CN115386562A - 一种重组蛋白内毒素的去除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法，其中的高效去内毒素亲和填料FF可以特异性的去除病毒、核酸和蛋白等与重组蛋白结合的内毒素，且其载量较高，稳定性较好不会有脱落，重组蛋白回收率高，从而有效的降低了处理成本；同时，本发明所采用的方法操作简单，不需要对高效去内毒素亲和填料FF进行装柱，使用方便，可以根据重组蛋白中所含的内毒素总量加入，容易进行工艺放大，采用本发明的方法对注射用替奈普酶进行纯化处理后，注射用替奈普酶纯度大于98％，内毒素＜0.6eu/mg，收率大于90％，产品的质量得到了极大的提升。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法。
背景技术
内毒素是一种对人类或动物产生有害影响的热原，因而在生物制品中内毒素的浓度必须低于安全、受管制的水平，故在生产过程需要对生物制品中的内毒素进行去除。内毒素的去除方法有很多，例如超滤法、活性炭吸附法、相分离法、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、亲和吸附法(即在填料表面偶联如多粘菌素B、组胺、组氨酸以及一些聚阳离子等具有特异性结合作用的配位基，从而可以选择性吸附与其可发生特异性结合的物质)，此外还包括金属离子鳌合层析和氢氧化铝吸附法。
其中注射用替奈普酶目前多采用Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析、lysineHyperD亲和层析两步层析方法进行纯化，两步亲和层析对杂质去除效果较好，且纯化后蛋白纯度、收率较好；但是上述纯化方法对于注射用替奈普酶的内毒素控制只能达到＜2EU/mg的水平，且后续没有内毒素去除工艺，如果上样细胞表达内毒素含量较高，或者在纯化工艺中因缓冲液或器材处理不当，则会导致内毒素超标，采用上述纯化方法则不能很好的对注射用替奈普酶中的内毒素进行去除。
因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组蛋白内毒素的去除方法，其可以用于在注射用替奈普酶生产过程中对内毒素进行去除，且内毒素的去除效果优于现有技术。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
一种重组蛋白内毒素的去除方法，包括如下步骤：
步骤1：将待处理的细胞上清液进行预处理，得到预处理液；
步骤2：将所述预处理液经Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；
步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysine HyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；
以及，步骤4：在所述Lysine层析目的蛋白溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF进行纯化，而后经0.22um滤器除菌过滤，即得纯化后的注射用替奈普酶。
优选的，所述步骤1中采用0.45滤器对所述待处理的细胞上清液进行预处理。
优选的，所述步骤2中洗脱液A的组分为：10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％聚山梨酯20、0.5-1M氯化钠、2-4M尿素、5-10mg/L抑肽酶。
优选的，所述洗脱液A的pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的3-5倍。
优选的，所述步骤3中洗脱液B的组分为：0.2-1.0M精氨酸、0.1-0.5M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、6-10mg/L抑肽酶、5-18mg/mL磷酸。
优选的，所述洗脱液B的pH值为7.4-7.8，其用量是柱体积的3-5倍。
优选的，所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF的吸附载量为10000-14000eu/mL。
优选的，所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF在使用前需要使用平衡缓冲液C对其进行处理。
优选的，所述平衡缓冲液C的组分为：1％脱氧胆酸钠，10-50mM磷酸盐缓冲液。
优选的，所述平衡缓冲液C的pH值为6.8-7.4，用量为所需处理的填料体积的5-10倍。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所采用的内毒素去除方法，其中的高效去内毒素亲和填料FF可以特异性的去除病毒、核酸和蛋白等与重组蛋白结合的内毒素，且其载量较高，稳定性较好不会有脱落，重组蛋白回收率高，从而有效的降低了处理成本；同时，本发明所采用的方法操作简单，不需要对高效去内毒素亲和填料FF进行装柱，使用方便，可以根据重组蛋白中所含的内毒素总量加入，容易进行工艺放大，采用本发明的方法对注射用替奈普酶进行纯化处理后，注射用替奈普酶纯度大于98％，内毒素＜0.6eu/mg，收率大于90％，产品的质量得到了极大的提升。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
本发明提供的一种重组蛋白内毒素的去除方法，包括如下步骤：
步骤1：将待处理的细胞上清液使用0.45滤器进行预处理，得到预处理液。
步骤2：将所述预处理液经Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；
其中，Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析对注射用替奈普酶蛋白结合载量为10-20mg/mL；洗脱液A的组分为：10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.5-1M氯化钠、2-4M尿素和5-10mg/L抑肽酶，pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的3-5倍；
且在Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析上样前和上样后，均需要使用平衡缓冲液A进行柱平衡，平衡缓冲液A的组分为10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.1-0.5M氯化钠和1-3mg/L抑肽酶，pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的3-5倍；
同时，在Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析洗脱活性峰前，需要使用杂质洗脱液A进行杂质洗脱，杂质洗脱液A的组分为：10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、1-3M氯化钠和1-3mg/L抑肽酶，pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的5-10倍。
步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysine HyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；
其中，在进行lysine HyperD亲和层析上样前，需使用稀释缓冲液A对Blue层析目的蛋白溶液稀释5-6倍后用于上样，稀释缓冲液A的组分为10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20和1-3mg/L抑肽酶，pH为7.4-8.0；
在进行lysine HyperD亲和层析时，lysine HyperD亲和层析对注射用替奈普酶蛋白结合载量为5-10mg/mL，洗脱液B的组分为：0.2-1.0M精氨酸、0.1-0.5M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、6-10mg/L抑肽酶、5-18mg/ml磷酸，pH为7.4-7.8，其用量是柱体积的3-5倍；
且在进行lysine HyperD亲和层析时，Blue层析目的蛋白溶液上样前需使用平衡缓冲液B对层析柱进行平衡处理，平衡缓冲液B的组分为：10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20和2mg/L抑肽酶，pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的3-5倍；
同时，在lysine HyperD亲和层析时，Blue层析目的蛋白溶液上样后需使用杂质洗脱液B对层析柱进行杂质洗脱处理，杂质洗脱液B的组分为：10-50mM磷酸盐缓冲液、1M氯化钠、0.043％的聚山梨酯20和2mg/L抑肽酶，pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的5-15倍。
步骤4：在所述Lysine层析目的蛋白溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF进行纯化，而后经0.22um滤器除菌过滤，即得纯化后的注射用替奈普酶；
其中，高效去内毒素亲和填料FF的吸附载量为10000-14000eu/mL，根据lysine目的蛋白液中所含的内毒素总量，向样品溶液中加入相应的高效去内毒素亲和填料FF，于4℃条件下震荡混匀，然后使用0.22um滤器除菌过滤；
且所述高效去内毒素亲和填料FF在使用前需使用平衡缓冲液C对该填料进行处理，平衡缓冲液C的组分为1％脱氧胆酸钠，10-50mM磷酸盐缓冲液，pH值6.8-7.4，用量为所需处理的填料体积的5-10倍，处理后用50-100倍填料体积的注射水对高效去内毒素亲和填料FF进行抽洗。
实施例1
一种重组蛋白内毒素的去除方法，步骤如下：
上清液过滤：将待处理的细胞上清液经过0.45滤器进行预处理后，得到预处理液；
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析上样前后平衡：样品溶液上样前和上样后用平衡缓冲液A对层析柱平衡3个柱体积，平衡缓冲液A的组分为20mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.15M氯化钠和2mg/L抑肽酶，pH值为7.6，平衡后进行上样，然后再用平衡缓冲液A对层析柱平衡3个柱体积。
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析杂质洗脱：上样结束后，使用杂质洗脱液A洗脱5个柱体积，杂质洗脱液A的组分是20mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、2M氯化钠和2mg/L抑肽酶，pH值为7.6.
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析活性峰洗脱：杂质洗脱结束后，使用洗脱液A洗脱3个柱体积，收集Blue层析目的蛋白溶液。洗脱液A的组分是20mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、1M氯化钠、3M尿素和6mg/L抑肽酶，pH值为7.6，其用量为柱体积的3倍。
将收集的Blue层析目的蛋白溶液使用稀释缓冲液A稀释6倍后，用于下一步层析上样。稀释缓冲液A的组分为20mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20和2mg/L抑肽酶，pH为7.6。
lysine HyperD亲和层析杂质洗脱：上样后用平衡缓冲液B对层析柱平衡3个柱体积；然后用杂质洗脱液B洗出杂蛋白，杂质洗脱液B的组分为20mM磷酸盐缓冲液、1M氯化钠、0.043％的聚山梨酯20和2mg/L抑肽酶，杂质洗脱液B的用量为10个柱体积；
lysine HyperD亲和层析目的峰洗脱：最后使用3倍柱体积的洗脱液B洗脱得到目的蛋白峰，洗脱液B的组分为0.5M精氨酸、0.2M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、10mg/L抑肽酶、12mg/ml磷酸，pH为7.4，洗脱得到的溶液即为Lysine层析目的蛋白溶液。
内毒素去除：高效去内毒素亲和填料FF吸附载量为10000-14000eu/ml,根据lysine目的蛋白液中所含内毒素总量，向样品溶液中加入相应凉的经处理的高效去内毒素亲和填料FF，于4℃条件下震荡混匀，然后使用0.22um滤器除菌过滤，即为注射用替奈普酶纯化液。
在向样品溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF前需使用平衡缓冲液C对该填料进行处理，平衡缓冲液C的组分为1％脱氧胆酸钠，20mM磷酸盐缓冲液，pH值7.4，用量为所需处理的填料体积的10倍，然后用80倍填料体积的注射水进行抽洗。
经过上述纯化后所得的注射用替奈普酶纯化液蛋白纯度为99.2％上，回收率97.9％以上，内毒素＜0.5eu/mg，各项杂质指标均得到有效控制。
实施例2
一种重组蛋白内毒素的去除方法，步骤如下：
上清液过滤：将待处理的细胞上清液经过0.45滤器进行预处理后，得到预处理液；
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析上样前后平衡：样品溶液上样前和上样后用平衡缓冲液A对层析柱平衡4个柱体积，平衡缓冲液A的组分为35mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.3M氯化钠和1mg/L抑肽酶，pH值为7.4，平衡后进行上样，然后再用平衡缓冲液A对层析柱平衡3个柱体积。
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析杂质洗脱：上样结束后，使用杂质洗脱液A洗脱7个柱体积，杂质洗脱液A的组分是35mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、1M氯化钠和1mg/L抑肽酶，pH值为7.4.
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析活性峰洗脱：杂质洗脱结束后，使用洗脱液A洗脱4个柱体积，收集Blue层析目的蛋白溶液。洗脱液A的组分是35mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.5M氯化钠、2M尿素和8mg/L抑肽酶，pH值为7.4，其用量为柱体积的4倍。
将收集的Blue层析目的蛋白溶液使用稀释缓冲液A稀释6倍后，用于下一步层析上样。稀释缓冲液A的组分为35mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20和1mg/L抑肽酶，pH为7.8。
lysine HyperD亲和层析杂质洗脱：上样后用平衡缓冲液B对层析柱平衡4个柱体积；然后用杂质洗脱液B洗出杂蛋白，杂质洗脱液B的组分为35mM磷酸盐缓冲液、1M氯化钠、0.043％的聚山梨酯20和2mg/L抑肽酶，杂质洗脱液B的用量为8个柱体积；
lysine HyperD亲和层析目的峰洗脱：最后使用4倍柱体积的洗脱液B洗脱得到目的蛋白峰，洗脱液B的组分为0.8M精氨酸、0.3M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、6mg/L抑肽酶、7mg/ml磷酸，pH为7.6，洗脱得到的溶液即为Lysine层析目的蛋白溶液。
内毒素去除：高效去内毒素亲和填料FF吸附载量为10000-14000eu/ml,根据lysine目的蛋白液中所含内毒素总量，向样品溶液中加入相应凉的经处理的高效去内毒素亲和填料FF，于4℃条件下震荡混匀，然后使用0.22um滤器除菌过滤，即为注射用替奈普酶纯化液。
在向样品溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF前需使用平衡缓冲液C对该填料进行处理，平衡缓冲液C的组分为1％脱氧胆酸钠，35mM磷酸盐缓冲液，pH值7.0，用量为所需处理的填料体积的5倍，然后用50倍填料体积的注射水进行抽洗。
经过上述纯化后所得的注射用替奈普酶纯化液蛋白纯度为98.6％上，回收率96.1％以上，内毒素＜0.55eu/mg，各项杂质指标均得到有效控制。
实施例3
一种重组蛋白内毒素的去除方法，步骤如下：
上清液过滤：将待处理的细胞上清液经过0.45滤器进行预处理后，得到预处理液；
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析上样前后平衡：样品溶液上样前和上样后用平衡缓冲液A对层析柱平衡5个柱体积，平衡缓冲液A的组分为50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、0.5M氯化钠和3mg/L抑肽酶，pH值为8.0，平衡后进行上样，然后再用平衡缓冲液A对层析柱平衡3个柱体积。
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析杂质洗脱：上样结束后，使用杂质洗脱液A洗脱10个柱体积，杂质洗脱液A的组分是50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、3M氯化钠和3mg/L抑肽酶，pH值为8.0
Blue SepHarose 6FastFlow亲和层析活性峰洗脱：杂质洗脱结束后，使用洗脱液A洗脱5个柱体积，收集Blue层析目的蛋白溶液。洗脱液A的组分是50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20、1M氯化钠、4M尿素和10mg/L抑肽酶，pH值为8.0，其用量为柱体积的5倍。
将收集的Blue层析目的蛋白溶液使用稀释缓冲液A稀释6倍后，用于下一步层析上样。稀释缓冲液A的组分为50mM磷酸盐缓冲液、0.043％的聚山梨酯20和3mg/L抑肽酶，pH为8.0。
lysine HyperD亲和层析杂质洗脱：上样后用平衡缓冲液B对层析柱平衡5个柱体积；然后用杂质洗脱液B洗出杂蛋白，杂质洗脱液B的组分为50mM磷酸盐缓冲液、1M氯化钠、0.043％的聚山梨酯20和2mg/L抑肽酶，杂质洗脱液B的用量为12个柱体积；
lysine HyperD亲和层析目的峰洗脱：最后使用4倍柱体积的洗脱液B洗脱得到目的蛋白峰，洗脱液B的组分为1.0M精氨酸、0.5M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、10mg/L抑肽酶、12mg/ml磷酸，pH为7.8，洗脱得到的溶液即为Lysine层析目的蛋白溶液。
内毒素去除：高效去内毒素亲和填料FF吸附载量为10000-14000eu/ml,根据lysine目的蛋白液中所含内毒素总量，向样品溶液中加入相应凉的经处理的高效去内毒素亲和填料FF，于4℃条件下震荡混匀，然后使用0.22um滤器除菌过滤，即为注射用替奈普酶纯化液。
在向样品溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF前需使用平衡缓冲液C对该填料进行处理，平衡缓冲液C的组分为1％脱氧胆酸钠，50mM磷酸盐缓冲液，pH值7.4，用量为所需处理的填料体积的10倍，然后用100倍填料体积的注射水进行抽洗。
经过上述纯化后所得的注射用替奈普酶纯化液蛋白纯度为97.1％上，回收率95.3％以上，内毒素＜0.6eu/mg，各项杂质指标均得到有效控制。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (10)
1.一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：将待处理的细胞上清液进行预处理，得到预处理液；
步骤2：将所述预处理液经Blue SepHarose 6 FastFlow亲和层析后，用洗脱液A洗脱得到Blue层析目的蛋白溶液；
步骤3：将所述Blue层析目的蛋白溶液经lysine HyperD亲和层析后，用洗脱液B洗脱得到Lysine层析目的蛋白溶液；
以及，步骤4：在所述Lysine层析目的蛋白溶液中加入高效去内毒素亲和填料FF进行纯化，而后经0.22um滤器除菌过滤，即得纯化后的注射用替奈普酶。
2.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤1中采用0.45滤器对所述待处理的细胞上清液进行预处理。
3.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤2中洗脱液A的组分为：10-50mM磷酸盐缓冲液、0.043％聚山梨酯20、0.5-1M氯化钠、2-4M尿素、5-10mg/L抑肽酶。
4.根据权利要求3所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述洗脱液A的pH值为7.2-8.0，其用量是柱体积的3-5倍。
5.根据权利要求1所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤3中洗脱液B的组分为：0.2-1.0M精氨酸、0.1-0.5M氨基己酸、0.043％聚山梨酯20、6-10mg/L抑肽酶、5-18mg/ml磷酸。
6.根据权利要求5所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述洗脱液B的pH值为7.4-7.8，其用量是柱体积的3-5倍。
7.根据权利要求1或4或6所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF的吸附载量为10000-14000eu/mL。
8.根据权利要求7所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述步骤4中，所述高效去内毒素亲和填料FF在使用前需要使用平衡缓冲液C对其进行处理。
9.根据权利要求8所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述平衡缓冲液C的组分为：1％脱氧胆酸钠，10-50mM磷酸盐缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于：所述平衡缓冲液C的pH值为6.8-7.4，用量为所需处理的填料体积的5-10倍。
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