CN105567657A - 一种磷酸酶fm2382及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸酶FM2382及其编码基因与应用。本发明公开的磷酸酶FM2382为如下A1)、A2)、A3)或A4)：A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；A2)氨基酸序列为序列2的第21-309位的蛋白质；A3)在序列2或序列2的第21-309位的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)或A2)衍生的蛋白质；A4)在A1)、A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的FM2382具有磷酸水解酶的活性，本发明的磷酸酶FM2382易制备，稳定性好，耐受中高温，最适温度45℃，不仅能降解磷的化合物，还能降解卤素化合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种磷酸酶FM2382及其编码基因与应用。
背景技术
有机磷化合物作为农药和医药中间体被广泛应用。这些含磷化合物普遍具有环境毒性，化学性质比较稳定，不易被降解，而且容易通过食物链在人和动物体内积累，对人和动物的健康造成极大的威胁。
磷酸酶(Phosphatase,EC3.1.3)可以催化磷酸酯类或磷酸酐类物质的水解。其作用机理为催化有机磷素化合物去磷酸化，通过水解磷酸单酯，使磷酸基团从化合物中释放出来，同时生成磷酸根离子和自由羟基。磷酸酶能够通过释放有机磷农药中的磷，从而解除或降低其毒性，这对治理我国曾大量使用过的有机磷农药(敌敌畏、甲胺磷、乐果、毒死蜱等)的残留问题具有重要应用价值。磷酸酶还可催化土壤中的有机磷化合物水解，来提高土壤的肥力，这对农作物的增产丰收具有重要意义。磷酸酶也可应用于食品(如蔬菜、水果、茶叶等)中含磷农药残留的检测和清除，这对我国的食品安全监测提供了新的方法。
当前已发现的磷酸酶由于在产率、稳定性、催化活性等方面还存在不足，因此开发出新一代高产、高稳定性、高活性的磷酸酶具有重要的应用价值和社会效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的可作为磷酸酶的蛋白质及其编码基因。
本发明提供的蛋白质，其名称为FM2382，是如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；
A2)氨基酸序列为序列2的第21-309位的蛋白质；
A3)在序列2或序列2的第21-309位的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)或A2)衍生的蛋白质；
A4)在A1)、A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，序列1由309个氨基酸组成。
为了使A1)或A2)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2或序列2的第21-309位所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述A1)或A2)中的FM2382可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A1)或A2)中的FM2382的编码基因可通过将序列表中序列1或序列1的第61-930位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与FM2382相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B14)中的任一种：
B1)编码FM2382的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系或转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系或转基因植物细胞系；
B11)含有B1)所述核酸分子的转基因动物组织或转基因植物组织；
B12)含有B2)所述表达盒的转基因动物组织或转基因植物组织；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因动物器官或转基因植物器官；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因动物器官或转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的基因：
b1)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1的第61-930位的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)或限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码FM2382的cDNA分子或基因组DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码FM2382的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列1由930个核苷酸组成，编码序列1所示的FM2382。序列1的第13-30位编码序列2的第5-10位所示的His-tag。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码FM2382的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的FM2382的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码FM2382且具有FM2382功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码FM2382所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码FM2382的核酸分子的表达盒(FM2382基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达FM2382的DNA，该DNA不但可包括启动FM2382基因转录的启动子，还可包括终止FM2382基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述FM2382基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a(+)载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如大肠杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织、转基因植物器官、转基因动物细胞系、转基因动物组织和转基因动物器官均不包括繁殖材料。
FM2382的编码基因可通过含有FM2382的编码基因的表达盒的重组载体导入微生物得到重组微生物。在本发明的一个实施方式中，所述重组载体为将pET-28a(+)载体的NdeI和HindIII识别序列间的DNA片段替换为序列1的第61-930位所示的DNA分子，保持pET-28a(+)载体的其他序列不变，得到的重组载体pET-FM2382，pET-FM2382中，FM2382的编码基因的表达由T7启动子启动，pET-FM2382可表达序列2所示的蛋白质。
其中，序列1的第1-60位为pET-28a(+)载体上的DNA序列，序列1的第13-30位编码序列2的第5-10位所示的His-tag。
为解决上述技术问题，本发明还提供了FM2382的制备方法。所述FM2382的制备方法，包括：培养上述生物材料中B5)-B8)中任一所述重组微生物，使所述核酸分子表达，得到表达FM2382的重组微生物培养物；从所述重组微生物培养物中得到FM2382。
上述方法中，所述从所述重组微生物培养物中得到FM2382可包括：
H1)破碎所述重组微生物培养物中的细胞，得到含有FM2382的粗提液；
H2)分离所述粗提液中的FM2382，得到FM2382。
上述方法中，所述分离所述粗提液中的FM2382可采用亲和层析的方法对所述粗提液中的FM2382进行纯化，具体可采用镍柱进行亲和层析。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
L1、FM2382在作为磷酸酶或磷酸水解酶中的应用；
L2、FM2382在制备磷酸酶或磷酸水解酶产品中的应用；
L3、FM2382在作为碱性磷酸酶中的应用；
L4、FM2382在制备碱性磷酸酶产品中的应用；
M1、所述生物材料在制备磷酸酶或磷酸水解酶中的应用；
M2、所述生物材料在制备磷酸酶或磷酸水解酶产品中的应用；
M3、所述生物材料在制备碱性磷酸酶中的应用；
M4、所述生物材料在制备碱性磷酸酶产品中的应用；
N1、所述方法在制备磷酸酶或磷酸水解酶产品中的应用；
N2、所述方法在制备碱性磷酸酶产品中的应用；
O1、FM2382在降解磷的化合物中的应用；
O2、所述生物材料在降解磷的化合物中的应用；
O3、所述方法在降解磷的化合物中的应用。
上述应用中，所述磷的化合物可为有机磷化合物，如有机磷农药或含磷农药。在本发明的一个实施例中，所述磷的化合物为对硝基苯磷酸二钠(Para-nitrophenylphosphate(pNPP))。
上述应用中，所述磷酸酶或所述碱性磷酸酶具有磷酸水解酶的活性。
实验证明，本发明的FM2382具有磷酸水解酶的活性，本发明的磷酸酶FM2382易制备，稳定性好，耐受中高温，最适温度45℃，不仅能降解磷的化合物，还能降解卤素化合物，如芥子气等化学毒剂。本发明的FM2382具有重要的工业应用前景和社会效益。
附图说明
图1为磷酸酶的SDS-PAGE的结果。
图2为利用圆二色谱仪对磷酸酶Tm值的测定结果。
图3为纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同温度下处理不同时间后的酶活。
图4为纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同温度下的酶活。
图5为纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同pH下的酶活。
图6为本发明的磷酸酶在不同离子下的相对酶活。
图7为本发明的磷酸酶pH稳定性的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的Fulvimarinamanganoxydanssp.nov.8047(CGMCC1.10972)为(FeiRenetal.,Fulvimarinamanganoxydanssp.nov.,isolatedfromadeep-seahydrothermalplumeinthesouth-westIndianOcean，InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(2014),64,2920–2925)中的strain8047，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pET-28a(+)为Novagen公司的产品，产品目录号为69865-3。
下述实施例中的非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：0.1MTris–HCl、0.1MNaCl、0.01M咪唑(Imidazole)、0.5mMEDTA，pH为8.0。
下述实施例中的非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ的制备方法由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：0.1MTris-HCl、0.1MNaCl、0.5M咪唑(Imidazole)、0.5mMEDTA，pH为8.0。
实施例1、磷酸酶的获得及功能验证
一、磷酸酶的制备
1、FM2382蛋白质及其编码基因的获得
将来自Fulvimarinamanganoxydanssp.nov.8047(CGMCC1.10972)的序列1的第61-930位所示的DNA分子命名为基因FM2382，该基因编码的蛋白命名为FM2382，FM2382的氨基酸序列如序列表中序列2的第21-309位所示。
2、重组载体的获得
将pET-28a(+)载体的NdeI和HindIII识别序列间的DNA片段替换为序列1的第61-930位所示的基因FM2382，保持pET-28a(+)载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为pET-FM2382，pET-FM2382中，基因FM2382的表达由T7启动子启动，pET-FM2382能表达序列2所示的蛋白质。
其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质，序列1的第61-930位为基因FM2382的序列，编码序列2的第21-309位所示的FM2382，序列1的第1-60位为pET-28a(+)载体上的DNA序列，序列1的第13-30位编码序列2的第5-10位所示的His-tag。
3、重组菌的获得
将步骤2的pET-FM2382导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-pET-FM2382；将pET-28a(+)载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21-pET。
4、磷酸酶的获得
挑取步骤3的BL21-pET-FM2382的单菌落接入含有卡那霉素培养基(卡那霉素培养基为向LB培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为50μg/ml的液体培养基)中，于37℃过夜培养，得到过夜培养物。将过夜培养物接种于1L卡那霉素培养基中，在37℃下剧烈振荡(200rpm)发酵培养，得到发酵液，该发酵液的OD600值在0.6-0.8左右；向发酵液中加入IPTG，得到蛋白诱导前液，蛋白诱导前液中IPTG的浓度为1.0mM；将蛋白诱导前液在20℃、180rpm的条件下过夜培养(共培养12小时)，得到蛋白诱导发酵液；将蛋白诱导发酵液在6000rpm下离心10分钟，弃上清液，收集菌体；用非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ重悬菌体后，得到菌体悬液；用超声波破碎菌体悬液中的菌体后，12000rpm离心10min，收集上清液，该上清液即为含有目的蛋白的粗酶液，超声波破碎菌体的条件为：超声5s，间歇5s，40w的功率，30个循环。
5、磷酸酶的纯化
采用镍柱亲和层析进行纯化，在Amersham公司的AKTAFPLC系统中用1ml装量的HiTrapchelatingHPcolumn(镍柱)纯化上清。非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ用于平衡纯化柱体和上样。蛋白上样量为10ml，流速设为1ml/min。用非变性镍柱洗脱缓冲液A(非变性镍柱洗脱缓冲液A由非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ和非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ的混合溶液组成，其中，非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ占非变性镍柱洗脱缓冲液A的体积百分比为25％)进行洗涤，去除非特异性结合的杂蛋白。用非变性镍柱洗脱缓冲液B(非变性镍柱洗脱缓冲液B由非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ和非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ的混合溶液组成，其中，非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ占非变性镍柱洗脱缓冲液B的体积百分比为80％)进行洗脱，收集含洗脱峰的洗脱液，该洗脱液中为纯化后的磷酸酶溶液，用SDS-PAGE检测纯化后的磷酸酶溶液中磷酸酶的纯度。
结果如图1所示，结果显示纯化后的磷酸酶溶液含有比较纯的磷酸酶，得到的磷酸酶的大小为30kDa左右。纯化后的磷酸酶溶液中磷酸酶的浓度为10mg/ml。
利用LC-MALDI质谱对纯化后的磷酸酶溶液中磷酸酶进行检测，其序列为序列表中序列2。
二、磷酸酶性质的检测及功能验证
磷酸酶的酶活测定采用比色分析法。酶活定义为：45℃条件下，每毫克磷酸酶每分钟水解底物产生对硝基苯酚(pNP，p-nitrophenol)的量定义为一个酶活单位。底物为对硝基苯磷酸二钠(Para-nitrophenylphosphate(pNPP))。
1、酶活的测定方法
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
取步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液(10mg/ml)10μl加入到990μl的测活缓冲液(测活缓冲液由水和溶质组成，其中溶质及其浓度分别为20mMpNPP，2mMMgCl2,20mMTris-HCl，0.2MNaCl)中，得到反应体系，该反应体系的pH为8.0，将该反应体系在45℃下孵育10min，向反应后的体系中加入100μl1MNaOH溶液以终止反应，在405nm下测定反应体系的吸光度值。
pNP标准曲线的制备：分别配制0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/ml的PNP水溶液，各取1ml与0.1ml1MNaOH水溶液混合后，倒入比色杯中，在405nm处测吸光值。以pNP浓度为横坐标，A405为纵坐标作图，即为pNP标准曲线。
将磷酸酶的测定结果与pNP标准曲线比对，得到磷酸酶的酶活大小，结果显示，步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液中磷酸酶具有磷酸酶活性，其酶活为160nmol/(min·mg)。
2、热稳定性
酶蛋白的变性温度(Tm值)定义：是在连续升温的过程中，50％的蛋白质发生变性时所对应的温度。
步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶的热稳定性采用圆二色谱仪(circulardichroism，CD)进行测定，实验重复三次，具体步骤如下：
将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液置入圆二色谱仪中，设置条件为：初始温度为25℃，每两分钟温度提高0.5℃，测定结束时的温度为100℃，结果如图2(图2中1和2分别是软件拟合的曲线，两曲线的交点为溶解温度点)所示，步骤一的磷酸酶的Tm值为38.4±0.2℃。
将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液在0℃下孵育20分钟后冰上10min，得到0℃-20min样品；将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液在0℃下孵育40分钟后冰上10min，得到0℃-40min样品；将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液在0℃下孵育60分钟后冰上10min，得到0℃-60min样品；将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液在0℃下孵育80分钟后冰上10min，得到0℃-80min样品；将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液在0℃下孵育100分钟后冰上10min，得到0℃-100min样品；将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液在0℃下孵育120分钟后冰上10min，得到0℃-120min样品。
按照上述方法，将0℃分别替换为70℃、80℃、90℃和100℃，其他步骤均不变，分别得到在不同温度下孵育20分钟、40分钟、60分钟、80分钟和120分钟的样品，样品名称分别为70℃-20min样品、70℃-40min样品、70℃-60min样品、70℃-80min样品、70℃-100min样品、70℃-120min样品、80℃-20min样品、80℃-40min样品、80℃-60min样品、80℃-80min样品、80℃-100min样品、80℃-120min样品、90℃-20min样品、90℃-40min样品、90℃-60min样品、90℃-80min样品、90℃-100min样品、90℃-120min样品、100℃-20min样品、100℃-40min样品、100℃-60min样品、100℃-80min样品、100℃-100min样品和100℃-120min样品。
按照步骤1中酶活的测定方法，将步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液分别替换为0℃-20min样品、0℃-40min样品、0℃-60min样品、0℃-80min样品、0℃-100min样品、0℃-120min样品、70℃-20min样品、70℃-40min样品、70℃-60min样品、70℃-80min样品、70℃-100min样品、70℃-120min样品、80℃-20min样品、80℃-40min样品、80℃-60min样品、80℃-80min样品、80℃-100min样品、80℃-120min样品、90℃-20min样品、90℃-40min样品、90℃-60min样品、90℃-80min样品、90℃-100min样品、90℃-120min样品、100℃-20min样品、100℃-40min样品、100℃-60min样品、100℃-80min样品、100℃-100min样品和100℃-120min样品，其他步骤均不变，分别得到各样品的相对酶活(将未经任何处理的步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液中磷酸酶的酶活定为100％)。
结果分别如图3所示：除0℃外，其它温度条件下，孵育20分钟后磷酸酶的活性明显下降，其中，70℃、80℃、90℃和100℃时间中值分别为40分钟、30分钟、20分钟和10分钟。100℃处理60分钟后磷酸酶几乎完全失活，80℃高温处理60min还保存40％的生物活性，表明磷酸酶在高温条件下有一定的稳定性，稳定性好。
3、最适温度
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
按照步骤1中酶活的测定方法，将反应的温度分别替换为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃，其他步骤均不变，分别得到步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同温度下的酶活。
步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃下的酶活分别为46、102、135、165、104和58mol·min-1·mg-1(图4)，表明，步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在45℃条件下的酶活最高，最适温度为45℃。
4、最适pH
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
按照步骤1中酶活的测定方法，将反应体系中的20mMTris-HCl替换为100mM柠檬酸-柠檬酸钠，并将pH为8.0分别替换为pH为3.0、pH为4.0、pH为5.0、pH为6.0和pH为6.6，其他步骤均不变，分别得到步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同pH下的酶活。
按照步骤1中酶活的测定方法，将反应体系的pH为8.0分别替换为pH为7.1、pH为7.5、pH为8.0、pH为8.5和pH为8.9，其他步骤均不变，分别得到步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同pH下的酶活。
步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、6.6、7.1、7.5、8.0、8.5和8.9下的酶活分别为0、3、4、48、241、651、548、365、297和216mol·min-1·mg-1(图5)，表明，步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在pH为7.1下的酶活最高，最适pH为7.1。
5、离子对磷酸酶FM2382活性的影响
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
按照步骤1中酶活的测定方法，将反应体系中的MgCl2分别替换为MgCl2、MgSO4、MnCl2、NiCl2、CoCl2、FeCl2、FeSO4、ZnCl2、CuCl2、CuSO4和EDTA，其他步骤均不变，分别得到步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在不同离子和EDTA处理下的酶活。按照步骤1中酶活的测定方法，将反应体系中不含有MgCl2、MgSO4、MnCl2、NiCl2、CoCl2、FeCl2、FeSO4、ZnCl2、CuCl2、CuSO4或EDTA的反应作为对照(NONE)。
将MgCl2处理下的磷酸酶的酶活定为100％，结果显示，步骤一得到的纯化后的磷酸酶溶液的中磷酸酶在MgSO4、MnCl2、NiCl2、CoCl2、FeCl2、FeSO4、ZnCl2、CuCl2、CuSO4和EDTA处理下的相对酶活分别为104％、454％、20％、50％、31％、15％、0、28％、24％和0(图6)，对照中的磷酸酶的相对酶活为2％，表明，Mn2+对磷酸酶的磷酸酶活有很明显的促进作用，Mg2+、Co2+、Fe2+、Cu2+和Ni2+也均对本发明的磷酸酶的酶活具有促进作用。
6、pH稳定性
实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将步骤一得到的磷酸酶分别溶解至100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)、100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)、20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0)、20mMTris-HCl缓冲液(pH9.0)和20mMTris-HCl缓冲液(pH11)中，将得到的溶液命名为pH3.0磷酸酶溶液、pH5.0磷酸酶溶液、pH7.0磷酸酶溶液、pH9.0磷酸酶溶液和pH11磷酸酶溶液，各磷酸酶溶液中磷酸酶的浓度均为10mg/ml。将各磷酸酶溶液按照如下方法测定酶活：先在室温下静置60min后进行离心，取上清液10μl加入到990μl的测活缓冲液1(测活缓冲液1由水和溶质组成，其中溶质及其浓度分别为20mMpNPP，2mMMnCl2,20mMTris-HCl，0.2MNaCl)中，得到反应体系，该反应体系的pH为7.1，将该反应体系在45℃下孵育10min，向反应后的体系中加入100μl1MNaOH溶液以终止反应，在405nm下测定反应体系的吸光度值。
结果如图7所示：磷酸酶在pH7-9内活性保持最好。
Claims (10)
1.蛋白质，为如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；
A2)氨基酸序列为序列2的第21-309位的蛋白质；
A3)在序列2或序列2的第21-309位的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)或A2)衍生的蛋白质；
A4)在A1)、A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B14)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系或转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系或转基因植物细胞系；
B11)含有B1)所述核酸分子的转基因动物组织或转基因植物组织；
B12)含有B2)所述表达盒的转基因动物组织或转基因植物组织；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因动物器官或转基因植物器官；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因动物器官或转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的基因：
b1)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1的第61-930位的cDNA分子或DNA分子；
b3)与b1)或b2)或限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括：培养权利要求2或3的B5)-B8)中任一所述重组微生物，使所述核酸分子表达，得到表达所述蛋白质的重组微生物培养物；从所述重组微生物培养物中得到所述蛋白质。
5.下述任一应用：
L1、权利要求1所述蛋白质在作为磷酸酶或磷酸水解酶中的应用；
L2、权利要求1所述蛋白质在制备磷酸酶或磷酸水解酶产品中的应用；
L3、权利要求1所述蛋白质在作为碱性磷酸酶中的应用；
L4、权利要求1所述蛋白质在制备碱性磷酸酶产品中的应用。
6.下述任一应用：
M1、权利要求2或3所述生物材料在制备磷酸酶或磷酸水解酶中的应用；
M2、权利要求2或3所述生物材料在制备磷酸酶或磷酸水解酶产品中的应用；
M3、权利要求2或3所述生物材料在制备碱性磷酸酶中的应用；
M4、权利要求2或3所述生物材料在制备碱性磷酸酶产品中的应用。
7.下述任一应用：
N1、权利要求4所述方法在制备磷酸酶或磷酸水解酶产品中的应用；
N2、权利要求4所述方法在制备碱性磷酸酶产品中的应用。
8.权利要求1所述蛋白质在降解磷的化合物中的应用。
9.权利要求2或3所述生物材料在降解磷的化合物中的应用。
10.权利要求4所述方法在降解磷的化合物中的应用。
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