JPH06153926A - プラスミドを安定化するための微生物 - Google Patents
プラスミドを安定化するための微生物Info
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- JPH06153926A JPH06153926A JP4312450A JP31245092A JPH06153926A JP H06153926 A JPH06153926 A JP H06153926A JP 4312450 A JP4312450 A JP 4312450A JP 31245092 A JP31245092 A JP 31245092A JP H06153926 A JPH06153926 A JP H06153926A
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- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ベタイン利用に関して安定したプラスミドを
有する新規な微生物を開示する。 【構成】 この新規な微生物は、ａ）ベタインの利用に
関して暗号付けする遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を有す
るハイブリッドプラスミド、および、ｂ）染色体のベタ
イン利用に関して暗号付けする遺伝子における突然変異
を含む。
有する新規な微生物を開示する。 【構成】 この新規な微生物は、ａ）ベタインの利用に
関して暗号付けする遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を有す
るハイブリッドプラスミド、および、ｂ）染色体のベタ
イン利用に関して暗号付けする遺伝子における突然変異
を含む。
Description
【０００１】本発明は、新規なＤＮＡ断片を含む新規な
ハイブリッドプラスミドで形質転換した新規な微生物、
それらの製造方法ならびに安定したプラスミドを有する
生産品種のためのそれらの微生物の利用に関する。
ハイブリッドプラスミドで形質転換した新規な微生物、
それらの製造方法ならびに安定したプラスミドを有する
生産品種のためのそれらの微生物の利用に関する。
【０００２】一般に分子生物学において特定の化合物を
製造するために、この特定の化合物に関してコード化す
る遺伝子を取り入れる、いわゆる「人造」プラスミドで
微生物を形質転換することが知られている。
製造するために、この特定の化合物に関してコード化す
る遺伝子を取り入れる、いわゆる「人造」プラスミドで
微生物を形質転換することが知られている。
【０００３】このプラスミドの問題点は、とくにその安
定性、すなわちそれが微生物の細胞分裂の際に子細胞に
正しく伝わらないという性質である。 そのために、発
酵工程の際に、プラスミドを全く、またはほとんど含ま
ない子細胞が次から次へと生じることになる。
定性、すなわちそれが微生物の細胞分裂の際に子細胞に
正しく伝わらないという性質である。 そのために、発
酵工程の際に、プラスミドを全く、またはほとんど含ま
ない子細胞が次から次へと生じることになる。
【０００４】実験室規模では、そのプラスミドが相当す
る抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質をその培養基に加
えることにより、このプラスミド損失に対処することが
できる。 しかし、大規模な発酵では、前述の抗生物質
の添加は不利であることがわかっている。 たとえばテ
トラサイクリンのようなある種の抗生物質は、成長、分
裂および繁殖能力プラスミドを含む微生物に不利な影響
を示す（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，５，１
９８５，２９〜３７頁；Ｇｅｎｅ，３９，１９８５，１
７３〜１８０頁）。 抗生物質による安定化のもう一つ
の欠点は、抗生物質の添加がとくに大規模発酵の場合に
は経費がかかりすぎることである。 その上、医薬品の
製造ならびに食品添加物や試料添加物の製造では、抗生
物質の添加は好ましくない、または許容できない。
る抗生物質耐性遺伝子を含む抗生物質をその培養基に加
えることにより、このプラスミド損失に対処することが
できる。 しかし、大規模な発酵では、前述の抗生物質
の添加は不利であることがわかっている。 たとえばテ
トラサイクリンのようなある種の抗生物質は、成長、分
裂および繁殖能力プラスミドを含む微生物に不利な影響
を示す（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ，５，１
９８５，２９〜３７頁；Ｇｅｎｅ，３９，１９８５，１
７３〜１８０頁）。 抗生物質による安定化のもう一つ
の欠点は、抗生物質の添加がとくに大規模発酵の場合に
は経費がかかりすぎることである。 その上、医薬品の
製造ならびに食品添加物や試料添加物の製造では、抗生
物質の添加は好ましくない、または許容できない。
【０００５】このプラスミド損失に対処するための別の
方法が、Ｈ．サコダおよびＴ．イマナカによりＪ．Ｆｅ
ｒｍｅｎｔ． ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．，６９巻，１９９
０，７５〜７８頁に記載されている。
方法が、Ｈ．サコダおよびＴ．イマナカによりＪ．Ｆｅ
ｒｍｅｎｔ． ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．，６９巻，１９９
０，７５〜７８頁に記載されている。
【０００６】この方法は安定した「宿主組換え型」プラ
スミド系を含むが、そこではまずトリプトファン−オペ
ロンを宿主の染色体中で欠失し、そのために宿主細胞が
トリプトファン輸送に対して不活性になる。 続いて、
このトリプトファン−オペロンを有する組換えプラスミ
ドにより宿主細胞が形質転換される。 次いでこの組換
えプラスミドを備えた宿主細胞の選択が、トリプトファ
ン輸送により行なわれる。
スミド系を含むが、そこではまずトリプトファン−オペ
ロンを宿主の染色体中で欠失し、そのために宿主細胞が
トリプトファン輸送に対して不活性になる。 続いて、
このトリプトファン−オペロンを有する組換えプラスミ
ドにより宿主細胞が形質転換される。 次いでこの組換
えプラスミドを備えた宿主細胞の選択が、トリプトファ
ン輸送により行なわれる。
【０００７】この方法の欠点は、トリプトファンによる
選択にもかかわらず、実際の発酵方法における拡散のた
めに、プラスミドを有していない細胞も成長することが
でき、そのためにプラスミドを含まない子細胞が増加す
ることになる。
選択にもかかわらず、実際の発酵方法における拡散のた
めに、プラスミドを有していない細胞も成長することが
でき、そのためにプラスミドを含まない子細胞が増加す
ることになる。
【０００８】本発明の目的は、そのような欠点を克服
し、安価で容易に入手できる物質により、全発酵工程の
間プラスミドが安定化することができ、その際プラスミ
ド含有微生物の成長、分裂および繁殖能力が保証される
ように形成されたプラスミドを有する微生物を提供する
ことである。
し、安価で容易に入手できる物質により、全発酵工程の
間プラスミドが安定化することができ、その際プラスミ
ド含有微生物の成長、分裂および繁殖能力が保証される
ように形成されたプラスミドを有する微生物を提供する
ことである。
【０００９】この目的は、請求項１に記載する本発明
の、 ａ）ベタインの利用に関して暗号付けし、下記の制限地
図（図１）
の、 ａ）ベタインの利用に関して暗号付けし、下記の制限地
図（図１）
【００１０】
【図２】
【００１１】により特徴付けられる遺伝子配列を含むＤ
ＮＡ断片を有するハイブリッドプラスミド、および ｂ）染色体の、ベタインの利用に関して暗号付けする遺
伝子における突然変異を含むことを特徴とする微生物に
より達成される。
ＮＡ断片を有するハイブリッドプラスミド、および ｂ）染色体の、ベタインの利用に関して暗号付けする遺
伝子における突然変異を含むことを特徴とする微生物に
より達成される。
【００１２】以下、ベタインとは、ベタイン、コリン、
ジメチルグリシンおよびサルコシンのような化合物を指
す。
ジメチルグリシンおよびサルコシンのような化合物を指
す。
【００１３】安定したプラスミドを有する微生物の製造 本発明の微生物は、以下に詳細に説明する、請求項７に
より製造される。 製造は、工程ａ）において、 Ｉ ベタインを利用する微生物を、もはやベタインを利
用できないように、染色体において突然変異化し、 ＩＩ ベタインの利用に関して暗号付けする遺伝子配列
を含むＤＮＡ断片を分離し、工程ｂ）において、 ＩＩＩ この分離したＤＮＡ断片を発現ベクター中に導
入し、その際リゲーションにより、 ＩＶ ハイブリッドプラスミドが生じるので、このハイ
ブリッドプラスミドを工程ｃ）において、 Ｖ 形質転換により、工程Ｉで得られた微生物（宿主品
種）中に導入し、その際ベタインで淘汰することによ
り、ベタイン利用に関して安定したプラスミドを有する
微生物を得る。
より製造される。 製造は、工程ａ）において、 Ｉ ベタインを利用する微生物を、もはやベタインを利
用できないように、染色体において突然変異化し、 ＩＩ ベタインの利用に関して暗号付けする遺伝子配列
を含むＤＮＡ断片を分離し、工程ｂ）において、 ＩＩＩ この分離したＤＮＡ断片を発現ベクター中に導
入し、その際リゲーションにより、 ＩＶ ハイブリッドプラスミドが生じるので、このハイ
ブリッドプラスミドを工程ｃ）において、 Ｖ 形質転換により、工程Ｉで得られた微生物（宿主品
種）中に導入し、その際ベタインで淘汰することによ
り、ベタイン利用に関して安定したプラスミドを有する
微生物を得る。
【００１４】ＶＩ これらの形質転換した微生物は、そ
のハイブリッドプラスミドがさらに特定の変換に関して
暗号付けする遺伝子を含んでいれば、ベタイン利用に関
して安定したプラスミドを有する生産品種となる。
のハイブリッドプラスミドがさらに特定の変換に関して
暗号付けする遺伝子を含んでいれば、ベタイン利用に関
して安定したプラスミドを有する生産品種となる。
【００１５】Ｉ ベタインを利用する微生物の染色体突
然変異 ベタインを利用する微生物としては、ベタインを唯一の
炭素、窒素およびエネルギー源として成長するすべての
微生物を使用できる。 そのようなベタインを利用する
微生物の例としては、シュードモナス種、リゾビウム／
アグロバクテリウム種またはリゾビウム種がある。 ベ
タインを利用する微生物としては、リゾビウム／アグロ
バクテリウム属の微生物を使用するのが有利である。
好ましくはＤＳＭ−No.３９４４の微生物リゾビウム／
アグロバクテリウム種ＨＫ１３４９を使用する。 この
微生物は１９９１年１１月４日にドイチェン・ザムルン
グ・フュア・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルク
ルトゥーレン ＧｍｂＨ，マシェローデヴェーク１ｂ，
Ｄ−３３００ ブラウンシュバイクに寄託してある。
然変異 ベタインを利用する微生物としては、ベタインを唯一の
炭素、窒素およびエネルギー源として成長するすべての
微生物を使用できる。 そのようなベタインを利用する
微生物の例としては、シュードモナス種、リゾビウム／
アグロバクテリウム種またはリゾビウム種がある。 ベ
タインを利用する微生物としては、リゾビウム／アグロ
バクテリウム属の微生物を使用するのが有利である。
好ましくはＤＳＭ−No.３９４４の微生物リゾビウム／
アグロバクテリウム種ＨＫ１３４９を使用する。 この
微生物は１９９１年１１月４日にドイチェン・ザムルン
グ・フュア・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルク
ルトゥーレン ＧｍｂＨ，マシェローデヴェーク１ｂ，
Ｄ−３３００ ブラウンシュバイクに寄託してある。
【００１６】ベタインの利用に関して暗号付けする染色
体遺伝子（以下、「ｂｅｕ」と略記する）の突然変異
は、当業者には一般的な方法により行なうことができ
る。 そのような突然変異方法の例としては、相同組換
えによる欠失突然変異、突然変異誘発物質によるフレー
ムシフト突然変異またはトランスポゾン−挿入−突然変
異がある。
体遺伝子（以下、「ｂｅｕ」と略記する）の突然変異
は、当業者には一般的な方法により行なうことができ
る。 そのような突然変異方法の例としては、相同組換
えによる欠失突然変異、突然変異誘発物質によるフレー
ムシフト突然変異またはトランスポゾン−挿入−突然変
異がある。
【００１７】リゾビウム／アグロバクテリウム種ＨＫ１
３４９の場合、遺伝子ｂｅｕは、相同組換えの方法によ
り微生物−染色体から確実に欠失される。
３４９の場合、遺伝子ｂｅｕは、相同組換えの方法によ
り微生物−染色体から確実に欠失される。
【００１８】これには、まず、遺伝子ｂｅｕを含むＤＮ
Ａ断片を微生物染色体から分離し、いわゆる「補助」プ
ラスミドにより微生物中でクローニングする。 次いで
この「補助」プラスミドから望ましい、ｂｅｕに関して
暗号付けするＤＮＡ断片（その分離および確認は以下に
ＩＩに記載する）を欠失する。 次いで、このいわゆる
欠失した「補助」プラスミドを使用して、当業者には一
般的な方法により、相当する欠失を、相同組換えによる
交換により、染色体導入することができる（Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１０、１９８７、３８１〜３８
１頁、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１、１９８９、
４６１７〜４６２２頁）。
Ａ断片を微生物染色体から分離し、いわゆる「補助」プ
ラスミドにより微生物中でクローニングする。 次いで
この「補助」プラスミドから望ましい、ｂｅｕに関して
暗号付けするＤＮＡ断片（その分離および確認は以下に
ＩＩに記載する）を欠失する。 次いで、このいわゆる
欠失した「補助」プラスミドを使用して、当業者には一
般的な方法により、相当する欠失を、相同組換えによる
交換により、染色体導入することができる（Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２１０、１９８７、３８１〜３８
１頁、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１、１９８９、
４６１７〜４６２２頁）。
【００１９】微生物リゾビウム／アグロバクテリウム種
ＨＫ１３４９（ＤＳＭ−No.３９４４）は、欠失突然変
異の方法により、相同組換えにより、突然変異した、ｂ
ｅｕ−不活性な（Ｂｅｕ−）微生物ＨＫ１３４９．４に
変換するのが有利である。
ＨＫ１３４９（ＤＳＭ−No.３９４４）は、欠失突然変
異の方法により、相同組換えにより、突然変異した、ｂ
ｅｕ−不活性な（Ｂｅｕ−）微生物ＨＫ１３４９．４に
変換するのが有利である。
【００２０】ＩＩ ＤＮＡ断片ｂｅｕの分離 ＤＮＡ断片ｂｅｕの供給源としてすでにＩ）に記載した
微生物を使用することができる。 好ましくは、ＤＮＡ
断片ｂｅｕの供給源として、すでに記載したように供託
してあるリゾビウム／アグロバクテリウム種ＨＫ１３４
９（ＤＳＭ−No.３９４４）を使用する。
微生物を使用することができる。 好ましくは、ＤＮＡ
断片ｂｅｕの供給源として、すでに記載したように供託
してあるリゾビウム／アグロバクテリウム種ＨＫ１３４
９（ＤＳＭ−No.３９４４）を使用する。
【００２１】分離するには、まずベタインの利用に関し
て暗号付けする遺伝子配列を含むＤＮＡ断片をリゾビウ
ム／アグロバクテリウム種ＨＫ１３４９上に局在化する
のが有利である。 この局在化は当業者には一般的な方
法、例えば相当する微生物−染色体中にトランスポゾン
−挿入突然変異体を作ることにより行なう。 その際、
目的とするＤＮＡ断片ｂｅｕにトランスポゾンで標識を
付ける。 この標識ＤＮＡ断片を有する突然変異体は、
ベタインを炭素、窒素およびエネルギー源として利用し
ないことにより確認される。
て暗号付けする遺伝子配列を含むＤＮＡ断片をリゾビウ
ム／アグロバクテリウム種ＨＫ１３４９上に局在化する
のが有利である。 この局在化は当業者には一般的な方
法、例えば相当する微生物−染色体中にトランスポゾン
−挿入突然変異体を作ることにより行なう。 その際、
目的とするＤＮＡ断片ｂｅｕにトランスポゾンで標識を
付ける。 この標識ＤＮＡ断片を有する突然変異体は、
ベタインを炭素、窒素およびエネルギー源として利用し
ないことにより確認される。
【００２２】次いで、確認されたトランスポゾン挿入突
然変異体の染色体ＤＮＡを好ましくは制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断する。 その際得られる断片は、当業者には通
常の方法でＥ．コリ中のプラスミドによりクローニング
する。
然変異体の染色体ＤＮＡを好ましくは制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断する。 その際得られる断片は、当業者には通
常の方法でＥ．コリ中のプラスミドによりクローニング
する。
【００２３】それによって得られた、トランスポゾン−
抗生物質耐性に関して選択したハイブリッドプラスミド
は、大きさが１８．２ｋｂ（１２．５ｋｂおよび相当す
るトランスポゾンのための５．７ｋｂ）の、ＨＫ１３４
９から得られた、トランスポゾンで標識を付けたＥｃｏ
ＲＩ−ＤＮＡ−断片を有する。
抗生物質耐性に関して選択したハイブリッドプラスミド
は、大きさが１８．２ｋｂ（１２．５ｋｂおよび相当す
るトランスポゾンのための５．７ｋｂ）の、ＨＫ１３４
９から得られた、トランスポゾンで標識を付けたＥｃｏ
ＲＩ−ＤＮＡ−断片を有する。
【００２４】本来の、無傷の（トランスポゾンで標識を
付けていない）ＤＮＡ−断片ｂｅｕを分離するために、
まずリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９のＤ
ＮＡを当業者には通常の方法で分離する。 次いで、分
離したＤＮＡを好ましくは制限酵素ＥｃｏＲＩで十分に
消化し、分離する。 続いて１２．０〜１３．０ｋｂの
大きさのＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ−断片を当業者には通常の
方法でＥ．コリ中にクローニングする。 次いで、各種
クローンとｂｅｕ−陰性トランスポゾン標識突然変異体
の「パッチ−メイティング」接合により、無傷の遺伝子
ｂｅｕを含むクローンを突然変異の相補により確認し、
分離することができる。 そこでは、目的とするハイブ
リッドプラスミドがＥ．コリ中にある。
付けていない）ＤＮＡ−断片ｂｅｕを分離するために、
まずリゾビウム／アグロバクテリウムＨＫ１３４９のＤ
ＮＡを当業者には通常の方法で分離する。 次いで、分
離したＤＮＡを好ましくは制限酵素ＥｃｏＲＩで十分に
消化し、分離する。 続いて１２．０〜１３．０ｋｂの
大きさのＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ−断片を当業者には通常の
方法でＥ．コリ中にクローニングする。 次いで、各種
クローンとｂｅｕ−陰性トランスポゾン標識突然変異体
の「パッチ−メイティング」接合により、無傷の遺伝子
ｂｅｕを含むクローンを突然変異の相補により確認し、
分離することができる。 そこでは、目的とするハイブ
リッドプラスミドがＥ．コリ中にある。
【００２５】トランスポゾン−突然変異体に関する、サ
ブクローン（ＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ−断片の様々な範囲で
欠失を有するクローン）による相補試験に基付き、ベタ
インの利用に関して暗号付けする遺伝子配列を含む、３
ｋｂの大きさのＰｓｔＩ切断したＤＮＡ断片が確認さ
れ、分離される。
ブクローン（ＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ−断片の様々な範囲で
欠失を有するクローン）による相補試験に基付き、ベタ
インの利用に関して暗号付けする遺伝子配列を含む、３
ｋｂの大きさのＰｓｔＩ切断したＤＮＡ断片が確認さ
れ、分離される。
【００２６】このＤＮＡ断片は本発明の構成要素であ
り、下記の制限地図（図１）
り、下記の制限地図（図１）
【００２７】
【図３】
【００２８】により特徴付けられる。
【００２９】このＤＮＡ断片はハイブリッドプラスミド
ｐＬＯ３２中に含まれ、微生物ＨＫ１３４９．４中に供
託してある（ＤＳＭ−No.６７１２）。
ｐＬＯ３２中に含まれ、微生物ＨＫ１３４９．４中に供
託してある（ＤＳＭ−No.６７１２）。
【００３０】ＩＩＩ 発現ベクターにおけるＤＮＡ断片
のリゲーション そのようにして得られたＤＮＡｂｅｕは、通常の分子生
物学的方法により、予め同じように切断した発現ベクタ
ー−ＤＮＡによりハイブリッドプラスミドに結合させる
ことができる。 発現ベクターは通常好適なプロモータ
ー（発現制御配列）を含む。 このプロモーターの後
に、転写方向に制限酵素のための一つ以上の単一切断位
置があるのが有利である。 次いでこの切断位置に通
常、発現させるべき所望の遺伝子断片を挿入する。
のリゲーション そのようにして得られたＤＮＡｂｅｕは、通常の分子生
物学的方法により、予め同じように切断した発現ベクタ
ー−ＤＮＡによりハイブリッドプラスミドに結合させる
ことができる。 発現ベクターは通常好適なプロモータ
ー（発現制御配列）を含む。 このプロモーターの後
に、転写方向に制限酵素のための一つ以上の単一切断位
置があるのが有利である。 次いでこの切断位置に通
常、発現させるべき所望の遺伝子断片を挿入する。
【００３１】本発明のハイブリッドプラスミドには、宿
主範囲が広い発現ベクターを使用することができる。
そのような発現ベクターの例としては、 ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，１９８３，２７３〜２
８２頁） ｐＭＥ２８５（Ｇｅｎｅ，３６，１９８５，２７〜３６
頁） ｐＶＫ１００（Ｐlａｓｍｉｄ，８，１９８２，４５〜
５４頁） がある。
主範囲が広い発現ベクターを使用することができる。
そのような発現ベクターの例としては、 ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，１９８３，２７３〜２
８２頁） ｐＭＥ２８５（Ｇｅｎｅ，３６，１９８５，２７〜３６
頁） ｐＶＫ１００（Ｐlａｓｍｉｄ，８，１９８２，４５〜
５４頁） がある。
【００３２】本発明のハイブリッドプラスミドには、発
現ベクターｐＫＴ２４０を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、
生じた制限末端を、たとえばＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ
で、ＤＮＡ断片ｂｅｕと結合させるのが有利である。
現ベクターｐＫＴ２４０を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、
生じた制限末端を、たとえばＴ４−ＤＮＡ−リガーゼ
で、ＤＮＡ断片ｂｅｕと結合させるのが有利である。
【００３３】ＩＶ ハイブリッドプラスミド 本発明はさらに、そのようにして生じた、ＤＮＡ断片ｂ
ｅｕを含むハイブリッドプラスミドにも関する。
ｅｕを含むハイブリッドプラスミドにも関する。
【００３４】基本的に、選択した微生物中で複製し、Ｄ
ＮＡ断片ｂｅｕを発現させることができる、すべてのハ
イブリッドプラスミドが適している。
ＮＡ断片ｂｅｕを発現させることができる、すべてのハ
イブリッドプラスミドが適している。
【００３５】ハイブリッドプラスミド中で効果的な発現
を達成するためには、ＤＮＡ断片ｂｅｕを転写方向でプ
ロモーターに配列する。
を達成するためには、ＤＮＡ断片ｂｅｕを転写方向でプ
ロモーターに配列する。
【００３６】ＤＮＡ断片ｂｅｕおよび発現ベクターｐＫ
Ｔ２４０からなり、ＤＮＡ断片ｂｅｕが転写方向でプロ
モーターＰbla（アンピシリン耐性を与える）に配列さ
れているハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２が、とくに
好適である。
Ｔ２４０からなり、ＤＮＡ断片ｂｅｕが転写方向でプロ
モーターＰbla（アンピシリン耐性を与える）に配列さ
れているハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２が、とくに
好適である。
【００３７】このハイブリッドプラスミドは１９９１年
９月１７日に、ドイチェン・ザムルング・フュア・ミク
ロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレン Ｇ
ｍｂＨ，マシェローデヴェーク１ｂ，Ｄ−３３００ ブ
ラウンシュバイクにおいて、微生物ＨＫ１３４９．２中
に供託してある（ＤＳＭ−No.６７１２）。
９月１７日に、ドイチェン・ザムルング・フュア・ミク
ロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレン Ｇ
ｍｂＨ，マシェローデヴェーク１ｂ，Ｄ−３３００ ブ
ラウンシュバイクにおいて、微生物ＨＫ１３４９．２中
に供託してある（ＤＳＭ−No.６７１２）。
【００３８】図２は、ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３
２の図を示す。
２の図を示す。
【００３９】Ｖ 形質転換 そのようにして得られたハイブリッドプラスミドによ
り、工程Ｉ）で得られた微生物を形質転換する。 この
微生物も同様に本発明の構成要素である。
り、工程Ｉ）で得られた微生物を形質転換する。 この
微生物も同様に本発明の構成要素である。
【００４０】本発明のハイブリッドプラスミドによる微
生物の形質転換は、既知の方法により行なわれる。 形
質転換した微生物の分離ないし選択は、ベタインを炭素
または窒素供給源として添加した選択性栄養培地上で行
なう。 ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２を使用する
場合、形質転換した微生物の分離ないし選択は、ベタイ
ンを炭素または窒素供給源として添加した選択性栄養培
地上で行なう。
生物の形質転換は、既知の方法により行なわれる。 形
質転換した微生物の分離ないし選択は、ベタインを炭素
または窒素供給源として添加した選択性栄養培地上で行
なう。 ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２を使用する
場合、形質転換した微生物の分離ないし選択は、ベタイ
ンを炭素または窒素供給源として添加した選択性栄養培
地上で行なう。
【００４１】好ましくは、形質転換により、ハイブリッ
ドプラスミドｐＬＯ３２（ＤＳＭ−No.６７１２）を有
する微生物ＨＫ１３４９．４が得られる。
ドプラスミドｐＬＯ３２（ＤＳＭ−No.６７１２）を有
する微生物ＨＫ１３４９．４が得られる。
【００４２】これらの形質転換した微生物の安定化に
は、ベタインを０．２〜０．４％の濃度で培養基に加え
るのが有利である。 培養基としては、この専門分野で
一般的な、例えばクラら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１３５，１９８３，１〜７頁による鉱物塩培養基
を使用することができる。
は、ベタインを０．２〜０．４％の濃度で培養基に加え
るのが有利である。 培養基としては、この専門分野で
一般的な、例えばクラら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１３５，１９８３，１〜７頁による鉱物塩培養基
を使用することができる。
【００４３】ＶＩ ベタインの利用に関して安定したプ
ラスミドを有する生産品種 本発明は、ベタインの利用に関して安定したプラスミド
を製造するためのＤＮＡ断片ｂｅｕの利用、ならびに安
定したプラスミドを有する生産品種を製造するための、
この安定したプラスミドで形質転換することにより得ら
れる微生物の利用にも関する。 したがって、得られた
生産品種も本発明の構成要素である。
ラスミドを有する生産品種 本発明は、ベタインの利用に関して安定したプラスミド
を製造するためのＤＮＡ断片ｂｅｕの利用、ならびに安
定したプラスミドを有する生産品種を製造するための、
この安定したプラスミドで形質転換することにより得ら
れる微生物の利用にも関する。 したがって、得られた
生産品種も本発明の構成要素である。
【００４４】これらの生産品種は、染色体の、ベタイン
の利用に関して暗号付けする遺伝子の突然変異を含む微
生物を、ＤＮＡ断片ｂｅｕに加えて特定の変換に関して
暗号付けする遺伝子を含むハイブリッドプラスミドで形
質転換することにより得られる。
の利用に関して暗号付けする遺伝子の突然変異を含む微
生物を、ＤＮＡ断片ｂｅｕに加えて特定の変換に関して
暗号付けする遺伝子を含むハイブリッドプラスミドで形
質転換することにより得られる。
【００４５】これらの、ｂｅｕおよび追加の遺伝子を含
む安定したプラスミドは、当業者には一般的な方法によ
り、−たとえば、追加の遺伝子を、ｂｅｕを含むハイブ
リッドプラスミド中にリゲーションすることにより、あ
るいは−たとえば、ＤＮＡ断片ｂｅｕを、すでに特定の
変換に関して暗号付けする遺伝子を含むハイブリッドプ
ラスミド中にリゲーションすることにより得ることがで
きる。
む安定したプラスミドは、当業者には一般的な方法によ
り、−たとえば、追加の遺伝子を、ｂｅｕを含むハイブ
リッドプラスミド中にリゲーションすることにより、あ
るいは−たとえば、ＤＮＡ断片ｂｅｕを、すでに特定の
変換に関して暗号付けする遺伝子を含むハイブリッドプ
ラスミド中にリゲーションすることにより得ることがで
きる。
【００４６】すでに追加の遺伝子を含むハイブリッドプ
ラスミドを使用する場合、これを制限酵素ＰｓｔＩで切
断（直線化）し、ついでＰｓｔＩ−ＤＮＡ−断片ｂｅｕ
で安定したプラスミドにリゲーションする。
ラスミドを使用する場合、これを制限酵素ＰｓｔＩで切
断（直線化）し、ついでＰｓｔＩ−ＤＮＡ−断片ｂｅｕ
で安定したプラスミドにリゲーションする。
【００４７】使用するハイブリッドプラスミドがすでに
ＤＮＡ−断片ｂｅｕを含んでいる場合、直線化は、追加
の遺伝子の「側面に立つ」制限酵素で行なうのが有利で
ある。 本発明の微生物中に新たに形質転換した後、こ
れらの微生物は、ベタインで培養する際に、プラスミド
を失うことなく望ましい変換を確実に行なうことができ
る。
ＤＮＡ−断片ｂｅｕを含んでいる場合、直線化は、追加
の遺伝子の「側面に立つ」制限酵素で行なうのが有利で
ある。 本発明の微生物中に新たに形質転換した後、こ
れらの微生物は、ベタインで培養する際に、プラスミド
を失うことなく望ましい変換を確実に行なうことができ
る。
【００４８】好ましくは、安定したプラスミドとして、
特定の変換に関して暗号付けする追加の遺伝子を含むハ
イブリッドプラスミドｐＬＯ３２を使用する。 この安
定したプラスミドは、実質的にハイブリッドプラスミド
ｐＬＯ３２に相当する。 好ましくは、この安定したプ
ラスミドを微生物ＨＫ１３４９．９中に形質転換する。
安定したプラスミドを有する生産品種の例としては、
安定したプラスミドとしてプラスミドｐＬＯＬ０１を含
む微生物ＨＫ１３４９．４がある。 ｐＬＯＬ０１を製
造するには、すでにＥＰ−Ａ−０４７７８２８に記載さ
れている、発現ベクターｐＫＴ２４０および遺伝子ｘｙ
ｌＭＡ（酵素キシロール−モノオキシゲナーゼに関して
暗号付けする）からなるハイブリッドプラスミドｐＬ０
３を、制限酵素ＰｓｔＩで直線化し、次いでＤＮＡ−断
片ｂｅｕでリゲーションする。このプラスミドは、ｐＬ
Ｏ３２との違いは追加のｘｙｌＭＡを含むだけなので、
実質的にハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２に相当す
る。
特定の変換に関して暗号付けする追加の遺伝子を含むハ
イブリッドプラスミドｐＬＯ３２を使用する。 この安
定したプラスミドは、実質的にハイブリッドプラスミド
ｐＬＯ３２に相当する。 好ましくは、この安定したプ
ラスミドを微生物ＨＫ１３４９．９中に形質転換する。
安定したプラスミドを有する生産品種の例としては、
安定したプラスミドとしてプラスミドｐＬＯＬ０１を含
む微生物ＨＫ１３４９．４がある。 ｐＬＯＬ０１を製
造するには、すでにＥＰ−Ａ−０４７７８２８に記載さ
れている、発現ベクターｐＫＴ２４０および遺伝子ｘｙ
ｌＭＡ（酵素キシロール−モノオキシゲナーゼに関して
暗号付けする）からなるハイブリッドプラスミドｐＬ０
３を、制限酵素ＰｓｔＩで直線化し、次いでＤＮＡ−断
片ｂｅｕでリゲーションする。このプラスミドは、ｐＬ
Ｏ３２との違いは追加のｘｙｌＭＡを含むだけなので、
実質的にハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２に相当す
る。
【００４９】ｐＬＯＬ０１を微生物ＨＫ１３４９．４の
中に形質転換した後、この生産品種はベタインの存在下
で、プラスミドを失うことなく、２，５−ジメチルピラ
ジンを５−ヒドロキシメチルピラジンに変換することが
できる。
中に形質転換した後、この生産品種はベタインの存在下
で、プラスミドを失うことなく、２，５−ジメチルピラ
ジンを５−ヒドロキシメチルピラジンに変換することが
できる。
【００５０】
【実施例１】トランスポゾン（Ｔｎ５）−挿入突然変異体の製造およ
びその表現型による確認 アグロバクテリウム／リゾビウム種 ＨＫ１３４９（ＤＳ
Ｍ−No.３９４４）の品種を淘汰圧により、ストレプト
マイシン（１０００μｇ／ｍｌ）に対する自然耐性を持
たせた。 この耐性は、５０世代以上淘汰されずに安定
していたので、選択標識として使用した。
びその表現型による確認 アグロバクテリウム／リゾビウム種 ＨＫ１３４９（ＤＳ
Ｍ−No.３９４４）の品種を淘汰圧により、ストレプト
マイシン（１０００μｇ／ｍｌ）に対する自然耐性を持
たせた。 この耐性は、５０世代以上淘汰されずに安定
していたので、選択標識として使用した。
【００５１】０．２ｍｌのＴｎ５供与培養菌、Ｅ．コリ
Ｓ１７−１／ｐＳＵＰ２０２１（ネオマイシン耐性、
Ｒ．サイモンら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ１（１
９８３），７８４〜７９０頁）を２ｍｌの受容培養菌Ｈ
Ｋ１３４９と混合し、遠心分離した。
Ｓ１７−１／ｐＳＵＰ２０２１（ネオマイシン耐性、
Ｒ．サイモンら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ１（１
９８３），７８４〜７９０頁）を２ｍｌの受容培養菌Ｈ
Ｋ１３４９と混合し、遠心分離した。
【００５２】細胞を０．９％の食塩水（ＮａＣｌ溶液）
で洗浄し、１００μｌの０．９％食塩水中に分散させ
た。 受容品種と供与品種の接合は、乾燥した栄養寒天
上、３０℃で一晩かけて行なった。 続いて細胞を収穫
し、下記の受容およびトランスポゾンのための選択培養
基上で希釈した。
で洗浄し、１００μｌの０．９％食塩水中に分散させ
た。 受容品種と供与品種の接合は、乾燥した栄養寒天
上、３０℃で一晩かけて行なった。 続いて細胞を収穫
し、下記の受容およびトランスポゾンのための選択培養
基上で希釈した。
【００５３】ＨＫ１３４９のＴｎ５−突然変異体は、ス
トレプトマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）およびネオマ
イシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む栄養寒天上で選択す
ることにより得た。 表現型確認は、鉱物塩培養基（ク
ラら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３５、１９
８３、１〜７頁）中でベタインを炭素または窒素の供給
源として利用しないことにより行なった。
トレプトマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）およびネオマ
イシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む栄養寒天上で選択す
ることにより得た。 表現型確認は、鉱物塩培養基（ク
ラら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１３５、１９
８３、１〜７頁）中でベタインを炭素または窒素の供給
源として利用しないことにより行なった。
【００５４】
【実施例２】ＨＫ１３４９ゲノムからＴｎ５標識を付けたＤＮＡ断片
のクローニング Ｔｎ５で突然変異させたＨＫ１３４９（５μｇ）の、公
知の方法により分離した染色体ＤＮＡ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１３０，１９７９，１６１〜１７３頁）を、
ＥｃｏＲＩ（４単位／μｇ）で十分に消化した。 ２．
５μｇのプラスミドｐＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ，２，１９
７７，９５〜１１３頁）をＥｃｏＲＩ（１単位／μｇ）
で十分に消化した後、アルカリ性ホスファターゼ（０．
１単位／１〜２０ｐｍｏｌＤＮＡ末端）で処理した（脱
ホスホリル）。 組換えハイブリッドプラスミドは、ゲ
ノム性ＤＮＡおよびｐＢＲ３２５をＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼ（０．２単位／μｇＤＮＡ）と、４００μｌのリゲ
ーション緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．
２，１０ｍＭジチオエリトリトール（ＤＤＴ），１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，０．６ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）］中で混合することにより得た。
のクローニング Ｔｎ５で突然変異させたＨＫ１３４９（５μｇ）の、公
知の方法により分離した染色体ＤＮＡ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，１３０，１９７９，１６１〜１７３頁）を、
ＥｃｏＲＩ（４単位／μｇ）で十分に消化した。 ２．
５μｇのプラスミドｐＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ，２，１９
７７，９５〜１１３頁）をＥｃｏＲＩ（１単位／μｇ）
で十分に消化した後、アルカリ性ホスファターゼ（０．
１単位／１〜２０ｐｍｏｌＤＮＡ末端）で処理した（脱
ホスホリル）。 組換えハイブリッドプラスミドは、ゲ
ノム性ＤＮＡおよびｐＢＲ３２５をＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼ（０．２単位／μｇＤＮＡ）と、４００μｌのリゲ
ーション緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．
２，１０ｍＭジチオエリトリトール（ＤＤＴ），１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，０．６ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴ
Ｐ）］中で混合することにより得た。
【００５５】１２℃で一晩培養した。 リゲーション混
合物のアリコートを、コーエンらによる形質転換実験
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９
６（１９７２），２１１０〜２１１４頁）にＥ．コリＥ
Ｄ８６５４とともに使用した。
合物のアリコートを、コーエンらによる形質転換実験
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９
６（１９７２），２１１０〜２１１４頁）にＥ．コリＥ
Ｄ８６５４とともに使用した。
【００５６】栄養寒天上でアンピシリン（１００μｇ／
ｍｌ，ｐＢＲ３２５）およびカナマイシン（２５μｇ／
ｍｌ，Ｔｎ５−標識を付けた挿入物）に対する耐性によ
り形質転換物を分離した。
ｍｌ，ｐＢＲ３２５）およびカナマイシン（２５μｇ／
ｍｌ，Ｔｎ５−標識を付けた挿入物）に対する耐性によ
り形質転換物を分離した。
【００５７】すべてのクローニングしたハイブリッドプ
ラスミドが、Ｔｎ５で標識を付けたＨＫ１３４９挿入物
を有していた（１２．５ｋｂ＋Ｔｎ５のための５．７ｋ
ｂ）。 正確な制限地図作成により、選択されたＴｎ５
突然変異体の同一の表現型Ｂｅｕ-（Ｔｎ５挿入による
不活性ｂｅｕ遺伝子、遺伝子型ｂｅｕ）に相当する同じ
位置で同じゲノム性断片におけるトランスポゾン挿入が
証明された。 この突然変異体は以下ＨＫ４Ｖ１１とし
て明記する。
ラスミドが、Ｔｎ５で標識を付けたＨＫ１３４９挿入物
を有していた（１２．５ｋｂ＋Ｔｎ５のための５．７ｋ
ｂ）。 正確な制限地図作成により、選択されたＴｎ５
突然変異体の同一の表現型Ｂｅｕ-（Ｔｎ５挿入による
不活性ｂｅｕ遺伝子、遺伝子型ｂｅｕ）に相当する同じ
位置で同じゲノム性断片におけるトランスポゾン挿入が
証明された。 この突然変異体は以下ＨＫ４Ｖ１１とし
て明記する。
【００５８】
【実施例３】ＨＫ１３４９ゲノムからのＤＮＡ断片ｂｅｕ（標識を付
けていない）のクローニング ＨＫ１３４９−ＤＮＡを実施例２に応じて分離し、Ｅｃ
ｏＲＩ（４単位／μｇ）で十分に消化し、アガロース−
ゲル−電気泳動により分離した。 １２．０ｋｂ〜１
３．０ｋｂ（標識を付けた断片は１２．５ｋｂの大きさ
を有していた）の大きさ範囲にあるＤＮＡ断片をアガロ
ース−電気泳動ゲルから分離した。 この分離したＤＮ
Ａを実施例２と同様にＥｃｏＲＩで切断し、実施例２と
同様に脱ホスホリル化したベクターｐＶＫ１００（Ｐｌ
ａｓｍｉｄ ８（１９８２），４５〜５４頁）と結合さ
せた。 リゲーション混合物のアリコートを実施例２に
準じてＥ．コリＳ１７−１における形質転換実験（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，１，１９８３，１７８４〜
１７９１頁）に使用した。
けていない）のクローニング ＨＫ１３４９−ＤＮＡを実施例２に応じて分離し、Ｅｃ
ｏＲＩ（４単位／μｇ）で十分に消化し、アガロース−
ゲル−電気泳動により分離した。 １２．０ｋｂ〜１
３．０ｋｂ（標識を付けた断片は１２．５ｋｂの大きさ
を有していた）の大きさ範囲にあるＤＮＡ断片をアガロ
ース−電気泳動ゲルから分離した。 この分離したＤＮ
Ａを実施例２と同様にＥｃｏＲＩで切断し、実施例２と
同様に脱ホスホリル化したベクターｐＶＫ１００（Ｐｌ
ａｓｍｉｄ ８（１９８２），４５〜５４頁）と結合さ
せた。 リゲーション混合物のアリコートを実施例２に
準じてＥ．コリＳ１７−１における形質転換実験（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，１，１９８３，１７８４〜
１７９１頁）に使用した。
【００５９】形質転換物を、栄養寒天上でテトラサイク
リン（２５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ
／ｍｌ）に対する耐性に基付いて淘汰した。
リン（２５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ
／ｍｌ）に対する耐性に基付いて淘汰した。
【００６０】得られた形質転換物を、受容品種としてト
ランスポゾン突然変異体ＨＫ４Ｖ１１ｂｅｕとの「パッ
チ−メイティング」接合により、必要とするＤＮＡ断片
の遺伝子ｂｅｕによる挿入に基付いて検査したが、耐抗
生物質性の形質転換物は、淘汰培養基（カナマイシン２
μｇ／ｍｌを含む栄養寒天）上の固定Ｍｕｓｔｅｒ中に
接種した。 並行して、栄養寒天平板に、受容品種ＨＫ
４Ｖ１１の菌を接種した。
ランスポゾン突然変異体ＨＫ４Ｖ１１ｂｅｕとの「パッ
チ−メイティング」接合により、必要とするＤＮＡ断片
の遺伝子ｂｅｕによる挿入に基付いて検査したが、耐抗
生物質性の形質転換物は、淘汰培養基（カナマイシン２
μｇ／ｍｌを含む栄養寒天）上の固定Ｍｕｓｔｅｒ中に
接種した。 並行して、栄養寒天平板に、受容品種ＨＫ
４Ｖ１１の菌を接種した。
【００６１】接合のために、単一クローンとして形質転
換物を受容品種の成長した細胞群の上に押しつけ、３０
℃で一晩培養した。
換物を受容品種の成長した細胞群の上に押しつけ、３０
℃で一晩培養した。
【００６２】最後に、得られたトランス接合物を選択す
るために、「メイティング」平板を、供与品種および受
容品種が利用できないベタイン（０．２重量％）を基質
として含む、実施例１に記載した鉱物塩培養基上に押し
つけた。 成長するトランス接合物では、受容菌（ＨＫ
４Ｖ１１）の突然変異化したゲノム性ＤＮＡ断片が、相
当する無傷のＤＮＡ範囲を有するハイブリッドプラスミ
ドを受け入れることにより、供与品種から相補化（ない
し相同組換え）される。 相補化するハイブリッドプラ
スミドには、ｐＶＫ１００ｓの記号を付けた。 品種Ｈ
Ｋ４Ｖ１１の復帰突然変異体を抑制するために、培養基
にネオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えた。 クロ
ーニングした、Ｔｎ５標識を付けたＤＮＡ断片に対して
ハイブリダイゼーションすることにより、ＨＫ１３４９
ゲノムから無傷のｂｅｕ遺伝子を含む相補化された断片
の、ハイブリッドプラスミドｐＶＫ１００ｓ上での効果
的なクローニングを立証することができた。
るために、「メイティング」平板を、供与品種および受
容品種が利用できないベタイン（０．２重量％）を基質
として含む、実施例１に記載した鉱物塩培養基上に押し
つけた。 成長するトランス接合物では、受容菌（ＨＫ
４Ｖ１１）の突然変異化したゲノム性ＤＮＡ断片が、相
当する無傷のＤＮＡ範囲を有するハイブリッドプラスミ
ドを受け入れることにより、供与品種から相補化（ない
し相同組換え）される。 相補化するハイブリッドプラ
スミドには、ｐＶＫ１００ｓの記号を付けた。 品種Ｈ
Ｋ４Ｖ１１の復帰突然変異体を抑制するために、培養基
にネオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えた。 クロ
ーニングした、Ｔｎ５標識を付けたＤＮＡ断片に対して
ハイブリダイゼーションすることにより、ＨＫ１３４９
ゲノムから無傷のｂｅｕ遺伝子を含む相補化された断片
の、ハイブリッドプラスミドｐＶＫ１００ｓ上での効果
的なクローニングを立証することができた。
【００６３】
【実施例４】ｂｅｕに関して暗号付けされたＤＮＡ小断片の確認 各種の制限酵素（ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｈＩ、Ｐ
ｓｔＩ）によるハイブリッドプラスミドｐＶＫ１００ｓ
で欠失クローニングし、続いてｂｅｕＴｎ５突然変異体
ＨＫ４Ｖ１１で相補化することにより、ベタイン利用に
関して暗号付けする３ｋｂの大きさのＰｓｔＩ切断され
たＤＮＡ断片が、プラスミド上で確認された。
ｓｔＩ）によるハイブリッドプラスミドｐＶＫ１００ｓ
で欠失クローニングし、続いてｂｅｕＴｎ５突然変異体
ＨＫ４Ｖ１１で相補化することにより、ベタイン利用に
関して暗号付けする３ｋｂの大きさのＰｓｔＩ切断され
たＤＮＡ断片が、プラスミド上で確認された。
【００６４】この断片は、下記の制限地図（図１）によ
り特徴付けられる。
り特徴付けられる。
【００６５】
【図４】
【００６６】
【実施例５】ＨＫ１３４９ゲノムにおけるｂｅｕの安定した突然変異 原則的に、抗生物質淘汰による、またはよらないＴｎ挿
入突然変異は非常に不安定なので、品種ＨＫ１３４９に
安定した欠失突然変異を導入した。
入突然変異は非常に不安定なので、品種ＨＫ１３４９に
安定した欠失突然変異を導入した。
【００６７】これには、通常の方法で、相同組換えによ
り、次のように行なった。
り、次のように行なった。
【００６８】実施例３で得られた１２．５ｋｂの大きさ
のＥｃｏＲＩ断片を、ＨＫ品種中で発現しないＳｕｉｚ
ｉｄベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１３４，１９７８，１１４１〜１１５６頁）中に
クローニングし、そこからｂｅｕ暗号付けした、３ｋｂ
の大きさのＰｓｔＩ断片をＰｓｔＩ（１単位／μｇ）で
制限することにより欠失させた。 １単位／μｇのＴ４
−ＤＮＡ−リガーゼにより一晩かけて再リゲーションし
た。
のＥｃｏＲＩ断片を、ＨＫ品種中で発現しないＳｕｉｚ
ｉｄベクターｐＡＣＹＣ１８４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，１３４，１９７８，１１４１〜１１５６頁）中に
クローニングし、そこからｂｅｕ暗号付けした、３ｋｂ
の大きさのＰｓｔＩ断片をＰｓｔＩ（１単位／μｇ）で
制限することにより欠失させた。 １単位／μｇのＴ４
−ＤＮＡ−リガーゼにより一晩かけて再リゲーションし
た。
【００６９】欠失ハイブリッドｐＣＣ６をＥ．コリＨＢ
１０１／ｐＲＫ２０１３（ｐＣＣ６を移動させるための
介助プラスミド）中で形質転換し、そこから接合継代に
よりＨＫ１３４９中に導入することができた。 得られ
たトランス接合物は、供与菌（Ｐｒｏ-、プロリン陰
性）の栄養要求性に対して、およびプラスミドの抗生物
質耐性（鉱物塩培地０．４％グルコースおよびテトラサ
イクリン（２５μｇ／ｍｌ））により淘汰した。
１０１／ｐＲＫ２０１３（ｐＣＣ６を移動させるための
介助プラスミド）中で形質転換し、そこから接合継代に
よりＨＫ１３４９中に導入することができた。 得られ
たトランス接合物は、供与菌（Ｐｒｏ-、プロリン陰
性）の栄養要求性に対して、およびプラスミドの抗生物
質耐性（鉱物塩培地０．４％グルコースおよびテトラサ
イクリン（２５μｇ／ｍｌ））により淘汰した。
【００７０】プラスミドを相同組換えにより染色体に一
体化した細胞だけがテトラサイクリン耐性を有し、この
培地上で成長できる。
体化した細胞だけがテトラサイクリン耐性を有し、この
培地上で成長できる。
【００７１】第二組換え現象によりベクターｐＡＣＹＣ
１８４および無傷のｂｅｕ遺伝子をＨＫ１３４９染色体
から再び分離するために、これらのトランス接合体を同
じ培養基中で、淘汰せずに、テトラサイクリンにより１
００世代にわたって培養した。 次いで、テトラサイク
リンに対して敏感なｂｅｕ突然変異体の数を増加させる
ために、一体化されたベクターｐＡＣＹＣ１８４および
無傷のｂｅｕ遺伝子に対する淘汰を行なった。 これに
は、細胞を２５ｍｌの複合培地ＮＹＢ（オキソイド、ヴ
ェーゼル、ＢＲＤ）テトラサイクリン（１０μｇ／ｍ
ｌ）に入れ、３０℃で６時間培養した。
１８４および無傷のｂｅｕ遺伝子をＨＫ１３４９染色体
から再び分離するために、これらのトランス接合体を同
じ培養基中で、淘汰せずに、テトラサイクリンにより１
００世代にわたって培養した。 次いで、テトラサイク
リンに対して敏感なｂｅｕ突然変異体の数を増加させる
ために、一体化されたベクターｐＡＣＹＣ１８４および
無傷のｂｅｕ遺伝子に対する淘汰を行なった。 これに
は、細胞を２５ｍｌの複合培地ＮＹＢ（オキソイド、ヴ
ェーゼル、ＢＲＤ）テトラサイクリン（１０μｇ／ｍ
ｌ）に入れ、３０℃で６時間培養した。
【００７２】その後、成長している（テトラサイクリン
耐性を有する）細胞を殺すために、０．５ｍｇ／ｍｌの
Ｄ−シクロセリンおよび１５ｍｇ／ｍｌのペニシリンＧ
を培地に加えた。
耐性を有する）細胞を殺すために、０．５ｍｇ／ｍｌの
Ｄ−シクロセリンおよび１５ｍｇ／ｍｌのペニシリンＧ
を培地に加えた。
【００７３】３０℃でさらに８４時間培養した後、細胞
を遠心分離し、新しいＮＹＢで３回洗浄し、適度に希釈
して栄養寒天上に塗布した。
を遠心分離し、新しいＮＹＢで３回洗浄し、適度に希釈
して栄養寒天上に塗布した。
【００７４】得られたコロニーの１８％はテトラサイク
リンに対して敏感で、その内の３分の１は同時にベタイ
ンの利用においても陰性であった。 ｂｅｕの欠失が正
しく導入されたことは、ハイブリッドプラスミドｐＶＫ
１００ｓ（実施例３から）における１２．５ｋｂに対す
るハイブリダイゼーションにより立証された。（３ｋｂ
だけ短くなったＥｃｏＲＩ断片だけが標識付けされ
た。）得られた突然変異体ＨＫ１３４９．４は、適当な
ベクター中でクローニングされた３ｋｂの大きさのＰｓ
ｔＩ断片（ｂｅｕ）により相補化することができた。こ
れらのベクターは下記の実施例６で説明する。
リンに対して敏感で、その内の３分の１は同時にベタイ
ンの利用においても陰性であった。 ｂｅｕの欠失が正
しく導入されたことは、ハイブリッドプラスミドｐＶＫ
１００ｓ（実施例３から）における１２．５ｋｂに対す
るハイブリダイゼーションにより立証された。（３ｋｂ
だけ短くなったＥｃｏＲＩ断片だけが標識付けされ
た。）得られた突然変異体ＨＫ１３４９．４は、適当な
ベクター中でクローニングされた３ｋｂの大きさのＰｓ
ｔＩ断片（ｂｅｕ）により相補化することができた。こ
れらのベクターは下記の実施例６で説明する。
【００７５】
【実施例６】 ａ）種々の「宿主範囲の広いベクター」におけるｂｅｕ
遺伝子のクローニング 既知の「宿主範囲の広い発現ベクター」ｐＫＴ２４０、
ｐＭＥ２８５、ｐＶＫ１００中に、ｂｅｕに関して暗号
付けする３ｋｂの大きさのＰｓｔＩ断片をクローニング
した。 （『分子生物学の現況』 ジョン・ウイリー・
アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８９）３．１６
章，ＤＮＡ断片のサブクローニング） その際、プロモ
ーターに対する挿入物の正しい配向が問題であった。
遺伝子のクローニング 既知の「宿主範囲の広い発現ベクター」ｐＫＴ２４０、
ｐＭＥ２８５、ｐＶＫ１００中に、ｂｅｕに関して暗号
付けする３ｋｂの大きさのＰｓｔＩ断片をクローニング
した。 （『分子生物学の現況』 ジョン・ウイリー・
アンド・サンズ，ニューヨーク（１９８９）３．１６
章，ＤＮＡ断片のサブクローニング） その際、プロモ
ーターに対する挿入物の正しい配向が問題であった。
【００７６】その際、ｐＫＴ２４０の場合、プロモータ
ーＰbla（アンピシリン耐性を与える遺伝子ｂｌａのプ
ロモーター）に対する挿入物の正しい配向（転写方向に
おける配列）が問題であった。
ーＰbla（アンピシリン耐性を与える遺伝子ｂｌａのプ
ロモーター）に対する挿入物の正しい配向（転写方向に
おける配列）が問題であった。
【００７７】ｂ）ｐＫＴ２４０中へのｂｅｕの挿入 ｐＫＴ２４０をＰｓｔＩ（１単位μｇ）で「直線化」し
た。 この「直線化」ＤＮＡを３ｋｂの大きさのＰｓｔ
Ｉ断片（挿入物）と、リゲーション緩衝液（２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１０ｍＭ ＤＤＴ，１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，０．６ｍＭ ＡＴＰ）中でＴ４−ＤＮ
Ａ−リガーゼ（１単位／μｇ）により結合させた。
た。 この「直線化」ＤＮＡを３ｋｂの大きさのＰｓｔ
Ｉ断片（挿入物）と、リゲーション緩衝液（２０ｍＭト
リス−ＨＣｌ，ｐＨ７．２，１０ｍＭ ＤＤＴ，１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，０．６ｍＭ ＡＴＰ）中でＴ４−ＤＮ
Ａ−リガーゼ（１単位／μｇ）により結合させた。
【００７８】このリゲーションは１２℃の温度で一晩か
けて行なった。
けて行なった。
【００７９】まず、得られたリゲーション混合物を、レ
ーダーベルグおよびコーエンの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１１９，１９７４，１０７２〜１０７４頁）
により、Ｅ．コリＳ．１７−１中に接合した。 選択
は、ＮＹＢ上でカナマイシン２５μｇ／ｍｌにより、お
よびアンピシリン１００μｇ／ｍｌに対して行なった。
この、プロモーターＰblaへの転写方向で挿入物（アン
ピシリンに敏感で、カナマイシンに耐性）を有するハイ
ブリッドプラスミドにｐＬＯ３２の記号を付けた。
ーダーベルグおよびコーエンの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１１９，１９７４，１０７２〜１０７４頁）
により、Ｅ．コリＳ．１７−１中に接合した。 選択
は、ＮＹＢ上でカナマイシン２５μｇ／ｍｌにより、お
よびアンピシリン１００μｇ／ｍｌに対して行なった。
この、プロモーターＰblaへの転写方向で挿入物（アン
ピシリンに敏感で、カナマイシンに耐性）を有するハイ
ブリッドプラスミドにｐＬＯ３２の記号を付けた。
【００８０】ｃ）ＨＫ１３４９．４におけるｐＬＯ３２
の接合 Ｅ．コリ Ｓ１７−１からＨＫ１３４９．４への接合継代
移動も、上記の方法により行なった。ハイブリッドプラ
スミドｐＬＯ３２を含むＨＫ１３４９．４の選択は、直
接、相補化すべきベタイン利用に基付いて行なった
（０．２重量％のベタインを含む、実施例１と同様の鉱
物塩培養基）。
の接合 Ｅ．コリ Ｓ１７−１からＨＫ１３４９．４への接合継代
移動も、上記の方法により行なった。ハイブリッドプラ
スミドｐＬＯ３２を含むＨＫ１３４９．４の選択は、直
接、相補化すべきベタイン利用に基付いて行なった
（０．２重量％のベタインを含む、実施例１と同様の鉱
物塩培養基）。
【００８１】
【実施例７】ＨＫ１３４９．４におけるｐＬＯ３２の安定性 微生物ＨＫ１３４９．４中のハイブリッドプラスミドの
長期安定性を種々の培地上で試験した。 基質として唯
一の炭素供給源、ベタイン（または他のベタイン、たと
えばコリンおよびジメチルグリシン）の利用に関する安
定化は、明らかに１００％行なわれた。
長期安定性を種々の培地上で試験した。 基質として唯
一の炭素供給源、ベタイン（または他のベタイン、たと
えばコリンおよびジメチルグリシン）の利用に関する安
定化は、明らかに１００％行なわれた。
【００８２】連続循環培養における窒素を含まない培地
のような窒素制限の際も、唯一の窒素供給源としてベタ
インを利用する際の安定化は、他の炭素供給源の存在下
で、１００％確認された。
のような窒素制限の際も、唯一の窒素供給源としてベタ
インを利用する際の安定化は、他の炭素供給源の存在下
で、１００％確認された。
【００８３】培地 全細胞 プラスミドを有する細胞 ＭＭ（硫酸アンモニウムを含む） １００％ ５％ ０．２％ Ｇｌｃ（選択なし） ＭＭ（硫酸アンモニウムなし） １００％ ２０％ ０．１％ Ｂｅｔ ０．２％Ｇｌｕ（選択なし） ＭＭ（硫酸アンモニウムなし） １００％ １００％ ０．１％ Ｂｅｔ（ＣおよびＮ供給源） ＭＭ（硫酸アンモニウムを含む） １００％ １００％ ０．２％ Ｂｅｔ（Ｃ供給源） ＭＭ（硫酸アンモニウムなし） １００％ １００％ ０．１％ Ｂｅｔ （Ｎ供給源）０．２％ Ｇｌｃ 表の略号： Ｇｌｕ＝Ｌ−グルタミン酸塩（ＣおよびＮ供給源） Ｇｌｃ＝グルコース（Ｃ供給源） Ｎ＝窒素＋，− Ｂｅｔ＝ベタイン（ＣおよびＮ供給源） ＭＭ＝最少培地（クラら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．（１９８３），１３５，１〜７頁）
ｌ．（１９８３），１３５，１〜７頁）
【００８４】
【実施例８】生物変換特性をそなえたハイブリッドプラスミドの安定
性 ｂｅｕ 陰性宿主品種ＨＫ１３４９．９におけるプラスミ
ド暗号付けするｂｅｕ遺伝子の安定化作用のための例と
して、すでにＥＰ−Ａ ０４７７８２８に記載されてい
るハイブリッドプラスミドｐＬＯ３を選択した。
性 ｂｅｕ 陰性宿主品種ＨＫ１３４９．９におけるプラスミ
ド暗号付けするｂｅｕ遺伝子の安定化作用のための例と
して、すでにＥＰ−Ａ ０４７７８２８に記載されてい
るハイブリッドプラスミドｐＬＯ３を選択した。
【００８５】そのハイブリッドプラスミドとは、遺伝子
ｘｙｌＭＡに関して暗号付けし、カナマイシンホスホト
ランスフェラーゼ−プロモーターの管理下でクローニン
グされる、ベクターｐＫＴ２４０およびＴＯＬ−プラス
ミドのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．３５Ｋｂ）
からなるハイブリッドプラスミドである。
ｘｙｌＭＡに関して暗号付けし、カナマイシンホスホト
ランスフェラーゼ−プロモーターの管理下でクローニン
グされる、ベクターｐＫＴ２４０およびＴＯＬ−プラス
ミドのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．３５Ｋｂ）
からなるハイブリッドプラスミドである。
【００８６】ａ）新規なカナマイシン耐性（ＫｍR）の
導入 ｐＲＭＥ１（ハラヤマら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６７、４５５〜４６１頁）から得たカナマイシン耐性カ
セット（１．１Ｋｂ）をＥｃｏＲＩ（ＤＮＡ１μｇあた
り４単位）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分
離した。 ＤＮＡ断片の５’で突き出した末端をクレノ
ー反応により補充した（『分子生物学における現況』
ジョンウイリー，ニューヨーク １９８７，３．５
章）。 ｐＬＯ３−ＤＮＡをＨｐａＩ（ＤＮＡ１μｇあ
たり１単位）で切断し、４．８単位のアルカリ性ホスフ
ァターゼで脱ホスホリル化した。 イソプロパノール沈
殿の後、この「ブラントエンド」切断したベクターを、
今度は「ブラントエンド」挿入物（ＫｍR−カセット）
で一晩１５℃でリゲーションした。 リゲーション緩衝
液：２０ｍＭトリス、１０ｍＭＭｇＣｌ2、０．６ｍＭ
ＡＴＰ、ｐＨ７．２、１０％ＰＥＧ ６０００、０．５
単位Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ。
導入 ｐＲＭＥ１（ハラヤマら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６７、４５５〜４６１頁）から得たカナマイシン耐性カ
セット（１．１Ｋｂ）をＥｃｏＲＩ（ＤＮＡ１μｇあた
り４単位）で切断し、アガロースゲル電気泳動により分
離した。 ＤＮＡ断片の５’で突き出した末端をクレノ
ー反応により補充した（『分子生物学における現況』
ジョンウイリー，ニューヨーク １９８７，３．５
章）。 ｐＬＯ３−ＤＮＡをＨｐａＩ（ＤＮＡ１μｇあ
たり１単位）で切断し、４．８単位のアルカリ性ホスフ
ァターゼで脱ホスホリル化した。 イソプロパノール沈
殿の後、この「ブラントエンド」切断したベクターを、
今度は「ブラントエンド」挿入物（ＫｍR−カセット）
で一晩１５℃でリゲーションした。 リゲーション緩衝
液：２０ｍＭトリス、１０ｍＭＭｇＣｌ2、０．６ｍＭ
ＡＴＰ、ｐＨ７．２、１０％ＰＥＧ ６０００、０．５
単位Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ。
【００８７】Ｅ．コリＫ１２を実施例２と同様にしてリ
ゲーション混合物で形質転換し、ｐＬＯ３（ＫｍR）を
含む形質転換物を栄養寒天上で５０μｇ／ｍｌ Ｋｍで
淘汰した。
ゲーション混合物で形質転換し、ｐＬＯ３（ＫｍR）を
含む形質転換物を栄養寒天上で５０μｇ／ｍｌ Ｋｍで
淘汰した。
【００８８】ｂ）ｂｅｕ遺伝子のｐＬＯ３（ＫｍR）へ
の導入 ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３（ＫｍR）をＰｓｔＩ
（１単位／μｇＤＮＡ）で「直線化」し（実施例６参
照）、大きさ３ＫｂのＰｓｔＩ−断片ｂｅｕでリゲーシ
ョンした。 Ｅ．コリ中の形質転換およびＨＫ１３４
９．４中の接合実施例６と同様に行なった。 このハイ
ブリッドプラスミドはｐＬＯＬＯ１と命名し、追加のキ
シレンモノオキシゲナーゼ活性（ｘｙｌＭＡ）を有する
ｐＬＯ３２に相当する。
の導入 ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３（ＫｍR）をＰｓｔＩ
（１単位／μｇＤＮＡ）で「直線化」し（実施例６参
照）、大きさ３ＫｂのＰｓｔＩ−断片ｂｅｕでリゲーシ
ョンした。 Ｅ．コリ中の形質転換およびＨＫ１３４
９．４中の接合実施例６と同様に行なった。 このハイ
ブリッドプラスミドはｐＬＯＬＯ１と命名し、追加のキ
シレンモノオキシゲナーゼ活性（ｘｙｌＭＡ）を有する
ｐＬＯ３２に相当する。
【００８９】ｃ）安定化したハイブリッドプラスミドに
よる生物変換 アグロバクテリウム／リゾビウム 種ＨＫ１３４９．４／
ｐＬＯＬＯ１を鉱物塩培地（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．１３５（１９８３），１〜７頁）中で唯一の炭素
供給源として０．２％ベタインで３０℃で培養した。
０．１％（ｖ／ｖ）２，５−ジメチルピラジンの５−ヒ
ドロキシメチル−２−メチルピラジンへの生物変換が確
認された。
よる生物変換 アグロバクテリウム／リゾビウム 種ＨＫ１３４９．４／
ｐＬＯＬＯ１を鉱物塩培地（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．１３５（１９８３），１〜７頁）中で唯一の炭素
供給源として０．２％ベタインで３０℃で培養した。
０．１％（ｖ／ｖ）２，５−ジメチルピラジンの５−ヒ
ドロキシメチル−２−メチルピラジンへの生物変換が確
認された。
【００９０】５−ヒドロキシメチル−２−メチルピラジ
ンの収率は２日後に２０％になった 。ｄ）ＨＫ１３４９．４中のｐＬＯＬＯ１の安定性 実施例７と同様に、微生物ＨＫ１３４９．４中のハイブ
リッドプラスミドの長期間安定性を試験した。 唯一の
炭素供給源ならびに唯一の窒素供給源としてベタインを
利用することにより、このプラスミドは生物変換条件下
でも生産品種中で安定して１００％保存された。
ンの収率は２日後に２０％になった 。ｄ）ＨＫ１３４９．４中のｐＬＯＬＯ１の安定性 実施例７と同様に、微生物ＨＫ１３４９．４中のハイブ
リッドプラスミドの長期間安定性を試験した。 唯一の
炭素供給源ならびに唯一の窒素供給源としてベタインを
利用することにより、このプラスミドは生物変換条件下
でも生産品種中で安定して１００％保存された。
【図１】 本発明の微生物を特徴付けるＤＮＡ断片の遺
伝子配列を示す制御地図。
伝子配列を示す制御地図。
【図２】 ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２の図。
【手続補正書】
【提出日】平成５年１２月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クヌート ブルクドルフ スイス国 カントン・ヴァリス ラルデン バッハシュトラーセ（番地なし) (72)発明者 カテリーヌ コーベール フランス国 ナンシー リュー・ド・セー ル 11
Claims (12)
- 【請求項１】 ａ）ベタインの利用に関して暗号付け
し、図１の制限地図 【図１】 により特徴付けられる遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を有
するハイブリッドプラスミド、および ｂ）染色体の、ベタインの利用に関して暗号付けする遺
伝子における突然変異を含むことを特徴とする微生物。 - 【請求項２】 ハイブリッドプラスミドｐＬＯ３２を含
む、識別のための名称ＨＫ１３４９．４を有することを
特徴とする請求項１の微生物（ＤＳＭ−No.６７１
２）。 - 【請求項３】 請求項１のＤＮＡ断片および発現ベクタ
ーからなることを特徴とするハイブリッドプラスミド。 - 【請求項４】 ＨＫ１３４９．４の名称を有する微生物
（ＤＳＭ−No.６７１２）中に供託されている、請求項
１のＤＮＡ断片および発現ベクターｐＫＴ２４０からな
り、ｐＬＯ３２の名称を有することを特徴とする請求項
３のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項５】 ベタインの利用に関して暗号付けし、請
求項１の制限地図により特徴付けられる遺伝子配列を含
むことを特徴とするＤＮＡ断片。 - 【請求項６】 ＨＫ１３４９．４の名称を有する微生物
（ＤＳＭ−No.６７１２）中に供託されている、ハイブ
リッドプラスミドｐＬＯ３２中にあることを特徴とする
請求項５のＤＮＡ断片。 - 【請求項７】 ベタインの利用に関して安定したプラス
ミドで形質転換した微生物の製造方法において、 ａ）ベタインを利用する微生物を、もはやベタインを利
用できないように、染色体において突然変異化するこ
と、 ｂ）分離した、ベタインの利用に関して暗号付けする請
求項５のＤＮＡ断片を発現ベクター中でハイブリッドプ
ラスミドに結合させること、および ｃ）工程ａ）で得られた微生物を、工程ｂ）で得られた
ハイブリッドプラスミドで形質転換し、次いでベタイン
の利用に関して選択することを特徴とする方法。 - 【請求項８】 ａ）ベタインを利用する微生物として、
ＨＫ１３４９の名称を有する微生物を、微生物ＨＫ１３
４９．４が生じるように、染色体で突然変異化するこ
と、 ｂ）分離した、ベタインの利用に関して暗号付けする請
求項５のＤＮＡ断片を発現ベクターｐＫＴ２４０中に結
合させること、および ｃ）工程ａ）で得られたＨＫ１３４９．４の名称を有す
る微生物を、工程ｂ）で得られたハイブリッドプラスミ
ドｐＬＯ３２で形質転換し、次いでベタインの利用に関
して選択することを特徴とする請求項７の方法。 - 【請求項９】 請求項５のＤＮＡ断片の、ベタイン利用
に関して安定したプラスミドの製造への利用。 - 【請求項１０】 請求項１の微生物の、ベタイン利用に
関して安定したプラスミドを有する生産品種の製造への
利用。 - 【請求項１１】 ベタインの利用に関して安定したプラ
スミドを有する生産品種において、染色体の、ベタイン
の利用に関して暗号付けする遺伝子の突然変異を含む微
生物を、請求項３の、特定の変換に関して暗号付けする
追加の遺伝子を含むハイブリッドプラスミドで形質転換
することにより得られることを特徴とする生産品種。 - 【請求項１２】 名称ＨＫ１３４９．４の微生物を、請
求項４の、特定の変換に関して暗号付けする追加の遺伝
子を含むハイブリッドプラスミドで形質転換することに
より得られることを特徴とする請求項１１の生産品種。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH3412/91-8 | 1991-11-21 | ||
| CH341291 | 1991-11-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153926A true JPH06153926A (ja) | 1994-06-03 |
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Family
ID=4255432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31245092A Expired - Fee Related JP3399993B2 (ja) | 1991-11-21 | 1992-11-20 | プラスミドを安定化するための微生物 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0543344B1 (ja) |
| JP (1) | JP3399993B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2083407C (ja) |
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| DE (1) | DE59209482D1 (ja) |
| DK (1) | DK0543344T3 (ja) |
| ES (1) | ES2121808T3 (ja) |
| HU (1) | HU218739B (ja) |
| IL (1) | IL103811A (ja) |
| MX (1) | MX9206630A (ja) |
| RU (1) | RU2099418C1 (ja) |
| SK (1) | SK279052B6 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013523704A (ja) * | 2010-03-31 | 2013-06-17 | スタビリテック リミテッド | ウイルス粒子、ポリペプチド又は生体材料を安定化させる添加剤 |
| US10029007B2 (en) | 2011-10-05 | 2018-07-24 | Stabilitech Biopharma Ltd | Stabilisation of polypeptides |
| US10206960B2 (en) | 2010-03-31 | 2019-02-19 | Stabilitech Biopharma Ltd | Stabilisation of viral particles |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2698879B1 (fr) * | 1992-12-09 | 1995-01-13 | Rhone Poulenc Biochimie | gellules modifiées au niveau du catabolisme de la bétaïne, préparation et utilisations, notamment pour la production de métabolites ou d'enzymes. |
| KR100346293B1 (ko) * | 1993-10-08 | 2002-11-30 | 론자 아게 | 부티로베타인/크로토노베타인-l-카르니틴대사유전자와l-카르니틴의미생물학적제조에사용되는그것의용도 |
| WO2002061094A2 (de) * | 2001-01-31 | 2002-08-08 | Lonza Ag | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von l-carnitin |
| US7229792B2 (en) * | 2004-05-03 | 2007-06-12 | Vinod Pandiripally | Method of producing recombinant proteins |
| GB201406569D0 (en) | 2014-04-11 | 2014-05-28 | Stabilitech Ltd | Vaccine compositions |
| GB2562241B (en) | 2017-05-08 | 2022-04-06 | Stabilitech Biopharma Ltd | Vaccine compositions |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US4650761A (en) * | 1981-11-27 | 1987-03-17 | Eli Lilly And Company | Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cell |
| EP0178764A1 (en) * | 1984-08-28 | 1986-04-23 | Genex Corporation | Method of stabilizing a host microorganism/expression vector system for large scale production of proteins |
| DK594084A (da) * | 1984-12-12 | 1986-06-13 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til stabilisering af extra-chromosomale elementer i bakterier under dyrkning |
| US5198343A (en) * | 1986-08-05 | 1993-03-30 | Transgene, S.A. | Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained |
| CZ279464B6 (cs) * | 1990-09-24 | 1995-05-17 | Lonza A.G. | Způsob hydroxylace methylových skupin v aromatických heterocyklech, hybridní plasmidy pL05 a p L04 uložené v mikroorganismech Pseudomonas putida a Escherichia coli |
-
1992
- 1992-10-13 RU SU925053267A patent/RU2099418C1/ru active
- 1992-11-17 ES ES92119635T patent/ES2121808T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-17 AT AT92119635T patent/ATE170563T1/de active
- 1992-11-17 DE DE59209482T patent/DE59209482D1/de not_active Expired - Lifetime
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