CN1670034A - 毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法，该方法包括反相柱层析、疏水柱层析、凝胶柱层析顺序组合纯化，能够大规模制备得到高纯度的药用重组人白细胞介素11蛋白。

Description

毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及一种从表达重组人白细胞介素11(rhIL-11)的毕赤酵母工程菌高密度发酵液中大规模纯化rhIL-11的方法。

背景技术

人白细胞介素11(human Interleukin 11，hIL-11)是与许多造血细胞相互作用的细胞因子，最早是从IL-1a刺激的哺乳动物骨髓细胞系PU-34的条件培养基中被鉴别的活性物质，可长期维持培养的血细胞的生存，随后从人胚胎成纤维细胞系中克隆到hIL-11cDNA。天然的hIL-11成熟蛋白含178个氨基酸，分子量19Kd；不含半胱氨酸，因而缺少二硫键，但蛋白的结构却相当稳定；没有糖基化修饰；富含脯氨酸(12％)，亮氨酸(23％)及正电荷残基(14％)，等电点为11.7。

hIL-11是由多种细胞产生并与多种细胞作用的细胞因子。rhIL-11可与其它因子协同作用刺激人的粒细胞，红细胞及巨核细胞的前体细胞生长，最终导致血小板数量的增加。除了造血细胞，rhIL-11还作用于其它细胞，具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性(DuXX，Williams DA.Review of molecular，cell biology，and clinic use.Blood，1997，89(11)：3897-3908；Reynolds CH.Clinical efficacy of rhIL-11，Oncology(Huntingt)，2000，14(9 Suppl 8)：32-40)。

1997年，美国Genetic Institute公司(GI)生产的rhIL-11获准上市，用于防止化疗引起的再生性血小板减少症(Kaye JA et al.FDA licensure ofNEUMEGA to prevent severe chemotherapy-induced thrombocytopenia，StemCells，1998，16(Suppl 2)：207-223；Rust DM，Wood LS，Battiato LA et al.Oprelvekin：an alternative treatment for thrombocytopenia，Clin J OncolNurs，1999，3(2)：57-62)。GI于1993年获得hIL-11基因(专利号US5215895)，1997年补充了该专利(专利号US5700664)，1998年获得生产方法发明专利(专利号US5760189)。GI采用的是大肠杆菌融合表达生产方法。但这种系统存在以下缺点：(1)表达量不高，(2)生产成本过高，(3)蛋白纯化工序复杂。毕赤酵母是近年来发展起来的一种外源蛋白表达系统(Cereghino JL，Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris.FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)：45-66)。它既具有大肠杆菌系统操作简单的优点，又对重组蛋白有一定的折叠和加工能力。本专利申请人曾提出了用甲醇酵母生产重组人白细胞介素11的方法(申请号：99118279.0)，可以极其方便的获得大量具有生物学活性的rhIL-11。但是该方法需要将发酵液离心后通过超滤等方法进行浓缩，去除发酵液中的杂质，降低电导，然后通过离子交换层析，疏水层析及凝胶层析的顺序组合来纯化蛋白，工序比较复杂，经离子交换层析后，杂蛋白和内毒素含量仍然比较高，不利于后续纯化。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法，该方法采用了一般大规模蛋白纯化很少使用的反相层析方法，用来代替常用的超滤浓缩和离子交换层析两个步骤。采用本发明的方法，既可以减少纯化工序，也可以提高纯化效率和收率，更有利于杂蛋白和色素，内毒素等杂质的去除。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法，毕赤酵母发酵后，发酵液上清依次进行反相柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析纯化得到白介素11。进一步地，反相柱层析过程中，反相层析柱填料为SOURCE 15RPC、SOURCE 30RPC等反相介质；疏水柱层析过程中，疏水柱填料为Phenyl、SOURCE ISO等基团的疏水介质；凝胶柱层析过程中，凝胶柱填料为低吸附的Sephacryl、Superdex或Sephadex等系列介质。

本发明具有以下技术效果：

1)采用反相层析的方法可直接纯化发酵液，减少了发酵液的预处理的过程。

2)采用反相层析的方法，可使一步纯化所得的rhIL-11的纯度可达到90％以上。

3)采用反相层析的方法，可去除大部分的内毒素为后续的纯化工作带来方便。

4)反相层析的方法操作简单、方便、省时，有利于大规模的工业生产。

5)通过疏水层析的方法，使过反相层析所得的rhIL-11得以精纯化，经反相高效液相层析(HPLC-RP)检测，其纯度大于97％，生物学活性达到0.8×10⁷U/mg以上。

6)通过凝胶层析可以改变疏水目标峰的缓冲体系，使所得目标峰可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失。

附图说明

图1是反相柱纯化时的rhIL-11梯度洗脱图；

图2是经RP-HPLC分析后目标峰A纯度图；

图3是疏水柱纯化时的rhIL-11梯度洗脱图；

图4是rhIL-11经凝胶柱纯化时的洗脱图。

具体实施方式

工程菌毕赤酵母JYIL4(CCTCC NO：M204072)进行发酵生产(参考已经公开的专利，申请号99118279.0)，本发明采用的是二步法发酵。第一阶段，工程菌接种于甘油或葡萄糖等为碳源的半合成培养基(其配方为：六偏磷酸钠25g/L，CaSO₄·2H₂O 1.176g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄ 7.28g/L，EDTA 0.925g/L，甘油40g/L，PTM1 4.35ml/L，(NH₄)₂SO₄ 9g/L，泡敌0.02％。其中PTM1的配方为：CuSO₄·5H₂O 6g/L，NaI 0.08g/L，MnSO₄·2H₂O 3g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，硼酸0.02g/L，生物素0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，ZnCl₂ 20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，硫酸5ml)培养16-28小时至甘油或葡萄糖耗尽，菌密度达到大于OD₆₀₀＝160，此为菌种生长期。第二阶段，甲醇补料到浓度0.5％-5％，诱导表达，表达持续48-96小时达到平台期。其他参数选择；培养温度控制为酵母生长最适的30℃；溶氧15％-35％(搅拌速度相关)；pH3-6，低pH可抑制酵母自身蛋白酶的活性，减少降解。

发酵结束后通过离心除去菌体，收集发酵上清后直接通过反相层析、疏水层析及凝胶层析的顺序组合来去除杂蛋白、内毒素、糖类等杂质最终得到纯蛋白。

已经报道的纯化方法都是先将发酵上清经超滤浓缩，并用缓冲液来透滤以降低电导达到下一步离子交换层析的要求。而用反相层析来代替一般的离子交换层析可以将发酵上清直接上样，省略超滤步骤，而且，与以往的离子交换层析相比，采用反相层析，不仅可以简化步骤，还可以提高蛋白回收率和纯化效率。从表1可看出，采用本发明的反相层析方法，收率、纯度和内毒素指标都比离子交换方法要好的多。反相层析填料选用SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC等反相介质。一般的反相层析介质是以二氧化硅为基架的，其蛋白结合量低，容易堵塞，几乎不可能再生，所以不经济；再者，高反压、低回收率、寿命短、不可在位清洗、装柱团难，因而不实用。而SOURCE反相介质是以高聚物为基架，是均一的坚固珠状物，反压低、可在位清洗、回收率高、装柱简单，是一种非常有效及经济的分离系统。

表1两种纯化方法的结果对比

	RP-HPLC纯度	收率	内毒素含量
				离子交换层析	90.8％	45.5％	1285EU/mg
反相层析	95.8％	64.5％	15EU/mg

反相层析流动相可选用三氟醋酸-乙腈体系，以0.01-1.0％的三氟醋酸为流动相A，以0.01-1.0％的三氟醋酸加40-100％的乙腈为流动相B，将离心后的发酵液上清经5微米微孔滤膜过滤后直接上样后，用流动相A平衡柱子。当所有未结合在柱上的组分流出后，用30％的流动相B冲洗2-3个柱体积，将大部分蛋白聚体、内毒素等杂质洗脱。最后用30-50％的流动相B梯度洗脱目标峰。通过反相层析，可去除大部分的杂蛋白、内毒素、糖类等杂质，得到的rhIL-11蛋白的纯度可达90％以上，纯化回收率可达50％以上。

疏水柱选用SOURCE ISO，Phenyl等基团的疏水填料，可选用20-50mMTris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液，pH的范围在6.0-10.0，加入0.5-1.6mol/L(NH₄)₂SO₄或0.5-1.6mol/L Na₂SO₄的缓冲液为流动相A，以不含(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄的缓冲液为流动相B。反相目标峰用pH的范围在6.0-10.0，20-50mM Tris-HCl、Gly-NaOH或磷酸缓冲液稀释10-20倍，降低反相目标峰中的乙腈浓度。在上述稀释液中直接加入高浓度的(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄溶液至浓度为0.8-1.6mol/L(NH₄)₂SO₄或0.8-1.6mol/L Na₂SO₄，上样于疏水柱，然后以流动相A平衡柱子，再以0-100％流动相B梯度洗脱，收集目标峰。通过疏水层析可进一步去除可能存在的寡聚体、降解蛋白、色素以及充分减少乙腈残留量，使目标峰中rhIL-11的纯度可达到97％以上，这一步纯化的回收率可达60％。

经疏水层析后收集的目标峰，可直接上样于以5-10mM的磷酸缓冲液为流动相平衡好的Sephacryl、Superdex或Sephadex凝胶层析柱，进行精制。最终使乙腈残留量、蛋白纯度、活性等指标合格。凝胶层析用此流动相旨在将可能存在的寡聚体、降解蛋白进一步去除的同时，可以将前述疏水条件下的体系改换为5-10mM磷酸盐，经此凝胶层析得到的目标蛋白rhIL-11，可以直接用于制剂的配制，而无须采用透析等其他改换溶液体系的处理，减少处理步骤中可能的污染与损失，这步脱盐的回收率可达90％。

以下实例将进一步说明本发明，但不仅限于该实例。

菌种发酵生产后，发酵液上清经过以下步骤进行纯化。

一.rhIL-11的反相柱纯化

在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入1L的SOURCE 30RPC反相胶，以0.1％的三氟醋酸缓冲液为流动相A，0.1％的三氟醋酸缓冲液加90％乙腈为流动相B。用流动相A平衡反相柱后，以200ml/min流速将离心后的发酵液上清经5微米微孔滤膜过滤后含有40g rhIL-11的发酵上清直接上SOURCE 30RPC反相柱，上完样后先以流动相A平衡柱子，将所有未结合在柱上的组分冲干净；再用30％的流动相B冲洗2-3个柱体积，将大部分降解蛋白、蛋白聚体及内毒素等杂质洗脱；最后以3个柱体积的30-40％的流动相B梯度洗脱目标峰A，如图1所示，经RP-HPLC分析此时所得目标峰A的纯度为95.8％，如图2所示，rhIL-11的蛋白总量为25.8g，因而过此反相柱的回收率为64.5％。

二.rhIL-11的疏水柱纯化

在安玛西亚的BPG 100/500L柱中装入2L的SOURCE ISO疏水胶，流动相A为20mM PH8.0加1.6mol/L(NH₄)₂SO₄，流动相B为20mM PH8.0的Tris-Hcl缓冲液。先将反相目标峰A用流动相B稀释15倍，然后再直接加入4mol/L的(NH₄)₂SO₄溶液至浓度为1.6mol/L(NH₄)₂SO₄，接着以100ml/min的流速上样于用流动相A平衡好的SOURCE ISO疏水柱，上完样后用流动相A平衡2个柱体积(将未结合于柱上的杂质冲洗干净)，再用10％的流动相B冲洗柱子(洗脱一些挂于柱上的杂蛋白)，最后用35％的流动相B洗脱，收集目标峰B，如图3所示，经RP-HPLC分析此时所得目标峰B的纯度为97.2％，rhIL-11蛋白总量为15.58g，此步纯化的回收率为60.4％。

三.rhIL-11的凝胶柱纯化

在安玛西亚的XK 50/100L柱中装入2L的Sephadex G25 Coarse胶，疏水目标峰B过Sephadex G25 Coarse柱脱盐，以5mM的磷酸缓冲液为平衡液，洗脱收集目标峰C，即为高纯度的rhIL-11，可直接用于制剂的制备，不用再进行透析等处理，如图4所示。经RP-HPLC、SDS-PAGE分析，纯度为98％，rhIL-11蛋白总量为14.5g，因此过凝胶柱纯化的回收率为93.1％。应用B9-11测活细胞株测定rhIL-11的体外活性，比活性为1.0×10⁷U/mg。

本发明的生物材料样品已在位于中国武汉市武汉大学的中国专利局指定的保藏单位“中国典型培养物保藏中心”保藏，保藏日期为2004年9月11日，保藏编号为M204072，分类命名为：pichia pastoris GS115JYIL4。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种毕赤酵母表达重组人白介素11的生产方法，其特征在于，毕赤酵母发酵后，发酵液上清依次进行反相柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析纯化得到白介素11。

2.  根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述反相柱层析过程中，反相层析柱填料为SOURCE 15RPC、SOURCE 30RPC等反相介质。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述疏水柱层析过程中，疏水柱填料为Phenyl、SOURCE ISO等基团的疏水介质。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述凝胶柱层析过程中，凝胶柱填料为低吸附的Sephacryl、Superdex或Sephadex等系列介质。

Images