SU1449582A1

SU1449582A1 - Способ получени рестриктазы AI и I

Info

Publication number: SU1449582A1
Application number: SU874194840A
Authority: SU
Inventors: Марианна Яновна Хейслере; Сергей Харитонович Дегтярев; Юрий Николаевич Бойков; Владимир Евгеньевич Репин; Николай Александрович Божко
Original assignee: Научно-производственное объединение "Биолар"; Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Молекулярной Биологии Главмикробиопрома
Priority date: 1987-02-16
Filing date: 1987-02-16
Publication date: 1989-01-07

Description

(21) 4194840/28-13 (22) 16.02.87 (46) 07.01.89. Бюл. № 1 (7.1) Научно-производственное объединение Бислар и Всесоюзный научно- исследовательский институт молекул рной биологии

(72) М.Я.Хейслере, С.Х.Дегт рев, Ю.Н.Бойков, В.Е.Репин и Н.А.Божко (53) 577.15(088.8)

(.56) Roberts R.J. Myers P.А., Morrison А., Murray К.А. Specific endonuc- lease from Arthrobacter luteus.- J. Molec. Biol., 1976, V. 102, № 1 P. 157-165.

Clarke C.M., Hartley B.C. Purification , properties and ,specifity of the restriction endonuclease from Bacillus stearothermophilus.- Bio- chem, J., 1979, v. 177, p. 49-62.

George J., Chrikjian I.e. Biospe- cific fractionation matrix for seg- nence - specific endonucleases.- Nucleic Acids Res., 1978, v. 5. p. 2223-2232.

Green P.J., Heyneker H.L.et al. A general method for the purification of restriction enzymes.- Mud. Ac, Res., 1978, V. 5, N 7, p. 2373-2380.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ Alul. ,

(57) Изобретение относитс к биотехнологии и касаетс способа получени рестриктазьк Alul из клеток бактерий: Arthrobacter luteus. Целью изобрете- ни вл етс повьшение стабильности рестрнктазы Alul и увеличение вькода целевого продукта. Разрушение клеток провод т в присутствии 6-8%-ного раствора ичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического растворител используют толуол при объемных соотношени х ичного масла и толуола (1,0:12,0)- (1,0:16,0). В результате использовани предлагаемого изобретени выход рестриктазы Alul.составл ет 10000- 15000 ед/г биомассы. 2 табл.

W

4

(;о

ел

00

IN9

Изобретение относитс к химическо п|ромьп1шенности, касаетс способа по- л|учени .рестриктазы Alul из клеток бактерий Arthrobacter luteus.

Цель изобретени - повышение стабильности рестриктазы Alu1 и увеличение выхода целевого продукта, °

Способ предусматривает разрушет:. Яие клеток в присутствии 6-8%-ного ipacTBopa ичного масла в толуоле, в лиэате сохран етс 90% активности ре стриктазы Alul. При разрушении клето только в присутствии толуола в лиза- 16 сохран етс 60% активности реет- риктазы Alul J т.е. в 1j5 раза меньше чем при добавлении 6-8%-ного раствор ичного масла в толуоле. I Яичное масло получают из желтка куриньк иц. Яичное масло имеет сле- ;ующий состав, %: липиды 60, этило- Еый спирт 15, вода 25. Липиды включа нт большую и крайне ..разнородную группу веществ лецитин, кефалин, ариглицериды, холестерин и др, I Пример 1. Юг биомассы Air- tjbrobacter luteus ВКПМ . В-3670 :.раз- ораживают и суспендируют в 20 мл ра очего буфера .(, 0,01М,, 752-7,6; 2-меркаптоэтанол. Os6lM).

К 30 мл суспензии добавл ют 5 мл раствора ичного масла в то- Луоле. Отношение ичного масла к то- Луолу 1,0:12,0, Во врем разрушени ijuieToK температуру суспензии поддер- з|сивают на уровне 1 2° С, Обрабатывают фуспензию ультразвуком 5-10 с 2тЗ jfasa,

Обработанную ультразвуком микроб- ую массу центрифугируют на Центрифу i e High ppeed (10000 х g, 30 мин). После центрифугировани отбирают фодньй слой и нанос т на колонку с фосфоцеллюлОзой. (V. 40 см) уравно ешенную рабочим буфером

Фракции, содержащие рестриктазу ф.лц1, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе.

Активные фракции диали.зируют про- тив 1 л диализной смеси в течение 12 ч.

Состав диализной смеси глицерин 50% , трис-HCl 10 мМ, рН 7,4; КС1 50 мМ. ,

Выход рестриктазы Alu1 150000 ед/ /10 мл, активность 15000 ед/мл., вы- 5сод 15000 ед/г биомассы.

0

5

0

5

0 5

«

Дл измерени активности рестриктазы Alu1 используют метод электрофореза в геле.

За единицу активности рестриктазы Alul принимаетс количество фермента, достаточное дл полного расщеплени 1 мкг ДНК фага -Д за 1 ч при 37 С.

П р и м е.р 2. Суспендирование биомассы провод т аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавл ют 5,0 мл 7%-ного раствора ичного масла в толуоле. Отношение ичного масла к толуолу 1,,X). Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы Alul провод т аналогично примеру ,1 .г

Выход рестриктазы Alul 125000 ед/ /10 мл, активность 12500 ед/мл, выход 12500 ед/г биомассы

П р и м е р 3. Суспендирование биомассы провод т аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии ..добавл ют 5,0 мл ..6%-ного раствора ичного масла в толуоле. Отношение ичного масла к толуолу 1,0:16,0. Дезинтеграцию клеток и последующее вьщеление рестриктазы Alul провод т аналогично примеру 1,

Выход рестриктазы Alul 100000 ед/ /10 мл, активность 10000 ед/мл, вы-- ход 10000 ед/г биомассы.

Приме р4 Суспендирование- биомассы провод т аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии дoбaвл юt 5,0 мл .5%-ного раствора, ичного масла в толуоле. Отношение ичного масла к толуолу 1,0:19, О. Дезинтеграцию клеток и последунлцее вьзделение рестриктазы Alul провод т аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 50000 ед/ /10 МП, активность 5000 ед/мл, выход 5000 ед/г биомассы.

П р и м е р 5, Суспевдирование биомассы провод т аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавл ют 5 мл 9%-ного раствора ичного масла в толуоле. Отношение ичного масла к толуолу 1,0:10,0. Дезинтеграцию клеток и последующее вьщеление рестриктазы Alul провод т аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 53000 ед/ /10 мл, активность 5500 ед/мл, выход 5500 ед/г биомассы.

Приме р6. Юг биомассы Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 размораживают и суспендируют в 20 мл рабочего буфера (трис-HCl ,0,01М, рН 7,2-7,6; 2-меркаптоэтанол 0,01М). К 30 МП суспензии добавл ют 5 мл концентрированного толуола. Во врем разрушени клеток температуру суспен- зии поддерживают на уровне Обрабатывают суспензию ультразвуком 5-10 с 2-3 раза.

Обработанную ультразвукбм микроб- ную массу центрифугируют на центрифуге High speed -(10000 X g, 30 мин).

После центрифугировани отбирают водный слой и нанос т на колонку с

Выход рестриктаз г Alul 75000 ед/ /10 мл, активность 7500 ед/мл, выход 7500 ед/г биомассы .

В примерах 4-8 иллюстрируютс запредельные значени параметров.

Данные, полученные в результате вьщелени рестриктазы Alul из штамма бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 с использованием разных спосо бов, представлены в табл. 1.

Пример 10. Дл вьщелени рестриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

фосфоцеллншозой (V 40 см) уравно- 15 ° ™ вешенную рабочим 6v benoM Размораживание биомассы, девешенную рабочим буфером.

Фракции, содержащие рестриктазу Alul, подвергают дальнейшей очистке с помощью колоночной хроматографии на гепарин-сефарозе. , .

Активные фракции диализируют против 1 л диализной с)иеси в т еченйе 12 ч.

Состав диализной смеси: глицерин 50%, трис-НС 10 мМ, рН 7,4; КС1 50 мМ.

Выход рестриктазы Alul 100000 ед/ /10 мл, активность 10000 ед/мл, выход 10000 ед/г биомассы.

П р и м е р 7. Суспендирование провод т аналогично примеру 1. К 30 мл суспензии добавл ют 4 мл концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее вьщеление рестриктаэы Alu1 провод т аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 83000 ед/ /10 МП, активность 8300 ед/мл, выход 8300 ед/г биомассы.

П р и м е р 8. Суспендирование биомассы провод т аналогично примеру 1. К 30 мл. суспензии добавл ют 3 мл концентрированного толуола. Дезинтеграцию клеток и последующее выделение рестриктазы Alul провод т . аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы Alul 66000 ед/ /1б мл, активность 6600 ед/мл, выход

25

30

,6600 ед/г биомассы.

Пример 9. Суспендирование биомассы провод т аналогично примеру 1. 30 мл суспензии обрабатывают

зинтеграцию клеток и вьщеление фермента провод т аналогично примеру 1. Выход рестриктазы Alul 80000 ед/ /10 мл, активность 8000 ед/мл, выход 20 800 ед/г биомассы.

П р и м .е р 11. Дл выделени ре- стриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-1777. Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьщеление фермента провод т аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы. Alul 40000 ед/ /10 мл, активность 4000 ед/мл, выход 4000 ед/г биомассы.

Данные, полученные в результате .. вьщелени рестриктазы Alul из разных штаммов бактерий Arthrobacter luteus с использованием различных способов, представлены в табл. 2. 35 Из табл. 2 видно, что при вьщеле- нии рестриктазы Alu1 из разных бактериальных штаммов Arthrobacter luteus происходит увеличение активности и выхода фермента по сравнению с из- 40 вестным способом.

Claims

Формула изобретени Способ получени рестриктазы Alul, включающий разрушение клеток Arthrobacter luteus, фракционирование полу

45 ченного лизата и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией и диализом, отличающийс тем, что, с целью повышени стабильности рестриктазы Alul и увеличени

50 выхода целевого продукта, разрушение клеток провод т в присутствии стабилизатора - 6-8%-ного раствора ичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического растультразвуком 5-10 с, 2-3 раза. После- 55 ворител исполь;;юГ;;;;о Г;;Гоб:Г;: Рестриктааь, Alu I ньпс соотношени х ичного масла и то- провод т аналогично примеру 1. луола 1,0:12,0-1,0:16,0.

1449582

Выход рестриктаз г Alul 75000 ед/ /10 мл, активность 7500 ед/мл, выход 7500 ед/г биомассы .

В примерах 4-8 иллюстрируютс запредельные значени параметров.

Данные, полученные в результате вьщелени рестриктазы Alul из штамма бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-3670 с использованием разных способов , представлены в табл. 1.

Пример 10. Дл вьщелени рестриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ

° ™ Размораживание биомассы, де15 ° ™ Размораживание биомассы, де25

30

зинтеграцию клеток и вьщеление фермента провод т аналогично примеру 1. Выход рестриктазы Alul 80000 ед/ /10 мл, активность 8000 ед/мл, выход 20 800 ед/г биомассы.

П р и м .е р 11. Дл выделени ре- - стриктазы Alul используют биомассу бактерий Arthrobacter luteus ВКПМ В-1777. Размораживание биомассы, дезинтеграцию клеток и вьщеление фермента провод т аналогично примеру 1.

Выход рестриктазы. Alul 40000 ед/ /10 мл, активность 4000 ед/мл, выход 4000 ед/г биомассы.

Данные, полученные в результате .. вьщелени рестриктазы Alul из разных штаммов бактерий Arthrobacter luteus с использованием различных способов, представлены в табл. 2. 35 Из табл. 2 видно, что при вьщеле- нии рестриктазы Alu1 из разных бактериальных штаммов Arthrobacter luteus происходит увеличение активности и выхода фермента по сравнению с из- 0 вестным способом.

Формула изобретени Способ получени рестриктазы Alul, включающий разрушение клеток Arthrobacter luteus, фракционирование полу

5 ченного лизата и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией и диализом, отличающийс тем, что, с целью повышени стабильности рестриктазы Alul и увеличени

0 выхода целевого продукта, разрушение клеток провод т в присутствии стабилизатора - 6-8%-ного раствора ичного масла в органическом растворителе, причем в качестве органического раст5 ворител исполь;;юГ;;;;о Г;;Гоб:Г;: ньпс соотношени х ичного масла и то- луола 1,0:12,0-1,0:16,0.

Таблица 1

Arthrobac- ter luteus ВКПМ B-3670 15000

15000 10000 10000 7500

2U

7500

Таблиц a 2