CN103980327B - 一种可用于药用注射剂的高纯海藻糖制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯海藻糖的制备方法。以食品级海藻糖为原料，通过热溶冷析结晶，除热原，除菌，乙醇结晶等步骤，获得纯度>99%的高纯度海藻糖制品。本工艺流程不需添加晶种，清洁卫生，可在GMP厂房内实现无菌生产，所得海藻糖产品无菌，细菌内毒素检查合格，可作为药用注射剂使用。

Description

一种可用于药用注射剂的高纯海藻糖制备方法

技术领域

本发明涉及一种药用注射级海藻糖的制备工艺，特别是指一种可用于药用注射剂的高纯海藻糖制备方法。

背景技术

海藻糖（trehalose）是由2个葡萄糖分子通过半缩醛羟基以α-1,1糖苷键结合的一种非还原性双糖，分子量为378.33（二水合物），水溶性好，在自然界中广泛存在于动物、植物和微生物体内。

海藻糖无毒性，结构稳定，在120℃、90min和37℃、12个月均无褐变，不被一般的酶所降解。近年来国内外的众多研究表明海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，国际上用它作为生物活性物质的稳定和保护剂，在保护基因工程酶类、各种病毒、疫苗、抗体、蛋白质因子、核酸等方面都取得了令人振奋的结果，在食品、保健品、化妆品、医药、分子生物化学和农业等领域显示了广阔的应用前景。

目前海藻糖的生产方法主要有酵母发酵提取法，淀粉酶解转化法等：

CN1219071C 公开了一种两步发酵法生产酵母胞外海藻糖的方法，发酵以后的海藻糖通过混合床离子交换系统进行纯化。

CN1807465A 公开了一种海藻糖的分离纯化方法，酿酒酵母发酵培养后经离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥得海藻糖纯品。所得海藻糖纯品经HPLC 检测，纯度达到98.0%。

CN102965412A公开了一种海藻糖的制备方法，它以大米为基本原料，经淀粉酶进行酶解后再用海藻酶转化成海藻糖，通过脱色、离子交换等流程获得海藻糖制品。

CN101230407A公开了一种提高海藻糖提取收率的方法，采用氢化和色谱分离的技术，将利用微生物或酶使淀粉转化得到的海藻糖与麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖的杂质进行分离，最后在结晶液中加入晶种，可获得纯度>99%的海藻糖制品。

国内现有对海藻糖制备工艺的研究，主要是以获得食品级原料为目标，主要表现为：1、所得的产品大多纯度较低（≤98%）或未体现纯度要求，无法满足药用注射剂产品对于成分纯度以及杂质含量的严格要求；少数能够获得99%以上产品的工艺，需要在生产过程中添加晶种，难以保证晶种的无菌，不适合作为药用注射剂产品的生产工艺。2、现有发明的工艺流程中没有涉及除菌，除热原的步骤，无法保证最终产品的无菌及细菌内毒素指标合格，不能作为药用注射剂产品的生产工艺。

发明内容

针对现有工艺技术的不足，本发明的目的是提供一种药用注射级海藻糖的制备方法，其在制备工艺流程符合药用注射剂生产要求的前提下，提高海藻糖产品的纯度；产品无菌、细菌内毒素检查合格，粒度分布均匀，性质稳定，可作为药用注射剂使用。

为实现上述目的，本发明的解决方案是：

一种药用注射级海藻糖的制备方法，其步骤包括：

步骤1、热溶冷析结晶：往反应釜内加入注射用水，加热，加入海藻糖原料，使之终浓度为1.5-3.0kg/L；降温至室温让晶体析出完全后获得一次结晶固体；

步骤2、除热原：将一次结晶的固体溶解于注射用水中去除热原；

步骤3、除菌：去除热原后的海藻糖溶液除菌；

步骤4、乙醇结晶：将除菌后的海藻糖溶液移入已灭菌的反应釜中，加入过滤除菌后的乙醇；让晶体析出完全后获得二次结晶固体；

步骤5、分装、包装：二次结晶的海藻糖固体进行无菌分装及包装，获得最终产品。

所述海藻糖原料纯度大于等于70%。

所述步骤1热溶冷析结晶方法为：注射用水加热至80℃，按1.5-3.0kg/L的量加入海藻糖原料，充分搅拌溶解，以1-3℃/min的速率降温析晶，过滤，减压干燥获得一次结晶固体。

所述步骤2除热原方法为超滤法，采用的超滤膜截留分子量为3000-5000道尔顿。

所述步骤3除菌方法为2道0.22µm PES或PVDF超滤膜过滤。

所述步骤4海藻糖乙醇结晶方法为：一次结晶的海藻糖固体配制成浓度0.3-1.5kg/L的溶液，搅拌状态下，以0.5-4L/min的速率加入乙醇，使其终浓度为80%-92%，过滤，减压干燥获得二次结晶固体；

所述步骤1、步骤4减压干燥条件为：干燥温度：55~65℃，真空度：0.09MPa以上，干燥时间：10~40h。

所述海藻糖在药用注射剂中所起作用包括作为活性成分或作为辅料使用。

有益效果

（1）本发明的最大特点为不加入晶种，避免晶种引入微生物及热原，制备工艺符合药用注射剂产品的生产要求。

（2）热溶冷析法是利用溶质在不同温度条件下的溶解度差异进行结晶的一种常用方法，并且在结晶过程中，含量较低的杂质较含量高的目标产物更不易达到饱和析出。本发明利用海藻糖与杂质（主要为葡萄糖等杂糖）在80℃及室温条件下溶解度差（分别约为300和200，单位：g/100gH₂0），通过热溶冷析法对目标产物海藻糖进行第一步的纯化。经研究，确定了海藻糖一次结晶的最佳工艺条件，海藻糖结晶后纯度可达95%以上，回收率可达70%以上。

（3）经过一次结晶后的海藻糖，其纯度仍不能达到《中国药典》对药用注射剂产品杂质含量相关要求。为近一步提高纯度，本发明采用了乙醇结晶法作为二次结晶的工艺，利用海藻糖在乙醇中的溶解度小于杂质（主要为葡萄糖等杂糖）的特点，对目标产物海藻糖进行进一步纯化。此外，热溶冷析法结晶的海藻糖，容易结成块状，均匀度无法满足药用注射剂产品的要求，采用乙醇结晶后的产品，粒度均匀，符合《中国药典》的相关要求。经研究，确定了乙醇结晶法的最佳工艺条件，最终产品经检验，纯度>99%。

（4）热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质，其进入血液会引起严重的不良反应。因此，药用注射剂产品必须经过热原的主要成分——细菌内毒素的检查合格后才能使用。一般热原的去除方法有活性炭吸附法和超滤法两种，但是活性炭吸附法有可能会引入新的杂质，也容易吸附目标产物，加大损失率；而超滤法是利用热原（分子量一般大于6000道尔顿）和目标产物之间的分子量差异，利用膜过滤的方式加以除去。本发明经研究，发现截留分子量3000-5000道尔顿的超滤膜最适宜进行热原的去除。经检测，最终产品的细菌内毒素含量<0.10EU/mg，符合《中国药典》的相关规定。

（5）细菌等微生物活体通过注射进入体内也会带来严重的安全隐患，甚至危及生命。《中国药典》规定药用注射剂产品必须达到无菌的要求。要到这一要求，可以对终端产品进行高温或辐照杀菌，也可以在制备过程中采用无菌生产方法。固体粉末类产品传热不均，一般不采用高温方式进行终端灭菌，而高剂量辐照杀菌会引起糖类等生物样品变色，也不宜作为此类产品的终端灭菌方式。本发明经研究，建立了海藻糖溶液经无菌过滤后进行无菌结晶及无菌分装的工艺路线。经检测，产品无菌检查合格，符合《中国药典》的相关要求。

（6）由于在结晶过程中采用了乙醇，按《中国药典》的相关要求，乙醇属于ICH规定的三类溶剂，在药用注射剂中的使用限度为≤5000ppm，因此需要通过干燥法对其进行去除，并对其残留量进行检测。海藻糖经过结晶后为2水合物，干燥时不能采用太高的温度，否则会引起其不均匀地失去结晶水，改变其性质，同时，干燥时间也不能太短，否则会照成产品中溶剂去除不彻底。本方面经过研究，发现减压干燥法最适合海藻糖晶体的干燥，在洁净度为A级的GMP环境下，经过55~65℃,10~40h的干燥，最终获得的产品粒度均匀，成松散的粉末状。经检测，产品中乙醇残留量<100ppm，无菌检测合格，符合《中国药典》的相关要求。

具体实施方式

本发明揭示了一种药用注射级海藻糖的制备方法，其步骤包括：

（1）热溶冷析结晶：在洁净度为C级的GMP环境下，往夹套反应釜内加入注射用水，通过外循环水加热至80℃，在搅拌状态下缓慢加入海藻糖原料，使之终浓度为1.5-3.0kg/L；充分溶解并搅拌均匀后，对夹套水制冷，以1-3℃/min的速率降温至室温；充分搅拌让晶体析出完全后，卸料，过滤，减压干燥获得一次结晶固体；

（2）超滤除热原：在洁净度为C级的GMP环境下，将一次结晶的固体溶解于注射用水中，配制成0.3-1.5kg/L的溶液；以截留分子量为3000-5000道尔顿的超滤膜去除热原；

（3）超滤除菌：去除热原后的海藻糖溶液，经过2道0.22µm PES或PVDF超滤膜过滤除菌；除菌后的溶液，应置于洁净度为B级的GMP环境下；

（4）乙醇结晶：将溶液移入已灭菌的反应釜中，以0.5-4L/h的速率缓慢加入过滤除菌后的乙醇，使其终浓度为80%-92%；充分搅拌让晶体析出完全后，卸料，过滤，减压干燥获得二次结晶固体；

（5）分装、包装：二次结晶的海藻糖固体在洁净度为A级的GMP环境下进行无菌分装及包装，获得最终产品。

因此，本发明采用了两次结晶法提高海藻糖的纯度，采用超滤法去除细菌内毒素，采用无菌过滤法除菌。

实施例1：

本实例制备海藻糖的方法具体包括如下步骤：

（1）在夹套反应釜内，注入5L注射用水，加热至80度；（2）加入纯度75%的海藻糖原料8.0kg，以150rpm的转速搅拌至完全溶解；（3）对反应液按1.5-2℃/min的速率进行降温，25-40min内降温至25℃；（4）搅拌状态下卸料，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.09MPa，干燥20h；（5）干燥后得晶体4.2kg，室温下溶解于12L注射用水中，配制成0.35kg/L的溶液，5000kDa超滤膜去除细菌内毒素；（6）超滤液再以两道0.22µm滤膜除菌，加入反应釜中；（7）150rpm的转速搅拌下，以1L/min的速率，加入68L无水乙醇，1h左右加完，搅拌30min至晶体完全析出；（8）搅拌状态下卸料，静置10min分钟，移去上层乙醇溶液液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步去除乙醇后，分装于托盘，置真空干燥箱，温度60℃、真空度0.09MPa，干燥12h；（9）干燥后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品3.9kg。产品经检测，纯度>99.1%，无菌，细菌内毒素检查合格。

结晶后回收的乙醇，加入氧化钙，充分反应后减压蒸馏，获得99.2%的乙醇，收集后可回用于二次结晶。

实施例2：

本实例制备海藻糖的方法具体包括如下步骤：

（1）在夹套反应釜内，注入10L注射用水，循环加热至80度；（2）加入纯度85%的海藻糖原料25kg，浓度2.5kg/L，以150rpm的转速搅拌至完全溶解；（3）对反应液按2.0-2.5℃/min的速率进行降温，15-25min内降温至25℃；（4）搅拌状态下卸料,静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.09MPa，干燥20h；（5）干燥后得晶体16.3kg，室温下溶解于12L注射用水中，配制成1.36kg/L的溶液，5000kDa超滤膜去除细菌内毒素；（6）超滤液再以两道0.22µm滤膜除菌，加入反应釜中；（7）150rpm的转速搅拌下，以2L/min的速率，加入108L无水乙醇，1h左右加完，搅拌30min至晶体完全析出；（8）搅拌状态下卸料，静置10min分钟，移去上层乙醇溶液液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步去除乙醇后，分装于托盘，置真空干燥箱，温度60℃、真空度0.09MPa，干燥24h；（8）干燥后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品15.6kg。产品经检测，纯度>99.2%,无菌，细菌内毒素检查合格。

结晶后回收的乙醇，加入氧化钙，充分反应后减压蒸馏，获得99.2%的乙醇，收集后可回用于二次结晶。

实施例3：

本实例制备海藻糖的方法具体包括如下步骤：

（1）在夹套反应釜内，注入10L注射用水，循环加热至80度；（2）加入纯度96%的海藻糖原料20kg，以150rpm的转速搅拌至完全溶解；（3）对反应液按2.0-2.5℃/min的速率进行降温，20-30min内降温至25℃；（4）搅拌状态下卸料,静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.09MPa，干燥20h；（5）干燥后得晶体14.2kg，室温下溶解于28L注射用水中，配制成0.51kg/L的溶液，5000kDa超滤膜去除细菌内毒素；（6）超滤液再以两道0.22µm滤膜除菌，加入反应釜中；（7）150rpm的转速搅拌下，以1.8L/min的速率，加入252L无水乙醇，2.5h左右加完，搅拌30min至晶体完全析出；（8）搅拌状态下卸料，静置10min分钟，移去上层乙醇溶液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步去除乙醇后，分装于托盘，置真空干燥箱，温度60℃、真空度0.09MPa，干燥20h；（8）干燥后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品13.5kg。产品经检测，纯度>99.6%,无菌，细菌内毒素检查合格。

结晶后回收的乙醇，加入氧化钙，充分反应后减压蒸馏，获得99.2%的乙醇，收集后可回用于二次结晶。

Claims (5)

1.一种药用注射级海藻糖的制备方法，其步骤包括：

步骤1、热溶冷析结晶：往反应釜内加入注射用水，加热至80℃，按1.5-3.0kg/L的量加入海藻糖原料，充分搅拌溶解，以1-3℃/min的速率降温析晶，过滤，减压干燥获得一次结晶固体；

步骤2、除热原：将一次结晶的固体溶解于注射用水中去除热原；

步骤3、除菌：去除热原后的海藻糖溶液除菌，其为2道0.22µm PES或PVDF超滤膜过滤；

步骤4、乙醇结晶：将除菌后的海藻糖溶液配制成浓度0.3-1.5kg/L移入已灭菌的反应釜中，搅拌状态下，以0.5-4L/min的速率加入乙醇，使其终浓度为80%-92%，过滤，减压干燥获得二次结晶固体；

步骤5、分装、包装：二次结晶的海藻糖固体进行无菌分装及包装，获得最终产品。

2.如权利要求1所述的药用注射级海藻糖的制备方法，其特征在于：所述海藻糖原料纯度大于等于70%。

3.如权利要求1所述的药用注射级海藻糖的制备方法，其特征在于：所述步骤2除热原方法为超滤法，采用的超滤膜截留分子量为3000-5000道尔顿。

4.如权利要求1所述的药用注射级海藻糖的制备方法，其特征在于：所述减压干燥条件为：干燥温度：55~65℃，真空度：0.09MPa以上，干燥时间：10~40h。

5.如权利要求1所述的药用注射级海藻糖的制备方法，其特征在于：所述海藻糖在药用注射剂中所起作用包括作为活性成分或作为辅料使用。