CN115558609A - 一种用于眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30诱导表达的培养基 - Google Patents

一种用于眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30诱导表达的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30诱导表达的培养基，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.186g，硫酸钾3.6g，七水硫酸镁2.98g，氢氧化钾0.826g，85%磷酸5.34ml，PTM1 4ml，赖氨酸或苯丙氨酸10g，余量为去离子水。使用本发明的培养基，提供重组毕赤酵母良好生长，显著提高了菌的表达量，同时，本发明的培养基明显提高了眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30的生物活性。

Description

一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基
技术领域
本发明涉及基因工程生物技术领域，具体地，涉及一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基。
背景技术
cathelicidins是一种在先天免疫系统中发挥重要作用的阳离子宿主防御肽，眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30为cathelicidins的截短肽，由30个氨基酸序列组成，目前研究发现其对大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa ）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。
目前眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30基因工程表达制备方法中，表达常用的培养基是BSM培养基，实验发现蛋白表达水平较低且生物活性也较低，基于上述表达过程中存在的问题，亟需通过调整优化培养基成分提高眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达水平及生物活性。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基。
本发明的目的是通过以下方案实现的：
一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基，其特征在于：所述培养基是在BSM培养基基础上添加了氨基酸，旨在提高抗菌肽OH-CATH30的表达量及抑菌活性。
所述培养基的配比如下：
配置1L该培养基，加入：
葡萄糖20g；
二水硫酸钙0.186g；
硫酸钾3.6g；
七水硫酸镁4.68g；
氢氧化钾0.826g；
85%磷酸5.34ml；
PTM1 4ml；
氨基酸10g
用去离子水溶解上述培养基组分，定容至终体积为1L。
优选的，所述氨基酸为赖氨酸、苯丙氨酸。
本发明所述的用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基的积极进步效果在于：本发明的培养基可提供重组毕赤酵母良好生长，显著提高了毕赤酵母菌的表达产量；同时，本发明的培养基显著提高了眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的生物活性。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基，为眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30大规模发酵提供基础。
实施例1：培养基的配制方法
（1）.试剂与材料
葡萄糖购于临沂市兰山区丰源食品添加剂经营部；
赖氨酸、苯丙氨酸购于广州康荻尔生物科技有限公司；
二水硫酸钙、硫酸钾、胰蛋白胨、酵母浸膏、氢氧化钠、氨水、二水钼酸钠、浓硫酸、五水硫酸铜、硼酸购于国药集团；
七水硫酸镁、氢氧化钾、85%磷酸、七水硫酸铁购于天津市福晨化学试剂厂；
碘化钾购于西胧科学股份有限公司；六水氯化钴购于无锡市亚泰联合化工有限公司；生物素购于生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化锌购于无锡市亚泰联合化工有限公司；一水硫酸锰购于江苏强盛功能化学股份有限公司；
（2）.配制培养基
①.配制YPD基础培养基：
a：称取胰蛋白胨6g和酵母浸膏3g，加入270ml纯水溶解，用1M氢氧化钠溶液调整pH值至7,然后121℃高温高压灭菌 20min；
b：称取葡萄糖20g，加入60ml纯水溶解后定容至100ml，108℃高温高压灭菌30min，得到20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液；
c：在步骤a中所配制的溶液，缓慢加入30ml的步骤b的20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液，得到基础培养基YPD。
②.配制BSM培养基：
a：称取葡萄糖20g、二水硫酸钙0.186g、硫酸钾3.6g、七水硫酸镁4.68g、氢氧化钾0.826g，加入800 mL去离子水溶解，加入85%磷酸5.34 mL，定容至1000 mL，121℃高温高压灭菌 20min；
b：称取3g上述赖氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸与苯丙氨酸按比例1:1配合的组合氨基酸，加入300 mL步骤（1）所配制的溶液中，65℃加热使其溶解，用氨水调整pH值到5.0，过0.22μm滤膜，待用；
c：配制PTM1溶液，称取五水硫酸铜6g、碘化钾0.08g、一水硫酸锰3g、二水钼酸钠0.2g、硼酸0.02g、六水氯化钴0.5g、氯化锌20g、七水硫酸铁65g、生物素0.2g、浓硫酸5mL，加入800 mL纯水溶解，定容至1000 mL，得到微量盐溶液PTM1；
d：取PTM1 1.2 mL加入到步骤b所配制待用的溶液中，得到BSM培养基。
实施例2：眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达实验
（1）眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的生长期
a：挑取含有表达质粒的毕赤酵母菌单菌落，接种于20 mLYPD培养基中，29℃，220rpm培养16h，得到一级种子液；
b：按1%的比例将一级种子液接种于100 mL YPD培养基中，29℃，220rpm扩大培养16h，得到二级种子液；
c：按10%的比例将二级种子液接种于300mL实施例2中配制的BSM培养基中，29℃，220rpm培养66h。
具体添加3种氨基酸对毕赤酵母菌生长速度影响的实验数据如表1所示：
表1：添加3种氨基对毕赤酵母菌生长速度影响的实验数据
Figure 165888DEST_PATH_IMAGE002
由上述试验结果可以得知，生长阶段分别添加赖氨酸能够提高毕赤酵母菌生长速度，添加量都为10g/L，pH＝5，接种10％，29℃培养18h即可。
（2）眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的诱导期表达
a：将上述3种添加不同氨基酸的培养基分别添加甲醇、山梨醇，对重组毕赤酵母开始诱导表达。
（3）进行抑菌实验
a：收集48h表达液，过0.22μm滤膜去除大分子后做金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）2种病原菌的平板抑菌实验，37℃培养约16h后取出观察抑菌圈的大小。结果如表2。
表2:48h表达液的抑菌圈大小
Figure 427105DEST_PATH_IMAGE003
注：“/”表示表达量过低不足以达到抑菌效果。
结果显示：分别添加的赖氨酸、苯丙氨酸或上述2种氨基酸的组合，添加赖氨酸在生长阶段能够提高重组毕赤酵母的生长速度，培养18小时就进入诱导阶段，但添加苯丙氨酸或上述2种氨基酸的组合的效果不明显。重组蛋白表达48h后取其表达液进行抑菌实验，重组毕赤酵母生长期添加赖氨酸后其表达液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）的抑菌效果均有明显提高，添加苯丙氨酸后其表达液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果有明显提高。

Claims (2)

1.一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基，其特征在于，所述培养基的配比如下：
配置1L该培养基，加入：
葡萄糖20g；
二水硫酸钙0.186g；
硫酸钾3.6g；
七水硫酸镁4.68g；
氢氧化钾0.826g；
85%磷酸5.34ml；
PTM1 4ml；
氨基酸10g
用去离子水溶解上述培养基组分，定容至终体积为1L。
2.根据权利要求1所述的一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达的培养基，其特征在于所述氨基酸为赖氨酸、苯丙氨酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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