KR20210099030A - 유전자 조작 벼 종자로부터 재조합 인체 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법 - Google Patents
유전자 조작 벼 종자로부터 재조합 인체 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20210099030A KR20210099030A KR1020217019636A KR20217019636A KR20210099030A KR 20210099030 A KR20210099030 A KR 20210099030A KR 1020217019636 A KR1020217019636 A KR 1020217019636A KR 20217019636 A KR20217019636 A KR 20217019636A KR 20210099030 A KR20210099030 A KR 20210099030A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- recombinant human
- human fibronectin
- buffer
- chromatography
- purification
- Prior art date
Links
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims 7
- 235000021305 genetically modified rice Nutrition 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 51
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 108
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 28
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 25
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 25
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 19
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 13
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 13
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 5
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 239000013077 target material Substances 0.000 abstract 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 11
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 11
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 5
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 amine salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000013444 DoE analysis Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000490 cosmetic additive Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/10—Seeds
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
- B01D15/203—Equilibration or regeneration
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/362—Cation-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/424—Elution mode
- B01D15/426—Specific type of solvent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
인간 피브로넥틴을 발현하는 유전자 조작된 벼 종자로부터 재조합 인간 피브로넥틴을 분리 및 정제하는 크로마토그래피 방법이 개시된다. 상기 방법에서, 유전자 조작된 벼 종자를 분쇄하고 추출 완충액과 혼합한 다음, 여과하여 재조합 인간 피브로넥틴을 포함하는 조 추출액을 얻는다. 재조합 인간 피브로넥틴을 포함하는 조 추출물을 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 1차 분리 및 정제를 수행함으로써, 재조합 인간 피브로넥틴을 포함하는 1차 산물을 수득한다. 1차 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 최종 분리 및 정제를 수행하여 재조합 인간 피브로넥틴을 표적 물질로 얻는다. 이 방법은 비용이 저렴하고 산업 규모로 쉽게 활용된다. 수득된 OsrhFn 표적 물질은 우수한 생체 활성과 함께 95 % 이상의 SEC-HPLC 순도를 갖는다.
Description
본 발명은 생명공학 분야에 속하며, 특히 재조합 인간 피브로넥틴(fibronectin)을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
피브로넥틴으로도 알려진 피브로넥틴(Fn)은 혈장, 세포 내 물질 및 다양한 세포 표면에 매우 널리 분포되어 있으며, 일반적으로 단백질의 카르복실 말단에 이황화물 결합이 있는 약 450 kD의 분자량을 갖는 이량체 형태로 존재하는 반면, 단량체의 분자량은 약 220∼250 kD이다. 피브로넥틴은 대부분 혈장과 같은 체액에 가용성 형태로 존재하며 세포 외 기질에는 불용성 형태로 존재한다. 콜라겐, 순환 혈액 단백질, 피브린, 글리코사미노글리칸 및 헤파린 등과 같은 세포 외 기질 단백질과 조합될 수 있다. 따라서 배아 발달, 상처 치유, 지혈 및 응고와 같이 수 많은 중요한 생리적 과정에서 중요한 역할을 한다.
주로 조직으로부터 Fn을 정제하는 방법은 대부분 동결 침전법(cryoprecipitation)이었다. Fn 및 일부 불순물 단백질은 4℃ 이하로 방치하면 공침될 수 있으며, 이온교환 크로마토그래피와 조합된 침전과 같은 방법으로 추가 정제될 수 있는 반면, 배양된 섬유소의 표면으로부터 Fn의 제조에는 일반적으로 저농도의 요소(urea)가 사용되고, 그리고 항 Fn 수지는 혈장 및 세포 배양에서 Fn의 정제에 널리 사용될 수 있다. 그러나 이러한 방법은 변성된 콜라겐(보통 젤라틴)에 결합하는 특이적 친화성의 특성을 기초로 하여, 친화성 크로마토그래피로 점진적으로 대체되며, 1몰 L KBr 및 1∼8몰 L 요소 또는 아민염으로 용출될 수 있다.
피브로넥틴의 함량은 혈장에 매우 풍부하여 약 300 mg/L로 추정된다. 따라서 혈장은 Fn의 주요 제조원이다. 해외에서 생산되는 Fn 제품은 거의 인간 혈장에서 추출된다. 화장품 첨가제로 널리 사용되며, 대안적으로는 상처, 화상, 쇼크 등의 치료제로도 사용될 수 있다. 이는 Fn이 중요한 사회적 이익과 경제적 가치를 가지고 있음을 보여준다. 그러나 제한된 혈장의 공급원과 복잡한 제조 공정은 대규모 생산을 저해한다.
본 발명의 목적은 재조합 인간 피브로넥틴을 발현하는 유전자 조작된 벼 종자로부터 재조합 인간 피브로넥틴을 분리 및 정제하는 크로마토그래피 방법을 제공하는 데 있다.
발명의 요약
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 다음과 같은 기술적 해결책을 제공한다.
유전자 조작된 벼 종자로부터 재조합 인간 피브로넥틴을 분리 및 정제하는 방법은 다음 단계 1) 내지 3)을 포함한다:
1) 유전자 조작된 벼 종자로부터 재조합 인간 피브로넥틴을 추출하여 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조(crude) 추출물을 얻는 단계;
2) 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조 추출물을 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 1차 생성물을 얻는 단계;
3) 1차 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 정제된 재조합 인간 피브로넥틴을 얻는 단계.
단계 1)에서, 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 유전자 조작된 벼 종자를 원료로 사용하고, 벼 낟알(벼 종자)을 탈피하여 반 정미된(semi-polished) 쌀로 정미하여 80∼100 메쉬의 미세한 쌀 분말로 분쇄한다. 쌀 분말을 추출 완충액과 1:5∼1:10의 중량/부피 비로 혼합하고, 실온에서 0.5∼2 시간 동안 추출하여 조 단백질 추출물을 얻는다. 추출 완충액은 다음 조성의 성분을 포함한다: 0∼50 mM Tris-HCl, 0∼50 mM PB, 0∼110 mM NaCl, pH 5.9∼8.0. 바람직하게는 추출 완충액은 0.8∼1 mM PMSF 또는 5∼10 mM GSH, 또는 0.05∼0.1% Tween 80 중 하나 이상의 성분을 포함한다.
단계 2)에서, 양이온 교환 크로마토그래피 용 수지는 NanoGel 30/50 SP, UniGel 30/80 SP, SP Bestarose FF, SP Bestarose HP, Bestarose Diomond MMC, Uniphere S, MacroPrep S, POROS XS, SP-6FF, SP-6HP, SP SepharoseTM Fast Flow로 구성된 군으로부터 선택되며, NanoGel 50 SP 또는 SP Bestarose HP가 바람직하다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, pH 구배 용출 또는 염화나트륨 농도 구배 용출을 선택할 수 있으며, 염화나트륨 구배 용출이 바람직하다.
일 실시형태에서, 용출은 pH 및 염화나트륨 구배의 조합에 의해 수행된다. 불순물 세정 완충액은 인산염 완충액, 0.13M 염화나트륨, 0.3M 염화나트륨, pH 5.9를 포함하고, 용출 완충액은 인산염 완충액, 0.1M 염화나트륨, 0.3M 염화나트륨, pH 7.0을 포함한다.
다른 실시형태에서, 염화나트륨 구배 용출이 선택되고, 크로마토그래피 공정에서 불순물 세정 및 용출 완충액은 인산염 완충액, 0.15M 염화나트륨, 0.3M 염화나트륨, pH 7.0을 포함한다.
단계 3)에서, 음이온 교환 크로마토그래피 용 수지는 Q Bestarose Fast Flow, Q Bestarose HP, Bestarose DEAE, Q SepharoseTM HP, Q SepharoseTM Fast Flow, DEAE SepharoseTM Fast Flow, UniGel 30/80Q, NanoGel 30/50Q, UNO Sphere Q로 구성된 군에서 선택되며, BLG Q FF (Bestchrom) 또는 HY Q HP (Huiyan)가 바람직하다.
음이온 교환 크로마토그래피에서는, 염화나트륨 농도 구배 용출을 선택할 수 있다. 일 실시 양태에서, 크로마토그래피 공정에서의 불순물 세정 및 용출 완충액은 인산염 완충액, 0.2M 염화나트륨, 0.3M 염화나트륨, 둘 모두 pH 7.0을 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피에 의해 얻어진 표적 단백질 용출 분획물은 공지된 방법에 의해 농축, 동결 건조 등을 통해 완제품으로 제조될 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피에서, 로딩(loading) 완충액은 pH가 7.5 미만이고 염 농도가 0.12M 미만인 인산염 완충액을 포함한다.
양이온 교환 크로마토그래피에서 표적 단백질(재조합 인간 피브로넥틴)에 대한 용출 완충액은 인산염 완충액 및 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.8∼7.0이다. 바람직하게는 염화나트륨 농도는 0.3M이고 완충액의 pH는 7.0이다.
일 실시형태에서, 양이온 교환 크로마토그래피가 SP Bestarose HP 인 경우, 사용된 완충액은 인산염 완충액, 0.09∼0.13M 염화나트륨, pH 5.8∼7.1을 포함한다.
다른 실시형태에서, 양이온 교환 크로마토그래피가 Nano Gel 50 SP 인 경우, 사용된 완충액은 인산염 완충액, 0.12∼0.3M 염화나트륨, pH 6.8∼7.1을 포함한다.
다른 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 HY Q HP (Huiyan) 인 경우, 사용된 완충액은 인산염, 0.1∼0.3M 염화나트륨, pH 6.8∼7.1을 포함한다.
다른 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 BLG Q FF (Bestchrom) 인 경우, 사용된 완충액은 인산염, 0.1∼0.3M 염화나트륨, pH 6.8∼7.1을 포함한다.
본 발명은 또한 유전자 조작된 벼 종자를 제조하기 위한 식물 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터는 인간 피브로넥틴을 발현하는 유전자, 벼 배젓(endosperm) 특이적 프로모터(Gt13a) 및 그 신호 펩타이드를 도입함으로써 구축된다. 바람직하게는, 인간 피브로넥틴을 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO. 1로 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖고, 플라스미드 벡터는 pOsPMP626이다.
본 발명에서 사용되는 원료는 재조합 피브로넥틴을 발현하는 유전자 조작 벼 낟알로부터 유래한다. Fn은 합성되어, 배젓 특이적 프로모터와 신호 펩타이드에 의해 구동되는 벼 배젓 세포의 내막(inner membrane) 계에 들어가며, 최종적으로 OsrFn은 벼 배젓의 단백질체에 저장되어 벼 낟알에 대량으로 축적된다. 벼 낟알에는 Fg 및 vWF와 같은 혈장 특이적 불순물이 함유되어 있지 않기 때문에, 정제 방법은 기타 소스(source)와 상이하다. 벼 종자로부터 Fn을 분리 및 정제하는 데 큰 장점이 있다.
본 발명은 양이온 및 음이온 교환의 2단계 크로마토그래피를 이용하여 재조합 피브로넥틴을 발현하는 유전자 조작된 벼 종자로부터 Fn을 분리 및 정제하고, 정제 공정이 확장될 수 있는 공정 파라미터를 탐색 및 최적화 한다.
도 1은 플라스미드 pOsPMP626 구조의 개략도이다.
도 2는 플라스미드 pOsPMP627 구조의 개략도이다.
도 3은 플라스미드 pOsPMP628 구조의 개략도이다.
도 4는 유전 공학적으로 조작된 물질의 T1 세대에서 표적 유전자에 대한 PCR 결과를 나타내며, 여기서, M은 DNA 표준 분자량 마커이고; PMP628-51, 628-62, 628-63, 628-64, 628-65, 628-68, 628-69 및 628-71은 T1 세대 트랜스제닉 물질이며; NC는 음성 대조군 수용 종이고; P는 양성 대조군 플라스미드이다.
도 5는 유전자 조작된 벼 잎의 T1 세대에서 마커 유전자의 검출을 위한 PCR 결과를 나타내며, 여기서, M은 DNA 표준 분자량 마커이고; PMP628-51, 628-62, 628-63, 628-64, 628-65, 628-68, 628-69 및 628-71은 T1 세대 유전자 조작 물질이고, NC는 음성 대조군 수용 종이고; P는 양성 대조군 플라스미드이다.
도 6은 T1 유전자 조작된 종자에서 발현된 FN의 검출을 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; PC, 220 kD 인간 혈장 피브로넥틴(FN) 순수 단백질(Merck)이고; PMP628-51, 628-62, 628-63, 628-64, 628-65, 628-68, 628-69 및 628-71은 트랜스제닉 계통(lines)이다.
도 7은 헤파린(Heparin) 친화성 크로마토그래피의 다양한 공정 파라미터에 의해 용출된 OsrFn 검출을 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내고, 여기서, Nanomicro, Qianchun, Bestchrom, GE 및 Huiyan 회사는 각각 NW, QC, BGL, GE 및 HY에 해당한다.
도 8은 헤파린 크로마토그래피의 최적화 된 세척(wash) 단계에 의해 OsrFN을 검출하기 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이며; FT는 통과(flow-through) 용액이고; 10% B는 100 mM NaCl이고; 18% B, 21% B, 29% B, 36% B는 각각 180 mM, 210 mM, 290 mM, 360 mM NaCl에 해당한다.
도 9는 헤파린 크로마토그래피의 최적화 된 세척 단계에 의해 OsrFN을 검출하기 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 용액이고; 12% B, 14% B, 16% B, 29% B는 각각 120 mM, 140 mM, 160 mM, 290 mM NaCl에 해당하고; CIP (clean-in-place)는 재생 용액이다.
도 10은 Q FF 크로마토그래피에서 다양한 pH, 전도도 및 유속 조합을 이용한 DoE 실험에 대한 예측 프로파일을 나타낸다.
도 11은 HY Q FF 크로마토그래피에서 다양한 로드 전도도, 용출 pH, 용출 전도도를 이용한 DoE 실험에 대한 예측 프로필을 나타낸다.
도 12는 GE Q HP와 HY Q FF 크로마토그래피 수지 사이의 OsrFN 검출 결과에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물-세척 분획물이고, 그리고 Elu는 용출 분획물이다.
도 13은 GE Q HP와 HY Q HP 크로마토그래피 수지 간의 OsrFN 검출 결과에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내고, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물 세정 분획물이고, Elu는 용출 분획물이고; CIP는 재생 용액이다.
도 14는 상이한 pH 값에서 추출물 안정성의 결과를 SDS-PAGE로 나타내고, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Supernatant는 pH 조정 및 샘플 원심 분리 후의 상청액이고; Precipitate는 pH 조정 및 샘플 원심 분리 후 침전물의 재 용해 된 침전 용액이다.
도 15는 BGL SP HP 크로마토그래피 수지의 OsrFN 용출 결과의 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물 세정 분획물이고; Elu는 용출 분획물이고; Elu (10X)는 10배 농축된 용출 분획물이다.
도 16은 NW Nano Gel 50 SP 수지에서 OsrFN의 용출에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내고, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고: Wash는 불순물 세정 분획물이고; Elu는 용출 분획물이다.
도 17은 HY Q HP, NW UniGel 80 Q, BGL Q FF 충전제의 상이한 크로마토그래피 수지에서 OsrFN 순도의 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 Nano Gel 50 SP 크로마토그래피로부터 수집된 용출 분획물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물 세정 분획물이고; Elu는 용출 분획물이고; CIP는 재생 용액이다.
도 18은 조합된 2단계 크로마토그래피 BLG SP HP 및 HY Q HP의 OsrFN 순도에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; Reduced 는 환원 로딩 완충액으로 처리된 HY Q HP 크로마토그래피에 대한 환원된 용출 분획물의 샘플이고; Non-reduced 는 비 환원 로딩 완충액으로 처리된 HY Q HP 크로마토그래피에 대한 용출 분획물의 샘플이다.
도 19는 NY Nano Gel 50 SP-BLG Q FF의 2단계 크로마토그래피의 분리 효과에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; Load는 로딩을 위한 pH 조정 후 단백질 추출물의 샘플이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물-세척 분획물이고, Elu는 용출 분획물이다.
도 20은 NY Nano Gel 50 SP의 크로마토그램이다.
도 21은 BLG Q FF의 크로마토그램이다.
도 22는 NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF의 2 단계 크로마토그래피 공정을 이용한 OsrFN 순도의 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; P는 Fn 양성 기준이고; 0927, 0928 및 0929는 서로 다른 뱃치(batch)의 샘플이고: Reducing 는 환원 전기영동이고; Non-reducing 는 비 환원 전기영동이다.
도 23은 NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF를 이용한 2단계 크로마토그래피의 OsrFN의 SEC-HPLC 프로파일을 보여준다.
도 24는 NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF의 2단계 크로마토그래피에 의해 얻어진 OsrFN의 생물학적 활성 분석을 나타낸다.
도 2는 플라스미드 pOsPMP627 구조의 개략도이다.
도 3은 플라스미드 pOsPMP628 구조의 개략도이다.
도 4는 유전 공학적으로 조작된 물질의 T1 세대에서 표적 유전자에 대한 PCR 결과를 나타내며, 여기서, M은 DNA 표준 분자량 마커이고; PMP628-51, 628-62, 628-63, 628-64, 628-65, 628-68, 628-69 및 628-71은 T1 세대 트랜스제닉 물질이며; NC는 음성 대조군 수용 종이고; P는 양성 대조군 플라스미드이다.
도 5는 유전자 조작된 벼 잎의 T1 세대에서 마커 유전자의 검출을 위한 PCR 결과를 나타내며, 여기서, M은 DNA 표준 분자량 마커이고; PMP628-51, 628-62, 628-63, 628-64, 628-65, 628-68, 628-69 및 628-71은 T1 세대 유전자 조작 물질이고, NC는 음성 대조군 수용 종이고; P는 양성 대조군 플라스미드이다.
도 6은 T1 유전자 조작된 종자에서 발현된 FN의 검출을 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; PC, 220 kD 인간 혈장 피브로넥틴(FN) 순수 단백질(Merck)이고; PMP628-51, 628-62, 628-63, 628-64, 628-65, 628-68, 628-69 및 628-71은 트랜스제닉 계통(lines)이다.
도 7은 헤파린(Heparin) 친화성 크로마토그래피의 다양한 공정 파라미터에 의해 용출된 OsrFn 검출을 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내고, 여기서, Nanomicro, Qianchun, Bestchrom, GE 및 Huiyan 회사는 각각 NW, QC, BGL, GE 및 HY에 해당한다.
도 8은 헤파린 크로마토그래피의 최적화 된 세척(wash) 단계에 의해 OsrFN을 검출하기 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이며; FT는 통과(flow-through) 용액이고; 10% B는 100 mM NaCl이고; 18% B, 21% B, 29% B, 36% B는 각각 180 mM, 210 mM, 290 mM, 360 mM NaCl에 해당한다.
도 9는 헤파린 크로마토그래피의 최적화 된 세척 단계에 의해 OsrFN을 검출하기 위한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 용액이고; 12% B, 14% B, 16% B, 29% B는 각각 120 mM, 140 mM, 160 mM, 290 mM NaCl에 해당하고; CIP (clean-in-place)는 재생 용액이다.
도 10은 Q FF 크로마토그래피에서 다양한 pH, 전도도 및 유속 조합을 이용한 DoE 실험에 대한 예측 프로파일을 나타낸다.
도 11은 HY Q FF 크로마토그래피에서 다양한 로드 전도도, 용출 pH, 용출 전도도를 이용한 DoE 실험에 대한 예측 프로필을 나타낸다.
도 12는 GE Q HP와 HY Q FF 크로마토그래피 수지 사이의 OsrFN 검출 결과에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물-세척 분획물이고, 그리고 Elu는 용출 분획물이다.
도 13은 GE Q HP와 HY Q HP 크로마토그래피 수지 간의 OsrFN 검출 결과에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내고, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물 세정 분획물이고, Elu는 용출 분획물이고; CIP는 재생 용액이다.
도 14는 상이한 pH 값에서 추출물 안정성의 결과를 SDS-PAGE로 나타내고, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Supernatant는 pH 조정 및 샘플 원심 분리 후의 상청액이고; Precipitate는 pH 조정 및 샘플 원심 분리 후 침전물의 재 용해 된 침전 용액이다.
도 15는 BGL SP HP 크로마토그래피 수지의 OsrFN 용출 결과의 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물 세정 분획물이고; Elu는 용출 분획물이고; Elu (10X)는 10배 농축된 용출 분획물이다.
도 16은 NW Nano Gel 50 SP 수지에서 OsrFN의 용출에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내고, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 단백질 추출물이고; FT는 통과 분획물이고: Wash는 불순물 세정 분획물이고; Elu는 용출 분획물이다.
도 17은 HY Q HP, NW UniGel 80 Q, BGL Q FF 충전제의 상이한 크로마토그래피 수지에서 OsrFN 순도의 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서, M은 표준 분자량 마커이고; Load는 Nano Gel 50 SP 크로마토그래피로부터 수집된 용출 분획물이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물 세정 분획물이고; Elu는 용출 분획물이고; CIP는 재생 용액이다.
도 18은 조합된 2단계 크로마토그래피 BLG SP HP 및 HY Q HP의 OsrFN 순도에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; Reduced 는 환원 로딩 완충액으로 처리된 HY Q HP 크로마토그래피에 대한 환원된 용출 분획물의 샘플이고; Non-reduced 는 비 환원 로딩 완충액으로 처리된 HY Q HP 크로마토그래피에 대한 용출 분획물의 샘플이다.
도 19는 NY Nano Gel 50 SP-BLG Q FF의 2단계 크로마토그래피의 분리 효과에 대한 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; Load는 로딩을 위한 pH 조정 후 단백질 추출물의 샘플이고; FT는 통과 분획물이고; Wash는 불순물-세척 분획물이고, Elu는 용출 분획물이다.
도 20은 NY Nano Gel 50 SP의 크로마토그램이다.
도 21은 BLG Q FF의 크로마토그램이다.
도 22는 NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF의 2 단계 크로마토그래피 공정을 이용한 OsrFN 순도의 SDS-PAGE 이미지를 나타내며, 여기서 M은 표준 분자량 마커이고; P는 Fn 양성 기준이고; 0927, 0928 및 0929는 서로 다른 뱃치(batch)의 샘플이고: Reducing 는 환원 전기영동이고; Non-reducing 는 비 환원 전기영동이다.
도 23은 NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF를 이용한 2단계 크로마토그래피의 OsrFN의 SEC-HPLC 프로파일을 보여준다.
도 24는 NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF의 2단계 크로마토그래피에 의해 얻어진 OsrFN의 생물학적 활성 분석을 나타낸다.
이하, 본 발명의 특징과 장점을 상세하게 설명하기 위해 실시예와 도면을 통해 본 발명의 기술적 해결 방안을 설명한다. 본 명세서에 제공된 실시예는 본 발명의 방법의 예시로서 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 발명에 의해 개시된 기술적 해결책을 제한하지 않는다.
다음 실시예에서 사용된 시약 및 기기는 달리 명시되지 않는 한 모두 상업적으로 이용 가능하다.
실시예 1: 재조합 인간 피브로넥틴 발현 카세트(cassette)를 포함하는 유전자 조작 벼의 제조
이 실시예에서, 벼-특이적 프로모터(Gt13a) 및 그 신호 펩타이드를 사용하여 벼 배젓 세포에서 재조합 인간 피브로넥틴 유전자의 발현을 유도하였다. 상세하게는, 중국 공고 번호 CN100540667의 방법을 참조하여, 본 발명의 벼에서 특이적으로 발현된 재조합 인간 피브로넥틴의 벡터를 구축하고, 유전자 조작된 벼 식물을 선별하여 재조합 인간 혈청 알부민 유전자를 본 발명의 재조합 인간 피브로넥틴 유전자로 대체하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, pOsPMP626으로 지정된 플라스미드를 사용하여 벼 배젓 특이적 발현 카세트를 구축하였다. 합성 코돈-최적화 인간 FN 유전자(SEQ ID NO. 1)를 Myll 및 XhoI로 분해하고, pOsPMP02로 클로닝하여 플라스미드 pOsPMP627을 구축하였다(도 2), 그 다음 pOsPMP627을 HindIII 및 EcoRI로 분해하고, 프로모터(Gt13a), 신호 펩타이드 서열, 코돈 최적화 FN 유전자 및 Nos 종결자(terminator)를 함유하는 7152 bp 길이의 전체 발현 카세트를 2진 발현 벡터 p1300에 삽입하여 pOsPMP628로 지정된 아그로박테리움(agrobacterium) 매개 플라스미드(도 3)를 생성하였다. pOsPMP628 플라스미드는 벼 품종 TP309의 캘러스(callus) 재생 조직으로 매개된 아그로박테리움 투메파시엔스(tumefaciens)를 통한 공동 형질 전환을 통해 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 (미국, 인비트로젠)로 형질 전환되었다. 재배 후, 스크리닝 및 유도하여 다음의 완전한 묘목을 형성하였다: 표적 유전자 특이적 프라이머 쌍, 정방향 프라이머 FN-F1 (SEQ ID NO. 2:5'-ATCAACTACCGCACCGAGAT-3') 및 역방향 프라이머 FN-R1 (SEQ ID NO.3: 5'-TCTTCTCCTTCGGGGTCAC-3')을 사용하여 PCR에 의해 확인된 Hpt 내성 묘목. PCR 생성물의 크기는 679 bp 이었다. 72개의 독립적인 형질전환체로부터 재조합 인간 피브로넥틴을 고도로 발현하기 위해 4개의 독립적인 형질전환체가 확인되었다. 식별 결과는 도 4 alc 도 5에 나타나있다.
이 실시예에서, 상기 4개의 유전자 조작된 벼 식물에서 OsrhFn의 발현 수준은 SDS-PAGE에 의해 결정되었다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, FN을 가장 많이 발현하는 계통(line)은 PMP628-71이었다. 이상의 복수의 검출 방법을 통해, 유전자적으로 안정적인 조작된 벼 식물이 선택되었다.
SEQ ID NO. 1
ATGCAGGCCC AGCAGATGGT GCAGCCGCAG AGCCCGGTGG CCGTGAGCCA GAGCAAGCCG 60
GGCTGCTACG ACAACGGCAA GCACTACCAG ATCAACCAGC AGTGGGAGCG CACCTACCTC 120
GGCAACGCCC TCGTGTGCAC CTGCTACGGC GGCAGCCGCG GCTTCAACTG CGAGAGCAAG 180
CCGGAGGCCG AGGAGACCTG CTTCGACAAG TACACCGGCA ACACCTACCG CGTGGGCGAC 240
ACCTACGAGC GCCCGAAGGA CAGCATGATC TGGGACTGCA CCTGCATCGG CGCCGGCCGC 300
GGCCGCATCA GCTGCACCAT CGCCAACCGC TGCCACGAGG GCGGCCAGAG CTACAAGATC 360
GGCGACACCT GGCGCCGCCC GCACGAGACC GGCGGCTACA TGCTCGAATG CGTGTGCCTC 420
GGCAACGGCA AGGGCGAGTG GACCTGCAAG CCGATCGCCG AGAAGTGCTT CGACCACGCC 480
GCCGGCACCA GCTACGTGGT GGGCGAGACC TGGGAGAAGC CGTACCAGGG CTGGATGATG 540
GTGGACTGCA CCTGCCTCGG CGAGGGCAGC GGCCGCATCA CCTGCACCAG CCGCAACCGC 600
TGCAACGACC AGGACACCCG CACCAGCTAC CGCATCGGCG ACACCTGGAG CAAGAAGGAC 660
AACCGCGGCA ACCTCCTCCA GTGCATCTGC ACCGGCAACG GCCGCGGCGA GTGGAAGTGC 720
GAGCGCCACA CCAGCGTGCA GACCACCAGC AGCGGCAGCG GCCCGTTCAC CGACGTGCGC 780
GCCGCCGTGT ACCAGCCGCA GCCGCACCCG CAGCCGCCGC CGTACGGCCA CTGCGTGACC 840
GACAGCGGCG TGGTGTACAG CGTGGGCATG CAGTGGCTCA AGACCCAGGG CAACAAGCAG 900
ATGCTCTGCA CCTGCCTCGG CAACGGCGTG AGCTGCCAGG AGACCGCCGT GACCCAGACC 960
TACGGCGGCA ACAGCAACGG CGAGCCGTGC GTGCTCCCGT TCACCTACAA CGGCCGCACC 1020
TTCTACAGCT GCACCACCGA GGGCCGCCAG GACGGCCACC TCTGGTGCAG CACCACCAGC 1080
AACTACGAGC AGGACCAGAA GTACAGCTTC TGCACCGACC ACACCGTGCT CGTGCAGACC 1140
CGCGGCGGCA ACAGCAACGG CGCCCTCTGC CACTTCCCGT TCCTCTACAA CAACCACAAC 1200
TACACCGACT GCACCAGCGA GGGCCGCCGC GACAACATGA AGTGGTGCGG CACCACCCAG 1260
AACTACGACG CCGACCAGAA GTTCGGCTTC TGCCCGATGG CCGCCCACGA GGAGATCTGC 1320
ACCACCAACG AGGGCGTGAT GTACCGCATC GGCGACCAGT GGGACAAGCA GCACGACATG 1380
GGCCACATGA TGCGCTGCAC CTGCGTGGGC AACGGCCGCG GCGAGTGGAC CTGCATCGCC 1440
TACAGCCAGC TCCGCGACCA GTGCATCGTG GACGACATCA CCTACAACGT GAACGACACC 1500
TTCCACAAGC GCCACGAGGA GGGCCACATG CTCAACTGCA CCTGCTTCGG CCAGGGCCGC 1560
GGCCGCTGGA AGTGCGACCC GGTGGACCAG TGCCAGGACA GCGAGACCGG CACCTTCTAC 1620
CAGATCGGCG ACAGCTGGGA GAAGTACGTG CACGGCGTGC GCTACCAGTG CTACTGCTAC 1680
GGCCGCGGCA TCGGCGAGTG GCACTGCCAG CCGCTCCAGA CCTACCCGAG CAGCAGCGGC 1740
CCGGTGGAGG TGTTCATCAC CGAGACCCCG AGCCAGCCGA ACAGCCACCC GATCCAGTGG 1800
AACGCCCCGC AGCCGAGCCA CATCAGCAAG TACATCCTCC GCTGGCGCCC GAAGAACAGC 1860
GTGGGCCGCT GGAAGGAGGC CACCATCCCG GGCCACCTCA ACAGCTACAC CATCAAGGGC 1920
CTCAAGCCGG GCGTGGTGTA CGAGGGCCAG CTCATCAGCA TCCAGCAGTA CGGCCACCAG 1980
GAGGTGACCC GCTTCGACTT CACCACCACC AGCACCAGCA CCCCGGTGAC CAGCAACACC 2040
GTGACCGGCG AGACCACCCC GTTCAGCCCG CTCGTGGCCA CCAGCGAGAG CGTGACCGAG 2100
ATCACCGCCA GCAGCTTCGT GGTGAGCTGG GTGAGCGCCA GCGACACCGT GAGCGGCTTC 2160
CGCGTGGAGT ACGAGCTCAG CGAGGAGGGC GACGAGCCGC AGTACCTCGA CCTCCCGAGC 2220
ACCGCCACCA GCGTGAACAT CCCGGACCTC CTCCCGGGCC GCAAGTACAT CGTGAACGTG 2280
TACCAGATCA GCGAGGACGG CGAGCAGAGC CTCATCCTCA GCACCAGCCA GACCACCGCC 2340
CCGGACGCCC CGCCGGACAC CACCGTGGAC CAGGTGGACG ACACCAGCAT CGTGGTGCGC 2400
TGGAGCCGCC CGCAGGCCCC GATCACCGGC TACCGCATCG TGTACAGCCC GAGCGTGGAG 2460
GGCAGCAGCA CCGAGCTCAA CCTCCCGGAG ACCGCCAACA GCGTGACCCT CAGCGACCTC 2520
CAGCCGGGCG TGCAGTACAA CATCACCATC TACGCCGTGG AGGAGAACCA GGAGAGCACC 2580
CCGGTGGTGA TCCAGCAGGA GACCACCGGC ACCCCGCGCA GCGACACCGT GCCGAGCCCG 2640
CGCGACCTCC AGTTCGTGGA GGTGACCGAC GTGAAGGTGA CCATCATGTG GACCCCGCCG 2700
GAGAGCGCCG TGACCGGCTA CCGCGTGGAC GTGATCCCGG TGAACCTCCC GGGCGAGCAC 2760
GGCCAGCGCC TCCCGATCAG CCGCAACACC TTCGCCGAGG TGACCGGCCT CAGCCCGGGC 2820
GTGACCTACT ACTTCAAGGT GTTCGCCGTG AGCCACGGCC GCGAGAGCAA GCCGCTCACC 2880
GCCCAGCAGA CCACCAAGCT CGACGCCCCG ACCAACCTCC AGTTCGTGAA CGAGACCGAC 2940
AGCACCGTGC TCGTGCGCTG GACCCCGCCG CGCGCCCAGA TCACCGGCTA CCGCCTCACC 3000
GTGGGCCTCA CCCGCCGCGG CCAGCCGCGC CAGTACAACG TGGGCCCGAG CGTGAGCAAG 3060
TACCCGCTCC GCAACCTCCA GCCGGCCAGC GAGTACACCG TGAGCCTCGT GGCCATCAAG 3120
GGCAACCAGG AGAGCCCGAA GGCCACCGGC GTGTTCACCA CCCTCCAGCC GGGCAGCAGC 3180
ATCCCGCCGT ACAACACCGA GGTGACCGAG ACCACCATCG TGATCACCTG GACCCCGGCC 3240
CCGCGCATCG GCTTCAAGCT CGGCGTGCGC CCGAGCCAGG GCGGCGAGGC CCCGCGCGAG 3300
GTGACCAGCG ACAGCGGCAG CATCGTGGTG AGCGGCCTCA CCCCGGGCGT GGAGTACGTG 3360
TACACCATCC AGGTGCTCCG CGACGGCCAG GAGCGCGACG CCCCGATCGT GAACAAGGTG 3420
GTGACCCCGC TCAGCCCGCC GACCAACCTC CACCTCGAAG CCAACCCGGA CACCGGCGTG 3480
CTCACCGTGA GCTGGGAGCG CAGCACCACC CCGGACATCA CCGGCTACCG CATCACCACC 3540
ACCCCGACCA ACGGCCAGCA GGGCAACAGC CTCGAAGAGG TGGTGCACGC CGACCAGAGC 3600
AGCTGCACCT TCGACAACCT CAGCCCGGGC CTCGAATACA ACGTGAGCGT GTACACCGTG 3660
AAGGACGACA AGGAGAGCGT GCCGATCAGC GACACCATCA TCCCGGCCGT GCCGCCGCCG 3720
ACCGACCTCC GCTTCACCAA CATCGGCCCG GACACCATGC GCGTGACCTG GGCCCCGCCG 3780
CCGAGCATCG ACCTCACCAA CTTCCTCGTG CGCTACAGCC CGGTGAAGAA CGAGGAGGAC 3840
GTGGCCGAGC TCAGCATCAG CCCGAGCGAC AACGCCGTGG TGCTCACCAA CCTCCTCCCG 3900
GGCACCGAGT ACGTGGTGAG CGTGAGCAGC GTGTACGAGC AGCACGAGAG CACCCCGCTC 3960
CGCGGCCGCC AGAAGACCGG CCTCGACAGC CCGACCGGCA TCGACTTCAG CGACATCACC 4020
GCCAACAGCT TCACCGTGCA CTGGATCGCC CCGCGCGCCA CCATCACCGG CTACCGCATC 4080
CGCCACCACC CGGAGCACTT CAGCGGCCGC CCGCGCGAGG ACCGCGTGCC GCACAGCCGC 4140
AACAGCATCA CCCTCACCAA CCTCACCCCG GGCACCGAGT ACGTGGTGAG CATCGTGGCC 4200
CTCAACGGCC GCGAGGAGAG CCCGCTCCTC ATCGGCCAGC AGAGCACCGT GAGCGACGTG 4260
CCGCGCGACC TCGAAGTGGT GGCCGCCACC CCGACCAGCC TCCTCATCAG CTGGGACGCC 4320
CCGGCCGTGA CCGTGCGCTA CTACCGCATC ACCTACGGCG AGACCGGCGG CAACAGCCCG 4380
GTGCAGGAGT TCACCGTGCC GGGCAGCAAG AGCACCGCCA CCATCAGCGG CCTCAAGCCG 4440
GGCGTGGACT ACACCATCAC CGTGTACGCC GTGACCGGCC GCGGCGACAG CCCGGCCAGC 4500
AGCAAGCCGA TCAGCATCAA CTACCGCACC GAGATCGACA AGCCGAGCCA GATGCAGGTG 4560
ACCGACGTGC AGGACAACAG CATCAGCGTG AAGTGGCTCC CGAGCAGCAG CCCGGTGACC 4620
GGCTACCGCG TGACCACCAC CCCGAAGAAC GGCCCGGGCC CGACCAAGAC CAAGACCGCC 4680
GGCCCGGACC AGACCGAGAT GACCATCGAG GGCCTCCAGC CGACCGTGGA GTACGTGGTG 4740
AGCGTGTACG CCCAGAACCC GAGCGGCGAG AGCCAGCCGC TCGTGCAGAC CGCCGTGACC 4800
AACATCGACC GCCCGAAGGG CCTCGCCTTC ACCGACGTGG ACGTGGACAG CATCAAGATC 4860
GCCTGGGAGA GCCCGCAGGG CCAGGTGAGC CGCTACCGCG TGACCTACAG CAGCCCGGAG 4920
GACGGCATCC ACGAGCTCTT CCCGGCCCCG GACGGCGAGG AGGACACCGC CGAGCTCCAG 4980
GGCCTCCGCC CGGGCAGCGA GTACACCGTG AGCGTGGTGG CCCTCCACGA CGACATGGAG 5040
AGCCAGCCGC TCATCGGCAC CCAGAGCACC GCCATCCCGG CCCCGACCGA CCTCAAGTTC 5100
ACCCAGGTGA CCCCGACCAG CCTCAGCGCC CAGTGGACCC CGCCGAACGT GCAGCTCACC 5160
GGCTACCGCG TGCGCGTGAC CCCGAAGGAG AAGACCGGCC CGATGAAGGA GATCAACCTC 5220
GCCCCGGACA GCAGCAGCGT GGTGGTGAGC GGCCTCATGG TGGCCACCAA GTACGAGGTG 5280
AGCGTGTACG CCCTCAAGGA CACCCTCACC AGCCGCCCGG CCCAGGGCGT GGTGACCACC 5340
CTCGAAAACG TGAGCCCGCC GCGCCGCGCC CGCGTGACCG ACGCCACCGA GACCACCATC 5400
ACCATCAGCT GGCGCACCAA GACCGAGACC ATCACCGGCT TCCAGGTGGA CGCCGTGCCG 5460
GCCAACGGCC AGACCCCGAT CCAGCGCACC ATCAAGCCGG ACGTGCGCAG CTACACCATC 5520
ACCGGCCTCC AGCCGGGCAC CGACTACAAG ATCTACCTCT ACACCCTCAA CGACAACGCC 5580
CGCAGCAGCC CGGTGGTGAT CGACGCCAGC ACCGCCATCG ACGCCCCGAG CAACTGA 5637
실시예 2: 유전자 조작된 벼 낟알로부터 재조합 인간 피브로넥틴(hFn)의 조 추출물 추출
재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 유전자 조작된 벼 낟알의 껍질을 벗기고 반 정미한 후, 80∼100 메쉬의 분말로 분쇄하였다. 쌀 분말을 추출 완충액과 1:5(w/v, kg/L)의 비로 혼합하고 실온에서 1시간 동안 추출하였다. 추출 완충액은 20 mM 인산나트륨(PB), pH 8.0, 5 mM 글루타티온, 1mM PMSF 및 0.1% Tween 80을 포함한다. 혼합물은 천(cloth) 필터 프레스를 통해 정화되었다. 추출 완충액의 글루타티온, PMSF 및 Tween 80은 추출 효율을 개선하고, 분해를 방지하며, 추출 과정 중에 이량체 및 다량체를 환원한다.
실시예 3 : OsrhFn의 소규모 정제 공정 개발
1. OsrhFn의 1차 정제 파라미터 개발
1.1 친화성 크로마토그래피 매질의 선택 및 크로마토그래피 파라미터의 개발
본 발명에서는 Nanomicro, Qianchun, Bestchrom, GE, 및 Huiyan을 포함한 5개 공급 업체로부터의 다양한 유형의 헤파린 친화성 수지를 비교하여 1차 정제 공정을 개발하였다. 다양한 헤파린 친화성 수지의 용출액을 얻었다. 최종 용출액은 SDS-PAGE에 의해 검출되었다. 그 결과는 도 7에 나타나 있다.
비교에 의해, Nanomicro, Bestchrom 및 GE의 3개 공급 업체로부터의 헤파린 수지가 더 나은 정제 성능을 갖는 것으로 밝혀졌다. Nanomicro의 수지는 폴리스티렌의 기본 프레임과 안정성 및 반복성을 기반으로 캡처 단계에 크로마토그래피 수지로서 더 적합하였다. 정제 파라미터에 대한 분석에 따르면, 헤파린은 비특이적 흡착을 감소시키지 않으며, 또한 고 함량 염 조건에서 많은 양의 표적 단백질이 손실되었다. 따라서 로딩을 위해 저 함량 염의 로딩 완충액을 선택하였다. 그 다음, 불순물 세정 단계가 개발되었다. 세척 완충액의 다양한 염 농도는 pH 8.0의 100∼180 mM NaCl에서 최적화되었다. 마지막으로, 용출을 위한 최적의 염 농도는 pH 8.0의 290 mM NaCl이었다. 마지막으로 헤파린 크로마토그래피의 최적 조건은 120 mM NaCl이고, 용출 조건은 290 mM NaCl이었다. 최적화 된 정제 파라미터의 결과는 도 8과 도 9에 나타나 있다.
1.2 음이온 크로마토그래피 수지 선택 및 1차 정제로서 크로마토그래피 조건의 최적화
헤파린은 친화성 크로마토그래피이지만 주로 이온 교환 거동을 특징으로 한다. 헤파린 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피에 대한 이전 연구에 따라, 음이온 교환 크로마토그래피로 대체할 수 있다. 본 발명자들은 37 종류의 음이온성 수지, Q Bestarose Fast Flow, Q Bestarose HP, Bestarose DEAE, Q SepharoseTM HP, Q SepharoseTM Fast Flow, DEAE SepharoseTM Fast Flow, UniGel 30/80Q, NanoGel 30/50Q, UNO Sphere Q에 대해 연구한 결과, 모든 수지는 표적 단백질을 효과적으로 풍부하게 하고 동시에 숙주 세포 단백질의 특정 부분을 제거할 수 있다는 사실을 알아냈다.
Huiyan Q FF 수지를 사용할 때 크로마토그래피 파라미터를 조사하였다. DoE는 pH 값, 전도도 및 유속의 3가지 요소를 각 요소에 대해 3 수준으로 조합함으로써 수행되었다. 그 결과, 최적의 샘플-로딩 파라미터는 전도도 9.6 mS/cm, pH 7.6 및 유속 0.58 mL/min이다. 이러한 조건 하에서 OsrFn의 회수율은 58.13 %에 달하였다. DoE의 예측 결과는 도 10에 나타나 있다. Q FF의 회수율을 더욱 향상시키기 위해, DoE는 로딩 pH를 고정하고, 각 인자에 대해 3 단계로 로딩 전도도, 용출 전도도, 용출 pH의 3 요소를 최적화 함으로써 수행되었다. 그 결과는 로딩 전도도, 용출 전도도 및 pH가 각각 9.6 mS/cm, 30 mS/cm, 7.0으로 최적화 되었음을 나타냈다. OsrFn의 순도와 최대 회수율은 각각 58.5 %와 13.2 %에 달했다. DoE 분석에 의한 크로마토그래피 파라미터의 예측 결과는 도 11과 같다.
낮은 전도도 또는 높은 전도도 조건에 관계없이, HY Q FF 수지를 사용하여 표적 단백질을 통한 일정한 흐름이 얻어져 낮은 회수율을 보였다. 음이온 수지 스크리닝 결과에 따르면, HY Q HP 또는 GE Q HP 수지가 추가 시험을 위해 제안된다. 도 12 및 도 13에 도시된 바와 같이, 최적화 된 세척 완충액은 50 mM Tris-HCl, 194 mM NaCl, pH 7.6을 포함하고, 용출 완충액은 50 mM Tris-HCl, 268 mM NaCl, pH 7.6을 포함한다.
1.3 일차 정제 공정으로서 양이온 크로마토그래피 파라미터 수지의 최적화
1.3.1 BGL SP HP 수지를 사용한 크로마토그래피 조건의 최적화
양이온 교환 크로마토그래피를 더 잘 연결하기 위해, Tris 완충액 시스템을 PB 완충액 시스템에 사용하여 동일한 추출 조건을 따른다. 본 발명자들은 조 추출물의 투명도가 크게 향상되었음을 알아냈다. pH를 조정하여 조 추출물의 안정성을 연구하였다. 도 14에서 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 pH 6.5 이하에서는 조 추출물이 탁해져 BGL SP HP 수지를 이용한 크로마토그래피의 최적화 된 로딩 완충액 pH는 7.0 이라는 것을 알아냈다. 마지막으로, 최적화 된 세척 조건은 20 mM PB, 130 mM NaCl, pH 5.9로 구성된 세척 완충액으로서, 그리고 20 mM PB, 100 mM NaCl, pH 6.95로 구성된 용출 완충액으로서 최적화 된다. 크로마토그래피의 결과는 도 15에 나타나 있다.
1.3.2 NW Nano Gel 50 SP를 사용한 크로마토그래피 조건의 최적화
대체 수지를 비교하기 위해, 고도로 가교 결합된 다공성 폴리스티렌 미세 기공을 갖는 수지인 NW Nano Gel 50 SP가 사용된다. 그것은 높은 유속, 높은 부하 용량, 높은 내염성 및 낮은 배압(back pressure) 등의 특성을 가지고 있다. 이 연구에서는 Nano Gel 50 SP의 로딩 용량이 높은 유속에서 수지 mL 당 쌀 분말 22.7g까지 도달했음을 알아냈다. 파일럿 시험 후, 안전한 로딩 용량은 수지 mL 당 쌀 분말 12.5g로서 이는 캡쳐 단계에 더 적합하다. 크로마토그래피 조건은 20 mM PB, 150 mM NaCl, pH 7.0으로 구성된 세척 완충액과, 20 mM PB, 300 mM NaCl, pH 7.0으로 구성된 용출 완충액으로 최적화 된다. 크로마토그래피 샘플의 결과는 도 16에 나타나 있다.
2. OsrhFn의 최종 정제 공정의 최적화
OsrFN에 대한 간단하고 최적화 된 정제 공정을 얻기 위해, 예비 연구 결과를 기반으로 한 추가 연구에 3가지 수지로서 HY Q HP, BLG Q FF 및 NW UniGel 80 Q를 사용하였다. 본 발명자들은 HY Q HP와 BLG Q FF가 고성능 분리 효과를 나타냄을 알아냈다. 동일한 조건 하에서, UniGel 80 Q에서 표적 단백질을 용출하기 위한 염 농도가 감소하여 이후 공정에 도움이 되었다. 종합하면, Q FF는 최종 정제에 가장 적합한 수지였으며, Q HP는 대안으로 사용되었다. 그 결과는 도 17에 나타나 있다.
실시예 4: BLG SP HP 및 HY Q HP의 2 단계 정제 공정
실시예 3의 1차 정제 및 최종 정제의 크로마토그래피 조건의 결과에 따르면, OsrhFn의 분리 및 정제를 위한 최종 공정 중 하나로 BLG SP HP와 HY Q HP로 구성된 2 단계 크로마토그래피를 결정하였다.
1) 추출: 실시예 1에 설명된 바와 같이 1,000g의 유전자 조작 쌀 분말을 추출하였다.
2) 1차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피의 제1 단계: 평형 완충액으로서 20 mM PB, pH 7.0을 사용하고; 불순물 세정 완충액으로서 20 mM PB, 130 mM NaCl, pH 5.9을 사용하고; 그리고 용출 완충액으로서 20mM PB, 100mM NaCl, pH 7.0을 사용하여, 235 ml SP Bestarose HP가 있는 크로마토그래피 컬럼에서 크로마토그래피를 수행하였다.
3) 최종 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피: 평형 완충액으로서 20mM PB, pH 7.0을 사용하고; 불순물 세정 완충액으로서 20 mM PB, 200 mM NaCl, pH 7.0을 사용하고, 그리고 용출 완충액으로서 20 mM PB, 300 mM NaCl, pH 7.0을 사용하여, 28 ml HY Q HP가 있는 크로마토그래피 컬럼에서 크로마토그래피를 수행하였다. 크로마토그래피 단계가 상이한 제품의 SDS-PAGE 결과는 도 18에 나타나 있다.
실시예 5 : NY NanoGel 50 SP-BLG Q FF의 2단계 정제 공정
실시예 3의 크로마토그래피 조건의 1차 결과에 따르면, OsrhFn의 분리 및 정제를 위한 최종 공정 중 하나로 NW NanoGel 50 SP - BLG Q FF로 구성된 2단계 크로마토그래피를 이용하였다.
1) 추출: 실시예 1에 기술된 바와 같이, 1,000g의 유전자 조작 쌀 분말을 추출하였다.
2) 1차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피: 평행 완충액으로서 20 mM PB, pH 7.0을 사용하고; 불순물 세정 완충액으로서 20mM PB, 140 mM NaCl, pH 7.0을 사용하고; 그리고 용출 완충액으로서 20mM PB, 300mM NaCl, pH 7.0를 사용하여 90 ml Nano Gel 50 SP가 있는 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다.
3) 최종 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피: 평형 완충액으로서 20 mM PB, pH 7.0을 사용하고; 불순물 세정 완충액으로서 20 mM PB, 200 mM NaCl, pH 7.0을 사용하고; 그리고 용출 완충액으로서 20 mM PB, 300 mM NaCl, pH 7.0을 사용하여 16 ml BLG Q FF 가 있는 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 크로마토그래피 단계가 상이한 제품의 SDS-PAGE 결과는 도 19에 나타나 있다.
실시예 6: OsrhFn의 정제 공정 검증
실험실 규모의 제조 공정을 검증하기 위해, NW Nano Gel 50 SP와 BLG Q FF로 구성된 최적화 된 2단계 크로마토그래피 공정을 3회 수행하였다. 검증 절차의 구체적인 수행 단계는 다음과 같다.
1) 추출: 7.7g의 GSH(초순수 물 100 mL에 용해됨)을 5,000 mL의 추출 완충액(20 mM PB, pH 8.0)에 첨가한 다음, 0.87g의 PMSF(이소프로판올 435 mL에 용해됨) 및 5 mL의 Tween 80을 추가하였다. 잘 혼합한 후, Fn이 함유된 쌀 분말 1kg을 추출 용액에 첨가한 후, 실온에서 1 시간 동안 교반한 다음, 250g의 여과 보조제가 첨가되었다. 양압(positive pressure)을 이용하여 여과를 수행하였다. 여액을 0.45μm 여과막으로 여과하여 조 추출물을 얻었다.
2) 1차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피: 평형 완충액(20 mM PB, pH 7.0), 불순물 세정 완충액(20 mM PB, 140 mM NaCl, pH 7.0) 및 용출 완충액(20 mM PB, 300 mM NaCl, pH 7.0)을 사용하여 크로마토그래피를 평형화시켜 OsrFn의 1차 정제를 수행하였다. 크로마토그램은 도 20에 나타나 있다.
3) 최종 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피: 평형 완충액(20 mM PB, pH 7.0), 불순물 세정 완충액(20 mM PB, 200 mM NaCl, pH 7.0), 및 용출 완충액(20 mM PB, 300 mM NaCl, pH 7.0)을 사용하여 크로마토그래피를 수행하고 OsrFn을 최종적으로 정제하였다. 크로마토그램은 도 21에 나타나 있다.
3가지 검증 뱃치의 순도, 단백질 농도 및 수율의 결과는 아래 표 1에 요약하였다.
| 검증 뱃치 번호 | 순도 (%) |
농도 (mg/mL) |
부피 (mL) |
수율 (mg/kg 쌀 분말) |
평균 수율 (mg/kg 쌀 분말) |
RSD (%) |
| 20180927 | 97.1 | 0.754 | 124.7 | 94.0 | 85.8 | 8.2 |
| 20180928 | 96.0 | 0.726 | 112.6 | 81.7 | ||
| 20180929 | 95.4 | 0.732 | 111.6 | 81.7 |
3개의 검증 뱃치로부터의 SDS-PAGE의 결과는 도 22에 나타나 있다. OsrFn의 순도는 95% 이상이다. NY Nano Gel 50 SP 및 BLG Q FF의 2단계 크로마토그래피 정제 공정으로부터 얻은 OsrFn의 SEC-HPLC 프로파일은 도 23에 나타나 있다. 2 단계 크로마토그래피 정제 공정으로부터 얻어진 OsrFn의 세포 활성은 도 24에 나타나 있다. OsrFn의 순도와 활성 모두 긍정직인(positive) 대조를 충족하였다.
Claims (10)
- 유전자 조작된 벼 낟알로부터 재조합 인간 피브로넥틴을 분리 및 정제하는 방법으로서,
1) 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 유전자 조작된 벼 낟알로부터 추출하여 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조 추출물을 얻는 단계;
2) 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조 추출물을 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 1차 생성물을 얻는 단계; 및
3) 1차 생성물을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 정제된 재조합 인간 피브로넥틴을 얻는 단계를 포함하고;
상기 양이온 교환 크로마토그래피 용 수지가 Nano Gel 30/50 SP, Uni Gel 30/80 SP, SP Bestarose FF, SP Bestarose HP, Bestarose Diomond MMC, Uniphere S, MacroPrep S, POROS XS, SP-6FF, SP-6HP, 및 SP SepharoseTM Fast Flow로 구성된 군으로부터 선택되고: 그리고
상기 음이온 교환 크로마토그래피 용 수지가 Q Bestarose Fast Flow, Q Bestarose HP, Bestarose DEAE, Q SepharoseTM HP, Q SepharoseTM Fast Flow, DEAE SepharoseTM Fast Flow, UniGel 30/80Q, NanoGel 30/50Q, 및 UNO Sphere Q로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 있어서,
양이온 교환 크로마토그래피 용 수지가 바람직하게는 Nano Gel 50 SP인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 있어서,
음이온 교환 크로마토그래피 용 수지가 바람직하게는 Q Bestarose FF인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 있어서,
단계 1)에서 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조 추출물은,
4a) 재조합 인간 피브로넥틴을 발현하는 유전자 조작 벼 낟알을 원료로 사용하여 벼 낟알을 깎아서 반 정미로 만든 다음, 반 정미를 80∼100 메쉬의 분말로 분쇄하는 단계.
4b) 쌀 분말을 추출 완충액과 1:5∼1:10의 중량 또는 부피비로 혼합하고, 실온에서 0.5∼2 시간 동안 추출하여 조 단백 추출물을 수득하는 단계에 있어, 추출 완충액이 pH 값 5.9∼8.0을 갖고, 10∼50mM Tris, 10∼50 mM PB 및 0∼110 mM NaCl을 포함하는 조 단백질 추출물을 수득하는 단계; 및
4c) OsrFn을 함유하는 조 단백질 추출물을 여과에 의해 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 4 항에 있어서,
단계 4b)의 추출 완충액은 0.8∼1 mM PMSF, 5∼10 mM GSH 및 0.05∼0.1% Tween 80으로 구성된 군으로부터 최적화 된 하나 이상의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 있어서,
단계 1)에서 수득한 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조 추출물을 1차 분리 및 정제를 위한 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 1차 생성물을 수득하고; 양이온 교환을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 수지가 바람직하게는 NW Nano Gel 50 SP이고, 크로마토그래피는,
6a) 50∼200 cm/h의 유속에서 컬럼 부피의 5∼15 배인 평형 완충액을 사용하여 크로마토그래피 컬럼을 평형화 하는 단계로서, 평형 완충액이 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50 mM PB 및 0∼120 mM NaCl을 포함하는 평형화 단계;
6b) 단계 1)의 조 추출물을 사용하여 전도도가 2∼13.5 ms/cm이고, pH 값이 6.8∼7.1인 크로마토그래피 컬럼에 로딩하는 단계;
6c) 50∼200 cm/h의 유속에서 컬럼 부피의 20∼40배인 불순물 세정 완충액을 사용하여 불순물 단백질을 제거하는 단계로서, 불순물 세정 완충액이 pH 6.8∼7.1을 가지며, 10∼50 mM PB 및 130∼200 mM NaCl을 포함하는 분순물 단백질 제거 단계; 및
6d) 50∼200 cm/h의 유속에서 용출 완충액을 사용하여 OsrFn을 용출하고, 용출 분획물을 1차 생성물로 하는 용출단계로서, 용출 완충액은 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50 mM PB 및 250∼300 mM NaCl을 포함하는 용출단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 1)에서 수득된 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 조 추출물을 1차 분리 및 정제를 위한 양이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 1차 생성물을 수득하고, 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 충전제 BGL SP Bestarose HP이며, 크로마토그래피는,
7a) 50∼200 cm/h의 유속에서 컬럼 부피의 5∼15 배의 평형 완충액으로 크로마토그래피 컬럼을 평형화하는 단계로서, 평형 완충액이 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50 mM PB를 포함하는 평형화 단계;
7b) 단계 1)의 조 추출물을 로딩할 샘플로서 로딩하는 단계로서, 샘플이 전도도 2.5 ms/cm 및 pH 값 6.8∼7.1을 갖는 로딩 단계;
7c) 단계 7a)에서 컬럼 부피의 20∼40 배인 평형화 완충액으로 컬럼을 재 평형화하고, 50∼200 cm/h의 유속에서 불순물 세정 완충액으로 불순물 단백질을 용출하는 단계로서, 불순물 세정 완충액이 pH 값 5.8∼6.1을 가지며, 10∼50 mM PB 및 100∼130 mM NaCl을 포함하는 불순물 단백질 용출 단계;
7d) 1차 생성물로서 용출 분획물을 수득하기 위해 50∼200 cm/h의 유속에서 용출 완충액으로 시료를 용출하는 단계로서, 용출 완충액이 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50 mM PB 및 90∼110 mM NaCl을 포함하는 용출 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 있어서,
단계 2)에서 수득된 재조합 인간 피브로넥틴을 함유하는 1차 추출물을 음이온 교환 크로마토그래피로 처리하여 정제된 재조합 인간 피브로넥틴을 수득하고; 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 충전제 Q Bestarose FF 또는 Huiyan Q HP이고, 크로마토그래피는,
8a) 50∼200 cm/h의 유속에서 컬럼 부피의 5∼15 배인 평형 완충액으로 크로마토그래피 컬럼을 평형화하는 단계로서, 평형 완충액은 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50 mM PB 및 0∼150 mM NaCl을 포함하는 평형화 단계;
8b) 단계 2)의 1차 생성물을 로딩할 샘플로 로딩하는 단계로서, 샘플 전도도 12.5∼17.6 ms/cm 및 pH 값 6.8∼7.1을 갖는 1차 생성물의 로딩 단계;
8c) 50∼200 cm/h의 유속에서 불순물 세정 완충액으로 불순물 단백질을 용출하는 단계로서, 불순물 세정 완충액이 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50 mM PB 및 200∼220 mM NaCl을 포함하는 불순물 단백질의 용출 단계;
8d) 최종 생성물로서 용출 분획물을 수득하기 위해 50∼200 cm/h의 유속에서 용출 완충액으로 샘플을 용출하는 단계로서, 용출 완충액이 pH 값 6.8∼7.1을 갖고, 10∼50mM PB 및 250∼300 mM NaCl을 포함하는 용출 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 인간 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법. - 제 1 항에 따른 유전자 조작된 벼 낟알 제조용 식물 발현 벡터로서,
발현 벡터는 인간 피브로넥틴, 벼 특이적 프로모터(Gt13) 및 프로모터(Gt13a)의 신호 펩타이드를 플라스미드 벡터에 발현하는 유전자를 도입함으로써 구축되는 것을 특징으로 하는 식물 발현 벡터. - 제 9 항에 있어서,
인간 피브로넥틴을 발현하는 유전자가 SEQ ID NO.1에 나타낸 바와 같은 염기 서열을 갖고, 플라스미드 벡터가 pOsPMP626인 것을 특징으로 하는 식물 발현 벡터.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811505129.2A CN111285932B (zh) | 2018-12-10 | 2018-12-10 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法 |
| CN201811505129.2 | 2018-12-10 | ||
| PCT/CN2019/123762 WO2020119609A1 (zh) | 2018-12-10 | 2019-12-06 | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210099030A true KR20210099030A (ko) | 2021-08-11 |
Family
ID=71021300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217019636A KR20210099030A (ko) | 2018-12-10 | 2019-12-06 | 유전자 조작 벼 종자로부터 재조합 인체 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220056071A1 (ko) |
| EP (1) | EP3896163A4 (ko) |
| JP (1) | JP7312830B2 (ko) |
| KR (1) | KR20210099030A (ko) |
| CN (1) | CN111285932B (ko) |
| WO (1) | WO2020119609A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113337493B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-10-14 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种以基因工程水稻表达和制备重组瑞替普酶的方法 |
| CN117645664A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-05 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 重组人纤连蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5460955A (en) * | 1991-01-03 | 1995-10-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Fibronectin purification vector |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| JP2005534300A (ja) * | 2002-07-29 | 2005-11-17 | ウニベルシテ ラバル | 植物由来組換えタンパク質の収率を向上させるための方法 |
| EP1668136B8 (en) * | 2003-08-27 | 2012-03-21 | ORF Liftaekni HF. | A process for proteolytic cleavage and purification of recombinant proteins produced in plants |
| CN100540667C (zh) * | 2005-07-13 | 2009-09-16 | 杨代常 | 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白 |
| US20130157356A1 (en) * | 2010-01-25 | 2013-06-20 | Ventria Bioscience | Methods & compositions for improving protein production |
| CN102532254B (zh) * | 2010-12-24 | 2015-06-24 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法 |
| CN104968796A (zh) * | 2012-06-07 | 2015-10-07 | 庄伟哲 | 经修饰纤维黏连蛋白片段或变体及其用途 |
| CN102994514B (zh) * | 2012-11-07 | 2015-06-10 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从水稻种子生产和分离纯化重组人抗胰蛋白酶(OsrAAT)的方法 |
| CN103865932A (zh) | 2012-12-11 | 2014-06-18 | 武汉禾元生物科技有限公司 | 一种从水稻种子生产重组人碱性成纤维细胞生长因子的方法 |
| CN103880947B (zh) * | 2012-12-21 | 2016-01-13 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种分离纯化高纯度重组人血清白蛋白的层析方法 |
| CN104109204B (zh) | 2013-04-16 | 2017-11-07 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法 |
| CN103589706B (zh) * | 2013-04-25 | 2016-03-30 | 珠海市御品堂生物科技有限公司 | 纳豆激酶的提纯方法及制备方法 |
| CN107827974B (zh) * | 2017-11-10 | 2021-01-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种人纤维蛋白原的制备方法 |
| CN108794639B (zh) * | 2018-07-03 | 2020-11-20 | 广州澳特朗生物技术有限公司 | 一种重组纤连蛋白及其应用 |
-
2018
- 2018-12-10 CN CN201811505129.2A patent/CN111285932B/zh active Active
-
2019
- 2019-12-06 KR KR1020217019636A patent/KR20210099030A/ko active IP Right Grant
- 2019-12-06 US US17/312,875 patent/US20220056071A1/en active Pending
- 2019-12-06 EP EP19894910.9A patent/EP3896163A4/en active Pending
- 2019-12-06 WO PCT/CN2019/123762 patent/WO2020119609A1/zh unknown
- 2019-12-06 JP JP2021533137A patent/JP7312830B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3896163A1 (en) | 2021-10-20 |
| CN111285932B (zh) | 2023-07-11 |
| WO2020119609A1 (zh) | 2020-06-18 |
| EP3896163A4 (en) | 2022-08-10 |
| JP7312830B2 (ja) | 2023-07-21 |
| JP2022511925A (ja) | 2022-02-01 |
| CN111285932A (zh) | 2020-06-16 |
| US20220056071A1 (en) | 2022-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10428107B2 (en) | Method for isolating and purifying recombinant human serum albumin from transgenic rice grain | |
| Hansson et al. | Single–Step Recovery of a Secreted Recombinant Protein by Expanded Bed Adsorption | |
| Tsai et al. | Studies on a mammalian cell protein (P8) with affinity for DNA in vitro | |
| KR20210099030A (ko) | 유전자 조작 벼 종자로부터 재조합 인체 피브로넥틴의 분리 및 정제 방법 | |
| US10981975B2 (en) | Method for efficient purification of human serum albumin | |
| KR20120045451A (ko) | 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법 | |
| CN116333097A (zh) | 一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN109929027B (zh) | 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法 | |
| CA2890659C (en) | Method for producing, isolating and purifying recombinant human antitryptase (osraat) from rice seeds | |
| CN111484557B (zh) | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白-表皮生长因子融合蛋白的方法 | |
| CN112175063B (zh) | 一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺 | |
| CN109929038B (zh) | Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法 | |
| CN111285929B (zh) | 一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人表皮细胞生长因子的方法 | |
| CN108484738B (zh) | 辐抗肽突变蛋白及其制备与纯化方法 | |
| KR930007430B1 (ko) | 크로마토그래피 단계에 의한 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자의 정제방법 | |
| JP2869417B2 (ja) | 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン | |
| CN108017688B (zh) | 一种目的蛋白的纯化方法 | |
| CN117700530A (zh) | 一种含多巴的重组iv型人源化胶原蛋白的纯化生产方法 | |
| CN114163517A (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法 | |
| CN116410295A (zh) | 一种大肠杆菌表达物的纯化方法 | |
| CN104498460A (zh) | 一种疏水色谱纯化激肽释放酶的方法 | |
| CN116675759A (zh) | 一种新的cho细胞表达重组人神经生长因子的纯化方法 | |
| RU2101292C1 (ru) | Способ выделения рекомбинантного человеческого альфа-фактора некроза опухоли | |
| JP2004002449A (ja) | ヒト血清アルブミンおよびその製造方法 | |
| JPH11158198A (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |