HUT63200A - Process for hydroxylating methyl groups in aromatic heterocyclic compounds in microbiological way - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás aromás, 5 vagy 6 szénatomos heterociklusos vegyületek metilcsoportjainak hidroxilezésére mikrobiológiai utón. A találmány továbbá új hibridplazmidokra és termelő tötzsekre vonatkozik, amelyek az új eljárás foganatosítására különösen alkalmasak.

A hidroximetilezett heterociklusos vegyületek például gyógyászati hatóanyagok és mezőgazdasági vegyszerek előállításában értékes közbenső termékek.

Alifás oldalláncok géntechnológiailag megváltoztatott mikroorganizmusokkal végzett terminális hidroxilezésére a 277 674 sz. európai szabadalmi leírás ismertet eljárást. A reakciót az alkán-hidroxiláz enzim katalizálja, amelyet a Pseudomonas oleovorans OCT-plazmidjában lévő alkBA gének kódolnak.

Ezeket a mikroorganizmusokat úgy megváltoztatták, hogy nem képesek a keletkezett hidroxilcsoportot savvá továbboxidálni. A gének természetes kifejeződését és szabályozását (alkR) azonban meghagyták. A mikroorganizmusok heterociklusok metilcsoportjainak oxidálására nem képesek, csak alkánok és 6-12 szénatomos alkilcsoportokkal alkilezett vegyületek hidroxilezését katalizálják.

Ismert továbbá (Harayama és munkatársai, J. Bacteriol. 171, 1989, 5048-5055. old.), hogy a pWWO plazmiddal rendelkező Pseudomonas putida fajhoz tartozó mikroorganizmusok a toluol metilcsoportját három lépésben benzoesavvá oxidálhatják. A xilol-monooxigenáz (xylMA) behatására először benzilalkohol keletkezik, amely két további lépésben alkohol(xvlB) és aldehid-hidroxigenáz (xvlC) enzim katalitikus hatására savvá alakul.

Ebben a törzsben mind a xilolbontás enzimjeit kódoló xvl-gének, mind a xvl-qéneket szabályozó gének a pWWO jelű plazmidon vannak. így ebből a metilcsoport oxidálásáért felelős xvlMABCN gének tulajdonságai, szelekciója, valamint restrikciós térképe is ismert. A xylN gén működése még nem ismert. Jelenleg nem ismert olyan mikrobiológiai eljárás, amellyel 5- vagy 6-tagú heterociklusos vegyületekben a metilcsoportokaz hidroxilezni lehetne. Kémiai utón az ilyen hidroximetilezett heterociklusok csak nehezen hozzáférhetők.

A jelen találmány feladata olyan mikrobiológiai eljárás kidolgozása volt, amellyel aromos 5- vagy 6-tagú heterociklusos vegyületel metilcsoportjait fajlagosan hidroxilezni lehet anélkül, hogy a keletkező tiszta hidroximetil-származékok további katalitikus átalakulást szenvednének.

Ezt a feladatot az 1. igénypont szerint oldottuk meg. A találmány értelmében az eljárásban olyan mikroorganizmusokat használunk, amelyek

a) Pseudomonas TOL-plazmidjának aktív xilol-monooxigenázt képző génjeit tartalmazzák, és

b) kromozomásan vagy plazmidban kódolt hatékony alkohol-dehidrogenázt nem képeznek és így képesek az aromás 5- vagy 6-tagú heterociklusok metilcsoport jait a megfelelő hidroxi-származékká hidroxilez ni, mimellett a heterociklus a reakció szubsztrátumát szolgáltatja, a hidroxilezni kívánt metilcsoporthoz szomszédos szénatomon nem hord szubsztituenst, és a kapott hidroximetil-származék további katalitikus átalakulást nem szenved.

Célszerűen a mikroorganizmusok a Pseudomonas pWWO jelű TOL-plazmidjának xilol-monooxigenázt képező génjeit tartalmazzák, amelyeket az 1. ábrán látható restrikciós térkép jellemez, és amelyeket a J. Bacteriol. 171 /1989/ említett cikkében (Harayama és munkatársai, J. Bacteriol. 171, 1989, 5048-5055. old.) már leírtak.

A xilol-monooxigenázt kódoló genetikai információt úgy szerezhetjük meg, hogy

a) a DNS forrásaként szolgáló mikroorganizmus TOLplazmidjának DNS-át elkülönítjük,

b) a xilol-monooxigenáz-gén kinyerésére a TOL-plazmid-DNS-at emésztjük,

c) a fajlagos gén-szekvenciát expressziós vektorba juttatjuk, aminek következtében

d) hibridvektor keletkezik. A hibridplazmidot

e) az eljárás szempontjából alkalmas mikroorganizmusba (gazdatörzsbe)

f) transzformálhatjuk. Az így kapott transzformált gazdatörzs a

g) termelő törzset képezi

h) (szelektálás után)

i) a találmány szerinti fermentációs eljárásban.

a) A TOL-plazmid-DNS elkülönítése

A TOL-plazmid-DNS-at a szakember számára ismert módszerrel kaphatjuk, például Hansen és Olsen (J. Bacteriol. 135, 1978, 227-238) vagy Humphreys és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 383, 1975, 457-483) módszerével. Nagyobb mennyiségű TOL-plazmid-DNS elkülenítésére célszerűen Humphreys és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 383, 1975, 457-483) módszerét alkalmazzuk, azaz Pseudomonas putida (ATCC 33015) mikroorganizmusokat teljesen lizálunk, és ezt követően sűrűségi gradienssel végzett centrifugálás utján a TOL-plazmidot elkülönítjük.

b) Restrikcióenzimes bontás és a DNS elkülönítése agarózqélen végzett elektroforézissei

A TOL-plazmid-DNS-at elkülenítése után Sáli és Hindui restrikciós enzimmel vágjuk és a xilol-monooxigenázt kódoló DNS-szakaszt agaróz-gélen végzett elektroforézissel elkülönítjük a Current Protocols (in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, 2.6. fejezet Isolation and Purification og Large DNA-Restriction Fragments from Agarose Gels) útmutatása alapján.

Az elkülönített DNS-szakaszra az 1. ábra szerinti restrikciós térkép jellemző. A DNS-szakaszban nincs olyan gén, amely hatásos alkohol-dehidrogenázt kódol.

c) A DNS-szakasz beépítése expressziós vektorba

A fentiek szerint kapott génszakaszt a szokásos molekula-biológiai technikával előzőleg szintén vágott expressiós vektor-DNS-al hibridplazmiddá ligálhatjuk.

Az expressiós vektorok általában alkalmas, többnyire • ·

- 6 szabályozható promotort tartalmaznak. Az átiródás irányában a promotor mögött előnyösen egy vagy több szinguláris vágóhely van. Ezekbe a vágóhelyekbe illesztik a kifejezni kívánt génszakaszt.

Expressziós vektorként célszerűen az 1. táblázatban feltüntetett vektorok valamelyikét alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárásban célszerű a széles gazdaspektrumú vektorok (broad hőst rangé), így pME285, pKT240, pMMB67EH vagy pMMB67EH* alkalmazása.

Az expressziós vektort célszerűen a Sáli és Hindin restrikciós enzimekkel vágjuk, és a keletkezett restrikciós végeket az elkülönített TOL-plazmid-DNS-al például T4-DNSligázzal ligáljuk. A ligálást más módon is végezhetjük, pl. Current Protocols (in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, 3.16. szakasz Subcloning of DNS-fragments) szerint.

d) Hibridplazmidok

Az így kapott pLO3, pL04 és pLO5 jelű plazmidok szintén a találmány tárgyához tartoznak. Gazdaspekrumuk széles, ezért szubsztrátum és közeg vonatkozásában igen türőképes gazdatörzsekbe ültethetők.

A hibridplazmidok többnyire le vannak kapcsolva a természetes szabályozó rendszertől. Ennek megfelelően a pLO4 hibridplazmidra, amely a pMMB67EH expressziós vektorból és a TOL-plazmid-génből áll, a már említett restrikciós térkép és a Ptac, promotor jellemző, az ellenőrzést a laclg represszor-gén látja el. Ezek szerint a TOL-plazmidgének expresszióját izopropil-tiogalaktoziddal (IPTG) indukálhatjuk.

A pLO5 hibridplazmidban (amely a pMMb67EH* expreszsziós vektorból és az 1. ábra szerinti TOL-plazmid-génből áll és Ptac, promotorral rendelkezik) a TOL-plazmid-gén expressziója állandó jelleggel indukált, mert hiányzik a laclg represszor-gén.

Ezt célszerűen úgy oldjuk meg, hogy kanamicin-rezisztencia-gén bejuttatásával a pMMB67EH* laqlq represszorgén j ét módosítjuk.

Szükebb gazdaspektrumú hibridplazmidot is alkalmazhatunk. Ilyen például a a lambda Pl promotorral rendelkező pGSH2836; itt is állandó jellegű a TOL-plazmid-gének kifejeződése. Ha a pGSH2836 plazmid gazdasejtje az Escherichia coli ÍE. coli) K12*, az ott kromozómában meglévő cI857 represszorgént hő behatásával inaktiválni kell, hogy a lambda Pl promotor kifejeződjék.

A pGSH2836 hibridplazmid E. coli K12* törzsbe inkorporálva DSM 6154 szám alatt letétben van (Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, NSZK). A pLO4 és pLO5 hibridplazmidok a következő bekezdésekben foglaltak szerint E. coli K12* -ben (pLO4) illetve Pseudomonas putida- bán (pLO5) inkorporálva letétben vannak.

e) Gazdatörzsek

A pLO3, pLO és pLO5 hibridplazmidok széles gazdaspektrumuk alapján számos mikroorganizmustörzybe juttathatók.

Előnyös, ha a gazdatörzs a különböző szubsztrátumokat és közegeket jól tolerálja, így például a Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobakterium vagy Escherichía nemzetséghez tartozó törzseket alkalmazhatunk.

f) Transzforrnálás

A hibridplazmidokat a szokásos eljárásokkal juttathatjuk a felsorolt törzsek valamelyikébe. Lederberg és Cohen (J. Bacteriol. 119, 1974, 1072-1074) módszerét előnyben részesítjük.

g) Termelő törzsek

Termelő törzsként célszerűen a 2. táblázatban felsoroltakat alkalmazzuk. A pLO3, pLO4 és pLO5 plazmidokkal transzformált mikroorganizmusok (2. táblázat) újak és így szintén a találmány tárgyához tartoznak.

Előnyösen az E. coli K12* mikroorganizmust transzformáljuk pL04 hibridplazmiddal (ez az együttest 1990. 08. 29én DSM 6153 szám alatt helyeztük letétbe), vagy Pseudomonas putida JD7 mikroorganizmust pLO5 hibridplazmiddal (az így transzformált törzset 1990. 08. 29-én DSM 6152 szám alatt helyeztük letétbe). Ezeket a törzseket vagy mutánsaikat és variánsaikat alkalmazzuk termelő törzsként.

A letétbe helyezést a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ( Mascheroderweg lb, D-3300 Braunschweig) intézménnyel eszközöltük.

Termelő törzsként olyan mikroorganizmust is alkalmazhatunk, amely természetes TOL-plazmidot tartalmaz; a hatásos alkohol-dehidrogénázt kódoló gént az esetben eltávolítani ·· ’· · « « « 4 « «· ♦ · « * « · · > τ · ί • · * 9 · «« «

- 9 vagy inaktiválni kell. Az inaktiválás illetve eltávolítás transzponzon-inzerten keresztül klasszikus mutációkiváltás utján történhet, pl. akridin-naranccsal, de az alábbi irodalomban leírt, homológ rekombinációjú Gene-replacement módszerrel (A. Zimmermann és munkatársai, Molecular Microbiology 5, 1991, 1483-1490) is elvégezhető.

A termelő törzsekben lezajlik majd a TOL-plazmid-gén kifejeződése, amelyet például toluollal, xilollal vagy kumollal indukálhatunk.

Az alkohol-dehidrogenáz-gént célszerűen úgy távolítjuk el, hogy előzetesen segéd-hibridplazmidot készítünk, amelyből az alkohol-dehidrogenáz-gént már eltávolítottuk, és ezt a segédplazmidot homológ rekombináció során bejuttatjuk a természetes TOL-plazmidba (Gene-replacement). Ezzel az alkohol-dehidrogenázt a természetes TOL-plazmidból eltávolítottuk.

h) A transzformált mikroorganizmusok (termelő törzsek) szelektálása

A transzformált mikroorganizmusokat glükóz-agaros minimál-táptalajón a szokásos módon alkalmas antibiotikumok gétló koncentrációi segítségével szelektálhatjuk. Az alkalmazott antibiotikum-rezisztenciák az 1. táblázatból vehető ki.

i) A fermentálás

Az előzőek szerint előállított termelő törzsek, valamint mutánsaik és variánsaik a találmány szerinti eljárás során felhasználhatók aromás 5- vagy 6-tagú heterocilusos vegyületek metilcsoportjainak hidroxilezésére.

A reakció szubsztrátumaként 5- vagy 6-tagú, metilezett aromás heterociklusos vegyületeket alkalmazunk, amelyek heteroatomként egy vagy több oxigén-, nitrogén- és/vagy kénatomot tartalmaznak. Alkalmas 5 tagú heterociklusok például: metilezett tiofen-, furán-, pirrol-, tiazol-, pirazol- és imidazol-vegyületek, amelyek a hidroxilezni kívánt metilcsoporthoz szomszédos szénatomon szubsztituenst nem hordoznak. Az 5-tagú heterociklusos vegyületek közül előnyösen 3,5-dimetil-pirazol, 4-metil-tiazol és 2,5-dimetil-tiofén alkalmazható.

A 6-tagú heterociklusos vevyületek közül például metilezett piridin-, pirimidin-, pirazin- és piridazinszármazékok alkalmazhatók, amennyiben a hidroxilezni kívánt metilcsoporthoz szomszédos szénatomom nem hordoznak szubsztituenst. Előnyösen 2-klór-5-metil-piridint, 2,5-dimetilpirazint és 2,6-dimetil-pirimidint hidroxilezünk.

A szubsztrátum adagolása előtt a sejteket 1 és 200 közötti, előnyösen 5 és 100 közötti optikai sűrűségig (650 nm-nél mérve; ΟΟθ₅₀) tenyésztjük a tápközegben.

A szubsztrátumot vagy egyszerre, vagy folyamatosan adagoljuk a tenyészközegbe, ügyelve arra, hogy a tenyészlé szubsztrátum-koncentrációja a 20 vegyes%-ot illetve folyékony szubsztrátum esetén tf%-ot ne haladja meg. Előnyösen a szubsztrátum-adagolást úgy ütemezzük, hogy a tenyészlé szubsztrátum-koncentrációja az 5 %-ot (vegyes%, ill. tf%) ne haladja meg.

Az eljárást előnyösen pihenő sejtekkel, 4 és 11 közötti, előnyösen 6 és 10 közötti pH mellett, 15-50 °C-on, előnyösen 25-45 °C-on valósítjuk meg.

A reakció befejeztével a hidroximetil-származékot ismert módon elkülöníthetjük.

1. példa

Az xylMA gének klónozása

1.1 A plazmid kinyerse

Humphreys és munkatársai (Biochem. Biophys. Acta 383, 1975, 457-483)

Pseudomonas putida pWWO (ATCC 33015) kinőtt baktériumkultura 1 literjőben lévő sejteket kicentrifugálunk. A sejteket 10 ml 25 % szacharózt tartalmazó 0,05 M triszpufferben (pH 8,0) újra szuszpendáljuk, majd 1,5 ml lizozimoldatot (20 mg/ml, 0,25 M trisz-pufferban, pH 8,0) adagolunk. Az elegyet 5 percig jégre tesszük, utána 10 ml 0,25 M Na₂EDTA-t (pH 8) adagolunk, és az elegyet újabb 5 percig jégre tesszük. Ezt követően 15 ml Brij^R polioxietilénlauril-éter/DCL-oldatot (1 % Brij^R 58, 0,4 % nátrium-dezoxikolát 0,001 M Na₂EDTA.t tartalmazó 0,01 M trisz-pufférrel készített oldata, pH 8,0). Az elegyet egyenletesen homogenizáljuk és utána 30 percig jégre tesszük, a sejtlízis teljes befejeződéséig.

A lizált oldatot 45 percen keresztül 4 °C-on 16 000 perc^-1 fordulatszám mellett centrifugáljuk, majd a felülúszót autoklávos mérőhengerbe dekantáljuk. 3 vegyes% nátrium-klorid és 10 tf% polietilénglikol adagolása után a lezárt hengert óvatosan forgatjuk, így oldatot kapunk. Az oldatot 4 °C-on 2 órára inkubáljuk, 2 percen át 5000 perc^-1 fordulatszám mellett centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk és a csapadékot 5 ml TES-pufferban (0,05 M trisz, 0,005 M Na2EDTA, 0,05 M NaCl, pH 8,0) oldjuk; az oldatot autoklávos 15 ml-es corex csőbe öntjük, 8,0 g cezium-kloridot és 0,6 ml etidiumbromidoldatot (10 mg/ml) adunk hozzá és az elegyet 30 percen át jégén tartjuk.

°C-on 12 000 perc^-1 fordulatszám mellett 30 percen keresztül végzett centrifugálás után óvatosan dekantáljuk, a kicsapódott polietilénglikol eltávolítására. Az oldatot zárt csőben 50TI-tipusu rotorral 40 000 perc^-1 fordulatszám mellett 18 °C-on 30 percen keresztül centrifugáljuk. A plazmidsávot UV-átvilágító előtt fecskendővel eltávolítjuk a CsCl-gradiensből. Az elegyet n-butanollal kirázva az etidiumbromidot eltávolítjuk. A plazmid-DNS-t izopropanollal kicsapjuk, a csapadékot Speed Vác Concentrator típusú vákuumos szárítóberendezésben szárítjuk. Utána a plazmidkészítményt 0,01 M triszpufferban,amely 0,001 M Na₂EDTA-t tartalmaz (pH 8,0), újra szuszpendáljuk.

1.2 DBS-fragmensek (xylMA) elkülönítése agaróz-gélből

A plazmid-DNS-t Sáli és Hindui restrikciós enzimekkel (1 Mg plazmid-DNS-re számítva 4-4 egység) vágtuk, majd agaróz-gélen preparatív gélelektroforézisnek vetjük alá (0,6 vegyes% agarózTBE-pufferban, amelynek összetétele: 0,09 M trisz-borát, 2,5 mM Na₂EDTA, pH 8,3, etidiumbromid 100 Mg/ml mennyiségben).

• · · ·

- 13 DEAE-cellulóz-membránt kis csíkokra vágunk, a csíkokat vízben duzzasztjuk. Az elektroforetikus szétválasztásban használt agarózlemezt közvetlenül a kívánt DNS-sáv előtt felhasítjuk és a hasítékba DEAE-cellulóz csíkot dugunk. A feszültségtérben a DNS továbbvándorol és felfut az útjában lévő cellulózcsíkra. Más sávokat további cellulóz-csíkokkal visszatartjuk. A cellulóz-csíkból a DNS-t 500 μΐ eluáló pufferrel (20 mM trisz, pH 7,5, 1 mM Na₂EDTA, 1,5 M NaCl) 65 °C-on 1 óra alatt kimossuk. A membráncsókot kivesszük a pufferból és leöblítjük. A DNS-oldatból az etidiumbromidot vízzel telített n-butanollal extraháljuk, majd a DNS-t izopropanollal kicsapjuk. A csapadékot Speed Vác Concentrator típusú vákuumos szárítóberendezésben szárítjuk. Utána a készítményt 0,01 M triszpufferban,amely 0,001 M Na₂EDTA-t tartalmaz (pH 8,0), újra szuszpendáljuk.

1.3 xyIMA DNS-fragmensek és az expressiós vektorok ligálása (current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York /1989/, 3.16. szakkasz, Subcloning of DNAfragments)

a) pL04 hibridvektor előállítása

Az expressziós vektor DNS-ának előkészítése

Ligálás előtt a pMMB67EH-vektor 2 ng DNS-át 10 egység Sáli és 10 egység Hindin restrikciós enzimekkel vágjuk a megfelelő ligációs pufferben (20 mM trisz-puffér, 10 mM DTT /ditioeritritol/, 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP, pH 7,2). A vágott DNS-t 4,8 egység alkálikos foszfátázzál defoszfori14 lezzük, izopropanollal kicsapjuk és mossuk.

A xylMA-DNS és a vektor-DNS liqálása

Ligáláshoz a DNS-mintákat (különböző mennyiségi arányokkal, a beépíteni kívánt DNS feleslege mellett) egyesítjük, izopropanollal kicsapjuk, a szárított csapadékot 40-100 μΐ ligációs pufferban felvesszük (20 mM trisz-puffer, 10 mM DTT /ditioeritritol/, 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP, pH 7,2). Egy μg DNS-ra számítva 0,2 egység T4-DNS-ligázt adagolunk, és az elegyet 12-16 °C-on egy éjszakán át állni hagyjuk. A ligáit elegyet közvetlenül használjuk fel transzformálásra.

b) pL05 hibridvektor előállítása

Az 1.3 a) pontban ismertettek alapján a pMMB67EH* expressziós vektort előkészítjük, és a xvlMA-qéneket beleligáljuk a vektorba.

1.4 Kompetens sejtek transzformálása hibridplazmid-DNS-sal (pLO4)

a) A hibridplazmid-DNS (pL04) dúsítása

Az E. coli S17-1 segédtörzs tenyészetének 25 ml-jében lévő sejteket elkülönítjük, amikor a tenyészet optikai sűrűsége OD546 = 2,0. A sejteket Lederberg és Cohen (J. Bacteriol. 119 /1974/, 1072-1074) módszerével kompetenssé tesszük.

A sejteket 10 ml 0,1 M MgCl₂-oldatban mossuk, majd 10 ml 0,1 M CaCl₂-oldatban jégen tartjuk 30 percig. A sejteket centrifugáljuk és ml 0,1 M CaCl₂-oldatban újraszuszpendáljuk. A sejtszuszpenzió 0,2-0,2 ml-jét összekeverjük 0,5 μg ligáit hibridplazmid-DNS-sal, majd az elegyet 30 percen át jégén, 2 percen át 42 °C-on (hősokk) tartjuk. A sejtszuszpenziókat előmelegített Nutrient Yeast Broth (Oxoid, Wesel, NSZK) tápközeggel 5 ml-re feltöltjük és 1 órán át rázás nélkül, 1 órán át rázva, a befogadó sejtek (E. coli S17-1) optimális növekedési feltételei mellett inkubáljuk. A transzformált tenyészetek mintáit szelektív táptalajon (tápagar 100 Mg ampicillin/ml) helyeztük.

b) pL04 transzformálása termelő törzsbe

Az E. coli S17-1 segédtörzsből a hibridplazmidot az 1.1 és 1.2 pontban leírtak szerint elkülönítjük. Utána az E. coli K-12* törzset az 1.4 a) alatt leírtak szerint pLO4 hibridplazmiddal transzformáljuk. Szelektáláshoz ml-enként 100 Mg ampicillint tartalmazó szelektív agar táptalajt használunk.

1.5 Kompetens sejtek transzformálása pLO5 hibridplazmiddal

Az 1.4 pont alatt leírtak szerint pLO5 hibridplazmidot Pseudomonas putida JD7 transzformáltuk. A szelektálás szelektív tápagaron (50 mű kanamicin/ml) történik.

2-8. példák

Az 1.3 pont szerint a pLO3 hibridplazmidot állítjuk elő. Az 1.4 és 1.5 pontban leírtak szerint a pGSH2836, pLO3, pLO4 és pLO5 hibridplazmidokat az E. coli K12*. Pseudomonas aeruqinosa PAO25, Pseudomonas putida JD7 és Pseudomonas putida gazdasejtekbe transzformáljuk. A 2. táblázatban összefoglaltuk a fentiek szerint kapott termelő törzsek ···· ·· ···· · · • · · · · · • · · · · ·· · hozamát.

9. példa

A xvlB-mutáns szerkesztése

A pGSH2816 plazmidból (Haramaya és munkatársai, J. Bacteriol. 171, 1989) EcoRI és Hpal enzimekkel végzett vágással kivettük a xylMABCN géneket, majd a hasonlóképpen vágott,azaz nyitott pBR322 vektorba (Bolivár és munkatársai, Gene 2, 1977, 95. oldaltól kezdve) ligáljuk.

9.1.1 Restrikciós enzimekkel végzett vágás és a DNS elkülönítése aqaróz-elektroforetikusan

Az EcoRI és Hpal enzimekkel vágott pGSH2816-DNS-t (5-5 egység enzim/^g DNS) agarózgélen végzett preparatív gélelektroforézis szétválasztjuk (0,7 % agaróz 0,09 M triszborát-pufferban, amely 2,5 mM Na-EDTA-t tartalmaz, pH 8,3), és a keresett méretű DNS-fragmenseket az 1.2 példa szerint elkülönítjük.

a. A vektor-DNS előkészítése

Ligálás előtt a pBR322-DNS-t (2 Mg) 10-10 egységnyi EcoRI és Scal enzimekkel restrikciós pufferben (50 mM trisz, 10 mM MgCl₂, 100 mM ) szétválasztjuk. A 3850 bp-nyi sávot a 9.1.1 pontban leírtak szerint elkülönítjük.

b. Ligálás

Ligáláshoz a DNS-mintákat (különböző mennyiségi arányokkal, a beépíteni kívánt DNS feleslege mellett) egyesítjük, ligációs puffért adunk hozzá (20 mM trisz-puffér, 10 mM DTT /ditioeritritol/, 10 mM MgC12, 0,6 mM ATP, pH 7,2). Egy • ·

- 17 egység T4-DNS-ligázt adagolunk, és az elegyet 12-16 °C-on egy éjszakán át állni hagyjuk. A ligáit elegyet közvetlenül haszáljuk fel transzformálásra.

c. E. coli C600 transzformálása (az 1.4 példa szerint)

A szelektálást tetraciklint tartalmazó (25 μg/μl) tápagaron végezzük. Restrikciós ellenőrzés után nagyobb mennyiségű pLOlO-DNS-t tisztítjuk CsCl-gradiens segítségével.

9.2____A pLOll plazmid szerkesztése

9.2.1 pLOlO-DNS vágása restrikciós enzimekkel μυ pLOlO-DNS-t 22 egységnyi HindlII enzimmel restrikciós pufferban vágunk (10 mM trisz, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5) majd agaróz gélen preparatív elektroforézisnek vetjük alá. Két fragmenst - 3,8 kb, illetve a 2,9 kb-nyit - a 9.1.1 példa szerint elkülönítünk és 45, illetve 30 μΐ vízben felvesszük. A fragmensek a pBR322 vektort és a - a xvlB kivételével - a xvl-gének tartományát tartalmazza.

9.2.2 Liqálás

A 9.2.1 szerint elkülönített két fragmenst a 9.1.2b pont szerint ligáijuk. 45 μΐ 3,8 kb fragmens, 30 μΐ 2,8 kb fragmens, 10 μΐ ligációs puffer, 10 μΐ 10 mM ATP és 1 μΐ T4-DNS-ligáz elegyét 12-16 °C-on egy éjszakán át állni hagyjuk. Utána a DNS-t etanollal kicsapjuk és 10 μΐ vízben felvesszük.

9.2.3 E. coli HB101 transzformálása

A 9.2.2 szerint kapott DNS-t közvetlenül E. coli HB101

- 18 transzformálásához használjuk fel (a 9.1.2c példához analóg módon. A transzformált sejteket 25 μς/μΐ tetraciklint tartalmazó táptalajon szelektáljuk.

9.3 pLOll bejuttatása olyan E. coli HB 101 sejtbe, amely PRK2013 plazmidot tartalmaz

A pLOll plazmid gazdájának olyan E. coli HB101 sejtet választunk, amely a pRK2013 plazmidot is tartalmazza. Az ezen a plazmidon kódolt funkciók lehetővé teszik az információk továbbadása más gram-negatív baktériumba, pl. Pseudomonas putida JD7 baktériumba, a pWWO plazmid felhasználásával.

Az elkülönített pLOll-DNS-t a 9.1.2a példa szerint olyan E. coli HB101 sejtbe juttatjuk, amely a pRK2013 plazmidot is tartalmazza. A szelektálást 25 μg/μl tetraciklint és 25 μg/μl kanamicint tartalmazó táptalajon végezzük.

9.4 A pLOll és a PRK2013 plazmidot tartalmazó E. coli HB101 és a pWWO plazmidot tartalmazó Pseudomonas putida JD7 konjugálása

A két konjugációs partner egyéjszakás tenyészetéből két ml-t centrifugálunk, a sejteket többszörösen 0,9 t%-os NaCl-oldattal mossuk, 100 μΐ ilyen oldatban felvesszük és táptalaj lemezeken összekeverjük. A lemezeket 30 °C-on 6 órán át inkubáljuk. A kapott baktériumgyepet 1 ml 0,9 %-os NaCl-oldatban szuszpendáljuk és alkalmas hígításokban tetraciklint (50 μg/μl) tartalmazó táptalajon szélesztjük. A homológ rekombináció alapján feltételezhető, hogy a kapott transzkomjugált sejtek közül néhány a pLOll plazmidot fel·«

- 19 vette a TOL-plazmidba.

9.5 ____Jelcsere pLOll és pWWo között

A Pseudomonas putida JD7 pWWO TOL-plazmidján lévő xylB gént akarjuk eltávolítani. Ehhez a 9.4 szerint kapott transzkonjugált E. coli sejteket kb. 100 generáción keresztül tenyésztjük antibiotikummal kiváltott szelekciós nyomás nélkül. Kívánatos volt a pBR322 és a működő xvlB-gén eltűnése. Hogy a tetraciklinnel szemben érzékeny xvlB-mutánsok számát növeljük, az integrált pBR322 vektorral szemben szelektálunk az alábbiak szerint:

ml élesztőkivonat tartalmú komplex tápközegben (Oxoid, Wesel, BRD), amely μΐ-enként 50 μg tetraciklint tartalmaz, sejteket szuszpendálunk és 30 °C-on inkubálunk, mig az optikai sűrűség ODg5Q kb. 3,0 nem lesz. Utána az elegyhez 500 μg/ml cikloszerint és 100 μg/ml piperacillint adunk, és a tenyészetet tovább inkubáljuk 30 °C-on. Néhány óra elteltével a sejtek majdnem teljesen feloldódnak. A túlélő sejteket centrifugáljuk, 0,9 %-os NaCl-oldatban mossuk és alkalmas hígításokban tápagaron szélesztjük. A kapott telepek közel 85 %-a tetraciklinnel szemben érzékeny.

9.6 A telep megvizsgálása a xvlB-gén eltűnésének a kimutatására

9.6.1 Az eltűnés kimutatása Southern Biot hibridizálással

A kapott kiónok pWWO'-DNS-át Kado és Liu (J. Bacteriol. 145, 1365-1373. old. /1981/) módszerével elkkülönítjük. Ehhez 1 ml egyéjszakás tenyészetet centrifugáljuk és a sejteket 40 mM trisz-acetát pufferban (2 mM EDTA, pH 7,9) újra

- 20 szuszpendáljuk. 200 μΐ 12,6 pH-jú, 3 %-os SDS adagolásával a sejteket lizáljuk, 65 °C-on egy úrán át inkubáljuk és végül fenol és klroform 1:1 tömegarányú elegyével többszörösen extraháljuk. A vizes DNS-oldatot dietil-éterrel fenolmentesre mossuk és 1/10 térfogatnyi 3M nátrium-acetát-oldatot (pH 4,8) adagolunkk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, szárítjuk és 100 μΐ vízben felvesszük.

Ebből a mintából kb. 40 μΐ-t 100 egység EcoRI és 5 egység Hpal enzimmel emésztő pufferban (50 mM trisz, 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,5) vágunk és agaróz-gélen végzett elektroforézissel a komponenseket szétválasztjuk. A nitrocellulóz membránokra átvitt DNS-t 500 ng ³²P-ATP-val jelzett pLOll szondával hibridizáljuk. Az 1,4 kb xvlB-hiánv az autoradiogramon közvetlenül látható.

10. példa

Hidroximetilezett heterociklusok előállítása

A pLO4 plazmiddal rendelkező E. coli K12* törzset (DSM 6153) élesztőkivonat tartalmú tápközegben, az 1. táblázatban felsorolt antibiotikumok adagolása mellett 30 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk az 1.4 példa szerint. Ezzel friss közeget oltunk be és a tenyészetet további 2 órán át inkubáljuk 30 °C-on, mielőtt a xilol-monooxigenáz-géneket (lásd 1. táblázat) beindítanánk. A beindítás 1 mM IPTG adagolásával történik, ami a tac-promotor vezérelte kifejeződést indukálja. Az indukálás ideje 2-4 óra. A baktérium szuszpenziót centrifugáljuk, és a sejteket annyi friss, antibiotikummentes közegben szuszpendáljuk, hogy 10 körüli OD^sq érték áll be. A szuszpenzióhoz 0,1 % (folyékony anyagok esetére tf-%, szilárd anyagok esetére vegyes%) oxidálni kívánt heterociklust adunk. Az elegyet 30 °C-on tovább inkubáljuk. Időközönként a tenyészetet vizsgáljuk végtermék szempontjából .

11. példa

A 10. példa szerint pLO5 plazmidot tartalmazó Pseudomonas putida mikroorganizmust tenyésztünk. Tekintettel arra, hogy ebben nincs laclq represszorgén, nem kellett IPTG-vel indukálni a génkifejeződést. A törzset a 10. példa szerint heterociklusos vegyületek hidroxilezésére használjuk.

12. példa

A 10. példa szerint a pGSH2839 plazmidot tartalmazó E. coli K12* törzset (DSM 6154) használjuk. Az indukálás a represszorgén termikus inaktiválása utján történik (2 órán át 42 °C-on).

13. és 14. példa

A 2-8. példák szerint előállított termelő törzseket a

10. példa szerint alkalmazzuk heterociklusok hidroxilezésére.

15-20. példa

A 12. példában szereplő termelő törzzsel különböző heterociklusos vegyületeket reagáltatunk. Az elért hozamokat a

3. táblázat mutatja.

• · · • ·

η CM

I táblázat

CN

• · · · • · • ·

3. táblázat

Metilezett aromás heterociklusos vegyületek mikrobiológiai oxidálása a pGSH2836 expressziós vektort tartalmazó E. coli K12 mikroorganizmus felhasználásával 16 órás reakcióidővel

Claims (14)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Mikrobiológiai eljárás aromás heterociklusos vegyületek metilcsoportjainak a hidroxilezésére, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást olyan mikroorganizmussal végezzük, amely

   a) Pseudomonas TOL-plazmidjának aktív xilol-monooxigenázt képző génjeit tartalmazza, és

   b) kromozomásan vagy plazmidban kódolt hatékony alkohol-dehidrogenázt nem képez és így képes az aromás 5- vagy 6-tagú heterociklusok metilcsoport jait a megfelelő hidroxi-származékká hidroxilezni, mimellett a heterociklus a reakció szubsztrátumát szolgáltatja, a hidroxilezni kívánt metilcsoporthoz szomszédos szénatomon nem hord szubsztituenst, és a kapott hidroximetil-származék további katalitikus átalakulást nem szenved.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatáshoz olyan mikroorganizmust használunk, amelynek génjeit Pseudomonas TOL-plazmidjából származnak, amely aktív monooxigenázt nem képez, és a gén az 1. ábra szerinti restrkciós térképpel jellemezhető.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobakterium vagy Escherichia nemzetséghez tartozó törzseket alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatáshoz olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amely természetes TOL-plazmidot tartalmaz, • •«4 * · « · · t * · · • · · · · · • * · 9 · ·· «

   - 26 amelyben a hatásos alkohol-dehidrogenázt kódoló gént eltávolítottuk vagy inaktiváltuk.
5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatáshoz a pGDH2836 hibridplazmiddal transzformált Escherichia coli K12* mikroorganizmusot (DSM 6154) vagy variánsait és mutánsait alkalmazzuk.
6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatáshoz a pLO4 hibridpia zmiddal transzformált Escherichia coli KI2* mikroorganizmusot (DSM 6153) vagy variánsait és mutánsait alkalmazzuk .
7. 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatáshoz a pL05 hibridplazmiddal transzformált Pseudomonas putida JD7 (DSM 6152) mikroorganizmuwsot vagy variánsait és mutánsait alkalmazzuk.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként 5 vagy 6-tagú metilezett heterociklusos vegyületet alkalmazunk, amely egy vagy több oxigén-, nitrogén- és/vagy kénatomot tartalmaz a gyűrűben.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatás során a szubsztrátum koncentrációját egyszeri vagy folyamatos adagolásával 20 % (vegyes% vagy tf%) alatti értéken tartjuk.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagáltatást 15-50 °C-on, 4 és 11 • · ·« közötti pH mellett végezzük.
11. 11. pL04 sz. hibridplazmid (DSM 6153), amely a pMMB67EH expressziós vektorból és Pseudomonas 2. igénypont szerinti TOL-plazmidjának a génjeiből áll, hosszúsága 2,35 kb, egy SAH- és egy HindlII-vágóhellyel rendelkezik, és Escherichia coli K12* baktériumban van letétbehelyezve.
12. 12. pLO5 sz. hibridplazmid (DSM 6152), amely a pMMB67EH* expressziós vektorból és Pseudomonas 2. igénypont szerinti TOL-plazmidjának a génjeiből áll, hosszúsága

    2,35 kb, egy SA1I- és egy HindlII-vágóhellyel rendelkezik, és Pseudomonas putida JD7 baktériumban van letétbehelyezve.
13. 13. A pLO4 hibridplazmiddal transzformált Escherichia coli K12* mikroorganizmus (DSM 6153), valamint mutánsai és variánsai.
14. 14. A pLO5 hibridplazmiddal transzformált Pseudomonas putida JD7 mikroorganizmus (DSM 6152), valamint mutánsai és variánsai.