CN109439588B - 一种克雷伯氏菌株,吡啶生物降解菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种克雷伯氏菌株,吡啶生物降解菌剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种克雷伯氏菌株,吡啶生物降解菌剂及其制备方法和应用,克雷伯氏菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BD2,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2018685。吡啶生物降解菌剂由克雷伯氏菌株经活化、培养制备得到。本发明的克雷伯氏菌BD2吡啶降解效率高、耐盐、环境耐受性好,由其制备的吡啶生物降解菌剂可应用于降解废水和土壤中吡啶,降解效率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种克雷伯氏菌株,吡啶生物降解菌剂及吡啶生物降解菌剂的制备方法和应用。
背景技术
吡啶是含有一个氮杂原子的六元杂环化合物,分子式C5H5N,无色或微黄色液体,有恶臭,溶于水和醇、醚等多数有机溶剂,具强刺激性,其蒸汽与空气可形成爆炸性混合物,遇明火、高热极易燃烧爆炸。吡啶及其同系物存在于骨焦油、煤焦油、煤气、页岩油、石油中,在工业中除作溶剂外,还可用作变性剂、助染剂,以及合成药品、消毒剂、染料、食品调味料、粘合剂、炸药等的起始物,作为一种广谱、高效杀虫剂,在使用过程中造成环境污染及危害人体健康,吡啶能麻醉中枢神经系统,对眼及上呼吸道有刺激作用,高浓度吸入后,轻者有欣快或窒息感,继之出现抑郁、肌无力、呕吐,重者意识丧失、大小便失禁、强直性痉挛、血压下降,误服可致死。2017年10月27日,世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考,吡啶在2B类致癌物清单中。吡啶的生物毒性大,普通生化系统吡啶一般需控制在10ppm以下,如何有效回收和降解“三废”中的吡啶成为吡啶生产和使用单位十分棘手的难题。
近年来,研究吡啶合成的文献很多,而研究吡啶降解工艺的却鲜有报道,于凤文等以生物柴油为萃取剂对废水中的吡啶进行萃取回收,但是该技术,费用高、萃取不完全、易造成二次污染。张良波等采用超声波/Fenton试剂连用降解废水中的吡啶,但难以将废水处理到普通生化系统吡啶进水浓度要求,需大比例稀释后才能进入生化处理装置。乔琳等在吡啶废水的序批式反应器中,引入吡啶降解菌Paracoccus sp.KT-5加速了反应器的启动,但后期作用不明显,菌体活性不强。综上所述,国内外虽开展了吡啶的去除研究,但涉及的物理、化学法去除吡啶的成本高,工艺较复杂,已筛选的吡啶降解菌不耐盐、环境耐受性差,难以实际应用。
面对上述问题,本领域急需寻求一种耐盐、降解效率高、环境耐受性好的用于降解吡啶的降解菌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种吡啶降解效率高、耐盐、环境耐受性好、可在实际混合废水中高效降解吡啶的克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BD2,还提供了由克雷伯氏菌株制备的吡啶生物降解菌剂及其制备方法和应用,能用于吡啶废水的生物降解或是进一步制备生物降解剂对吡啶污染土壤进行修复。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种克雷伯氏菌株,所述克雷伯氏菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BD2,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M 2018685。
做为一个总的技术构思,本发明还提供了一种吡啶生物降解菌剂,所述吡啶生物降解菌剂由所述的克雷伯氏菌株经活化、培养制备得到。
做为一个总的技术构思,本发明还提供了一种上述吡啶生物降解菌剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)活化:将克雷伯氏菌BD2菌株放置至室温,然后接种至LB液体培养基中,摇床培养24h,使菌株活化;
(2)培养:取活化后菌株接种至吡啶浓度100mg/L、pH7.5的无机盐培养基中,摇床培养24h~30h得到菌剂;再取所述菌剂至吡啶浓度100mg/L、pH7.5的无机盐培养基中,摇床培养24h~30h;如此重复2~3次,制得吡啶生物降解菌剂。
上述的制备方法,优选的,所述步骤(1)中,所述摇床培养的转速为180r/min。
上述的制备方法,优选的,所述步骤(2)中,所述菌液的接种量为2v/v%,摇床培养的转速为180r/min左右、培养温度为30℃。
做为一个总的技术构思,本发明还提供了一种所述吡啶生物降解菌剂在降解废水中吡啶的应用。
上述的应用,优选的,所述应用方法为:取吡啶生物降解菌剂加入至废水中,摇床培养,使吡啶充分降解。
上述的应用,优选的,所述摇床培养过程中,摇床转速为180r/min左右,摇床培养的温度为30℃左右,摇床培养的时间为24h。
上述的应用,优选的,所述废水中吡啶浓度为100mg/L以下。
上述的应用,优选的,所述吡啶生物降解菌剂添加量为2wt%。
上述的应用,优选的,所述废水的盐度为0%~1.5%,废水的pH为7.5左右。
做为一个总的技术构思,本发明还提供了一种上述的吡啶生物降解菌剂在降解土壤中吡啶的应用。
上述的应用,优选的,所述应用方法为:取吡啶生物降解菌剂至土壤中,将菌剂与土壤混合均匀,使吡啶充分降解。
上述的应用,优选的,降解过程中的温度为30℃左右,降解的时间为24h~48h,土壤的pH为7.5。
上述的应用,优选的,所述吡啶生物降解菌剂添加量为5wt%。
上述的应用,优选的,所述土壤的含水量为20%(饱墒)。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)本发明提供了一种克雷伯氏菌株,能以吡啶作为唯一碳源,具有高效降解吡啶的和一定的耐盐能力;对吡啶的降解率为99%;在盐度为0%~1.5%之间,菌株BD2的生长量和对吡啶的降解能力所受抑制较小,能用于吡啶废水的生物降解或是进一步制备生物降解剂对吡啶污染土壤进行修复。因此,该吡啶高效降解菌具有很好的应用前景。
一种吡啶高效降解菌株,其分类命名为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BD2,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2018685;保藏地址为中国湖北省武汉大学,保藏日期为2018年10月17日。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中废水中菌株的分离结果图。
图2为本发明实施例1中菌株BD2的培养性状图。
图3为本发明实施例1中菌株BD2的扫描电镜图。
图4为本发明实施例1中菌株BD2的部分理化实验结果图;1为淀粉水解实验,2为甲基红实验,3为亚硝酸盐还原实验,4为吲哚实验。
图5为本发明实施例2中菌株BD2的生长曲线图。
图6为本发明实施例3中吡啶生物降解菌剂耐盐能力的测定结果图。
图7为本发明实施例4中吡啶生物降解菌剂对废水中吡啶降解能力测定结果图。
图8为本发明实施例5中温度对吡啶生物降解菌剂降解效果的影响结果图。
图9为本发明实施例6中pH对吡啶生物降解菌剂降解效果的影响。
图10为本发明实施例7中摇床转速对吡啶生物降解菌剂降解效果的影响。
图11为本发明实施例8中吡啶生物降解菌剂对土壤中吡啶降解能力测定结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述,但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1:
一种吡啶高效降解菌株,其分类命名为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)BD2,该菌株已于2018年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2018685;保藏地址为中国湖北省武汉大学。
本发明菌株BD2是将从长沙一农药化工企业废水处理池中取的水样经过筛选、分离得到。
具体的筛选方法为:
(1)从长沙一农药化工厂废水池中采集水样3份,每份废水约500ml,标记后带回实验室。
(2)取废水处理池水样的上层清液1ml,用浓度梯度稀释法进行稀释,取10-5、10-6、10-7三个梯度的稀释液1ml均匀涂布于吡啶选择固体培养基上,每一个梯度浓度均设3个平行样,30℃恒温培养箱中培养24h,培养皿中长出菌落后,选取菌落生长状态良好的培养皿(见图1),从中挑取单个菌落进行平板划线,纯化,得到本发明菌株BD2,并于4℃冰箱保存备用。
将本发明菌株BD2在LB固体培养基上,30℃恒温培养箱中培养24h,肉眼观察发现:菌落菌株BD2菌落呈圆形、浅黄色、边缘不整齐、中间无凸起、无光泽、不粘稠、不产色素(见图2)。电子显微镜观察菌株BD2的形态特征,发现菌株BD2呈杆状,无端生鞭毛(见图3)。
参照《细菌鉴定手册》对本发明菌株BD2进行革兰氏染色、甲基红实验、过氧化氢酶实验、吲哚实验、淀粉水解实验、硝酸盐还原实验等检测。发现菌株BD2的革兰氏染色阳性、淀粉水解实验阴性、甲基红实验阴性、硝酸盐还原实验阳性、吲哚实验阳性(见图4)。
采用菌落PCR方法提取菌株BD2的基因组DNA,用16S rDNA测序法测得菌株BD2的序列,将该序列于GenBank数据库中进行BLAST分析,比对发现,菌株BD2与Klebsiellasp.SPC06(Genbank登录号为:KF945683.1)的同源性达到99%,结合形态和生理生化特征的检测结果,确定该菌株为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.),命名为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)BD2。
实施例2:
一种吡啶生物降解菌剂,其制备方法为:
(1)将处于-20℃LB固体斜面保藏或-80℃超低温70%甘油冷冻保藏的克雷伯氏菌BD2菌株取出放置室温,然后接种至50mL的LB液体培养基中摇床培养24h,摇床转速为180r/min,完成菌株活化。
(2)取经过活化后菌液2ml至吡啶浓度100mg/L、pH7.5的100ml无机盐培养基中,摇床转速180r/min、30℃条件下培养24h得到菌液;图5为培养32h过程中,菌株生长曲线图,从图5中可知,菌株在24h时,菌株的生长量达到最大。
(3)再取2ml步骤(2)中的菌液至吡啶浓度100mg/L、pH7.5的100ml无机盐培养基中,摇床转速180r/min、30℃条件下培养24h;如此重复2次(2~3次均可),制得吡啶生物降解菌剂。
实施例3:
考察吡啶生物降解菌剂的耐盐能力。取1ml实施例2的吡啶生物降解菌剂加入到盐度为0%(W/V)、0.5%(W/V)、1%(W/V)、1.5%(W/V)、2%(W/V)、2.5%(W/V)的MS培养基中,摇床转速180r/min、pH7.0、吡啶浓度100mg/L、30℃条件下培养24h,紫外分光光度计(600nm)测定菌株的生长量,高效液相色谱法测定吡啶含量。
结果参见图6,从图6中可知,在盐度为0%~1.5%之间,菌株BD2的生长量变化较小,当盐度大于1.5%时,生长量下降明显,菌株生长受到抑制,实验结果表明,本发明菌株BD2具有一定的耐盐能力。
实施例4:
一种吡啶生物降解菌剂在降解废水中吡啶的应用,其应用方法为:
取1ml吡啶生物降解菌剂至49ml吡啶废水中,设置废水吡啶浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L,摇床转速180r/min、温度30℃条件下培养24~30h,每组3个平行,高效液相色谱法测定吡啶含量。
结果参见图7,从图7中可知:吡啶浓度为100mg/L时,本发明菌株BD2对吡啶的降解率为99%,实验结果表明,本发明菌株BD2对废水中吡啶具有高效降解能力。
实施例5:
考察温度对吡啶生物降解菌剂活性的影响:取1ml吡啶生物降解菌剂至49ml,pH为7.5的吡啶废水中,设置废水吡啶浓度为100mg/L,摇床转速180r/min左右、温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃以及40℃条件下培养24~30h,每组3个平行,高效液相色谱法测定吡啶含量。
结果参见图8;从图8中可知,温度对吡啶生物降解菌剂的活性有较大影响,当温度为25℃~35℃时,吡啶生物降解菌剂的降解率达到85%以上,温度为30℃时,降解率达到了99%,当温度为20℃、40℃时,吡啶的降解率降低至75%以下。因此,吡啶生物降解菌剂的最佳温度为30℃。
实施例6:
考察pH对吡啶生物降解菌剂活性的影响:取1ml吡啶生物降解菌剂至49ml,pH分别为5、6、7、8、9的吡啶废水中,设置废水吡啶浓度为100mg/L,摇床转速180r/min、温度30℃条件下培养24~30h,每组3个平行,高效液相色谱法测定吡啶含量。
结果参见图9;从图9中可知,pH对吡啶生物降解菌剂的活性有较大影响,当pH为7~8时,吡啶生物降解菌剂的降解率达到95%以上,当pH为5时,吡啶的降解率降低至50%以下。因此,吡啶生物降解菌剂的最佳pH为7.5。
实施例7:
考察摇床转速对吡啶生物降解菌剂活性的影响:
取1ml吡啶生物降解菌剂至49ml,pH7.5的吡啶废水中,设置废水吡啶浓度为100mg/L,摇床转速分别为120r/min、150r/min、180r/min、200r/min、220r/min、温度30℃条件下培养24~30h,每组3个平行,高效液相色谱法测定吡啶含量。
结果参见图10;从图10中可知,摇床转速对吡啶生物降解菌剂的活性有较大影响,当摇床转速为180r/min时,吡啶生物降解菌剂的降解率达到99%,当摇床转速低于180r/min时,吡啶的降解率降低至90%以下。因此,吡啶生物降解菌剂的最佳摇床转速为180r/min。
实施例8:
一种吡啶生物降解菌剂在降解土壤中吡啶的应用,其应用方法为:
取吡啶生物降解菌剂5g加入至含水量为20%(饱墒)的95g土壤中,生物降解剂添加量为5wt%左右,设置土壤吡啶浓度分别为20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg,将菌剂与土壤混合均匀,降解24~30h,高效液相色谱法测定吡啶含量。
结果参见图11,从图11中可知,土壤中吡啶浓度为50mg/L时,本发明菌株BD2对吡啶的降解率为81%。实验结果表明,本发明菌株BD2对土壤中吡啶具有高效降解能力。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下,都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰,均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (10)
1.一种克雷伯氏菌株,其特征在于,所述克雷伯氏菌株为克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)BD2,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2018685。
2.一种吡啶生物降解菌剂,其特征在于,所述吡啶生物降解菌剂由权利要求1所述的克雷伯氏菌株经活化、培养制备得到。
3.一种权利要求2所述吡啶生物降解菌剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)活化:将克雷伯氏菌BD2菌株放置至室温,然后接种至LB液体培养基中,摇床培养24h,使菌株活化;
(2)培养:取活化后菌株至吡啶浓度100mg/L、pH7.5的无机盐培养基中,摇床培养24h~30h得到菌剂;再取所述菌剂至吡啶浓度100mg/L、pH7.5的无机盐培养基中,摇床培养24h~30h;如此重复2~3次,制得吡啶生物降解菌剂。
4.一种权利要求2所述吡啶生物降解菌剂在降解废水中吡啶的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述应用方法为:取吡啶生物降解菌剂加入至废水中,摇床培养,使吡啶充分降解。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述摇床培养过程中,摇床转速为180r/min,摇床培养的温度为30℃,摇床培养的时间为24h~30h。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述废水的盐度为0%~1.5%;
和/或,所述吡啶生物降解菌剂添加量为2wt%。
8.一种权利要求2所述的吡啶生物降解菌剂在降解土壤中吡啶的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述应用方法为:取吡啶生物降解菌剂加入至土壤中,将菌剂与土壤混合均匀,使吡啶充分降解。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,降解的温度为30℃,降解的时间为24h~48h,土壤的pH为7.5;
和/或,所述吡啶生物降解菌剂的加入量为5wt%。
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