CN110358743A - 一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110358743A CN201910474705.XA CN201910474705A CN110358743A CN 110358743 A CN110358743 A CN 110358743A CN 201910474705 A CN201910474705 A CN 201910474705A CN 110358743 A CN110358743 A CN 110358743A
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梁书利
林影
李璐
廖一波
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    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

本发明公开了一种单加氧酶DszC突变体，该单加氧酶DszC突变体对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，该单加氧酶DszC突变体是将来源于Rhodococcuserythropolis IGTS8的DszC的第101位丙氨酸突变为赖氨酸，第327位色氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列如SEQ NO:4所示。本发明还提供制备该单加氧酶DszC突变体的方法及该单加氧酶DszC突变体在制备高校脱硫剂中的应用。本发明的技术方案通过获得在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC，能够对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，显著地脱硫效率。

Description

一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用。
背景技术
在微生物4S脱硫途径中，DszC酶是第一个参与反应的酶，将DBT两步加氧氧化成DBTO2。DszA、DszB、DszC酶均受到代谢终产物HBP的抑制，其中DszC受到的抑制最严重。因此，解除HBP对DszC酶的抑制从而提高DszC酶的催化活性获得优选的DszC酶对于提高4S脱硫途径的脱硫效率有着至关重要的意义。
微生物脱硫的4S途径可特异性裂解加氢脱硫(HDS)后残留的难脱硫芳香族S-杂环化合物的C-S键而不损失其燃烧值。该途径的四种Dsz酶将模式化合物二苯并噻吩(DBT)转化为无硫化合物2-羟基联苯(HBP)。该途径最困难的瓶颈之一是HBP对Dsz酶的反馈抑制作用，并且4S途径中第一个参与反应的酶DszC受到最严重的抑制。
然而，目前关于HBP在DszC上的结合位点和结合机制尚未得到解析。在缺乏酶结构或催化机理信息的情况下，定向进化技术是提高酶催化活性的有力工具。因此，通过定向进化技术获得优选的DszC酶能够有效提高4S途径的脱硫效率。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中不足，提供一种单加氧酶DszC突变体，通过获得在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC，能够对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，显著地脱硫效率。
本发明所解决的技术问题在于提供一种单加氧酶DszC突变体，通过高通量筛选和模拟分子对接获得了HBP产量最高的突变菌株E.coli BL21(DE3)/A101V，并对A101和一个与HBP通过π键相互作用的关键残基W327进行了迭代饱和诱变，最终获得了在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC。
为了达到上述技术效果，本发明提供了如下技术方案：
一种单加氧酶DszC突变体，该单加氧酶DszC突变体对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，其特征在于：该单加氧酶DszC突变体是将来源于Rhodococcuserythropolis IGTS8的DszC的第101位丙氨酸突变为赖氨酸，第327位色氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列如SEQNO:4所示。编码该DszC突变体的核苷酸序列如SEQ NO:3所示。
一种制备上述单加氧酶DszC突变体的方法，包括以下步骤：
(1)以SEQ NO:1所示的野生型DszC的核苷酸序列为模板，以其编码序列如SEQ NO:1的核苷酸序列为模板，通过易错PCR引物EP-S/EP-A、使用低保真DNA聚合酶rTaq酶和添加一定量的MnSO4对DszC进行随机突变；
(2)步骤(1)的突变基因和含有4S途径其余三个基因dszA、dszB和dszD的表达载体pSB4A5-BAD经Nhe I和HindⅢ双酶切、T4连接酶连接后转化表达宿主E.coli BL21(DE3)；
(3)将(2)中获得的突变子逐一挑至无菌96孔板中，在含有氨苄青霉素的LB培养基中35～38℃震荡培养过夜，即得母板；将母板中的菌复制至深孔96孔板，获得子板；子板中的菌在如上条件下培养过夜，加入IPTG进行诱导，继续相同条件培养3～6小时后，加入一定量的DBT作为全细胞催化反应的底物，27～35℃震荡反应24小时；
(4)取一定量子板中的发酵液在600nm下测量菌体浓度OD600；
(5)把子板剩余发酵液进行离心，取上清至干净的96孔酶标版，用Na2CO3调节pH至9～10之间，用Gibss乙醇溶液进行显色反应，在610nm下测量蓝色络合物的浓度；
(6)从母板中选取A610/A600比野生型HBP产量高的菌株进行测序，挑选有氨基酸变化的菌株进行摇瓶复筛；即将菌体诱导发酵后收集、洗涤，在5mL反应体系中控制一定的菌体量以及一定量DBT作为全细胞催化底物；在27～35℃下震荡反应24小时后，取一定量反应液，用等体积乙酸乙酯萃取，用HPLC检测反应体系内各组分的含量；
(7)经上述步骤筛选到一株HBP产量最高的菌株E.coli BL21(DE3)/A101V；结合Discovery Studio 3.0的模拟分子对接结果，发现A101是其中一个可能的结合口袋中的残基；
(8)通过引物A101-S/A101-A对DszC进行A101位氨基酸的饱和突变，获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力；其中A101K酶活力最高；
(9)以A101K的核苷酸序列为模板，通过引物W327-S/W327-A对DszC进行迭代饱和突变；获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力；其中A101K/W327C(标记为AKWC)酶活力最高。
优选地，步骤(3)、(6)所述震荡的速率为180～250rpm。
优选地，步骤(3)、(6)所述种子液按0.8～1.2:90～120的体积比例接种到LB液体培养基。
优选地，步骤(3)、(6)所述IPTG加入培养基后的浓度为0.1～0.5mM。
本发明还提供上述单加氧酶DszC突变体制备高校脱硫剂中的应用。通过采用在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC，能够对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，显著地脱硫效率。
相对于现有技术本发明具有如下的优点和有益效果：
(1)HBP对AKWC的IC50值从μM水平提高到mM水平，表明AKWC对HPB的抑制已经不敏感。
(2)BL21(DE3)/AKWC的脱硫效率为32.81μMHBP/g CDW/h，是目前最高的。
(3)由于DszC对HBP反馈抑制的脱敏作用，4S途径的代谢流量增加。
结合以上三点可见，本发明的方案通过获得在HBP抑制下酶活性最高的DszC酶突变体AKWC，能够对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，显著地脱硫效率，将其应用于微生物脱硫中，具有广阔的前景。
下面结合附图和具体实施方式进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围；
附图说明
图1为对含有突变体菌株的摇瓶复筛结果。
图2为DszC在A101K的基础上对327位氨基酸进行迭代饱和突变，各纯化后的突变体在1.5μM DBT和5μM HBP下测量的比酶活。
图3为含有DszC及其突变体的E.coli BL21(DE3)全细胞催化0.5mM DBT生成HBP的量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
实施例1、使用pSB4A5-BADC质粒构建dszC基因的突变库
(1)设计随机突变引物EP-S/EP-A。
EP-S:5’-ATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTAC-3’(SEQ NO:5)
EP-A:5’-TTTACAAAAAACCCCTCAAGACCCGT-3’(SEQ NO:6)
以Seq1所示的野生型DszC的核苷酸序列为模板，通过易错PCR引物EP-S/EP-A、使用低保真DNA扩增酶rTaq酶和添加MnSO4对DszC进行随机突变。将dszC的突变基因和含有4S途径其余三个基因dszA、dszB和dszD的表达载体pSB4A5-BAD经Nhe I和HindⅢ双酶切、T4连接酶连接后转化克隆宿主E.coli BL21(DE3)。将获得的突变子逐一挑至无菌96孔板中，在含有氨苄青霉素的LB培养基中35～38℃震荡培养过夜，即得母板。将母板中的菌复制至深孔96孔板，获得子板。子板中的菌在如上条件下培养过夜，加入IPTG进行诱导，继续相同条件培养3～6小时后，加入一定量的DBT作为全细胞催化反应的底物，27～35℃震荡反应24小时。取一定量子板中的发酵液在600nm下测量菌体浓度OD600。把子板剩余发酵液进行离心，取上清至干净的96孔酶标版，用Na2CO3调节pH至9～10之间，用Gibss乙醇溶液进行显色反应，在610nm下测量蓝色络合物的浓度。
实施例2、对孔板筛选得到的突变子摇瓶发酵复筛
从母板中选取A610/A600比野生型HBP产量高的菌株进行测序，挑选有氨基酸变化的菌株进行摇瓶复筛。将菌体诱导发酵后收集、洗涤，在5mL反应体系中控制一定的菌体量以及一定量DBT作为全细胞催化底物。在27～35℃下震荡反应24小时后，取一定量反应液，用等体积乙酸乙酯萃取，用HPLC检测反应体系内各组分的含量。通过高通量筛选和模拟分子对接获得了HBP产量最高的突变菌株E.coli BL21(DE3)/A101V，比含有野生型DszC的菌株提高28.81％。结果如图1所示。
实施例3、对DszC进行迭代饱和突变
通过定点突变引物对野生型DszC进行A101位氨基酸的饱和突变，获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力。其中A101K酶活力最高，比WT提高29.51％。
以A101K为模板，通过定点突变引物对DszC进行迭代饱和突变。获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力。如图2所示，其中A101K/W327C(标记为AKWC)酶活力最高，比WT提高3.3倍。在HBP抑制下测量纯化的AKWC的酶活性，其IC50从μM级别增加至mM级别，表明AKWC已经对HBP脱敏(如表1所示)。
表1.HBP对DszC及其突变体的IC50值
实施例4、含有野生型DszC及突变体大肠杆菌全细胞催化DBT的评价
将菌体诱导发酵后收集、洗涤，在5mL反应体系中控制一定的菌体量以及一定量DBT作为全细胞催化底物。在27～35℃下震荡反应24小时后，取一定量反应液，用等体积乙酸乙酯萃取，用HPLC检测反应体系内各组分的含量。如图3所示，菌株BL21(DE3)/AKWC生成的HBP达到5.04μM，比含有WT的菌株提高3.45倍，并且它的脱硫效率为32.81μMHBP/g CDW/h，已超过已报道的水相中工程细菌静息细胞的最高效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内；
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> SEQUENCE LISTIN
<130> 一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1254
<212> DNA
<213> 红平红球菌（Rhodococcuserythropolis）
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<211> 417
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<213> 红平红球菌（Rhodococcuserythropolis）
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Ala Arg Glu Tyr Thr Arg Thr Gln Ala Arg Pro Trp Thr Pro Ala Gly
275 280 285
Ile Gln Gln Ala Thr Glu Asp Pro Tyr Thr Ile Arg Ser Tyr Gly Glu
290 295 300
Phe Thr Ile Ala Leu Gln Gly Ala Asp Ala Ala Ala Arg Glu Ala Ala
305 310 315 320
His Leu Leu Gln Thr Val Cys Asp Lys Gly Asp Ala Leu Thr Pro Glu
325 330 335
Asp Arg Gly Glu Leu Met Val Lys Val Ser Gly Val Lys Ala Leu Ala
340 345 350
Thr Asn Ala Ala Leu Asn Ile Ser Ser Gly Val Phe Glu Val Ile Gly
355 360 365
Ala Arg Gly Thr His Pro Arg Tyr Gly Phe Asp Arg Phe Trp Arg Asn
370 375 380
Val Arg Thr His Ser Leu His Asp Pro Val Ser Tyr Lys Ile Ala Asp
385 390 395 400
Val Gly Lys His Thr Leu Asn Gly Gln Tyr Pro Ile Pro Gly Phe Thr
405 410 415
Ser
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac 30
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tttacaaaaa acccctcaag acccgt 26

Claims (7)

1.一种单加氧酶DszC突变体，该单加氧酶DszC突变体对4S途径终产物HBP反馈抑制脱敏，其特征在于：该单加氧酶DszC突变体是将来源于Rhodococcuserythropolis IGTS8的DszC的第101位丙氨酸突变为赖氨酸，第327位色氨酸突变为半胱氨酸，氨基酸序列如SEQNO:4所示。
2.如权利要求1所述的单加氧酶DszC突变体，其特征在于：编码该DszC突变体的核苷酸序列如SEQNO:3所示。
3.一种制备权利要求1或2所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以SEQ NO:1所示的野生型DszC的核苷酸序列为模板，通过易错PCR引物EP-S/EP-A、使用低保真DNA聚合酶rTaq酶和添加一定量的MnSO4对DszC进行随机突变；
(2)步骤(1)的突变基因和含有4S途径其余三个基因dszA、dszB和dszD的表达载体pSB4A5-BAD经Nhe I和HindⅢ双酶切、T4连接酶连接后转化表达宿主E.coli BL21(DE3)；
(3)将(2)中获得的突变子逐一挑至无菌96孔板中，在含有氨苄青霉素的LB培养基中35～38℃震荡培养过夜，即得母板；将母板中的菌复制至深孔96孔板，获得子板；子板中的菌在如上条件下培养过夜，加入IPTG进行诱导，继续相同条件培养3～6小时后，加入一定量的DBT作为全细胞催化反应的底物，27～35℃震荡反应24小时；
(4)取一定量子板中的发酵液在600nm下测量菌体浓度OD600；
(5)把子板剩余发酵液进行离心，取上清至干净的96孔酶标版，用Na2CO3调节pH至9～10之间，用Gibss乙醇溶液进行显色反应，在610nm下测量蓝色络合物的浓度；
(6)从母板中选取A610/A600比野生型HBP产量高的菌株进行测序，挑选有氨基酸变化的菌株进行摇瓶复筛；即将菌体诱导发酵后收集、洗涤，在5mL 反应体系中控制一定的菌体量以及一定量DBT作为全细胞催化底物；在27～35℃下震荡反应24小时后，取一定量反应液，用等体积乙酸乙酯萃取，用HPLC检测反应体系内各组分的含量；
(7)经上述步骤筛选到一株HBP产量最高的菌株E.coli BL21(DE3)/A101V；结合Discovery Studio 3.0的模拟分子对接结果，发现A101是其中一个可能的结合口袋中的残基；
(8)通过引物A101-S/A101-A对DszC进行A101位氨基酸的饱和突变，获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力；其中A101K酶活力最高；
(9)以A101K的核苷酸序列为模板，通过引物W327-S/W327-A对DszC进行迭代饱和突变；获得的突变体分别表达纯化后，在一定浓度的HBP抑制作用下测量它们的酶活力；其中A101K/W327C标记为AKWC，酶活力最高。
4.如权利要求3所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，步骤(3)、(6)所述震荡的速率为180～250rpm。
5.如权利要求3所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，步骤(3)、(6)所述种子液按0.8～1.2:90～120的体积比例接种到LB液体培养基。
6.如权利要求3所述的单加氧酶DszC突变体的方法，其特征在于，步骤(3)、(6)所述IPTG加入培养基后的浓度为0.1～0.5mM。
7.如权利要求1或2所述的单加氧酶DszC突变体制备高校脱硫剂中的应用。
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