CN115558020A - 一种用于眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30发酵培养基，其配方主要组成部分如下：葡萄糖50g/L、二水硫酸钙0.186‑0.372g/L、硫酸钾3.64‑7.28g/L、硫酸镁2.98‑5.96g/L、氢氧化钾0.826‑1.652g/L、85%磷酸5.34‑8.01ml/L、PTM1 4ml/L；所述发酵优化培养基的Ph值为4.5‑6.0；培养时间为24~48h；接种量为20~40%；培养方式为需氧发酵罐培养；发酵培养温度为30℃。本发明优化培养基含盐量较低，优化了后续分离纯化工艺，同时又节省了成本，有助于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，更具体地涉及一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基。
背景技术
cathelicidins是一种在先天免疫系统中发挥重要作用的阳离子宿主防御肽，眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30为cathelicidins的截短肽，由30个氨基酸序列组成，目前研究发现其对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和产气肠杆菌等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。
目前眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基使用的是BSM培养基，BSM培养基为无机盐培养基，其组分简单，配置方便，经实验发现一个发酵周期结束BSM培养基未被利用部分成分含量较多，一方面在生产过程中易造成原材料的浪费，另一方面因为含盐量较大，使得后期分离纯化工艺较繁琐，不利于规模化生产。
发明内容
本发明是提供一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基，该培养基配方节省成本，含盐量少，优化后续处理工艺。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
本发明中，所述发酵培养基有如下组分组成：
1）葡萄糖 50g/ L
2）二水硫酸钙 0.186-0.372g/L
3）硫酸钾 3.64-7.28g/ L
4）硫酸镁 2.98-5.96g/ L
5）氢氧化钾 0.826-1.652g/ L
6）85%磷酸 5.34-8.01ml/ L
7）PTM1 4ml/ L
8）所述发酵优化培养基的Ph值为4.5-6.0；所述发酵优化培养基的培养时间为24~48h；所述发酵优化培养基的接种量为20~40%；所属发酵优化培养方式为需氧发酵罐培养；所属发酵培养温度为30℃。
优选的，所述二水硫酸钙 0.186g/L。
优选的，所述硫酸钾 3.64g/L。
优选的，所述硫酸镁 2.98g/L。
优选的，所述氢氧化钾0.826g/ L。
优选的，所述85%磷酸 5.34ml/ L。
优选的，所述PTM1溶液的组分如下：6g/L五水硫酸铜、0.08g/L碘化钾、3g/L一水硫酸锰、0.2g/L二水钼酸钠、0.02g/L硼酸、0.5g/L六水氯化钴、20g/L氯化锌、65g/L七水硫酸铁、0.2g/L生物素、5mL/L浓硫酸，余量为纯水。
优选的，所述发酵优化培养基的Ph值为6.0；所述的发酵培养时间为24h；所述接种量为20%；所述的培养方式为需氧发酵罐培养；所述的发酵培养温度为30℃。
本发明中，溶解所述发酵优化培养基的介质为本领域常规，较佳地为水；所述水为本领域常规所述，如蒸馏水、双蒸水等。
本发明中，所述的发酵优化培养基的制备方法为本领域常规，只需将其包含的各组分简单混合，然后按照本领域常规微生物培养基的制备条件制备即可；所述的常规制备条件为121℃，高压温热灭菌15min。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明所述的用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基的积极进步效果在于：本发明的发酵优化培养基含盐量较低，优化了后续分离纯化工艺，同时又节省了成本，有助于规模化生产。
具体实施方式
下面通过实验实例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实例范围之中。
实施例1：本发明培养基的制备方法如下：取各原料，葡萄糖 50g/ L、
、二水硫酸钙 0.186g/L、硫酸钾 3.64g/ L、硫酸镁 2.98g/ L、氢氧化钾 0.826g/L、85%磷酸 5.34ml/ L、PTM1 4ml/ L，将各原料搅拌均匀后，搅拌预热80℃，调节pH为6.0，115℃灭菌30min，冷空气降温10min，开搅拌，冷却设备降温至常温，制得发酵培养基。上述PTM1溶液配制方法如下：称取6g五水硫酸铜、0.08g碘化钾、3g一水硫酸锰、0.2g二水钼酸钠、0.02g硼酸、0.5g六水氯化钴、20g氯化锌、65g七水硫酸铁、0.2g生物素、5mL浓硫酸，加入800 mL纯水溶解，定容至1000 mL，得到微量盐溶液PTM1。
采用常用发酵工艺：制备一级种子液和二级种子液备用，对发酵罐及发酵培养基进行灭菌处理，标定溶氧和校正PH电极，待溶氧标定和PH电极校正好后，将制备好的二级种子液通过火圈接种于发酵罐种进行发酵。发酵过程中分为生长培养和诱导培养，生长培养即补料培养阶段，控制发酵温度为30℃，PH设定在6，维持溶氧值在35%—45%之间，发酵培养24h，培养过程中取样检测发酵液中的剩余葡萄糖，当检测出葡萄糖消耗完时，开始以50ml/h的速率流加30%葡萄糖溶液，补料流加时间以开始诱导时的菌种浓度而定，当菌种浓度达到诱导开始的菌种浓度条件使，进行饥饿培养60—90min。诱导培养即表达培养阶段，饥饿培养结束后，开始甲醇诱导，在诱导培养阶段，控制发酵温度为30℃，PH设定在6，发酵培养48h，初始调整通气量为1L/min，随着甲醇消耗增加，适量调整通气量，开始一次性流加发酵液体积的1%的100%甲醇，当甲醇消耗完时，开始以2ml/h/L流加甲醇，待菌种完全适应甲醇后，调整甲醇流加速度为5ml/h/L，维持溶氧值在20%—40%之间，直至发酵结束。
发酵液的处理：发酵结束后，将发酵液通过管式离心机在10000rpm的转速下，离去酵母菌种，取上清液，然后用膜过滤设备依次过10000D、5000D超滤膜和600D纳米膜除去大分子杂蛋白和小分子无机盐，最后用冷冻干燥机制备眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30粗品。
实施例2
所述培养基的制备方法如下：取各原料，葡萄糖 50g/ L、二水硫酸钙 0.372g/L、硫酸钾 7.28g/ L、硫酸镁 5.96g/ L、氢氧化钾 1.652g/ L、85%磷酸 10.68ml/ L、PTM14ml/ L，将各原料搅拌均匀后，搅拌预热80℃，调节pH为6.0，115℃灭菌30min，冷空气降温10min，开搅拌，冷却设备降温至常温，制得发酵培养基。
其余重复实施例1的发酵工艺步骤进行实验。
实施例3
所述培养基的制备方法如下：取各原料，葡萄糖 50g/ L、
、二水硫酸钙 0.465g/L、硫酸钾 9.1g/ L、硫酸镁 7.45g/ L、氢氧化钾 4.13g/L、85%磷酸 26.7ml/ L、PTM1 4ml/ L，将各原料搅拌均匀后，搅拌预热80℃，调节pH为6.0，115℃灭菌30min，冷空气降温10min，开搅拌，冷却设备降温至常温，制得发酵培养基。
其余重复实施例1的发酵工艺步骤进行实验。
实施例4
所述培养基的制备方法如下：取各原料，葡萄糖 50g/ L、
、二水硫酸钙 0.93g/L、硫酸钾 18.2g/ L、硫酸镁 14.9g/ L、氢氧化钾 4.13g/L、85%磷酸 26.7ml/ L、PTM1 4ml/ L，将各原料搅拌均匀后，搅拌预热80℃，调节pH为6.0，115℃灭菌30min，冷空气降温10min，开搅拌，冷却设备降温至常温，制得发酵培养基。
其余重复实施例1的发酵工艺步骤进行实验。
结果显示：根据实施例1-实施例4的实验结果，在发酵培养过程中对发酵液OD600值测定和菌体湿重的测定，以及对制得的抗菌肽粗品含量的测定，得到结果如下表格。
表1：不同含量的BSM培养基实验结果
从上述表格可知，20%BSM培养基配方与100%BSM培养基配方的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30工程菌发酵中的最高OD600值和最高湿重是一样的，制得的镜王蛇抗菌肽OH-CATH30粗品含量是一样的，即20%BSM优化培养基发酵的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的生长情况与100%BSM培养基发酵的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的生长情况一致，且不影响眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达。20%BSM培养基优化配方含盐量较低，使用优化20%BSM培养基进行发酵，能够优化后续分离纯化工艺，同时又节省了成本，有助于规模化生产。
Claims (4)
1.一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基由如下组分组成：
1）葡萄糖 50g/ L；
2）二水硫酸钙 0.186-0.372g/L；
3）硫酸钾 3.64-7.28g/ L；
4）硫酸镁 2.98-5.96g/ L；
5）氢氧化钾 0.826-1.652g/ L；
6）85%磷酸 5.34-8.01ml/ L；
7）PTM1 4ml/ L；
8）所述发酵优化培养基的Ph值为4.5-6.0；所述发酵优化培养基的培养时间为24~48h；所述发酵优化培养基的接种量为20~40%；所属发酵优化培养方式为需氧发酵罐培养；所属发酵培养温度为30℃。
2.根据权利要求1所述的一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基，所述发酵培养基的组成组分为：葡萄糖 50g/ L；二水硫酸钙 0.186g/L；硫酸钾 3.64g/ L；硫酸镁2.98g/ L；氢氧化钾 0.826g/ L；85%磷酸 5.34ml/ L；PTM1 4ml/ L。
3.根据权利要求1所述的一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基，所述PTM1溶液的组分如下：6g/L五水硫酸铜、0.08g/L碘化钾、3g/L一水硫酸锰、0.2g/L二水钼酸钠、0.02g/L硼酸、0.5g/L六水氯化钴、20g/L氯化锌、65g/L七水硫酸铁、0.2g/L生物素、5mL/L浓硫酸，余量为纯水。
4.根据权利要求1所述的一种用于眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30发酵培养基，所述发酵优化培养基的Ph值为6.0；所述的发酵培养时间为24h；所述接种量为20%；所述的培养方式为需氧发酵罐培养；所述的发酵培养温度为30℃。
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|---|---|---|---|---|
| CN115558613A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-01-03 | 江苏亢钧生物科技有限公司 | 一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30表达效率的培养基及其配制方法 |
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| CN115558613A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-01-03 | 江苏亢钧生物科技有限公司 | 一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30表达效率的培养基及其配制方法 |
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