CN104592316B - 一种供注射用海藻糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种供注射用海藻糖的制备方法，具体包括以下步骤：以经过离子交换后的海藻糖粗品为原料，先用乙醇粗结晶，再经高温高压灭菌除热原，最后通过真空降温结晶，获得纯度大于99%的可供注射用的高纯度海藻糖产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种供注射用的海藻糖制备方法。
背景技术
海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，无毒，结构稳定，具有化学惰性，在120℃、90min 和37℃、12 个月的储存条件下均无褐变，且一般只对海藻糖酶有响应，是一种应急代谢产物。近年来发现海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，而且海藻糖在科学界有“生命之糖”的美誉，广泛存在于动植物和微生物体内。它的这种性质使其在食品、保健品、化妆品、医药、分子生物等领域有广阔的应用前景。
CN1219071C 公开了一种两步发酵法生产酵母胞外海藻糖的方法，发酵以后的海藻糖通过混合床离子交换系统进行纯化。
CN1807465A 公开了一种海藻糖的分离纯化方法，酿酒酵母发酵培养后经离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥得海藻糖纯品。所得海藻糖纯品经HPLC 检测，纯度达到98.0%。
申请人在经过大量检索后，发现与本发明最接近的现有技术为CN 103980327 A，该发明公开了一种药用注射剂的高纯海藻糖制备方法，通过热溶冷析结晶、除热原、除菌、乙醇结晶获得纯度＞ 99%，可作为药用注射剂使用的海藻糖。该发明是利用超滤法和超膜过滤法进行除菌除热原来获得可供注射用的海藻糖，然而超滤和超膜过滤法既耗时，且易堵塞，给实际操作带来不便。
综合目前对海藻糖制备工艺的研究，大多目的都是为了获得食品级海藻糖，而对于供注射用海藻糖的研究还比较少。然而，两者的主要区别就在于供注射用的海藻糖涉及到除菌除热原这一关键步骤。
发明内容
针对现有工艺技术的不足，本发明的目的是提供一种供注射用海藻糖的制备方法。
为实现上述目的，本发明的具体方案为：
一种供注射用海藻糖的制备方法，其步骤包括：
（1）乙醇结晶：将经过离子交换后的海藻糖粗品加入到体积分数为60%-80%的乙醇溶液中，使其完全析出晶体，过滤，获得粗结晶海藻糖。
（2）除菌除热原：将纯化水加热到95℃-120℃后，再加入粗结晶的海藻糖进行溶解，使海藻糖溶液的最终浓度为70%-90%，然后将压力控制在2Mpa -4Mpa，保持20-60min。
（3）纯化结晶：将高温高压灭菌除热原后的料液经搅拌均匀后，经冷却至海藻糖晶体全部析出，过滤即得海藻糖晶体；
（4）减压干燥分装包装：将析出的晶体减压干燥后进行无菌分装及包装，获得最终产品。
减压干燥条件为：干燥温度：50~65℃，真空度：-0.06Mpa以上，干燥时间：10~30h。
步骤（3）的冷却结晶过程如下：以3.5-4.5℃/min的速率降至80℃，然后在80℃下再保持5-15min，再以1-1.5℃/min的速率降至60℃，再以2-2.5℃/min的速率降温至25℃。
纯化结晶步骤中所述的搅拌速度为100-150r/min。
进一步，所用的海藻糖粗品为经过离子交换后除去大量杂质的原料，纯度大于60%。
本发明的有益效果
（1）本发明的最大特点为除菌除热原一步完成，缩短了工艺流程，
提高了效率，降低了生产成本，而且高温高压后的液体经过降温减压结晶可直接获得终产品。由于热溶冷析结晶法的海藻糖容易结成块状，无法满足药用注射的要求，而本申请虽然在最后的结晶步骤中采用热溶冷析结晶法，但是经过仔细摸索各种条件，克服了上述缺陷，获得了粒度均匀、颗粒较小的粉体。
（2）本发明首次公开报道了利用高温高压方法对海藻糖进行灭菌除
热原处理，利用纯化水溶解粗结晶的方式，克服、避免了在高温高压条件下使用乙醇溶剂对海藻糖进行重结晶时可能会引发的安全隐患。
（3）制备工艺符合药用注射剂产品的生产要求，并且避免了由晶种
引入新的微生物及热原。
（4）为进一步提高产品纯度，结合高温高压对溶剂的要求，本发明
采用了纯化水结晶法作为二次结晶工艺，利用热溶冷析的原理，对目标产物海藻糖进行进一步纯化，经检验，纯度可达到99%以上。
（5）本发明所制得的海藻糖产品的细菌内毒素含量<0.10EU/mg，且
产品无菌检查合格，符合《中国药典》的相关规定。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，这些实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为65%的粗品25kg，然后再加入体积分数为60%的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体17.5kg。
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入13L纯化水升温至95℃，然后加入乙醇结晶后的晶体17.5kg，搅拌下溶解，压力控制在2Mpa下保持60min。
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以4℃/min的速率由95℃降至80℃，然后在80℃下再保持10min，再以1.2℃/min的速率降至60℃，再以2.2℃/min的速率降温至25℃，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.06MPa，干燥20h）干燥后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品16.8kg。产品经检测，纯度>99%，无菌，细菌内毒素检查合格。
实施例2
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为80%的粗品45kg，然后再加入体积分数为80%的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体38.2kg。
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入20L纯化水升温至120℃，然后加入乙醇结晶后的晶体38.2kg，搅拌下溶解，压力控制在3Mpa,保持30min。
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以4℃/min的速率由120℃降至80℃，然后在80℃下再保持12min，再以1.2℃/min的速率降至60℃，再以2.3℃/min的速率降温至25℃，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度50℃、真空度0.06MPa，干燥30h后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品36.5kg。产品经检测，纯度>99%，无菌，细菌内毒素检查合格。
实施例3
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为90%的粗品35kg，然后再加入体积分数为70%的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体28.7kg。
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入15L纯化水升温至100℃，然后加入乙醇结晶后的晶体28.7kg，搅拌下溶解，压力控制在4Mpa,保持20min。
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以4℃/min的速率由100℃降至80℃，然后在80℃下再保持11min，再以1.3℃/min的速率降至60℃，再以2.1℃/min的速率降温至25℃，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h、后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品26.8kg。产品经检测，纯度>99%，无菌，细菌内毒素检查合格。
对比例1
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为65%的粗品25kg，然后再加入体积分数为60%的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体17.5kg。
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入13L纯化水升温至95℃，然后加入乙醇结晶后的晶体17.5kg，搅拌下溶解，压力控制在2Mpa下保持60min。
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以2-2.5℃/min的速率降温至25℃，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.06MPa，干燥20h）干燥后取出晶体。
对比例2
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为65%的粗品25kg，然后再加入体积分数为60%的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体17.5kg。
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入13L纯化水升温至95℃，然后加入乙醇结晶后的晶体17.5kg，搅拌下溶解，压力控制在2Mpa下保持60min。
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以2.5℃/min的速率由95℃降至80℃，然后在80℃下再保持10min，再以2.1℃/min的速率降至60℃，再以2.2℃/min的速率降温至25℃，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.06MPa，干燥20h）干燥后取出晶体。
对比例3
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为65%的粗品25kg，然后再加入体积分数为60%的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体17.5kg。
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入13L纯化水升温至95℃，然后加入乙醇结晶后的晶体17.5kg，搅拌下溶解，压力控制在2Mpa下保持60min。
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以3℃/min的速率由95℃降至80℃，然后在80℃下再保持10min，再以1.5℃/min的速率降至60℃，再以2.5℃/min的速率降温至25℃，静置10min 分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.06MPa，干燥20h）干燥后取出晶体。
将实施例1以及对比例1-3的晶体分别过80目筛，以测定过80目筛的重量百分比X，X=过80目筛的重量/总重量*100%，并测定含水量，具体结果见表1。
表1 晶体的粒度以及含水量
| 过80目筛的重量百分比（%） | 含水量（%） | |
| 实施例1 | 81.2% | 9.8% |
| 对比例1 | 40.9% | 20.2% |
| 对比例2 | 53.2% | 16.9% |
| 对比例3 | 52.2% | 17.8% |
通过大量的实验摸索发现，采用本发明的结晶的方法克服了超滤法和超膜过滤法既耗时，且易堵塞，实际操作带来不便的缺点，同时又克服了用水热溶冷析结晶获得的晶体易结块的缺点。因而，本发明的方法降低了成本，也使制备的海藻糖颗粒细、均匀，并能适于注射。
Claims (3)
1.一种供注射用海藻糖的制备方法，其特征在于，其步骤包括：
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为65％的粗品25kg，然后再加入体积分数为60％的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体17.5kg；
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入13L纯化水升温至95℃，然后加入乙醇结晶后的晶体17.5kg，搅拌下溶解，压力控制在2Mpa下保持60min；
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以4℃/min的速率由95℃降至80℃，然后在80℃下再保持10min，再以1.2℃/min的速率降至60℃，再以2.2℃/min的速率降温至25℃，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度60℃、真空度0.06MPa，干燥20h)干燥后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品16.8kg；产品经检测，纯度>99％，无菌，细菌内毒素检查合格。
2.一种供注射用海藻糖的制备方法，其特征在于，其步骤包括：
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为80％的粗品45kg，然后再加入体积分数为80％的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体38.2kg；
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入20L纯化水升温至120℃，然后加入乙醇结晶后的晶体38.2kg，搅拌下溶解，压力控制在3Mpa,保持30min；
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以4℃/min的速率由120℃降至80℃，然后在80℃下再保持12min，再以1.2℃/min的速率降至60℃，再以2.3℃/min的速率降温至25℃，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度50℃、真空度0.06MPa，干燥30h后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品36.5kg；产品经检测，纯度>99％，无菌，细菌内毒素检查合格。
3.一种供注射用海藻糖的制备方法，其特征在于，其步骤包括：
乙醇结晶：室温下，往反应釜内加入海藻糖纯度为90％的粗品35kg，然后再加入体积分数为70％的乙醇100L，以150r/min的速度搅拌30min-50min至晶体完全析出，搅拌下卸料，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h，得晶体28.7kg；
除菌除热原：于高温高压反应釜内加入15L纯化水升温至100℃，然后加入乙醇结晶后的晶体28.7kg，搅拌下溶解，压力控制在4Mpa,保持20min；
冷却结晶：经过除菌除热原后降到标准大气压的料液在无菌条件下卸料，然后在150r/min的搅拌速度下以4℃/min的速率由100℃降至80℃，然后在80℃下再保持11min，再以1.3℃/min的速率降至60℃，再以2.1℃/min的速率降温至25℃，静置10min分钟，移去上层结晶母液，晶体沉淀经砂芯漏斗过滤进一步除水后，分装于托盘，置真空干燥箱温度65℃、真空度0.06MPa，干燥10h、后取出晶体，分装后无菌包装，共得产品26.8kg；产品经检测，纯度>99％，无菌，细菌内毒素检查合格。
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