CN115772216A - 一种重组弹性蛋白的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组弹性蛋白的生产方法，涉及基因重组工程菌发酵纯化技术领域。其中重组弹性蛋白的生产方法包括使用特异性发酵培养基、培养方法、诱导方法、破胞方法、纯化方法获得重组弹性蛋白。本发明可以提高重组弹性蛋白的发酵表达量、纯化效率，降低内毒素水平，从而提高重组弹性蛋白的生产水平，适用于稳定的工业化生产。同时，本发明生产的重组弹性蛋白与从动物组织提取的弹性蛋白相比具有极好的生物相容性、无病毒隐患、排异反应低等特点。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组工程菌发酵技术领域，具体而言，涉及一种重组弹性蛋白的生产方法。
背景技术
天然弹性蛋白是一种水溶性较低、无定型、疏水性强且广泛交联的细胞外基质蛋白，其在皮肤、肺脏、韧带、和血管等组织中含量较高，并在维持组织弹性中发挥着重要作用，因此其在医学美容、护肤领域具有广阔的应用前景。
在现有技术中，弹性蛋白的主要来源是动物组织提取，而随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得的重组弹性蛋白已取得巨大成果，与天然弹性蛋白相比，利用该技术生产的重组弹性蛋白解决了传统提取法存在的病毒隐患缺陷，同时又显著提高了弹性蛋白的稳定性、亲水性和生物相容性。
对于重组弹性蛋白的应用，以经济高效的方式大量生产和高纯度生产它们非常重要。尤其是作为生物材料和组织工程支架，高产率和低成本是其规模使用的两个最大障碍。国外有报道在摇瓶阶段其表达量可达1.6g/L,但对于大规模工业化生产鲜有报道，本发明旨在提供一种大规模重组弹性蛋白生产工艺。
目前，一般使用大肠杆菌工程菌进行发酵培养生产重组弹性蛋白；但是目前发酵培养基多是以改良LB培养基为主，而基因工程菌大肠杆菌传统发酵使用葡萄糖作为碳源，葡萄糖在使用过程中产生大量有机酸，抑制菌体生长，蛋白表达。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种重组弹性蛋白的生产方法，可以提高重组弹性蛋白的发酵表达量、纯化效率、降低内毒素水平，从而提高重组弹性蛋白的发酵生产水平，适用于稳定的工业化生产。
为解决上述技术问题，本发明的目的是通过以下技术方案实现的：提供一种重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、发酵：使用特异性发酵培养基培养工程菌种，并在培养过程中分阶段诱导工程菌种；
S2、破胞：使用表面活性剂及盐离子进行破胞；
S3、纯化：调节pH，控制温度，并加入表面活性剂进行蛋白纯化。
通过采用上述技术方案，可以提高重组弹性蛋白的发酵表达量、纯化效率、降低内毒素水平，从而提高重组弹性蛋白的发酵生产水平，适用于稳定的工业化生产。
优选地，所述步骤S1中，还包括以下步骤：
A1、将大肠杆菌工程菌种子液接种于发酵罐中的特异性发酵培养基中培养，待溶氧大幅度回升后，流加补料培养基继续培养；
A2、当工程菌菌液OD值达到44-60时，开始缓慢补加乳糖溶液进行初步诱导，同时流加补料培养基继续培养；
A3、当工程菌菌液OD值达到65-73时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束。
通过采用上述技术方案，使得发酵过程中可分阶段诱导的方式来提高诱导压力，提高蛋白产量。其中，A1步为底料消耗阶段；当OD达到44-60为初诱导阶段，目的是让菌种适应乳糖；A3为正式诱导阶段；A4保持诱导压力，以实现持续诱导。
优选地，所述步骤A1中，特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵0.5～3.5g/L，磷酸二氢钾3.0～13.5g/L，一水柠檬酸0.2～1.6g/L，七水硫酸镁0.2～1.8g/L，一水葡萄糖2～15g/L,甘油10～20g/L，七水硫酸亚铁30～70mg/L，五水硫酸锰1～5mg/L，七水硫酸锌8～15mg/L，五水硫酸铜3～10mg/L，二水氯化钙5～20mg/L，硼砂0.5～2mg/L，钼酸铵0.1～2mg/L。
通过采用上述技术方案，利用发酵培养基中甘油和葡萄糖复配减小了葡萄糖的存在抑制乳糖诱导的可能性，且减少了发酵过程中产生的有机酸对菌种生长及蛋白表达的抑制。
进一步地，优选为磷酸氢二铵2.0～3.0g/L；磷酸二氢钾5.0～10.0g/L，一水柠檬酸0.5～1.5g/L，七水硫酸镁0.2～1.0g/L，一水葡萄糖2～7g/L,甘油10～18g/L，七水硫酸亚铁40～60mg/L，五水硫酸锰2～4mg/L，七水硫酸锌10～13mg/L，五水硫酸铜4～7mg/L，二水氯化钙8～13mg/L，硼砂0.7～1.5mg/L，钼酸铵0.3～0.8mg/L。
通过采用上述技术方案，进一步减小了葡萄糖的存在抑制乳糖诱导的可能性，且减少了发酵过程中产生的有机酸对菌种生长及蛋白表达的抑制；另外，培养基中采用纯无机盐离子及食品级原料，无传统动、植物蛋白胨/酵母粉涉及的致病性、风俗禁忌、转基因等风险。
优选地，所述步骤A1中，补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖150～300g/L，甘油300～600g/L，七水硫酸镁0.1～4.5g/L，复合氨基酸1～6.0g/L，七水硫酸亚铁10～50mg/L，五水硫酸锰0.5～3mg/L，七水硫酸锌2～10mg/L，五水硫酸铜1～5mg/L，二水氯化钙2～10mg/L，硼砂0.1～1mg/L，钼酸铵0.1～1mg/L。
通过采用上述技术方案，利用补料培养基中甘油和葡萄糖复配减小了葡萄糖的存在抑制乳糖诱导的可能性，且减少了发酵过程中产生的有机酸对菌种生长及蛋白表达的抑制。
进一步地，优选为一水葡萄糖175～250g/L，甘油350～500g/L，七水硫酸镁1.0～3.0g/L，脯氨酸2.0～5.0g/L，丙氨酸2.0～5.0g/L，七水硫酸亚铁20～40mg/L，五水硫酸锰1.0～2.5mg/L，七水硫酸锌4.0～8.0mg/L，五水硫酸铜3.0～6.0mg/L，二水氯化钙2.0～6.0mg/L，硼砂0.1～0.5mg/L，钼酸铵0.2～0.7mg/L。
通过采用上述技术方案，进一步减小了葡萄糖的存在抑制乳糖诱导的可能性，且减少了发酵过程中产生的有机酸对菌种生长及蛋白表达的抑制；另外，培养基中采用纯无机盐离子及食品级原料，无传统动、植物蛋白胨/酵母粉涉及的致病性、风俗禁忌、转基因等风险。
优选地，所述步骤A2中，乳糖溶液包括以下浓度的组分：乳糖40-80g/L，进一步优选为45～60g/L。
优选地，所述步骤A1补料培养基的流加速率为10～15mL/h/L，所述步骤A2中补料培养基的流加速率为15-20mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3～5mL/h/L，所述步骤A3中补料培养基的流加速率为15-20mL/h/L，乳糖溶液的流加量为5-12.5mL/L，所述步骤A4中补料培养基的流加速率为10-15mL/h/L，乳糖溶液的流加量为1-2mL/h/L。
通过采用上述技术方案，使得生产过程中，乳糖的分阶段自诱导提高了基因工程菌的蛋白表达量。其中，在对数生长中期缓慢加入乳糖自诱导，在对数生长的中后期一次加入适量乳糖提高诱导压力，在诱导期缓慢加入乳糖保持诱导压力。
优选地，所述发酵培养的条件为：发酵温度34～37℃，氨水调节pH为6.5～7.0，溶氧不低于30％，罐压0.04～0.08MPa。
优选地，所述步骤S2中，还包括如下步骤：
B1、发酵结束后离心进行固液分离；
B2、将菌体沉淀复溶至放罐体积的0.8-1.5倍，调节pH 2～5，加入氯化钠、EDTA、表面活性剂，加热至55-85℃；
B3、调节罐压，50-150rpm持续搅拌2～5h。
通过采用上述技术方案，针对了弹性蛋白耐酸热的特性，其中，结合表面活性剂和其他盐离子的使用及压力的控制，使得破胞时无需使用昂贵的高压均质机，即可实现高效破胞，操作简单，节约生产成本。
优选地，所述步骤S3中，还包括如下步骤：
C1、破胞液温度降至30-40℃时，加入少量盐离子，调节pH 3.0-5.0，保持温度并持续搅拌，离心收取上清液；
C2、上清液调节pH3.0-5.0，加入EDTA，表面活性剂，加热至30-40℃，调节罐压，保持温度继续搅拌，离心收取上清液，重复此步骤；
C3、上清液加入无机盐，加热至38-50℃，搅拌、离心收取蛋白沉淀；
C4、蛋白沉淀复溶，超滤脱盐，经弱阴离子填料层析纯化。
通过采用上述技术方案，能根据重组弹性蛋白特性对初始内毒素得以有效控制，并通过对纯化料液离子环境、pH、温度的控制以及表面活性剂的加入，使目标蛋白析出而其他蛋白析出极少量，从而提高了蛋白纯度，且通过层析纯化进一步提高了蛋白纯度，蛋白纯度可达95％以上，同时可将内毒素控在10EU/mL以下，并且操作简单，极大地节约纯化成本，同时低内毒素水平加大了产品可使用范围。
优选地，所述步骤C1中，加入的盐离子为0.1M～0.2M氯化钠，保持温度50-150rpm继续搅拌2-5h，采用管式离心机10000-12000rpm，收取上清液；所述步骤C2中，加入1-10mMEDTA，1.5％-3％表面活性剂，通入空气至罐压为1.0-1.6Mpa，保持温度50-150rpm继续搅拌1-2h，离心收取上清液；所述步骤C3中，上清液加入10％-40％硫酸铵，50-150rpm搅拌1-3h，离心收取蛋白沉淀；所述步骤S4中，蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的5-10倍，经DEAE弱阴离子层析。
本发明使用的特异性发酵培养基及补料培养基，采用甘油和葡萄糖复配、及分阶段诱导相结合的方式，既解决了现有技术中葡萄糖存在抑制乳糖诱导的问题，又避免了过多的有机酸产生而对菌种生长以及蛋白表达的抑制，相较于使用传统方式减少了乳糖添加量、节约成本；另外，本发明采用纯无机盐离子及食品级原料，无传统动、植物蛋白胨/酵母粉涉及的致病性、风俗禁忌、转基因等风险,。在生产过程中，本发明使用乳糖分阶段自诱导，在对数生长中期缓慢加入乳糖自诱导，在对数生长的中后期一次加入适量乳糖提高诱导压力，在诱导期缓慢加入乳糖保持诱导压力，从而提高基因工程菌的蛋白表达量；且本发明采用的破胞方法，针对弹性蛋白耐酸热的特性，结合表面活性剂和其他盐离子的使用及压力的控制，无需使用昂贵的高压均质机，即可实现高效破胞，操作简单，节约生产成本；另外，本发明根据重组弹性蛋白特性设计的纯化方法，对初始内毒素得以有效控制，并通过对纯化料液离子环境、pH、温度的控制以及表面活性剂的加入，使目标蛋白析出而其他蛋白析出极少量，初步实现了蛋白纯度的提高，通过层析纯化，进一步提高了蛋白纯度，蛋白纯度可达95％以上，同时可将内毒素控在10EU/mL以下，操作简单，极大地节约纯化成本，同时低内毒素水平加大了产品可使用范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为破胞效果对比的SDS-PAGE凝胶电泳图，
图2为纯化效果示意图；
图3为细胞毒性对比示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。
还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。
还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。
此外，“大致”、“基本”等用语旨在说明相关内容并不是要求绝对的精确，而是可以有一定的偏差。例如：“大致相等”并不仅仅表示绝对的相等，由于实际生产、操作过程中，难以做到绝对的“相等”，一般都存在一定的偏差。因此，除了绝对相等之外，“大致等于”还包括上述的存在一定偏差的情况。以此为例，其他情况下，除非有特别说明，“大致”、“基本”等用语均为与上述类似的含义。
本发明提供了一种重组弹性蛋白的生产方法，其中，本发明中的重组弹性蛋白的氨基酸序列如下：
MASVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGSSVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGSSVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGSSVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGVGVAPGSR
实施例1
本实施例上述重组弹性蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1、发酵：调配生产重组弹性蛋白使用的特异性发酵培养基、培养(发酵)工程菌种、诱导工程菌种；
S2、破胞；
S3、纯化。
其中，步骤S1中，包括如下步骤：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为13mL/h/L；
A2、待OD增至52时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为18mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3mL/h/L；
A3、待OD增至72时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液7mL/L,补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为13mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为1mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.5，罐压0.08MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.25g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵2.5g/L；磷酸二氢钾8.0g/L，一水柠檬酸1.0g/L，七水硫酸镁0.4g/L，一水葡萄糖5g/L,甘油15g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，五水硫酸锰2.5mg/L，七水硫酸锌11.25mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙10mg/L，硼砂1.15mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖200g/L，甘油400g/L，七水硫酸镁1.5g/L，脯氨酸4.0g/L，丙氨酸4.0g/L，七水硫酸亚铁28mg/L，五水硫酸锰2.0mg/L，七水硫酸锌6.0mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙4.0mg/L，硼砂0.3mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖50g/L。
而步骤S2中，包括如下步骤：
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的1.2倍，调节pH至3.5，加入10mM氯化钠，10mM EDTA，1.8％Triton-114，加热至60℃，
B3、通入空气至罐压为1.5Mpa，50-150rpm搅拌保持4h，经检测破胞率可达98％。
另外，步骤S3中，包括以下步骤：
C1、破胞液温度降至30℃时，加入0.1M氯化钠，调节pH3.5，保持温度50rpm继续搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液。
C2、上清液调节pH3.5，加入3mM EDTA，2.0％Triton-114，加热至30℃，通入空气至罐压为1.0Mpa，保持温度60rpm继续搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入25％硫酸铵，加热至45℃，100rpm搅拌1.5h，采用管式离心机12000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的10倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
另外需要说明的是，本发明的发酵方法适用于可以使用该培养基的大肠杆菌发酵体系，而破胞方法适用于耐酸热蛋白，但纯化方法仅适用于弹性蛋白。
实施例2
基于实施例1的基础之上，本实施例中具体设定如下：
步骤S1中：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为10mL/h/L；
A2、待OD增至45时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为15mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3mL/h/L；
A3、待OD增至65时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液7mL/L,补料培养基的流加速率为16mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为10mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为1mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.7，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.14g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵2.1g/L；磷酸二氢钾5.0g/L，一水柠檬酸0.6g/L，七水硫酸镁0.3g/L，一水葡萄糖4g/L,甘油10g/L，七水硫酸亚铁35mg/L，五水硫酸锰1.5mg/L，七水硫酸锌9mg/L，五水硫酸铜7mg/L，二水氯化钙15mg/L，硼砂0.8mg/L，钼酸铵0.2mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖175g/L，甘油350g/L，七水硫酸镁0.9g/L，脯氨酸2.0g/L，丙氨酸2.0g/L，七水硫酸亚铁15mg/L，五水硫酸锰1.0mg/L，七水硫酸锌4.0mg/L，五水硫酸铜1.5mg/L，二水氯化钙2.5mg/L，硼砂0.6mg/L，钼酸铵0.8mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖45g/L。
步骤S2中：
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的1.2倍，调节Ph至4.0，加入10mM氯化钠，10mM EDTA，1.8％Triton-114，加热至55℃，
B3、通入空气至罐压为1.5Mpa，100rpm搅拌保持4h，经检测破胞率可达98％。
另外，步骤S3中，：
C1、破胞液温度降至30℃时，加入0.15M氯化钠，调节pH4.0，保持温度50rpm继续搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液。
C2、上清液调节pH4.0，加入4mM EDTA，2.0％Triton-114，加热至30℃，通入空气至罐压为1.4Mpa，保持温度50-150rpm继续搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入15％硫酸铵，加热至45℃，100rpm搅拌1.5h，采用管式离心机12000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的10倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
实施例3
基于实施例1的基础之上，本实施例中具体设定如下：
步骤S1中：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为10mL/h/L；
A2、待OD增至45时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为18mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为4.5mL/h/L；
A3、待OD增至65时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液7mL/L,补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为15mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为2mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.7，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.23g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵3.0g/L；磷酸二氢钾12.0g/L，一水柠檬酸1.5g/L，七水硫酸镁1.5g/L，一水葡萄糖7g/L,甘油18g/L，七水硫酸亚铁65mg/L，五水硫酸锰4.5mg/L，七水硫酸锌13mg/L，五水硫酸铜9mg/L，二水氯化钙5mg/L，硼砂0.5mg/L，钼酸铵1.0mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖250g/L，甘油350g/L，七水硫酸镁4.0g/L，脯氨酸3.0g/L，丙氨酸3.0g/L，七水硫酸亚铁45mg/L，五水硫酸锰2.8mg/L，七水硫酸锌8mg/L，五水硫酸铜3mg/L，二水氯化钙8mg/L，硼砂0.8mg/L，钼酸铵0.8mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖60g/L。
步骤S2中
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的1.5倍，调节pH至4.5，加入10mM氯化钠，10mM EDTA，2.2％Triton-114，加热至70℃；
B3、通入空气至罐压为1.5Mpa，150rpm搅拌保持2h，经检测破胞率可达98％。
另外，步骤S3中：
C1、破胞液温度降至30℃时，加入0.15M氯化钠，调节pH4.0，保持温度50rpm继续搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液。
C2、上清液调节pH4.0，加入4mM EDTA，2.0％Triton-114，加热至30℃，通入空气至罐压为1.4Mpa，保持温度150rpm继续搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入25％硫酸铵，加热至45℃，100rpm搅拌1.5h，采用管式离心机12000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的10倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
实施例4
基于实施例1的基础之上，本实施例中具体设定如下：
步骤S1中：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为13mL/h/L；
A2、待OD增至45时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为16mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为4mL/h/L；
A3、待OD增至65时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液5mL/L,补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为15mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为2mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.7，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.03g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵2.0g/L；磷酸二氢钾5.0g/L，一水柠檬酸0.2g/L，七水硫酸镁1.8g/L，一水葡萄糖15g/L,甘油20g/L，七水硫酸亚铁40mg/L，五水硫酸锰1mg/L，七水硫酸锌15mg/L，五水硫酸铜3mg/L，二水氯化钙18mg/L，硼砂1.5mg/L，钼酸铵1.0mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖150g/L，甘油600g/L，七水硫酸镁0.2g/L，脯氨酸1.0g/L，丙氨酸6.0g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，五水硫酸锰0.5mg/L，七水硫酸锌2mg/L，五水硫酸铜8mg/L，二水氯化钙10mg/L，硼砂0.1mg/L，钼酸铵0.1mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖80g/L。
步骤S2中
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的1.5倍，调节pH至4.5，加入10mM氯化钠，10mM EDTA，2.2％Triton-114，加热至70℃；
B3、通入空气至罐压为1.5Mpa，150rpm搅拌保持2h，经检测破胞率可达98％。
另外，步骤S3中：
C1、破胞液温度降至30℃时，加入0.15M氯化钠，调节pH4.0，保持温度50rpm继续搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液。
C2、上清液调节pH4.0，加入4mM EDTA，2.0％Triton-114，加热至30℃，通入空气至罐压为1.4Mpa，保持温度150rpm继续搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入35％硫酸铵，加热至45℃，80rpm搅拌1.5h，采用管式离心机11000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的10倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
实施例5
基于实施例1的基础之上，本实施例中具体设定如下：
步骤S1中：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为12mL/h/L；
A2、待OD增至45时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为18mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3mL/h/L；
A3、待OD增至65时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液12.5mL/L,补料培养基的流加速率为20mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为12mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为2mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.7，罐压0.06MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.09g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵3.5g/L；磷酸二氢钾10.0g/L，一水柠檬酸0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，一水葡萄糖2g/L,甘油20g/L，七水硫酸亚铁30mg/L，五水硫酸锰5mg/L，七水硫酸锌10mg/L，五水硫酸铜4mg/L，二水氯化钙8mg/L，硼砂0.6mg/L，钼酸铵0.6mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖300g/L，甘油300g/L，七水硫酸镁3.0g/L，脯氨酸2.0g/L，丙氨酸5.0g/L，七水硫酸亚铁20mg/L，五水硫酸锰2.5mg/L，七水硫酸锌10mg/L，五水硫酸铜6mg/L，二水氯化钙6mg/L，硼砂0.5mg/L，钼酸铵0.2mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖40g/L。
步骤S2中
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的1.5倍，调节pH至4.5，加入10mM氯化钠，10mM EDTA，2.2％Triton-114，加热至70℃；
B3、通入空气至罐压为1.5Mpa，150rpm搅拌保持2h，经检测破胞率可达98％。
另外，步骤S3中：
C1、破胞液温度降至30℃时，加入0.18M氯化钠，调节pH4.0，保持温度50rpm继续搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液。
C2、上清液调节pH4.0，加入6mM EDTA，2.0％Triton-114，加热至30℃，通入空气至罐压为1.4Mpa，保持温度150rpm继续搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入10％硫酸铵，加热至45℃，150rpm搅拌2h，采用管式离心机12000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的10倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
实施例6
本实施例上述重组弹性蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1、发酵：调配生产重组弹性蛋白使用的特异性发酵培养基、培养(发酵)工程菌种、诱导工程菌种；
S2、破胞；
S3、纯化。
其中，步骤S1中，包括如下步骤：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度34℃，氨水调节pH为6.5，罐压0.04MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为10mL/h/L；
A2、待OD增至44时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为15mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3mL/h/L；
A3、待OD增至65时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液5mL/L,补料培养基的流加速率为15mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为10mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为1mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.5，罐压0.04MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.11g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵0.5g/L；磷酸二氢钾3.0g/L，一水柠檬酸0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，一水葡萄糖2g/L,甘油10g/L，七水硫酸亚铁30mg/L，五水硫酸锰1mg/L，七水硫酸锌8mg/L，五水硫酸铜3mg/L，二水氯化钙5mg/L，硼砂0.5mg/L，钼酸铵0.1mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖150g/L，甘油300g/L，七水硫酸镁0.1g/L，脯氨酸1g/L，丙氨酸1g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，五水硫酸锰0.5mg/L，七水硫酸锌2mg/L，五水硫酸铜1mg/L，二水氯化钙2mg/L，硼砂0.1mg/L，钼酸铵0.1mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖40g/L。
而步骤S2中，包括如下步骤：
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的0.8倍，调节pH至2.0，加入5mM氯化钠，5mM EDTA，1.5％Triton-114，加热至55℃，
B3、通入空气至罐压为1.2Mpa，50-150rpm搅拌保持2h，经检测破胞率可达95％。
另外，步骤S3中，包括以下步骤：
C1、破胞液温度降至30℃时，加入0.1M氯化钠，调节pH3.0，保持温度50rpm继续搅拌2h，采用管式离心机10000rpm，收取上清液。
C2、上清液调节pH3.0，加入1mM EDTA，1.5％Triton-114，加热至30℃，通入空气至罐压为1.0Mpa，保持温度50rpm继续搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入10％硫酸铵，加热至38℃，50rpm搅拌1h，采用管式离心机12000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的5倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
实施例7
本实施例上述重组弹性蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1、发酵：调配生产重组弹性蛋白使用的特异性发酵培养基、培养(发酵)工程菌种、诱导工程菌种；
S2、破胞；
S3、纯化。
其中，步骤S1中，包括如下步骤：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为7.0，罐压0.08MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为15mL/h/L；
A2、待OD增至60时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为20mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为5mL/h/L；
A3、待OD增至73时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液12.5mL/L,补料培养基的流加速率为20mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为15mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为2mL/h/L；温度37℃，氨水调节pH为7.0，罐压0.08MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为2.0g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵3.5g/L；磷酸二氢钾13.5g/L，一水柠檬酸1.6g/L，七水硫酸镁1.8g/L，一水葡萄糖15g/L,甘油20g/L，七水硫酸亚铁70mg/L，五水硫酸锰5mg/L，七水硫酸锌15mg/L，五水硫酸铜10mg/L，二水氯化钙20mg/L，硼砂2mg/L，钼酸铵2mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖300g/L，甘油600g/L，七水硫酸镁4.5g/L，脯氨酸6g/L，丙氨酸6g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，五水硫酸锰3mg/L，七水硫酸锌10mg/L，五水硫酸铜8mg/L，二水氯化钙10mg/L，硼砂1mg/L，钼酸铵1mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖80g/L。
而步骤S2中，包括如下步骤：
B1、发酵结束后采用碟式离心机，固液分离；
B2、后将菌体沉淀加纯化水复溶至放罐体积的1.5倍，调节pH至5.0，加入15mM氯化钠，15mM EDTA，2.0％Triton-114，加热至85℃，
B3、通入空气至罐压为1.5Mpa，50-150rpm搅拌保持5h，经检测破胞率可达95％。
另外，步骤S3中，包括以下步骤：
C1、破胞液温度降至40℃时，加入0.2M氯化钠，调节pH5.0，保持温度50rpm继续搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液。
C2、、上清液调节pH5.0，加入10mM EDTA，3％Triton-114，加热至40℃，通入空气至罐压为1.6Mpa，保持温度50-150rpm继续搅拌2h，采用管式离心机12000rpm，收取上清液，重复此步骤一次，此时上清液内毒素水平可降至100-300EU/ml。
C3、上清液加入40％硫酸铵，加热至50℃，50-150rpm搅拌3h，采用管式离心机12000rpm，收取蛋白沉淀。
C4、蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的10倍，超滤脱盐，经DEAE弱阴离子填料层析柱去除内毒素及精纯，经检测蛋白纯度可达95％以上，内毒素可降至5-10EU/ml。
对比例1
基于实施例1的基础上，设置为以下参数：
发酵培养条件为：培养温度37℃，氨水调节pH6.8，溶氧不低于30％，罐压0.05MPa，接种量5％。
流加策略：控制葡萄糖浓度为1.0％，溶氧30％，pH控制6.8。
诱导方法：当菌液OD值达到72.0时，加入IPTG至终浓度0.5mM诱导表达5h后离心收获菌体，低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为1.75g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：胰蛋白胨1.0g/L，酵母提取物20.0g/L，葡萄糖30.0g/L，氯化钠2.0g/L，磷酸氢二钾8.7g/L，磷酸二氢钠4.2g/L，硫酸铵5.6g/L，明胶(明胶水解物)10.0g/L，七水硫酸镁2.5g/L，EDTA 1.0g/L，六水三氯化铁100.0mg/L，四水硫酸锰20.0mg/L，硫酸锌8.0mg/L，硼酸2.5mg/L，钼酸钠2.5mg/L，氯化钴2.5mg/L，氯化铜2.5mg/L。
对比例2
基于实施例1的基础上，设置为以下参数：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为13mL/h/L；
A2、待OD增至52时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为18mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3mL/h/L；
A3、待OD增至72时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液1750mL,补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为13mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为1mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.5，罐压0.08MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为1.81g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵2.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，一水柠檬酸1.0g/L，七水硫酸镁0.4g/L，一水葡萄糖20g/L,七水硫酸亚铁50mg/L，五水硫酸锰2.5mg/L，七水硫酸11.25mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙10mg/L，硼砂1.15mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖600g/L，七水硫酸镁1.5g/L，脯氨酸4.0g/L，丙氨酸4.0g/L，七水硫酸亚铁28mg/L，五水硫酸锰2.0mg/L，七水硫酸锌6.0mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙4.0mg/L，硼砂0.3mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖50g/L。
对比例3
基于实施例1的基础上，设置为以下参数：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为13mL/h/L；
A2、待OD增至52时，加大补料培养基补料速率，同时开始流加乳糖溶液，补料培养基的流加速率为18mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3mL/h/L；
A3、待OD增至72时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液1750mL,补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A4、在诱导期缓慢加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为13mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为1mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.5，罐压0.08MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为1.90g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵2.5g/L，磷酸二氢钾8.0g/L，一水柠檬酸1.0g/L，七水硫酸镁0.4g/L，甘油20g/L,七水硫酸亚铁50mg/L，五水硫酸锰2.5mg/L，七水硫酸11.25mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙10mg/L，硼砂1.15mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：甘油600g/L，七水硫酸镁1.5g/L，脯氨酸4.0g/L，丙氨酸4.0g/L，七水硫酸亚铁28mg/L，五水硫酸锰2.0mg/L，七水硫酸锌6.0mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙4.0mg/L，硼砂0.3mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖50g/L。
对比例4
基于实施例1的基础上，设置为以下参数：
A1、将大肠杆菌工程菌按照5％的接种量接种于含250L发酵培养基的500L发酵罐中培养，温度37℃，氨水调节pH为6.8，罐压0.05MPa，溶氧不低于30％，待溶氧大幅度回升后补加补料培养基，补料培养基的流加速率为13mL/h/L；
A2、待OD增至52时，加大补料培养基补料速率，补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A3、待OD增至72时，一次加入适量乳糖溶液开始诱导，同时流加补料培养基继续培养，加入乳糖溶液1750mL,补料培养基的流加速率为18mL/h/L；
A4、在诱导期流加补料培养基至发酵结束,补料培养基的流加速率为13mL/h/L；温度34℃，氨水调节pH为6.5，罐压0.08MPa，溶氧不低于30％，诱导5h，大肠杆菌菌体OD不再增加，镜检菌体衰老，整个发酵过程结束,低温超声破胞后经SDS-PAGE检测蛋白含量为1.93g/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵2.5g/L；磷酸二氢钾8.0g/L；一水柠檬酸1.0g/L；七水硫酸镁0.4g/L；一水葡萄糖5g/L,甘油15g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，五水硫酸锰2.5mg/L，七水硫酸11.25mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙10mg/L，硼砂1.15mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖200g/L；甘油400g/L；七水硫酸镁1.5g/L，脯氨酸4.0g/L，丙氨酸4.0g/L，七水硫酸亚铁28mg/L，五水硫酸锰2.0mg/L，七水硫酸锌6.0mg/L，五水硫酸铜5mg/L，二水氯化钙4.0mg/L，硼砂0.3mg/L，钼酸铵0.5mg/L。
发酵罐中使用的大肠杆菌工程菌乳糖培养基包括以下浓度的组分：乳糖50g/L。
实验例1
测定重组弹性蛋白细胞毒性
用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将培养的小鼠成纤维细胞L929稀释成1×103/mL的单细胞悬液；取96孔培养板，每孔接种100μL的细胞悬液，置含5％CO2培养箱中，37℃培养24h；弃去原培养液，加入100μL重组弹性蛋白和水解弹性蛋白(sigma)，分别设置100mg/L，500mg/L，1000mg/L，5000mg/L蛋白溶液，同时设置阴性对照组(单纯细胞培养液)和阳性对照组(4％DMSO)，每组8孔；将培养板移入37℃、5％CO2培养箱中，96小时后取出培养板，每孔再加入MTT(噻唑蓝)50μL，继续在37℃条件下培养2h，吸弃液体，立即加入二甲基亚砜(每孔150μL)，室温放置并轻轻震荡10～15min；选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，计算细胞相对增殖率：
RGR(％)＝(实验组吸收值/阴性对照组吸收值)×100％
结果如图3所示。
由图3可知，不同浓度的重组弹性蛋白体系下细胞相对增殖率均大于100％，且显著高于水解弹性蛋白的增殖率，细胞毒性为0级，生物相容性良好。
实验例2
按照常规方法，取实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4得到的溶液，进行蛋白凝胶电泳实验，检测发酵重组弹性蛋白生产水平(发酵生产水平(g/L·h)＝重组弹性蛋白的浓度(g/L)/发酵周期(h))，结果如表1所示。破胞效果如图1所示，重组弹性蛋白纯化效果如图2所示：
表1重组弹性蛋白生产水平
由表1可知，实施例1～5与对比例1-4相比，实施例1～5采用甘油、葡萄糖复合培养、诱导，复合氨基酸及无机盐离子配方及分阶段乳糖诱导，促进了菌体的生长和目标蛋白的表达，实施例1～5发酵生产水平可达0.117g/L/h，比对比例提高20％以上；对比例1采用传统蛋白胨/酵母粉配方，IPTG诱导，对比例2采用单纯葡萄糖作为碳源，对比例3采用单纯甘油作为碳源，葡萄糖作为碳源在大肠杆菌生长过程中易产有机酸抑制菌体生长、蛋白表达；甘油粘稠，易造成氧传递受阻，利用率低，导致大肠杆菌生长缓慢，影响蛋白表达。本发明采用合适比例的葡萄糖与甘油复配作为碳源，在大肠杆菌生长过程中避免过多的有机酸生成，同时不影响菌体的生长速率，无机盐离子促进碳源利用，复合氨基酸、其他复合离子既可促进菌体生长又促进了蛋白的表达；对比例4则采用乳糖单次诱导，通过生产水平对比可知，分阶段乳糖诱导远高于单次乳糖诱导。综合来说本发明提供的发酵方法，实施例1～5与对比例1-4相比，所得的重组弹性蛋白的浓度较高，发酵周期较短，重组弹性蛋白的发酵生产水平较高。另外，在发酵过程中，乳糖及补料培养基的流加速率过低则生长缓慢、影响表达，过快则导致有机酸积累进而抑制菌体生长和蛋白表达，破胞过程中利用目标蛋白本身热变相的性质，采用盐离子、加热使目标蛋白析出而其他蛋白析出极少量、利于纯化，提高了蛋白纯度。
由图1可知(图中1中泳道1为Marker，泳道2、3、4、5、6为浓度分别是0.1mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL的重组弹性蛋白拟标准品溶液，7为实施例1中500L发酵罐放罐采用超声破胞样稀释20倍溶液，8为实施例1中500L发酵罐破胞样稀释20倍溶液，上样量均为10uL),以重组弹性蛋白浓度为横坐标，以其灰度值为纵坐标(见表2)，经软件计算，线性回归(y＝25265x+1815.5，R2＝0.9993)，重组弹性蛋白500L发酵罐发酵产量为2.25g/L，破胞后为2.21g/L,破胞完全率可达98％，完全可以满足工业化生产条件。
表2重组弹性蛋白破胞效果
| 泳道 | 蛋白浓度(mg/mL) | 灰度值 |
| 2 | 0.1 | 4296.648 |
| 3 | 0.15 | 5681.355 |
| 4 | 0.2 | 6873.305 |
| 5 | 0.25 | 8075.134 |
| 6 | 0.3 | 9415.962 |
| 7 | 2.25 | 4656.305 |
| 8 | 2.21 | 4606.234 |
根据图2，图中泳道1为Marker，泳道2为重组弹性蛋白纯化B1样品，泳道3为重组弹性蛋白纯化B2样品，泳道3为重组弹性蛋白纯化B3样品，上样量均为10uL,由图3可知，采用本发明提供的纯化方法可简单、高效实现重组弹性蛋白的纯化，有效去除了杂蛋白，同时实现了内毒素物质的去除，最终产品纯度经灰度分析纯度可达95％以上，内毒素可控制在5～10EU/mL，操作简单，极大地节约纯化成本，同时低内毒素水平也加大了产品可使用范围。
综上，本申请提供的一种重组弹性蛋白生产工艺，其使用与传统改良LB培养基完全不同的发酵培养基，且在发酵过程中，使用甘油、葡萄糖混合碳源及氨基酸、微量元素补料培养，在对数生长中期缓慢加入乳糖自诱导，在对数生长的中后期一次加入适量乳糖提高诱导压力，在诱导期缓慢加入乳糖保持诱导压力，有效提高重组弹性蛋白发酵表达量，且结合重组弹性蛋白热变相的特性，开发出不需要高压均质机的破胞工艺，不需要复杂且冗长的纯化除内毒后处理工艺。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、发酵：使用特异性发酵培养基培养工程菌种，并在培养过程中分阶段诱导工程菌种；
S2、破胞：使用表面活性剂及盐离子进行破胞；
S3、纯化：调节pH，控制温度，并加入表面活性剂进行蛋白纯化。
2.根据权利要求1所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤S1中，还包括以下步骤：
A1、将大肠杆菌工程菌种子液接种于发酵罐中的特异性发酵培养基中培养，待溶氧大幅度回升后，流加补料培养基继续培养；
A2、当工程菌菌液OD值达到44-60时，开始补加乳糖溶液进行初步诱导，同时流加补料培养基继续培养；
A3、当工程菌菌液OD值达到65-73时，一次加入适量乳糖溶液提高诱导压力，同时流加补料培养基继续培养；
A4、在诱导期加入乳糖溶液保持诱导压力，同时流加补料培养基至发酵结束。
3.根据权利要求2所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于：所述步骤A1中，特异性发酵培养基包括以下浓度的组分：磷酸氢二铵0.5～3.5g/L，磷酸二氢钾3.0～13.5g/L，一水柠檬酸0.2～1.6g/L，七水硫酸镁0.2～1.8g/L，一水葡萄糖2～15g/L,甘油10～20g/L，七水硫酸亚铁30～70mg/L，五水硫酸锰1～5mg/L，七水硫酸锌8～15mg/L，五水硫酸铜3～10mg/L，二水氯化钙5～20mg/L，硼砂0.5～2mg/L，钼酸铵0.1～2mg/L。
4.根据权利要求2所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤A1中，补料培养基包括以下浓度的组分：一水葡萄糖150～300g/L，甘油300～600g/L，七水硫酸镁0.1～4.5g/L，复合氨基酸1～6.0g/L，七水硫酸亚铁10～50mg/L，五水硫酸锰0.5～3mg/L，七水硫酸锌2～10mg/L，五水硫酸铜1～8mg/L，二水氯化钙2～10mg/L，硼砂0.1～1mg/L，钼酸铵0.1～1mg/L。
5.根据权利要求2所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于：所述步骤A2中，乳糖溶液包括以下浓度的组分：乳糖40-80g/L。
6.根据权利要求2所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于：所述步骤A1补料培养基的流加速率为10～15mL/h/L，所述步骤A2中补料培养基的流加速率为15-20mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为3～5mL/h/L，所述步骤A3中补料培养基的流加速率为15-20mL/h/L，乳糖溶液的流加量为5-12.5mL/L，所述步骤A4中补料培养基的流加速率为10-15mL/h/L，乳糖溶液的流加速率为1-2mL/h/L。
7.根据权利要求2所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：发酵温度34～37℃，氨水调节pH为6.5～7.0，溶氧不低于30％，罐压0.04～0.08MPa。
8.根据权利要求1所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤S2中，还包括如下步骤：
B1、发酵结束后离心进行固液分离；
B2、将菌体沉淀复溶至放罐体积的0.8-1.5倍，调节pH2～5，加入氯化钠、EDTA、表面活性剂，加热至55-85℃；
B3、调节罐压，50-150rpm持续搅拌2～5h。
9.根据权利要求1所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤S3中，还包括如下步骤：
C1、破胞液温度降至30-40℃时，加入少量盐离子，调节pH3.0-5.0，保持温度并持续搅拌，离心收取上清液；
C2、上清液调节pH3.0-5.0，加入EDTA，表面活性剂，加热至30-40℃，调节罐压，保持温度继续搅拌，离心收取上清液，重复此步骤；
C3、上清液加入无机盐，加热至38-50℃，搅拌、离心收取蛋白沉淀；
C4、蛋白沉淀复溶，超滤脱盐，经弱阴离子填料层析纯化。
10.根据权利要求9所述的重组弹性蛋白的生产方法，其特征在于：所述步骤C1中，加入的盐离子为0.1M～0.2M氯化钠；所述步骤C2中，加入1-10mM EDTA，1.5％-3％表面活性剂，通入空气至罐压为1.0-1.6Mpa，保持温度50-150rpm继续搅拌1-2h，离心收取上清液；所述步骤C3中，上清液加入10％-40％硫酸铵，50-150rpm搅拌1-3h，离心收取蛋白沉淀；所述步骤C4中，蛋白沉淀加去离子水复溶至其重量的5-10倍，经DEAE弱阴离子层析。
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