させることができる、と期待される。
本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産できる限り、所望の性質を有していてよい。例えば、本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下していてよい(WO2013/065869、WO2013/065772、WO2013/118544、WO2013/062029)。また、本発明の細菌は、ペニシリン結合タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい(WO2013/065869)。また、本発明の細菌は、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現が上昇するように改変されていてよい(WO2013/065772)。また、本発明の細菌は、変異型リボソームタンパク質S1遺伝子(変異型rpsA遺伝子)を有するように改変されていてよい(WO2013/118544)。また、本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を有するように改変されていてよい(WO2016/171224)。また、本発明の細菌は、RegX3タンパク質の活性が低下するように改変されていてよい(WO2018/074578)。また、本発明の細菌は、HrrSAシステムの活性が低下するように改変されていてよい(WO2018/074579)。また、本発明の細菌は、Tat系分泌装置の活性が増大するように改変されていてよい。これらの性質または改変は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用することができる。
本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されていてよい。「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型phoS遺伝子を有する」または「phoS遺伝子に変異を有する」ともいう。また、「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型PhoSタンパク質を有する」または「PhoSタンパク質に変異を有する」ともいう。
本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下しているものであってよい。本発明の細菌は、具体的には、細胞表層タンパク質の活性が非改変株と比較して低下しているものであってよい。「細胞表層タンパク質の活性が低下する」とは、特に、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が低下することを意味してもよい。以下に、細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。
C. glutamicum ATCC13058(AY524990)
C. glutamicum ATCC13744(AY524991)
C. glutamicum ATCC13745(AY524992)
C. glutamicum ATCC14017(AY524993)
C. glutamicum ATCC14020(AY525009)
C. glutamicum ATCC14067(AY524994)
C. glutamicum ATCC14068(AY525010)
C. glutamicum ATCC14747(AY525011)
C. glutamicum ATCC14751(AY524995)
C. glutamicum ATCC14752(AY524996)
C. glutamicum ATCC14915(AY524997)
C. glutamicum ATCC15243(AY524998)
C. glutamicum ATCC15354(AY524999)
C. glutamicum ATCC17965(AY525000)
C. glutamicum ATCC17966(AY525001)
C. glutamicum ATCC19223(AY525002)
C. glutamicum ATCC19240(AY525012)
C. glutamicum ATCC21341(AY525003)
C. glutamicum ATCC21645(AY525004)
C. glutamicum ATCC31808(AY525013)
C. glutamicum ATCC31830(AY525007)
C. glutamicum ATCC31832(AY525008)
C. glutamicum LP-6(AY525014)
C. glutamicum DSM20137(AY525015)
C. glutamicum DSM20598(AY525016)
C. glutamicum DSM46307(AY525017)
C. glutamicum 22220(AY525005)
C. glutamicum 22243(AY525006)
本発明の細菌は、タンパク質の分泌系であるTat系(Tat系分泌装置)を有する。本発明の細菌は、本来的にTat系分泌装置を有していてよい。本発明の細菌は、Tat系分泌装置の活性が増大するように改変されていてもよい。本発明の細菌は、具体的には、Tat系分泌装置の活性が非改変株と比較して増大するように改変されていてもよい。Tat系分泌装置の活性は、例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される1またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇させることにより、増大させることができる。すなわち、本発明の細菌は、より具体的には、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される1またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されていてもよい。Tat系分泌装置をコードする遺伝子の発現を上昇させる手法については特許第4730302号に記載されている。Tat系分泌装置の活性が増大するようにコリネ型細菌を改変することにより、TorAシグナルペプチドを利用する際の同細菌の異種タンパク質(具体的には、完全切断型の異種タンパク質)を分泌生産する能力を向上させることができる、すなわち、同細菌によるTorAシグナルペプチドを利用した異種タンパク質(具体的には、完全切断型の異種タンパク質)の分泌生産を増大させることができる、と期待される。
以下に、LepBタンパク質等のタンパク質の活性を増大させる手法(遺伝子の発現を増大させる手法も含む)について説明する。
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。なお、以下に記載するタンパク質の活性を低下させる手法は、野生型PhoSタンパク質の破壊にも利用できる。
分泌性タンパク質(secretory protein)は、一般に、プレタンパク質(プレペプチドともいう)またはプレプロタンパク質(プレプロペプチドともいう)として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質(mature protein)になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ(一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる)によって切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。よって、本発明の方法においては、異種タンパク質の分泌生産にシグナルペプチドを利用する。なお、本発明において、分泌型タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌型タンパク質前駆体」という場合がある。
上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、異種タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の異種タンパク質が得られる。
C. glutamicum ATCC13869株のゲノム配列およびType I signal peptidase(LepB)をコードするlepB遺伝子の塩基配列は既に決定されている(GenBank Accession No. AP017557、NCBI locus_tag CGBL_0119390)。C. glutamicum ATCC13869株由来のlepB遺伝子の塩基配列を<配列番号01>に、LepBタンパク質のアミノ酸配列を<配列番号02>に示す。
(1)既存(lepB遺伝子非増幅)の条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたPTGの分泌発現
WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PTG株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン 0.15 g、大豆塩酸加水分解液(全窒素量 0.2 g)、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整)で30℃、72時間培養した。なお、pPK6_T_PTGは、tatABC遺伝子増幅用ベクターpPK6から構築されたプロ構造部付きトランスグルタミナーゼ(PTG)の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のcspB遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたE. coli由来のTorAシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたStreptomyces mobaraense由来のPTG遺伝子を有するプラスミドである(WO2016/171224)。YDK010::phoS(W302C) 株は、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質CspBの欠損株であるYDK010株(WO2002/081694)の染色体上のphoS遺伝子中にPhoS(W302C) 変異を導入した株である(WO2016/171224)。培養終了後、培養液を遠心分離して得られた培養上清1.0 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20(Cosmo Bio)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された(図2のパネルA、lanes 3-5)。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではPTGのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列(GMLGPSLLTP;配列番号47)が確認され、低分子側のバンドではPTGのN末端アミノ酸配列(DNGAGEETKS;配列番号48)が確認された(図2のパネルB)。即ち、TorAシグナル配列を用いたPTG分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存していることが分かった。
WO2016/171224に記載のPTG分泌発現用ベクターpPK6_T_PTGを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号06>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号08>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナルペプチド-PTGの発現カセットを含む約1.9 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号06>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号08>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
実施例2(2)で構築したPTG分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_PTGおよびpPK6lepB(A)_T_PTGを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_PTG株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_PTG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清1.0 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20(Cosmo Bio)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_PTG導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_PTGおよびpPK6lepB(A)_T_PTG導入株では、いずれも、高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した(図2のパネルA、lanes 6-11)。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではPTGのN末端アミノ酸配列(DNGAGEETKS;配列番号48)が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたPTG分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するPTGの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
(1)既存(lepB遺伝子非増幅)の条件下におけるTorAシグナルペプチドを用いたPPGの分泌発現
WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PPG株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。なお、pPK6_T_PPGは、tatABC遺伝子増幅用ベクターpPK6から構築されたプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼ(PPG)の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のcspB遺伝子由来のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたE. coli由来のTorAシグナルペプチドをコードするDNA、および同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたChryseobacterium proteolyticum由来のPPG遺伝子を有するプラスミドである(WO2016/171224)。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20(Cosmo Bio)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された(図3のパネルA、lanes 3-5)。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではPPGのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列(GMLGPSLLTP;配列番号47)が確認され、低分子側のバンドではPPGのN末端アミノ酸配列(DSNGNQEING;配列番号49)が確認された(図3のパネルB)。即ち、TorAシグナル配列を用いたPPG分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存していることが分かった。
WO2016/171224に記載のPPGの分泌発現用ベクターpPK6_T_PPGを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号09>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号10>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-PPGの発現カセットを含む約1.6 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号09>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号10>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
実施例3(2)で構築したPPG分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_PPGおよびpPK6lepB(A)_T_PPGを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_PPG株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_PPG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20(Cosmo Bio)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_PPG導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_PPGおよびpPK6lepB(A)_T_PPG導入株では、いずれも高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した(図3のパネルA、lanes 6-11)。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではPPGのN末端アミノ酸配列(DSNGNQEING;配列番号49)が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたPPG分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が顕著に残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するPPGの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
(1)Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたBlaをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
β−ラクタマーゼ(β-lactamase;以下、Blaと表記する)の一種である、TEM-型に属するクラスA広域性β−ラクタマーゼTEM-116のアミノ酸配列は既に知られている(GenBank Accesson No. WP_000027050)。このアミノ酸配列のうち、N末端のシグナル配列を除いた24-286位の263残基のアミノ酸配列を<配列番号11>に示す。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、配列番号11のBlaをコードする塩基配列をデザインした。デザインした塩基配列を<配列番号12>に示す。
実施例4(1)で構築したBlaの分泌発現プラスミドpPK6_T_Blaを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_Bla株を得た。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された(図4のパネルA、lanes 3-5)。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではBlaのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列(GMLGPSLLTP;配列番号47)が確認され、低分子側のバンドはBlaのN末端アミノ酸配列(HPETLVKVKD;配列番号50)が確認された(図4のパネルB)。即ち、TorAシグナル配列を用いたBla分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存していることが分かった。
実施例4(1)で構築したBlaの分泌発現用ベクターpPK6_T_Blaを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号13>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号14>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-Blaの発現カセットを含む約1.5 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号13>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号14>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
実施例4(3)で構築したBla分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Blaを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_Bla株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_Bla株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_Bla導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Bla導入株では、いずれも高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した(図4のパネルA、lanes 6-11)。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではBlaのN末端アミノ酸配列(HPETLVKVKD;配列番号50)が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたBla分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するBlaの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
(1)Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたTrxをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
チオレドキシン(Thioredoxin;以下、Trxと表記する)の一種である、E. coli由来のTrxAタンパク質のアミノ酸配列は既に知られている(GenBank Accesson No. WP_001323277)。このアミノ酸配列からN末端19残基を除き、さらにN末端にAlaを1残基付加して得られた改変型Trxの109残基のアミノ酸配列を<配列番号15>に示す。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、配列番号15のTrxをコードする塩基配列をデザインした。デザインした塩基配列を<配列番号16>に示す。
実施例5(1)で構築したTrxの分泌発現プラスミドpPK6_T_Trxを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_Trx株を得た。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、NuPAGE(R) 12% Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された(図5のパネルA、lanes 3-5)。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではTrxのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列(GMLGPSLLTP;配列番号47)が確認され、低分子側のバンドではTrxのN末端アミノ酸配列(ASDKIIHLTD;配列番号51)が確認された(図5のパネルB)。即ち、TorAシグナル配列を用いたTrx分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存していることが分かった。
実施例5(1)で構築したTrxの分泌発現用ベクターpPK6_T_Trxを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号17>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号18>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-Trxの発現カセットを含む約1.1 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号17>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号18>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列が、それぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
実施例5(3)で構築したTrx分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_TrxおよびpPK6lepB(A)_T_Trxを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_Trx株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_Trx株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清2.5 μlを、NuPAGE(R) 12% Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_Trx導入株では主に2本のバンドが検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_BlaおよびpPK6lepB(A)_T_Bla導入株では、いずれも高分子側のバンドが減少してほとんど検出されなくなり、低分子側のバンドが増加した(図5のパネルA、lanes 6-11)。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではTrxのN末端アミノ酸配列(ASDKIIHLTD;配列番号51)が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたTrx分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するTrxの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
(1)Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたLFABPをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
ヒトのLiver-type fatty acid-binding protein(以下、LFABPと表記する)のアミノ酸配列は既に知られている(GenBank Accession No. NP_001434)。この127残基のアミノ酸配列を<配列番号19>に示す。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、配列番号19のLFABPをコードする塩基配列をデザインした。デザインした塩基配列を<配列番号20>に示す。
実施例6(1)で構築したLFABPの分泌発現プラスミドpPK6_T_LFABPを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C)株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_LFABP株を得た。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby(Life Technologies)にて染色を行った結果、主に2本のバンドが検出された(図6のパネルA、lanes 3-5)。尚、高分子側のバンドは、ネガティブコントロールであるYDK010::phoS(W302C)/pPK6株の培養上清にも検出されたため(図6のパネルA、lane2)、宿主であるC. glutamicum由来のタンパク質が含まれていることが推定された。それぞれのバンドのN末端アミノ酸配列を解析した結果、高分子側のバンドではLFABPのN末端にTorAシグナル配列のC末端側15残基が残存していることを示すアミノ酸配列(GMLGPSLLTP;配列番号47)、およびC. glutamicum由来のresuscitation-promoting factor Rpf1(GenBank Accession No. AP017557、NCBI locus_tag CGBL_0109030)の成熟タンパク質のN末端配列(APDSDWDRLA;配列番号52)が検出され、高分子側のバンドは主にこれら2種類のタンパク質の混合バンドであることが確認された(図6のパネルB)。なお、Rpf1シグナル配列のC末端側の部分配列が残存していることを示すアミノ酸配列は検出されず、Rpf1については正常にシグナルペプチド全長が切断されていることが確認された。一方、低分子側のバンドではLFABPのN末端アミノ酸配列(MSFSGKYQLQ;配列番号53)が確認された(図6のパネルB)。即ち、TorAシグナル配列を用いたLFABP分泌生産において、TorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存していることが分かった。
実施例6(1)で構築したLFABPの分泌発現用ベクターpPK6_T_LFABPを鋳型に、<配列番号05>と<配列番号21>のプライマー、または<配列番号07>と<配列番号22>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-TorAシグナル配列-LFABPの発現カセットを含む約1.1 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号05>と<配列番号21>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号07>と<配列番号22>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
実施例6(3)で構築したLFABP分泌発現プラスミドpPK6lepB(K)_T_LFABPおよびpPK6lepB(A)_T_LFABPを用いて、WO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(K)_T_LFABP株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6lepB(A)_T_LFABP株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、NuPAGE(R) 4-12% Bis-Tirs Gel(Thermo Fisher Scientific)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Ruby(Life Technologies)にて染色を行った。その結果、lepB遺伝子を増幅していないpPK6_T_LFABP導入株では主な2本のバンドがおよそ等量ずつ検出されていたのに対し、lepB遺伝子を増幅したpPK6lepB(K)_T_FABPおよびpPK6lepB(A)_T_FABP導入株では、いずれも低分子側の目的LFABPのバンドが顕著に増加した(図6のパネルA、lanes 6-11)。N末端アミノ酸配列を解析した結果、低分子側のバンドではLFABPのN末端アミノ酸配列(MSFSGKYQLQ;配列番号53)が確認された。即ち、TorAシグナル配列を用いたLFABP分泌生産において、lepB遺伝子非増幅条件下ではTorAシグナルペプチドのC末端側15残基の切れ残り型が残存しているが、lepB遺伝子の増幅によってTorAシグナルペプチドのプロセッシングを促進し、正しいN末端アミノ酸配列を有するLFABPの生産効率を顕著に向上できることが分かった。
(1)pPK5ベクターを用いたPTG分泌発現用ベクター構築
WO2002/081694に記載のPTGの分泌発現用ベクターpPKSPTG1を鋳型に、<配列番号23>と<配列番号24>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-SlpAシグナル配列-PTGの発現カセットを含む約1.8 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号23>と<配列番号24>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を、WO2016/171224に記載のpPK5ベクターのKpnI部位にインフュージョン反応により挿入することによって、SlpAシグナル配列を用いたPTG分泌発現ベクターであるpPK5_S_PTGを構築した(図1のパネルA)。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)と3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて行った。
実施例7(1)と同様に、WO2002/081694に記載のPTGの分泌発現用ベクターpPKSPTG1を鋳型に、<配列番号23>と<配列番号25>のプライマー、または<配列番号26>と<配列番号27>のプライマーを用いて、cspBプロモーター-SlpAシグナル配列-PTGの発現カセットを含む約1.8 kbpのDNA断片をPCR法によってそれぞれ増幅した。<配列番号23>と<配列番号25>のプライマーには制限酵素KpnIの認識配列が、<配列番号26>と<配列番号27>のプライマーには制限酵素ApaIの認識配列がそれぞれデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) HS DNA Polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を、実施例1で構築したpPK5lepBベクターのKpnI部位あるいはApaI部位にそれぞれインフュージョン反応により挿入することによって、lepB遺伝子と、SlpAシグナル配列を用いたPTG分泌の共発現ベクターであるpPK5lepB(K)_S_PTGおよびpPK5lepB(A)_S_PTGを構築した(図1のパネルB)。プラスミド名の (K) および (A) は、それぞれPTGの発現カセットを挿入したpPK5lepBベクターの制限酵素部位(KpnIサイトおよびApaIサイト)を表している。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がそれぞれ挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)と3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて行った。
実施例7(1)および(2)で構築した、SlpAシグナル配列を用いたPTG分泌発現プラスミドであるpPK5_S_PTG、pPK5lepB(K)_S_PTG、およびpPK5lepB(A)_S_PTGを用いてWO2016/171224に記載のYDK010::phoS(W302C) 株を形質転換し、YDK010::phoS(W302C)/pPK5_S_PTG株、YDK010::phoS(W302C)/pPK5lepB(K)_S_PTG株、およびYDK010::phoS(W302C)/pPK5lepB(A)_S_PTG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5.0 μlを、MULTIGEL(R) II mini 15/20(Cosmo Bio)を用いて還元SDS-PAGEに供してからSYPRO(R) Orange(Thermo Fisher Scientific)にて染色を行った。その結果、TorAシグナル配列を用いた場合とは異なり、SlpAシグナル配列を用いた場合では、lepB遺伝子を増幅していないpPK5_S_PTG導入株においてPTGの単一バンドが検出され、SlpAシグナルペプチドC末端側の部分配列が残存した切れ残り型は全く検出されなかった(図7のパネルA、lane 7)。また、lepB遺伝子を増幅したpPK5lepB(K)_S_PTGおよびpPK5lepB(A)_S_PTG導入株においてもバンドパターンは変化せず、むしろPTGの分泌発現量が減少した(図7のパネルA、lanes 8-9)。
配列番号1:C. glutamicum ATCC 13869のlepB遺伝子の塩基配列
配列番号2:C. glutamicum ATCC 13869のLepBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3〜10:プライマー
配列番号11:β−ラクタマーゼTEM-116のアミノ酸配列
配列番号12:β−ラクタマーゼTEM-116をコードする塩基配列
配列番号13〜14:プライマー
配列番号15:E. coliの改変型TrxAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号16:E. coliの改変型TrxAタンパク質をコードする塩基配列
配列番号17〜18:プライマー
配列番号19:ヒトのLFABPのアミノ酸配列
配列番号20:ヒトのLFABPをコードする塩基配列
配列番号21〜27:プライマー
配列番号28:C. glutamicum YDK010のphoS遺伝子の塩基配列
配列番号29:C. glutamicum YDK010のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号30:C. glutamicum ATCC 13032のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:C. glutamicum ATCC 14067のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号32:C. callunaeのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:C. crenatumのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号34:C. efficiensのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:C. glutamicum ATCC 13032のphoR遺伝子の塩基配列
配列番号36:C. glutamicum ATCC 13032のPhoRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:C. glutamicum ATCC 13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号38:C. glutamicum ATCC 13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子の塩基配列
配列番号40:C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:C. glutamicum ATCC 13032のtatB遺伝子の塩基配列
配列番号42:C. glutamicum ATCC 13032のTatBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:C. glutamicum ATCC 13032のtatC遺伝子の塩基配列
配列番号44:C. glutamicum ATCC 13032のTatCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:ツイン・アルギニンモチーフのアミノ酸配列
配列番号46:TorAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号47〜53:N末端アミノ酸配列
配列番号54〜59:シグナルペプチドを含むタンパク質のN末端アミノ酸配列
Claims (17)
- 異種タンパク質の製造方法であって、
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養すること、および
分泌生産された異種タンパク質を回収することを含み、
前記コリネ型細菌が、LepBタンパク質の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
前記遺伝子構築物が、5’から3’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、TorAシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。 - 前記LepBタンパク質が、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項1に記載の方法:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、TorAシグナルペプチドに対するシグナルペプチダーゼ活性を有するタンパク質。 - lepB遺伝子の発現を上昇させることにより、前記LepBタンパク質の活性が増大した、請求項1または2に記載の方法。
- 前記lepB遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、および/または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって上昇した、請求項3に記載の方法。
- 前記TorAシグナルペプチドが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法:
(a)配列番号46に示すアミノ酸配列を含むペプチド;
(b)配列番号46に示すアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド;
(c)配列番号46に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、Tat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するペプチド。 - 前記TorAシグナルペプチドが、配列番号46に示すアミノ酸配列からなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分泌生産された異種タンパク質が、前記TorAシグナルペプチドが完全に除去された異種タンパク質である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、さらに、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号29の302位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項8に記載の方法。
- 前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、請求項9に記載の方法。
- 前記野生型PhoSタンパク質が、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項9または10に記載の方法:
(a)配列番号29〜34のいずれかに示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号29〜34のいずれかに示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質;
(c)配列番号29〜34のいずれかに示すアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するタンパク質。 - 前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される1種またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇するように改変されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、請求項12に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム属細菌である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項14に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036(FERM BP-734)に由来する改変株またはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869に由来する改変株である、請求項15に記載の方法。
- 前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の細胞当たりの分子数が非改変株と比較して低下しているコリネ型細菌である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
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