CN115820772A - 一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方 - Google Patents
一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种提高鲈鱼抗菌肽wb‑moronecidin诱导表达水平的培养基配方，培养基配方是每1000mL体系中，包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.465g，硫酸钾9g，七水硫酸镁7.45g，氢氧化钾2.065g，85%磷酸13.35mL，PTM1 4mL，氨基酸10g，余量为去离子水，上述氨基酸为谷氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸、谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸或天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸。将含有表达质粒的毕赤酵母菌接种至上述培养基中，培养24h酵母即进入快速生长期进而可以开始诱导，本发明的培养基能够明显提高鲈鱼抗菌肽wb‑moronecidin诱导表达水平，同时抑制效果明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程生物技术领域，具体地，涉及一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方。
背景技术
鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin由28个氨基酸序列组成，鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin具有广谱抗菌活性，研究发现其对维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）两种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。
毕赤酵母表达外源蛋白过程中常用的培养基是BSM通用培养基，但BSM通用培养基存在因成分不能完全满足含有目标蛋白基因质粒的毕赤酵母的生长需求，导致单一使用BSM通用培养基表达不同蛋白的效果也有所差异，此时就需针对不同蛋白进行BSM通用培养基的优化，以提高表达水平。
在进行鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin在毕赤酵母中表达实验时，发现单以BSM通用培养基表达存在酵母生长速度慢、表达水平低的问题。因此针对鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin在毕赤酵母中分泌表达的方法中，亟需对通用BSM培养基进行优化，提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin在毕赤酵母分泌表达中的表达水平。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方，该方法能够提高毕赤酵母的生长速度，提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平。
本发明的目的是通过以下方案实现的：
本发明提供一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖 20g，二水硫酸钙 0.465g，硫酸钾9g，七水硫酸镁 7.45g，氢氧化钾 2.065g，85%磷酸 13.35mL，PTM1 4mL，氨基酸 10g，余量为去离子水。
优选的，所述氨基酸为谷氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸、谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸或天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸。
本发明有益效果为：本发明的培养基配方能够明显提高毕赤酵母的生长速度，较快的进入诱导阶段，提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平且具有明显的抑菌效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方，为鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin大规模发酵提供基础。
实施例1：添加氨基酸为赖氨酸的试验
（1）.试剂与材料
葡萄糖购于临沂市兰山区丰源食品添加剂经营部；
谷氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺购于广州康荻尔生物科技有限公司；
二水硫酸钙、硫酸、五水硫酸铜、硼酸、胰蛋白胨、酵母浸膏、氢氧化钠、硫酸钾、硫酸锰、二水合钼酸钠、氨水、氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购于国药集团；
七水硫酸镁、氢氧化钾、85%磷酸、七水硫酸铁购于天津市福晨化学试剂厂；
碘化钾购于西胧科学股份有限公司；六水氯化钴购于无锡市亚泰联合化工有限公司；生物素购于生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化锌购于无锡市亚泰联合化工有限公司；一水硫酸锰购于江苏强盛功能化学股份有限公司；
（2）.培养基的配制方法
①.配制YPD基础培养基：
a：称取6g胰蛋白胨、3g酵母浸膏，加入270mL纯水溶解，用1M氢氧化钠溶液调整pH至6.0,121℃高压灭菌 20min；
b：称取20g葡萄糖，加入60mL纯水溶解后定容至100mL，108℃高压灭菌 30min，得到20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液；
c：在步骤1中所配制的溶液，缓慢加入30mL的20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液，得到基础培养基YPD。
②.配制BSM培养基：
a：称取20g葡萄糖，0.465g 二水硫酸钙，9g 硫酸钾，7.45g 七水硫酸镁，2.065g氢氧化钾，加入800 mL去离子水溶解，加入13.35mL 85%磷酸，定容至1000 mL，121℃高压灭菌20min；
b：称取3g谷氨酸，加入300 mL步骤（1）所配制的溶液中，65℃加热使其溶解，用氨水调整pH 到5.0，过0.22μm滤膜，待用；
c：配制PTM1溶液，称取6g 五水硫酸铜、0.08g 碘化钾、3g 硫酸锰、0.2g 二水合钼酸钠、0.02g 硼酸、0.5g 六水氯化钴、20g 氯化锌、65g 七水硫酸铁、0.2g 生物素、5mL 浓硫酸，加入800 mL 纯水溶解，定容至1000 mL，得到微量盐溶液PTM1；
d：取1.2 mL PTM1 加入到步骤b所配制待用的溶液中，得到BSM培养基。
（3）鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin的表达试验
①含有鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin重组表达质粒的毕赤酵母的生长期扩增
a：挑取含有表达质粒的毕赤酵母菌单菌落，接种于20 mLYPD培养基中，29℃，220rpm培养16h；
b：按1%的比例将过夜培养的菌液接种于100 mL YPD培养基中，29℃，220rpm扩大培养16h；
c：按10%的比例将二级种子液接种于300mL实施例2中配制的BSM培养基中，29℃，220rpm培养66h。结果见表1。
②含有鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin重组表达质粒的毕赤酵母的诱导期表达
a：将上述添加氨基酸的培养基分别添加甲醇、山梨醇，对重组酵母开始诱导表达。
③表达液透析
a：称取2.922g 氯化钠；16.69g 十二水磷酸氢二钠；0.5034g 磷酸二氢钠，加超纯水定容至 1L，得到透析缓冲液；
b：收集步骤（1）中6种不同氨基酸及对照组的 48h 表达液，过0.22μm 滤膜去除表达液中不溶性的大颗粒物质后，4℃环境下，缓冲液中透析12h 后，超纯水透析 12h，收集透析完成的表达液；
c：将透析完成的表达液冷冻干燥，再用无菌水溶解，得到鲈鱼抗菌肽蛋白样品。
④进行抑菌试验
a：将上述步骤得到的样品做维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogene）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）3种病原菌的平板抑菌试验，37℃培养约 16h 后取出观察抑菌圈的大小。结果见表2。
实施例2：添加氨基酸为天门冬氨酸的试验
该实施例2与实施例1不同点在于上述添加的氨基酸为天门冬氨酸，其余参照实施例1的步骤进行试验，得到结果见表1、表2。
实施例3：添加氨基酸为天门冬酰胺的试验
该实施例3与实施例1不同点在于上述添加的氨基酸为天门冬酰胺，其余参照实施例1的步骤进行试验，得到结果见表1、表2。
实施例4：添加氨基酸为谷氨酸与天门冬酰胺组合氨基酸的试验
该实施例4与实施例1不同点在于上述添加的氨基酸为谷氨酸与天门冬酰胺组合氨基酸，其余参照实施例1的步骤进行试验，得到结果见表1、表2。
实施例5：添加氨基酸为谷氨酸与天门冬氨酸组合氨基酸的试验
该实施例5与实施例1不同点在于上述添加的氨基酸为谷氨酸与天门冬氨酸组合氨基酸，其余参照实施例1的步骤进行试验，得到结果见表1、表2。
实施例6：添加天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸的试验
该实施例6与实施例1不同点在于上述添加的氨基酸为天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸，成分比例为1:1；其余参照实施例1的步骤进行试验，得到结果见表1、表2。
添加6种不同氨基酸对毕赤酵母菌生长速度影响试验数据如表1所示：
表1：添加6种不同氨基酸对毕赤酵母菌生长速度影响试验数据
由上述试验结果可以得知，生长阶段分别添加谷氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸或谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸都能够提高重组毕赤酵母生长速度，添加量都为10g/L，pH＝5.0 ,接种 10％，29℃培养 24h 即可。
表2:48h表达液的抑菌圈大小
结果显示：分别添加的谷氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸、谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸或天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸，添加谷氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸或谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸在生长阶段能够提高重组毕赤酵母的生长速度，培养24h酵母即进入快速生长期进而可以开始诱导。诱导48h后取其表达液进行抑菌试验，结果表明，生长期添加谷氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸的表达液对维氏气单胞菌（A. veronii）和单核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）抑制效果明显提高，生长期添加谷氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸、谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸或天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸的表达液对铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）的抑制效果明显提高。
Claims (1)
1.一种提高鲈鱼抗菌肽wb-moronecidin诱导表达水平的培养基配方，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.465g，硫酸钾9g，七水硫酸镁7.45g，氢氧化钾2.065g，85%磷酸13.35mL，PTM1 4mL，氨基酸10g，余量为去离子水，所述氨基酸为谷氨酸、天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸、谷氨酸和天门冬氨酸组合氨基酸或天门冬氨酸和天门冬酰胺组合氨基酸。
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