CN1342754A - 一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺。该工艺是在现有工艺中的沉淀步骤中加入氧化锌参与溶菌酶的沉淀,这样就可解决多年来人们单纯使用硫酸铵沉淀溶菌时,沉淀速度慢及沉淀不完全的问题,同时可提高溶菌酶的活性,通过该工艺可使溶菌酶的沉淀速度提高6—12倍。

Description

一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺

本发明涉及一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖蛋白水解酶，色白、鸡蛋清中含量最为丰富，其分子量为14388，结晶形状随结晶条件而异，是由129个安基酶组成的，碱性球蛋白，一种罕见的极其稳定的蛋白质。溶菌酶的最适合PH值为6.6，等电点为4.60，溶菌酶是一种国内外很紧俏的生化物质，广泛用于医药、化工、食品等行业，在医药上，溶菌酶可水解细菌细胞壁，所以具有抗炎作用并保护机体不受感染，在化工上可作多种生产原料的中间体应用，在食品上可在用于抗腐保鲜，尤其重要的是近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶，随着生物工程的发展提取溶菌酶具有重要的战略意义。现有的用鸡蛋提取溶菌的工艺如下：

1、取新鲜或冷冻蛋清，除去杂质(冷冻蛋清让其自然融化)，将处理过的蛋清移入搪瓷桶里，在搅拌条件下按15％加入已处理好的724型离子交换树脂，使树脂全部悬浮在蛋清中，于5-15℃搅拌吸附6小时，阴凉处静置过夜，待分层后弃去上清液，下层沉淀用树脂反复冲洗几次，除去蛋白，最后滤干树脂，移入另一搪瓷桶。

2、洗脱：在树脂中加入等体积PH值6.5，0.15摩尔/升磷盐缓冲液，搅拌20分钟，弃去缓冲液，按同法再处理一次，最后将除去杂物的树脂加入1倍量浓度为10％的硫酸铵溶液，搅拌洗脱1小时，滤出并收集洗脱液，按上法再收集一次合并二次洗脱液放入沉淀缸中。

3、沉淀：在沉淀缸中按洗脱液体积分别加入32％的固体硫酸铵粉未，充分搅拌使其完全溶解，此时，白色沉腚产生，在冷处放置过夜，虹吸上清液，收集沉淀。

4、透析：将沉淀用适量蒸馏水全部溶解，然后装入透析袋中，在冷水透析过夜，以除去小分子硫酸铵，收集透所液。

5、盐析、干燥：将透析过夜收集在搪瓷桶中用1∶5的盐酸(即1份盐酸加5份水)调PH3.5，加入5％的氯化钠，搅均，冷处放置48小时左右，收集溶菌酶盐析物，干燥：将沉淀的盐析物倒入丙酮中，搅拌放置2小时，滤去丙酮(可回收)沉淀物干燥即得溶菌酶产品。

该工艺的第三步使用硫酸铵来沉淀溶菌酶，溶菌酶的沉淀速度很慢且存在沉淀不完的问题，从而影响溶菌酶的活性和产量。

本发明的目的是提供一种可解决溶菌酶沉淀速度慢且可提高其活性的溶菌酶提取工艺。

本发明的技术方案是：一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺，按以下步骤制备：

(1)取新鲜或冷冻蛋清，除去杂质将处理过的蛋清移入搪瓷桶里，在搅拌条件下按15％加入已处理好的724型离子交换树脂，使树脂全部悬浮在蛋清中，于5-15℃搅拌吸附6小时，阴凉处静置过夜。待分层后弃去上清液，下层沉淀用树脂反复冲洗几次，除去杂蛋白，最后滤干树脂，移入另一搪瓷桶中；

(2)洗脱：在树脂中加入等体积PH值6.5，0.15摩尔/升磷酸盐缓冲液，搅拌20分钟，弃去缓冲液，按同法再处理一次，最后将除去杂物的树脂加入1倍量浓度为10％的硫酸铵溶液，搅拌洗脱1小时，滤出并收集洗脱液按上法再收集一次，合并二次洗脱液放入沉淀缸中；

(3)沉淀：在沉淀缸中按洗脱液体分别加入13-18％的固体氧化锌粉未，13-18％的固体硫酸铵粉未，充分搅拌使其完全溶解，此时有大量白色沉淀产生，在阴冷放置过夜，虹吸上清液，收集沉淀，干燥后，即可用于食品的抗腐保鲜；

(4)透析：将沉淀用适量蒸馏水全部溶解，然后装入透析袋中，在冷水中透析过夜，以除去小分子硫酸铵及氧化锌，收集透析液；

(5)盐析、干燥：将透析液的收集在搪瓷桶中，用1∶5的盐酸调PH值3.5加入5％的氯化钠，搅均冷处放置48小时左右，收集溶菌酶盐析物，干燥，将沉淀的盐析物倒入丙酮中，搅拌放置2小时，滤去丙酮，沉淀物干燥即得溶菌酶产品。

本发明的关键是在第三步沉淀工艺中加入氧化锌使其和硫酸铵一起参与溶菌酶的沉淀，这样就可解决多年来人们单纯使用硫酸铵沉淀溶菌酶沉淀慢及沉淀不完全的问题。

下面举一例子来说明新、老工艺的不同。

按原工艺：每100毫升硫酸铵洗脱液需加32克固体硫酸铵，才能使溶菌酶盐所出来，需冷处放置24-48小时才能沉淀，且沉淀不完全。

按新工艺：每100毫升洗脱液中加16克氧化锌粉未和16克硫酸铵粉末，就能使溶菌酶产品在4小时内完全沉淀，使沉淀速度提高6-12倍，这样就能更有效地保存溶菌酶的活性，而现有工艺中由于沉淀时间太长，对溶菌酶的活力有很大影响。

从对比试验中可以看出，新工艺对溶菌酶的质量和数量的提高都是很明显的。

采用新工艺时应注意以下事项：

1、要选取新鲜或冷冻的蛋清作原料，。同时注意原料卫生，防止细菌污染变质，PH值应在8-9，不要混入蛋黄等其它杂质，防止影响收率和树脂对产物的吸附力，操作全过程尽量要在0-15℃以下进行，防止原料变质及酶失活。

2、溶菌酶的等电点PH值为4.6，在酸性条件下较耐热，因此，在生产过程中，选择加热和调节PH值至4.6左右的方法，促使80％以上的蛋白质沉淀，同时可提高酶的活力3-5倍。

3、溶菌酶洗脱峰较宽，有拖尾现象，可用三氯乙酸检查洗脱液，如沉淀不明显可另行收集，供下次洗脱用。

4、用酸碱调节PH值时，要滴加均匀，同时，立即搅拌防止局部浓度过高使酶失活。

Claims (1)

1、一种用鸡蛋提取溶菌酶的新工艺，其特征是，按以下步骤制备：

(1)取新鲜或冷冻蛋清，除去杂质将处理过的蛋清移入搪瓷桶里，在搅拌条件下按15％加入已处理好的724型离子交换树脂，使树脂全部悬浮在蛋清中，于5-15℃搅拌吸附6小时，阴凉处静置过夜。待分层后弃去上清液，下层沉淀用树脂反复冲洗几次，除去杂蛋白，最后滤干树脂，移入另一搪瓷桶中；

(2)洗脱：在树脂中加入等体积PH值6.5，0.15摩尔/升磷酸盐缓冲液，搅拌20分钟，弃去缓冲液，按同法再处理一次，最后将除去杂物的树脂加入1倍量浓度为10％的硫酸铵溶液，搅拌洗脱1小时，滤出并收集洗脱液按上法再收集一次，合并二次洗脱液放入沉淀缸中；

(3)沉淀：在沉淀缸中按洗脱液体分别加入13-18％的固体氧化锌粉未，13-18％的固体硫酸铵粉未，充分搅拌使其完全溶解，此时有大量白色沉淀产生，在阴冷放置过夜，虹吸上清液，收集沉淀，干燥后，即可用于食品的抗腐保鲜；

(4)透析：将沉淀用适量蒸馏水全部溶解，然后装入透析袋中，在冷水中透析过夜，以除去小分子硫酸铵及氧化锌，收集透析液；

(5)盐析、干燥：将透析液的收集在搪瓷桶中，用1∶5的盐酸调PH值3.5加入5％的氯化钠，搅均冷处放置48小时左右，收集溶菌酶盐析物，干燥，将沉淀的盐析物倒入丙酮中，搅拌放置2小时，滤去丙酮，沉淀物干燥即得溶菌酶产品。