CN116254300A - 一种基于表面活性剂调控的β-榄香烯双相发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于表面活性剂调控的β‑榄香烯双相发酵生产方法，包括：取活化后的产天然产物β‑榄香烯的酵母菌菌种接种到合成培养基中培养得到种子液；将所述种子液接入合成培养基，使得初始OD为0.5~0.8，在28~30℃、180~240rpm条件下培养16~24h；之后加入萃取剂，再于28~30℃、180~240rpm条件下培养至72h；之后加入表面活性剂，继续培养至168~192h，收集有机相，即得。本发明通过优化表面活性剂的种类、添加量和添加时间，提高发酵系统中β‑榄香烯的生产效率，具有工艺简单，无环境污染物产生，适合于工业化生产的优点。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种基于表面活性剂调控的提高天然产物β-榄香烯产量的双相发酵生产方法。
背景技术
目前，从植物、动物和微生物中提取的天然产物被广泛的应用于制药、医疗和化妆品等领域。据统计，目前全世界被批准广泛使用的抗肿瘤药物中，约半数以上直接来自于天然产物；而在过去20年上市的新药中，约70％直接或间接来自于天然产物。因此，从天然产物中获取具有独特活性与结构的化合物在药物研究过程中具有不可替代的作用。然而传统天然产物研究的策略，即通过常规分离萃取的方法获得植物中的天然产物或通过培养条件和工艺优化筛选微生物中的天然产物，往往具有盲目性且耗时长、成本高。微生物作为新型天然产物发酵生产工程的宿主，将可再生基质转化为可持续的天然产物产品。目前，基于合成生物学改造的微生物平台，能够搭建合理的重组生物合成途径并构建相应产物的微生物高产菌株，来实现从可再生原料中生产能源、化学品及药品等高价值天然产物，有效地解决了目前从天然材料中提取天然产物的方法不断受到挑战，难以实现环境友好型工业化生产的问题，为其工业化大规模生产提供了一种替代的可持续绿色制造方法。
近年来随着人们对天然产物应用的重视,天然产物的性质受到广泛研究，天然产物成分大多数存在相对分子质量大、溶解性差等问题。许多天然产物如萜类化合物、生物碱、醌类和木脂素类等亲脂性强，在相对低浓度下依然存在细胞毒性，导致经济上生产指标(即细胞滴度、产量、生产率)是不可行的，这极大地限制了其可实现工业化的性能。目前，天然产物β-榄香烯抑制的机制知之甚少。虽然在过去40年中得到了广泛的研究，但这些报告主要集中在短链醇和有机酸上。由于其亲脂性，天然产物β-榄香烯抑制归因于分子毒性，即溶剂分子对膜功能的直接干扰。与此一致，在暴露于天然产物β-榄香烯的整个酵母细胞中观察到膜流动性和结构膜损伤的增加。由于天然产物分子的亲脂性，会在细胞膜上积累，膜失去了其完整性，并且抑制了质子和离子的渗透性。因此，发生质子动力的耗散和细胞内pH稳态的损害。这些性质限制了微生物生产天然产物的工业潜力。
在微生物发酵工业中，往往需要超量积累某一种代谢产物，以获得人们所期望的目标产物，提高生产效率。为达到这一目的，必须打破微生物原有的代谢调控系统，让微生物建立新的代谢方式，高浓度地积累人们所期望的代谢产物，而在微生物生产天然产物β-榄香烯必须解决其毒性对于发酵过程影响。常采用的方式有两种：一种是通过各种方法，改变微生物毒性耐受能力，从根本上改变微生物的耐受性；另一种更加重要的方法是发酵过程的代谢调控，即根据代谢调节的理论，通过改变发酵工艺条件(如pH、温度、供氧、外源添加物等)改变菌体内的代谢平衡，最大限度积累对人类有用的代谢产物。
表面活性剂吸附在细胞表面可以改变细胞表面化合物组分(提高疏水官能团浓度，调节元素浓度)，从而改变细胞表面性质引起膜结构和性质的变化，改变膜功能(物质运输、能量产生、通透性)和膜性质(膜电位等)。特别是，已经发现表面活性剂不仅可以提高微生物代谢物的产量，还可以提高微生物分泌这些产物的能力。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明提供一种提高天然产物β-榄香烯产量的方法。该方法便于操作简单，对环境无污染，产率高，有应用于工业化生产潜力，与普通天然产物β-榄香烯的发酵生产相比，本发明方法对于天然产物β-榄香烯的产量有明显的提高。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于表面活性剂调控的β-榄香烯双相发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)取活化后的产天然产物β-榄香烯的酵母菌菌种接种到合成培养基中培养得到种子液；
(2)将所述种子液接入合成培养基，使得初始OD为0.5～0.8，在28～30℃、180～240rpm条件下培养16～24h；
(3)向步骤(2)得到的两相混合发酵液中加入萃取剂，再于28～30℃、180～240rpm条件下培养至72h，得到两相混合发酵液；
(4)向步骤(3)得到的两相混合发酵液中加入表面活性剂，继续培养至168～192h，收集有机相，即得。
优选的，步骤(1)所述的产天然产物β-榄香烯的酵母菌为产β-榄香烯解脂耶式酵母菌。
优选的，步骤(1)中所述的培养的条件为28～30℃、180～240rpm。
优选的，所述的合成培养基含有如下组分：酵母膏10g/L～20g/L，蛋白胨20g/L～40g/L，葡萄糖20g/L-60g/L。
优选的，步骤(3)中所述的萃取剂为正庚烷、正己烷或十二烷，更优选为十二烷。
优选的，步骤(3)中所述的萃取剂在所述两相混合发酵液中的体积分数为10％～20％。
优选的，步骤(4)中所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、吐温80或鼠李糖脂(RLs)。优选为鼠李糖脂。
优选的，步骤(4)中所述表面活性剂与所述两相混合发酵液中的水相的比例为1.25～2.5g:1L。优选为1.25g:1L。
本发明通过添加外源表面活性剂来提高天然产物β-榄香烯产量，同时在培养基中添加具有协同增产效果的萃取剂，能够有效地将天然产物β-榄香烯萃取，有助于提高最终产品中β-榄香烯的含量。本发明利用表面活性剂鼠李糖脂提高天然产物β-榄香烯榄香烯的方法，涉及的转化方式简单、实际操作容易且产物具有较高价值，环境污染少，产率高，具有工业化生产潜力。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
实施例1
一、材料准备：
产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种；
YPD固体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和2％琼脂粉，用水定容至200ml，自然PH，在115℃下灭菌20min，倒平板。
将-80摄氏度保藏的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种接种到YPD平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间2天，得到活化后的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种。
YPD液体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，自然PH，分装入试管中5ml，在115℃下灭菌20min。
YPD液体培养基优化：20g/L酵母膏、40g/L蛋白胨、60g/L葡萄糖，自然PH，分装入500ml摇瓶中，其中葡萄糖需要与酵母膏和蛋白胨分开灭菌，在115℃下灭菌20min。
500ml十二烷，纯度为GC级。
100ml高纯度鼠李糖脂。
二、解脂耶氏酵母发酵制备天然产物β-榄香烯：
(1)从平板上挑取活化后的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌菌种接种到5ml液体YPD培养基中，于30℃、200rpm下培养12～16h，得到产β-榄香烯解脂耶式酵母种子液；
(2)从YPD试管中接取适量酵母种子液加入摇瓶内优化的YPD液体培养基中，使摇瓶培养基初始OD为0.5。在30℃、200rpm条件下培养24h。
(3)在培养24h后的摇瓶发酵液中加入体积分数10％的十二烷作为萃取剂，继续培养至72h。
(4)在摇瓶发酵液中按照水相发酵液的体积分别加入0.25g/L、0.75g/L、1.25g/L和2.5g/L的鼠李糖脂作为表面活性剂，继续培养至168h，收集有机相，即得β-榄香烯。加入的表面活性剂可增加细胞膜通透性，进而提高β-榄香烯发酵生产产量。
对比实施例1
一、材料准备：
产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种(Polf-tHE l2I)。
YPD固体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和2％琼脂粉。
YPD液体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。
YPD液体培养基优化：20g/L酵母膏、40g/L蛋白胨、60g/L葡萄糖。
500ml十二烷，纯度为GC级。
100ml高纯度鼠李糖脂。
二、解脂耶氏酵母发酵制备β-榄香烯：
(1)从平板上挑取活化后的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种接种到5ml液体YPD培养基中于30℃、200rpm下培养12-16h，得到产β-榄香烯解脂耶式酵母种子液；
(2)从YPD试管中接取适量酵母种子液加入摇瓶优化的培养基中，使摇瓶培养基初始OD为0.5。在30℃、200rpm条件下培养24h。
(3)在培养24h后的摇瓶发酵液中加入体积分数10％的十二烷作为萃取剂，继续培养到168h。
三、天然产物产量测量：
1.β-榄香烯产量的测定：
(1)精确称取β-榄香烯标样溶于GC级别十二烷中，分别配成4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L和0.1g/L浓度的β-榄香烯样品，使用气相质谱仪制作标曲，以浓度为横坐标，气相质谱仪峰面积为纵坐标，得到β-榄香烯标准曲线。
(2)发酵结束后，高速离心得到上层十二烷，稀释10倍，过有机滤膜，放入气相质谱仪上检测，结果如表1所示。
表1实施例1与对比实施例1的终产物中细胞滴度和产物产量对比
| 实施例\测量指标 | OD600 | β-榄香烯产量(mg/L) |
| 实施例1：0.25g/L | 127.8 | 991.9 |
| 实施例1：0.75g/L | 139.8 | 1093.5 |
| 实施例1：1.25g/L | 161 | 1142.7 |
| 实施例1：2.5g/L | 152.1 | 1103.2 |
| 对比实施例1 | 51.6 | 879.4 |
表1的数据显示，本发明方法得到的解脂耶式酵母发酵终产物中细胞滴度、β-榄香烯的产量均得到了大幅度的提高。与常规培养方法相比，采用本发明方法获得解脂耶式酵母的发酵终产物中效果最好的为1.25g/L鼠李糖脂，其中OD600提高了237.4％，β-榄香烯产量提高了30％。
实施例2
本实施例考察表面活性剂鼠李糖脂添加时间影响β-榄香烯生物合成。
一、材料准备：
产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种；
YPD固体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和2％琼脂粉，用水定容至200ml，自然PH，在115℃下灭菌20min，倒平板。
将-80摄氏度保藏的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种接种到YPD平板培养基上，进行活化培养，培养温度30℃，培养时间2天，得到活化后的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种。
YPD液体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖，自然PH，分装入试管中5ml,在115℃下灭菌20min。
YPD液体培养基优化：20g/L酵母膏、40g/L蛋白胨、60g/L葡萄糖，自然PH，分装入500ml摇瓶中，其中葡萄糖需要与酵母膏和蛋白胨分开灭菌，在115℃下灭菌20min。
500ml十二烷，纯度为GC级。
100ml高纯度鼠李糖脂。
二、解脂耶氏酵母发酵制备天然产物β-榄香烯
(1)从平板上挑取活化后的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种接种到5ml液体YPD培养基中于30℃、200rpm下培养12-16h，得到产β-榄香烯解脂耶式酵母种子液；
(2)从YPD试管中接取适量酵母种子液加入摇瓶内优化的培养基中，使摇瓶培养基初始OD为0.5。在30℃、200rpm条件下培养24h。
(3)分别在发酵开始0h、24h、48h、72h、96h和120h时按照水相发酵液的体积加入1.25g/L鼠李糖脂作为表面活性剂，并对每个样品在培养24h时向摇瓶发酵液中加入体积分数10％的十二烷作为萃取剂，继续培养至168h。
对比实施例2
一、材料准备：
产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种(Polf-tHE l2I)。
YPD固体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和2％琼脂粉。
YPD液体培养基：10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。
YPD液体培养基优化：20g/L酵母膏、40g/L蛋白胨、60g/L葡萄糖。
500ml十二烷，纯度为GC级。
二、解脂耶氏酵母发酵制备β-榄香烯：
(1)从平板上挑取活化后的产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种接种到5ml液体YPD培养基中于30℃、200rpm下培养12-16h，得到产β-榄香烯解脂耶式酵母种子液；
(2)从YPD试管中接取适量酵母种子液加入摇瓶优化的培养基中，使摇瓶培养基初始OD为0.5。在30℃、200rpm条件下培养24h。
(3)在培养24h时，向摇瓶发酵液中加入体积分数10％的十二烷作为萃取剂，继续培养到168h。
三、天然产物产量测量：
采用对比实施例1中的相同的检测方法测定上述样品中的细胞滴度和产物产量，结果如表2所示。
表2实施例2与对比实施例2的终产物中细胞滴度和产物产量对比
表2的数据显示，本发明方法得到的解脂耶式酵母发酵终产物中细胞滴度、β-榄香烯的产量与对照相比均得到了大幅度的提高。但表面活性剂鼠李糖脂添加时间对于发酵终产物中细胞滴度、β-榄香烯的产量影响不显著，添加时间效果最好为发酵开始72h。
综合表1、表2数据可见，表面活性剂鼠李糖脂其最佳浓度为1.25g/L，以及最佳添加时间为72h。
实施例3
本实施例验证表面活性剂增强细胞膜通透性：
一、材料准备：
发酵培养过168h的产β-榄香烯解脂耶式酵母(Polf-tHE l2I)细胞悬液：在温度28～30℃，200rpm条件下，向优化的YPD液体培养基中加入产β-榄香烯解脂耶式酵母菌种子液，培养24h时，加入十二烷继续培养至168h，得到发酵培养过的细胞悬液。
鼠李糖脂、96孔板、碘化丙啶、N-苯基-1-萘胺荧光探针和共聚焦荧光显微镜。
二、不同表面活性剂增强细胞膜通透性：
采用不同添加量的鼠李糖脂处理上述发酵培养过的细胞悬液6h，观察细胞膜通透性和细胞活性。使用N-苯基-1-萘胺(NPN)进行细胞膜通透性检测。完整的外膜是一个渗透性屏障，并排除疏水性物质。一旦细胞膜损坏，它可以允许NPN进入磷脂层，导致明显的荧光。使用碘化丙啶进行细胞活性检测，碘化丙啶可对DNA的细胞核染色，常用于细胞凋亡检测。细胞膜通透性和细胞活性检测结果如表3所示。
表3细胞膜通透性和细胞活性检测结果
如上表3数据显示，用鼠李糖脂表面活性剂处理细胞悬液，通过其细胞膜通透性和细胞活性检测显示，鼠李糖脂浓度在1.25g/L效果最好。
Claims (10)
1.一种基于表面活性剂调控的β-榄香烯双相发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取活化后的产天然产物β-榄香烯的酵母菌菌种接种到合成培养基中培养得到种子液；
（2）将所述种子液接入合成培养基，使得初始OD为0.5~0.8，在28~30℃、180~240rpm条件下培养16~24h；
（3）向步骤（2）得到的发酵液中加入萃取剂，再于28~30℃、180~240rpm条件下培养至72h，得到两相混合发酵液；
（4）向步骤（3）得到的两相混合发酵液中加入表面活性剂，继续培养至168~192h，收集有机相，即得。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）所述的产天然产物β-榄香烯的酵母菌为产β-榄香烯解脂耶式酵母菌。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）中所述的培养的条件为28~30℃、180~240rpm。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的合成培养基含有如下组分：酵母膏10g/L~20g/L，蛋白胨20g/L~40g/L，葡萄糖20g/L~60g/L。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）中所述的萃取剂为正庚烷、正己烷或十二烷；优选为十二烷。
6.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）中所述的萃取剂在所述两相混合发酵液中的体积分数为10%~20%。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）中所述的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、吐温80或鼠李糖脂。
8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，所述的表面活性剂为鼠李糖脂。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）中所述表面活性剂与所述两相混合发酵液中的水相的比例为1.25~2.5g:1L。
10. 根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述表面活性剂的添加量为终浓度1.25 g/L。
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