JP2022511925A - 遺伝子改良水稲の子実から組換えヒトフィブロネクチンを分離精製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
組換えヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子改良水稲の子実を用い、組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液を調製するステップ1と、
カチオン交換クロマトグラフィーを用い、組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液から一次産物を調製するステップ2と、
前記一次産物をアニオン交換クロマトグラフィーで精製することにより、精製済の組換えヒトフィブロネクチンを得るステップ3と、を含む。
本実施例では、水稲特異的プロモーターGt13a及びそのシグナルペプチドを利用することにより、水稲の胚乳細胞において組換えヒトフィブロネクチン遺伝子を発現させた。具体的には、中国特許出願公開公報第100540667号に記載の方法に従い、組換えヒト血清アルブミンを組換えヒトフィブロネクチンを変えて本発明の組換えヒトフィブロネクチンを特異的に発現するベクターを構築し、遺伝子改良水稲株を選別した。このとき、図1に示すpOsPMP626プラスミドを用いて水稲胚乳特異的な発現カセットを構築した。コドンを最適化したヒトFN遺伝子(配列番号1)を合成し、制限酵素MylIおよびXhoIで消化してpOsPMP02に導入することにより図2に示すpOsPMP627プラスミドを構築した。続いて、制限酵素HindIIIおよびEcoRIでpOsPMP627を消化して全長7152bpであり且つGt13aプロモーター、そのシグナルペプチド配列、コドン最適化済のFN遺伝子およびNosターミネーターを含む発現カセットを形成し、バイナリー発現ベクター1300に導入してアグロバクテリウムプラスミドを構築した。得られたプラスミドは、図3に示される通りであり、pOsPMP628と名付けた。上記pOsPMP628プラスミドを根頭癌アグロバクテリウムEHA105株(米国Invitrogen社製)に導入し、根頭癌アグロバクテリウムを利用してpOsPMP628を水稲TP309株の癒傷新生組織に感染させ、飼育、選別及び誘導を経て遺伝子改良株を得た。続いて、PCR法を利用して陽性株を検出し、目的遺伝子のフォワードプライマーFN-F1(5’-ATCAACTACCGCACCGAGAT-3’、配列番号2)及びリバースプライマーFN-R1(5’-TCTTCTCCTTCGGGGTCAC-3’、配列番号3)を用いてPCR法によって増幅させ、679bpの産物を得た。その結果、根頭癌アグロバクテリウムを利用することによりそれぞれ独立して組換えヒトフィブロネクチンのトランスジェニック水稲72株、及び高いレベルで組換えヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子改良水稲をそれぞれ独立して4株を得た。結果は、図4~図5に示される通りである。
ATGCAGGCCC AGCAGATGGT GCAGCCGCAG AGCCCGGTGG CCGTGAGCCA GAGCAAGCCG 60
GGCTGCTACG ACAACGGCAA GCACTACCAG ATCAACCAGC AGTGGGAGCG CACCTACCTC 120
GGCAACGCCC TCGTGTGCAC CTGCTACGGC GGCAGCCGCG GCTTCAACTG CGAGAGCAAG 180
CCGGAGGCCG AGGAGACCTG CTTCGACAAG TACACCGGCA ACACCTACCG CGTGGGCGAC 240
ACCTACGAGC GCCCGAAGGA CAGCATGATC TGGGACTGCA CCTGCATCGG CGCCGGCCGC 300
GGCCGCATCA GCTGCACCAT CGCCAACCGC TGCCACGAGG GCGGCCAGAG CTACAAGATC 360
GGCGACACCT GGCGCCGCCC GCACGAGACC GGCGGCTACA TGCTCGAATG CGTGTGCCTC 420
GGCAACGGCA AGGGCGAGTG GACCTGCAAG CCGATCGCCG AGAAGTGCTT CGACCACGCC 480
GCCGGCACCA GCTACGTGGT GGGCGAGACC TGGGAGAAGC CGTACCAGGG CTGGATGATG 540
GTGGACTGCA CCTGCCTCGG CGAGGGCAGC GGCCGCATCA CCTGCACCAG CCGCAACCGC 600
TGCAACGACC AGGACACCCG CACCAGCTAC CGCATCGGCG ACACCTGGAG CAAGAAGGAC 660
AACCGCGGCA ACCTCCTCCA GTGCATCTGC ACCGGCAACG GCCGCGGCGA GTGGAAGTGC 720
GAGCGCCACA CCAGCGTGCA GACCACCAGC AGCGGCAGCG GCCCGTTCAC CGACGTGCGC 780
GCCGCCGTGT ACCAGCCGCA GCCGCACCCG CAGCCGCCGC CGTACGGCCA CTGCGTGACC 840
GACAGCGGCG TGGTGTACAG CGTGGGCATG CAGTGGCTCA AGACCCAGGG CAACAAGCAG 900
ATGCTCTGCA CCTGCCTCGG CAACGGCGTG AGCTGCCAGG AGACCGCCGT GACCCAGACC 960
TACGGCGGCA ACAGCAACGG CGAGCCGTGC GTGCTCCCGT TCACCTACAA CGGCCGCACC 1020
TTCTACAGCT GCACCACCGA GGGCCGCCAG GACGGCCACC TCTGGTGCAG CACCACCAGC 1080
AACTACGAGC AGGACCAGAA GTACAGCTTC TGCACCGACC ACACCGTGCT CGTGCAGACC 1140
CGCGGCGGCA ACAGCAACGG CGCCCTCTGC CACTTCCCGT TCCTCTACAA CAACCACAAC 1200
TACACCGACT GCACCAGCGA GGGCCGCCGC GACAACATGA AGTGGTGCGG CACCACCCAG 1260
AACTACGACG CCGACCAGAA GTTCGGCTTC TGCCCGATGG CCGCCCACGA GGAGATCTGC 1320
ACCACCAACG AGGGCGTGAT GTACCGCATC GGCGACCAGT GGGACAAGCA GCACGACATG 1380
GGCCACATGA TGCGCTGCAC CTGCGTGGGC AACGGCCGCG GCGAGTGGAC CTGCATCGCC 1440
TACAGCCAGC TCCGCGACCA GTGCATCGTG GACGACATCA CCTACAACGT GAACGACACC 1500
TTCCACAAGC GCCACGAGGA GGGCCACATG CTCAACTGCA CCTGCTTCGG CCAGGGCCGC 1560
GGCCGCTGGA AGTGCGACCC GGTGGACCAG TGCCAGGACA GCGAGACCGG CACCTTCTAC 1620
CAGATCGGCG ACAGCTGGGA GAAGTACGTG CACGGCGTGC GCTACCAGTG CTACTGCTAC 1680
GGCCGCGGCA TCGGCGAGTG GCACTGCCAG CCGCTCCAGA CCTACCCGAG CAGCAGCGGC 1740
CCGGTGGAGG TGTTCATCAC CGAGACCCCG AGCCAGCCGA ACAGCCACCC GATCCAGTGG 1800
AACGCCCCGC AGCCGAGCCA CATCAGCAAG TACATCCTCC GCTGGCGCCC GAAGAACAGC 1860
GTGGGCCGCT GGAAGGAGGC CACCATCCCG GGCCACCTCA ACAGCTACAC CATCAAGGGC 1920
CTCAAGCCGG GCGTGGTGTA CGAGGGCCAG CTCATCAGCA TCCAGCAGTA CGGCCACCAG 1980
GAGGTGACCC GCTTCGACTT CACCACCACC AGCACCAGCA CCCCGGTGAC CAGCAACACC 2040
GTGACCGGCG AGACCACCCC GTTCAGCCCG CTCGTGGCCA CCAGCGAGAG CGTGACCGAG 2100
ATCACCGCCA GCAGCTTCGT GGTGAGCTGG GTGAGCGCCA GCGACACCGT GAGCGGCTTC 2160
CGCGTGGAGT ACGAGCTCAG CGAGGAGGGC GACGAGCCGC AGTACCTCGA CCTCCCGAGC 2220
ACCGCCACCA GCGTGAACAT CCCGGACCTC CTCCCGGGCC GCAAGTACAT CGTGAACGTG 2280
TACCAGATCA GCGAGGACGG CGAGCAGAGC CTCATCCTCA GCACCAGCCA GACCACCGCC 2340
CCGGACGCCC CGCCGGACAC CACCGTGGAC CAGGTGGACG ACACCAGCAT CGTGGTGCGC 2400
TGGAGCCGCC CGCAGGCCCC GATCACCGGC TACCGCATCG TGTACAGCCC GAGCGTGGAG 2460
GGCAGCAGCA CCGAGCTCAA CCTCCCGGAG ACCGCCAACA GCGTGACCCT CAGCGACCTC 2520
CAGCCGGGCG TGCAGTACAA CATCACCATC TACGCCGTGG AGGAGAACCA GGAGAGCACC 2580
CCGGTGGTGA TCCAGCAGGA GACCACCGGC ACCCCGCGCA GCGACACCGT GCCGAGCCCG 2640
CGCGACCTCC AGTTCGTGGA GGTGACCGAC GTGAAGGTGA CCATCATGTG GACCCCGCCG 2700
GAGAGCGCCG TGACCGGCTA CCGCGTGGAC GTGATCCCGG TGAACCTCCC GGGCGAGCAC 2760
GGCCAGCGCC TCCCGATCAG CCGCAACACC TTCGCCGAGG TGACCGGCCT CAGCCCGGGC 2820
GTGACCTACT ACTTCAAGGT GTTCGCCGTG AGCCACGGCC GCGAGAGCAA GCCGCTCACC 2880
GCCCAGCAGA CCACCAAGCT CGACGCCCCG ACCAACCTCC AGTTCGTGAA CGAGACCGAC 2940
AGCACCGTGC TCGTGCGCTG GACCCCGCCG CGCGCCCAGA TCACCGGCTA CCGCCTCACC 3000
GTGGGCCTCA CCCGCCGCGG CCAGCCGCGC CAGTACAACG TGGGCCCGAG CGTGAGCAAG 3060
TACCCGCTCC GCAACCTCCA GCCGGCCAGC GAGTACACCG TGAGCCTCGT GGCCATCAAG 3120
GGCAACCAGG AGAGCCCGAA GGCCACCGGC GTGTTCACCA CCCTCCAGCC GGGCAGCAGC 3180
ATCCCGCCGT ACAACACCGA GGTGACCGAG ACCACCATCG TGATCACCTG GACCCCGGCC 3240
CCGCGCATCG GCTTCAAGCT CGGCGTGCGC CCGAGCCAGG GCGGCGAGGC CCCGCGCGAG 3300
GTGACCAGCG ACAGCGGCAG CATCGTGGTG AGCGGCCTCA CCCCGGGCGT GGAGTACGTG 3360
TACACCATCC AGGTGCTCCG CGACGGCCAG GAGCGCGACG CCCCGATCGT GAACAAGGTG 3420
GTGACCCCGC TCAGCCCGCC GACCAACCTC CACCTCGAAG CCAACCCGGA CACCGGCGTG 3480
CTCACCGTGA GCTGGGAGCG CAGCACCACC CCGGACATCA CCGGCTACCG CATCACCACC 3540
ACCCCGACCA ACGGCCAGCA GGGCAACAGC CTCGAAGAGG TGGTGCACGC CGACCAGAGC 3600
AGCTGCACCT TCGACAACCT CAGCCCGGGC CTCGAATACA ACGTGAGCGT GTACACCGTG 3660
AAGGACGACA AGGAGAGCGT GCCGATCAGC GACACCATCA TCCCGGCCGT GCCGCCGCCG 3720
ACCGACCTCC GCTTCACCAA CATCGGCCCG GACACCATGC GCGTGACCTG GGCCCCGCCG 3780
CCGAGCATCG ACCTCACCAA CTTCCTCGTG CGCTACAGCC CGGTGAAGAA CGAGGAGGAC 3840
GTGGCCGAGC TCAGCATCAG CCCGAGCGAC AACGCCGTGG TGCTCACCAA CCTCCTCCCG 3900
GGCACCGAGT ACGTGGTGAG CGTGAGCAGC GTGTACGAGC AGCACGAGAG CACCCCGCTC 3960
CGCGGCCGCC AGAAGACCGG CCTCGACAGC CCGACCGGCA TCGACTTCAG CGACATCACC 4020
GCCAACAGCT TCACCGTGCA CTGGATCGCC CCGCGCGCCA CCATCACCGG CTACCGCATC 4080
CGCCACCACC CGGAGCACTT CAGCGGCCGC CCGCGCGAGG ACCGCGTGCC GCACAGCCGC 4140
AACAGCATCA CCCTCACCAA CCTCACCCCG GGCACCGAGT ACGTGGTGAG CATCGTGGCC 4200
CTCAACGGCC GCGAGGAGAG CCCGCTCCTC ATCGGCCAGC AGAGCACCGT GAGCGACGTG 4260
CCGCGCGACC TCGAAGTGGT GGCCGCCACC CCGACCAGCC TCCTCATCAG CTGGGACGCC 4320
CCGGCCGTGA CCGTGCGCTA CTACCGCATC ACCTACGGCG AGACCGGCGG CAACAGCCCG 4380
GTGCAGGAGT TCACCGTGCC GGGCAGCAAG AGCACCGCCA CCATCAGCGG CCTCAAGCCG 4440
GGCGTGGACT ACACCATCAC CGTGTACGCC GTGACCGGCC GCGGCGACAG CCCGGCCAGC 4500
AGCAAGCCGA TCAGCATCAA CTACCGCACC GAGATCGACA AGCCGAGCCA GATGCAGGTG 4560
ACCGACGTGC AGGACAACAG CATCAGCGTG AAGTGGCTCC CGAGCAGCAG CCCGGTGACC 4620
GGCTACCGCG TGACCACCAC CCCGAAGAAC GGCCCGGGCC CGACCAAGAC CAAGACCGCC 4680
GGCCCGGACC AGACCGAGAT GACCATCGAG GGCCTCCAGC CGACCGTGGA GTACGTGGTG 4740
AGCGTGTACG CCCAGAACCC GAGCGGCGAG AGCCAGCCGC TCGTGCAGAC CGCCGTGACC 4800
AACATCGACC GCCCGAAGGG CCTCGCCTTC ACCGACGTGG ACGTGGACAG CATCAAGATC 4860
GCCTGGGAGA GCCCGCAGGG CCAGGTGAGC CGCTACCGCG TGACCTACAG CAGCCCGGAG 4920
GACGGCATCC ACGAGCTCTT CCCGGCCCCG GACGGCGAGG AGGACACCGC CGAGCTCCAG 4980
GGCCTCCGCC CGGGCAGCGA GTACACCGTG AGCGTGGTGG CCCTCCACGA CGACATGGAG 5040
AGCCAGCCGC TCATCGGCAC CCAGAGCACC GCCATCCCGG CCCCGACCGA CCTCAAGTTC 5100
ACCCAGGTGA CCCCGACCAG CCTCAGCGCC CAGTGGACCC CGCCGAACGT GCAGCTCACC 5160
GGCTACCGCG TGCGCGTGAC CCCGAAGGAG AAGACCGGCC CGATGAAGGA GATCAACCTC 5220
GCCCCGGACA GCAGCAGCGT GGTGGTGAGC GGCCTCATGG TGGCCACCAA GTACGAGGTG 5280
AGCGTGTACG CCCTCAAGGA CACCCTCACC AGCCGCCCGG CCCAGGGCGT GGTGACCACC 5340
CTCGAAAACG TGAGCCCGCC GCGCCGCGCC CGCGTGACCG ACGCCACCGA GACCACCATC 5400
ACCATCAGCT GGCGCACCAA GACCGAGACC ATCACCGGCT TCCAGGTGGA CGCCGTGCCG 5460
GCCAACGGCC AGACCCCGAT CCAGCGCACC ATCAAGCCGG ACGTGCGCAG CTACACCATC 5520
ACCGGCCTCC AGCCGGGCAC CGACTACAAG ATCTACCTCT ACACCCTCAA CGACAACGCC 5580
CGCAGCAGCC CGGTGGTGAT CGACGCCAGC ACCGCCATCG ACGCCCCGAG CAACTGA 5637
まず、組換えヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子改良籾米の殻を除去して玄米に加工し、砕いて80-100メッシュの粉体にした。粉体と抽出バッファーを1:5の重量体積比(kg/L)で混ぜ合わせ、常温において1時間抽出した。抽出バッファーとしては20mMのリン酸ナトリウム塩バッファー(pH8.0)を使い、抽出液に予め5mMのグルタチオン、1mMのPMSF及び0.1%のTween80を加えた。得られた混合物をろ布式のプレートフレームフィルタープレスで圧搾ろ過することにより、透明なhFn粗抽出液を得た。このとき、抽出液に添加したグルタチオンは、hFnの抽出量を高め、同時にダイマーやポリマーの形成を低減することができ、PMSFは、一般に使われるプロテアーゼ阻害剤であり、hFnタンパク質を抽出するときのタンパク質分解を抑制することができ、Tween-80は、hFnタンパク質を抽出するときのタンパク質安定性を高めることができる。
1)OsrhFn一次精製条件の最適化
1-1)一次精製用担体の選定及び分離条件の最適化
本発明において、それぞれNanoMicro社、Qianchun Bio社、BestChrom社、GE社、HUIYAN社製のヘパリン担体を用い、同じ条件下で対比実験を行った。対比実験で得られたサンプルについてはSDS-PAGEで解析し、その結果は、図7に示される通りである。
ヘパリンカラムは、イオン交換作用を特徴とするものであり、ヘパリンカラムとアニオン交換カラムの分離作用を統合して考慮した場合、アニオン交換カラム単独で両者の分離効果を十分発揮できることが考えられる。そこで、Q Bestarose Fast Flow、Q Bestarose HP、Bestarose DEAE、Q SepharoseTM HP、Q SepharoseTM Fast Flow、DEAE SepharoseTM Fast Flow、UniGel 30/80Q、NanoGel 30/50QおよびUNO Sphere Qを含む37種のアニオン交換担体を試したところ、これらのアニオン交換担体が何れも効果的に目的タンパク質を分離して集めることができ、同時に一部のタンパク質不純物を排除できることが確認できた。
1-3-1)BestChrom社製SP HP担体を用いるときの分離条件の最適化
カチオン交換クロマトグラフィーにスムーズに移行できるようにするため、トリスバッファーをリン酸塩バッファーに変えて同様の条件下で抽出した場合、より透明な注入サンプルを得ることができた。また、抽出液のpHによってサンプルの安定性がどう変化するかについても検討を行ったところ、図14に示すように、pHが6.5未満である場合に抽出液が徐々に濁ってしまうことから、BestChrom社製SP HP担体を用いるときの注入pHを7.0とした。この条件に合わせて、洗浄バッファーとして130mMのNaClを含む20mMのリン酸塩バッファー(pH5.9)を使い、溶出バッファーとして100mMのNaCl20mMのリン酸塩バッファー(pH6.95)を使うことにした。分離サンプルの検出結果は、図15に示される通りである。
NanoMicro社製Nano Gel 50 SP担体は、架橋度の高い多孔質ポリスチレンビーズであり、流速および容量が高く、高塩濃度に対しても耐性があり、かつカラム圧力が低いなどといった特性がある。Nano Gel 50 SP担体は、高流速の条件下において容量が22.7g/mL(粉体重量/担体体積)に達し、かつ拡大実験の場合でも12.5g/mL(粉体重量/担体体積)の容量があるため、目的タンパク質を集めて回収することに適していると考えられる。Nano Gel 50 SP担体を用いるとき、好適な洗浄バッファーとしては150mMのNaClを含む20mMのリン酸塩バッファー(pH7.0)であり、溶出バッファーとしては300mMのNaClを含む20mMのリン酸塩バッファー(pH7.0)であった。分離サンプルの検出結果は、図16に示される通りである。
精製プロセスをより簡素化にする観点から、一連の検討実験結果に基づきHUIYAN社製Q HP、BestChrom社製Q FF、NanoMicro社製UniGel 80 Qを用いて更なる検討を行うことにした。その結果、HUIYAN社製Q HPおよびBestChrom社製Q FFが優れた分離性能を示し、一方、UniGel 80 Qを用いて同じ条件下において目的タンパク質を溶出するとき、塩濃度を低くしても溶出可能となり、後の処理に有利であることが確認できた。こうした識見に基づき、担体粒径が比較的大きいQ FFを精製用担体とし、Q HPを予備用担体とすることにした。これらの結果は、図17に示される通りである。
実施例3の一次及び二次精製の結果に基づき、実用向けの精製法を確立する観点から、BestChrom社製SP HPとHUIYAN社製Q HPを用いて2段階に分けてOsrhFnを分離、精製した。
実施例3の一次及び二次精製の結果に基づき、実用向けの精製法を確立するため、NanoMicro社製NanoGel 50 SPとBestChrom社製Q FFを用いて2段階に分けてOsrhFnを分離、精製した。
上記精製法の再現性を確認するため、NanoMicro社製Nano Gel 50 SPとBestChrom社製Q FF担体を用いる2段階精製プロセスについて、以下のようにして検証実験を3回行った。
Claims (10)
- 遺伝子改良水稲の子実から組換えヒトフィブロネクチンを分離、精製する方法であって、
組換えヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子改良水稲の子実を用い、組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液を調製するステップ1と、
カチオン交換クロマトグラフィーを用い、組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液から一次産物を調製するステップ2と、
前記一次産物をアニオン交換クロマトグラフィーで精製することにより、精製済の組換えヒトフィブロネクチンを得るステップ3と、
を含み、
ここで、カチオン交換クロマトグラフィーに用いる担体は、NanoGel 30/50 SP、UniGel 30/80 SP、SP Bestarose FF、SP Bestarose HP、Bestarose Diomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HPおよびSP SepharoseTM Fast Flowからなる群から選ばれる1種または2種以上であり、
アニオン交換クロマトグラフィーに用いる担体は、Q Bestarose Fast Flow、Q Bestarose HP、Bestarose DEAE、Q SepharoseTM HP、Q SepharoseTM Fast Flow、DEAE SepharoseTM Fast Flow、UniGel 30/80Q、NanoGel 30/50QおよびUNO Sphere Qからなる群から選ばれる1種または2種以上であることを特徴とする、方法。 - カチオン交換クロマトグラフィーに用いる担体は、Nano Gel 50 SPである、請求項1に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーに用いる担体は、Q Bestarose FFである、請求項1に記載の方法。
- 組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液を調製する前記ステップ1は、さらに、
組換えヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子改良水稲の子実を原料とし、籾殻を除去して玄米にした後、砕いて80~100メッシュの粉体にするステップ4aと、
10~50mMのトリス、10~50mMのリン酸塩、0~110mMのNaClを含み、かつpHが5.9~8.0の範囲である抽出バッファーを用い、前記粉体と抽出バッファーを1:5~1:10の重量体積比で混ぜ合わせ、常温条件下で0.5~2時間抽出してタンパク質粗抽出物を得るステップ4bと、
前記タンパク質粗抽出物をろ過することにより、組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液を得るステップ4cと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ステップ4bにおいて、抽出バッファーに、0.8~1mMのPMSF、5~10mMのグルタチオン及び0.05~0.1%のTween-80からなる群から選ばれる1種又は2種以上を添加する、請求項4に記載の方法。
- 前記ステップ1で得られる組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液を、NanoMicro社製Nano Gel 50 SPを担体とするカチオン交換クロマトグラフィーにかけて分離精製することにより、組換えヒトフィブロネクチンを含む一次産物を得るステップであって、
10~50mMのリン酸塩、0~120mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である平衡化バッファーを、カラム体積に対して5~15倍の溶液量、50~200cm/時間の流速でカラムに流してカラムを平衡化するステップ6aと、
前記ステップ1で得られた電気伝導率が2.5~13.5ms/cm、pHが6.8~7.1の範囲である粗抽出液を注入サンプルとし、前記カラムに注入するステップ6bと、
10~50mMのリン酸塩、130~200mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である洗浄バッファーを用い、カラム体積に対して20~40倍の溶液量、50~200cm/時間の流速でタンパク質不純物を溶出するステップ6cと、
10~50mMのリン酸塩、250~300mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である溶出バッファーを用い、50~200cm/時間の流速で溶出することにより一次産物を得るステップ6dと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ステップ1で得られる組換えヒトフィブロネクチンを含む粗抽出液を、BestChrom社製SP Bestarose HPを担体とするカチオン交換クロマトグラフィーにかけて分離精製することにより、組換えヒトフィブロネクチンを含む一次産物を得るステップであって、
10~50mMのリン酸塩を含み且つpHが6.8~7.1の範囲である平衡化バッファーを、カラム体積に対して5~15倍の溶液量、50~200cm/時間の流速でカラムに流してカラムを平衡化するステップ7aと、
前記ステップ1で得られた電気伝導率が2.5ms/cmであり、pHが6.8~7.1の範囲である粗抽出液を注入サンプルとし、前記カラムに注入するステップ7bと、
前記ステップ7aで使われる平衡化バッファーを、カラム体積に対して20~40の溶液量でカラムに流してカラムを再平衡化した後、10~50mMのリン酸塩、100~130mMのNaClを含み且つpHが5.8~6.1の範囲である洗浄バッファーを用い、50~200cm/時間の流速でタンパク質不純物を溶出するステップ7cと、
10~50mMのリン酸塩、90~110mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である溶出バッファーを用い、50~200cm/時間の流速で溶出することにより一次産物を得るステップ7dと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記ステップ2で得られる組換えヒトフィブロネクチンを含む一次産物を、BestChrom社製Q Bestarose FF又はHUIYAN社製Q HPを担体とするアニオン交換クロマトグラフィーにかけて分離精製することにより、精製済の組換えヒトフィブロネクチン目的産物を得るステップであって、
10~50mMのリン酸塩、0~150mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である平衡化バッファーを、カラム体積に対して5~15倍の溶液量、50~200 cm/時間の流速でカラムに流してカラムを平衡化するステップ8aと、
前記ステップ2で得られた電気伝導率が12.5~17.6ms/cm、pHが6.8~7.1の範囲である一次産物を注入サンプルとし、カラムに注入するステップ8bと、
10~50mMのリン酸塩、200~220mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である洗浄バッファーを用い、50~200cm/時間の流速でタンパク質不純物を溶出するステップ8cと、
10~50mMのリン酸塩、250~300mMのNaClを含み且つpHが6.8~7.1の範囲である溶出バッファーを用い、50-200cm/時間の流速で溶出することにより目的産物を得るステップ8dと、を含む、請求項1に記載の方法。 - 請求項1に記載の遺伝子改良水稲の子実を製造するための植物発現ベクターであって、
プラスミドベクターに、ヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子、水稲特異的プロモーター Gt13a及びそのシグナルペプチドを導入することにより構築されることを特徴とする、植物発現ベクター。 - 前記ヒトフィブロネクチンを発現する遺伝子は、配列番号1で表されるヌクレオチド配列を有し、前記プラスミドベクターは、pOsPMP626である、請求項9に記載の植物発現ベクター。
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