CN107244746A - 吡啶和苯酚降解菌及其在含吡啶和苯酚废水处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株吡啶和苯酚降解菌及其在含吡啶和苯酚废水处理中应用。本发明从化工厂污水处理系统的生化系统活性污泥池中取出的污泥混合样中分离筛选，直接以吡啶和苯酚为碳源和氮源的培养基进行吡啶和苯酚降解菌的富集，并以吡啶和苯酚为碳源、氮源的筛选培养基进行分离，得到吡啶和苯酚降解菌NJUST40，命名为Klebsiella pneumoniae NJUST40，保藏编号为CCTCC NO：M 2017101。本发明的吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40能够同时降解吡啶和苯酚，对高浓度的吡啶和苯酚具有耐受性，在18d内实现浓度均为1000mg/L的吡啶和苯酚的降解，吡啶和苯酚的降解率均达到99％以上。吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40特别适用于焦化废水的生物处理，在焦化废水处理中具有良好的应用前景。

Description

吡啶和苯酚降解菌及其在含吡啶和苯酚废水处理中的应用

技术领域

本发明属于有机污染物生物处理技术领域，涉及一株吡啶和苯酚降解菌及其在含吡啶和苯酚废水处理中的应用，具体涉及一株能够同时降解吡啶和苯酚的克雷伯氏杆菌及其在焦化废水生物处理中的应用。

背景技术

焦化废水是由煤气净化、原煤高温干馏和化工产品精制过程中产生的废水，成分复杂且难降解，其中含有酚类、含氮杂环化合物、苯系物，多环芳烃等有机污染物以及氨氮、氰、硫氰化物等无机污染物，有机污染物浓度高、毒性大，性质非常稳定，是典型的最难处理的有毒工业废水之一。苯酚和吡啶是焦化废水中最主要的难降解有机物，而且吡啶和苯酚有很强的生物毒性，会抑制其中氨氮、COD的降解，所以吡啶和苯酚的降解对处理焦化废水尤其重要。

目前国内外去除焦化废水COD和总氮的方法主要是A-O(缺氧-好氧)及A-A-O(厌氧-缺氧-好氧)生物处理技术。但是，焦化废水中的吡啶和苯酚本身就属于难降解有毒物质，同时又对微生物有较大的毒性，严重抑制了微生物对COD和总氮的降解。

目前已报道的可降解焦化废水中吡啶和苯酚的降解菌，大部分对吡啶和苯酚的耐受浓度低(小于1000mg/L)，降解时间长，效率低，降解性能受到限制，难以满足实际工程应用要求。Jiang等在添加电场的膜生物反应器中接种丛毛单胞菌，降解的吡啶和苯酚的最大浓度分别为700和90mg/L(B Jiang et al.Enhanced treatment performance of cokingwastewater and reduced membrane fouling using a novel EMBR,BioresourceTechnology,2017,229:39-45)。Sahariah等在移动床生物反应器中用多种混合微生物处理焦化废水，经过好氧-缺氧-厌氧的序批反应过程，初始苯酚和吡啶浓度分别为1350和50mg/L的条件下，最终只能去除约48％的吡啶和剩余88％的苯酚(Sahariah B P etal.Treatment of coke oven wastewater in an anaerobic–anoxic–aerobic movingbed bioreactor system.Desalination and Water Treatment,2016,57(31):14396-14402)。Mi等在以吡啶和苯酚为碳源进行反硝化动力学的研究中发现，在前期苯酚对吡啶的降解有严重的抑制作用(Mi J et al.Kinetic study of shortcut denitrificationwith a mixture of pyridine and phenol as carbon source.China EnvironmentalScience,2016,2(36):414-18)。因此，驯化筛选出具有高效吡啶和苯酚降解性能的微生物，是处理焦化废水的有效途径，对于处理焦化废水及其他含有含氮杂环化合物和含酚类工业废水具有重要的意义。

发明内容

针对现有的吡啶和苯酚降解菌耐受浓度低、降解时间长和降解效率低等不足，本发明提供了一株吡啶和苯酚的降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40。

发明人从化工厂污水处理系统的生化系统活性污泥池中取出的污泥混合样中分离筛选，直接以吡啶和苯酚为碳源和氮源的培养基进行吡啶和苯酚降解菌的富集，并以吡啶和苯酚为碳源、氮源的筛选培养基进行分离，得到吡啶和苯酚降解菌NJUST40，经分子生物学鉴定为Klebsiella pneumoniae，命名为Klebsiella pneumoniae NJUST40，GenBank登录号为KP303650。该菌株已于2017年3月9日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2017101，保藏地址为武汉市武汉大学。

本发明还提供上述吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40在含吡啶和苯酚废水处理中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：

本发明的吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40能够同时降解吡啶和苯酚，对高浓度的吡啶和苯酚具有耐受性，吡啶和苯酚同步降解效率高。在吡啶和苯酚浓度分别为0-1000mg/L的范围内，Klebsiella pneumoniae NJUST40正常生长并实现吡啶和苯酚的完全降解，在18d内实现浓度均为1000mg/L的吡啶和苯酚的降解，吡啶和苯酚的降解率均达到99％以上。

附图说明

图1是吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40对吡啶和苯酚初始浓度为100mg/L的模拟焦化废水的降解效果图。

图2是苯酚浓度对吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40的吡啶和苯酚降解性能的影响结果图。

图3是吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40对含高浓度吡啶和苯酚的模拟焦化废水的降解效果图。

图4是废水中易降解碳源的存在对吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniaeNJUST40的吡啶降解性能的影响结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

实施例1

Klebsiella pneumoniae NJUST40的筛选分离及其对吡啶和苯酚的降解性能。

(1)菌株的分离

从某化工厂污水处理系统的生化系统活性污泥池中取出的污泥混合样，取50mL污泥混合样加入灭菌的200mL吡啶和苯酚浓度分别为100mg/L的液体无机盐培养基(MSM)，装入500mL锥形瓶中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，实现降解菌的富集培养。6天后，5mL液体培养基转接入100mL新鲜培养基，并摇床培养。经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将液体培养基稀释10⁴-10⁸倍，涂布于吡啶和苯酚浓度分别为100mg/L、以吡啶和苯酚为碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入30℃培养箱进行培养。一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。

无机盐培养基(MSM)的组成如下：Na₂HPO₄·12H₂O(3.057g/L)，KH₂PO₄(0.760g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)，CaCl₂(0.05g/L),微量元素溶液SL-4(10mL/L)。微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g/L),FeSO₄·7H₂O(0.2g/L),微量元素SL-6(100mL/L)。微量元素SL-6组成：ZnSO₄·7H₂O(0.01g/L)，MnCl₂·4H₂O(0.03g/L)，H₃BO₄(0.3g/L)，CoCl₂·6H₂O(0.2g/L)，CuCl₂·2H₂O(0.01g/L)，NiCl₂·6H₂O(0.02g/L)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.03g/L)。

(2)菌株的筛选

挑取分离所得到的单菌落，分别接种于吡啶和苯酚浓度分别为100mg/L、以吡啶和苯酚为碳源和氮源的MSM中，摇床培养14d。用高效液相色谱法分别测定培养基中吡啶和苯酚浓度变化，如果培养基中吡啶和苯酚浓度显著降低，伴随氨氮的生成即可表明吡啶和苯酚发生了降解。在分离得到的单菌落中，命名降解性能最为优异的菌株为NJUST40，在14d的培养期内，吡啶和苯酚完全降解，因此选取该菌株作后续的鉴定。

(3)菌株的鉴定

对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该菌的种属。

①形态特征：NJUST40菌落呈乳脂色，圆形，无鞭毛，半透明，凸起，表面光滑，半流质，边缘整齐。

②生理生化特征：革兰氏阴性，甲基红阴性，VP阳性，可以利用柠檬酸盐和丙酸盐，不运动，最适生长温度为25-30℃。

③分子生物学鉴定：以NJUST40菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，该菌株的16S rDNA基因序列见序列表。将菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库(GenBank登录号为KP303650)，与GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，NJUST40与Klebsiella pneumoniae strainAR_0117和Klebsiella pneumoniae KP-1的序列相似度高达99％以上。

根据NJUST40的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST40鉴定为克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae，命名为Klebsiella pneumoniae NJUST40。

(4)菌株对吡啶和苯酚的降解及在焦化废水废水处理中的应用

将该菌株NJUST40接种至分别添加100mg/L吡啶和苯酚的MSM培养基，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，进行NJUST40的富集培养，待菌体进入对数生长期后期(约7d)，将所得菌体用3,000×g的转速离心分离5分钟，撇去上清液，采用涡旋震荡的方法将菌体重新悬浮于无菌液体MSM，离心。重复洗涤过程四次后，将菌体重新悬浮于无菌液体MSM(调节加入的MSM量，控制菌悬浮液光密度OD₆₀₀约为0.2)，得到种子液。

配制以100mg/L吡啶和苯酚为碳源和氮源的液体MSM作为模拟焦化废水，模拟焦化废水无机盐(MSM)的组成如下：Na₂HPO₄·12H₂O(3.057g/L)，KH₂PO₄(0.760g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)，CaCl₂(0.05g/L)，NH₄Cl(0.172g/L)。

将上述种子液加入模拟焦化废水中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，观测降解过程中废水中吡啶和苯酚浓度以及氨氮浓度，观测细菌生长情况。设立未接种NJUST40的空白对照。图1是吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40对吡啶和苯酚初始浓度为100mg/L的模拟焦化废水的降解效果图。由图1可知，100mg/L吡啶和苯酚可于6d内被驯化后的吡啶和苯酚特效降解菌完全降解并且伴随着NH₄ ⁺-N的生成。而在未接种NJUST40的对照样中，吡啶和苯酚未得到明显降解。

本实施例说明分离得到的Klebsiella pneumoniae NJUST40可以利用吡啶和苯酚为碳源和氮源进行生长繁殖，并可实现吡啶和苯酚的完全降解。

实施例2

苯酚浓度对Klebsiella pneumoniae NJUST40的吡啶和苯酚降解性能的影响。

配制吡啶浓度为500mg/L，苯酚浓度分别为500mg/L、1000mg/L的液体MSM作为模拟焦化废水，将Klebsiella pneumoniae NJUST40种子液以2％的接种量接入模拟焦化废水。图2是吡啶浓度对吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40的吡啶和苯酚降解性能的影响结果图。由图2所示，Klebsiella pneumoniae NJUST40可实现苯酚浓度高达1000mg/L的模拟焦化废水中吡啶和苯酚的完全降解。在苯酚浓度为500mg/L和1000mg/L的条件下，分别可在10d和10.5d内实现模拟废水中吡啶和苯酚的完全去除。虽然苯酚有较高的生物毒性和难降解特性，在高浓度条件下，尽管随着苯酚浓度的增加，Klebsiellapneumoniae NJUST40对苯酚和吡啶的降解时间并没有明显延长，依然对吡啶和苯酚有高效的降解能力。

本实施例说明Klebsiella pneumoniae NJUST40在高的苯酚浓度下依然保持对吡啶和苯酚有较高的降解性能。

实施例3

Klebsiella pneumoniae NJUST40对含高浓度吡啶和苯酚的模拟焦化废水的降解。

配制吡啶和苯酚浓度浓度分别为1000mg/L的液体MSM模拟焦化废水，将Klebsiella pneumoniae NJUST40种子液以2％的接种量接入模拟废水。图3是吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40对含高浓度吡啶和苯酚的模拟焦化废水的降解效果图。由图3所示，在初始吡啶和苯酚浓度分别为1000mg/L的条件下，Klebsiellapneumoniae NJUST40可实现吡啶和苯酚的完全降解。但降解速率明显较慢，在18天的时间里，吡啶和苯酚才能得到完全去除。

本实施例说明Klebsiella pneumoniae NJUST40能对高浓度的吡啶和苯酚进行有效的降解，由于吡啶的高毒性和难降解特性，在浓度较高的条件下，对细菌产生了一定的抑制作用。

实施例4

易降解有机碳源的存在对Klebsiella pneumoniae NJUST40的吡啶降解性能的影响。

配制吡啶和苯酚浓度分别为1000mg/L、外加易降解有机碳源(葡萄糖)浓度分别为500mg/L、1000mg/L和2000mg/L的模拟焦化废水，将Klebsiella pneumoniae NJUST40种子液以2％的接种量接入模拟废水。图4是废水中易降解碳源的存在对吡啶和苯酚降解菌Klebsiella pneumoniae NJUST40的吡啶降解性能的影响结果图。由图4所示，500mg/L葡萄糖的加入对于吡啶的降解速率的提升最明显；而1000mg/L、2000mg/L葡萄糖的加入则延缓了吡啶的降解。

本实施例说明低浓度的易降解碳源的存在有利于Klebsiella pneumoniaeNJUST40的生长，从而促进了吡啶的降解过程；高浓度的易降解碳源的存在消耗了氧气和营养元素，对吡啶的降解产生竞争性抑制，使得细菌优先利用葡萄糖从而对吡啶的降解产生抑制作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北臻润环境科技股份有限公司

<120> 吡啶和苯酚降解菌及其在含吡啶和苯酚废水处理中应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1405

<212> DNA

<213> 克雷伯氏杆菌

<400> 1

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ggtagcttaa ccttcgggag ggcgc 1405

Claims (2)

1.吡啶和苯酚的降解菌，为Klebsiella pneumoniae NJUST40，保藏编号为CCTCC NO：M2017101。

2.根据权利要求1所述的吡啶和苯酚的降解菌在含吡啶和苯酚废水处理中的应用。