CN100463682C - 鸡蛋清活性抽出物之提取及活性测定技术 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于鸡蛋清活性抽出物CEWAE的提取及活性成分的测定技术。天然鸡蛋清中的硷性环境和某些蛋白质的阻碍作用以及该活性物质的不稳定性使得鸡蛋清活性组分鲜为人们所关注。本发明通过超声波处理，稀释，酸化，电泳，硫酸铵沉淀等温和方法的有机组合及应用快速且灵敏的活性测定技术从天然鸡蛋清中提取到了多功能的生物活性抽出物。本技术也适合于提取其它禽蛋蛋清生物活性物质且无需使用有机溶剂和有害化学物质。以本技术提取的蛋清活性抽出物具有刺激神经生长，促进免疫细胞和上皮纤维细胞增殖等效果，可望用来开发一系列有助于健脑，增强免疫力，防止皮肤老化等纯天然生物药品或食品和用于科学试验的试剂等。
Description
技术领域：
生物技术，细胞培养技术，医药，保健食品。
背景技术：
鸡蛋清也称鸡蛋蛋白作为食物是可每天食用的优质蛋白质的来源。然而，遗憾的是鸡蛋清中所含的更有价值的生物活性物质及其功能一直鲜为人们所关注。那是因为天然的鸡蛋清中的碱性环境以及蛋清中某些蛋白质的阻碍作用，抑制了鸡蛋清中所含的活性物质的生物活性。而且该活性物质不稳定对热敏感，所以鸡蛋清煮熟后就不可逆地失去了其生物活性。另外缺乏快速有效生物活性物质检测方法也是制约人们发现鸡蛋清生物活性成份的重要因素之一。
凡培养过动物细胞的人都知道，在绝大部分的动物细胞培养中胎牛血清是必不可少的添加物。因为胎牛血清中含有刺激细胞增殖和发育所必需的复合成份。鸡蛋清作为鸡胚胎发育的营养供应体，可以推测鸡蛋清含有类似于血清中那些刺激细胞增殖和发育的成份。1957年Evans等首次报导说全鸡蛋抽出物中含有刺激细胞增殖成份。然而，1983年Fujii and Gospodarowicz却报导说鸡蛋黄中含有刺激细胞增长成份而鸡蛋清中含有阻碍细胞增长成份。1989年Yamada等报导说鸡蛋黄中的脂蛋白(lipoprotein)可刺激human-human hybridomaHB4C5细胞生产免疫球蛋白。
在当今的西药开发过程中，动物细胞模型已成为药物筛选所不可少的重要工具。能否建立一个合适的特定的细胞模型是关系到能否成功地筛选到某一特定药物的关键。寻找鸡蛋清中的活性成份也不例外。一个有效的提取方法还要配合一个合适的活性检测方法，二者缺一都只能得到阴性结果，而且还将弄不清是没有提取到活性成份还是检测方法不对使得到的活性成份没有被测出来。通常在动物细胞培养中都添加10％的胎牛血清，在这条件下因为胎牛血清本身极强的促细胞生长的作用会给检测带来极大的背景，而在无血清情况下培养的动物细胞其生命力是很弱的，除非被测成份对细胞生长有很强的促进作用，否则细胞很快就会死掉。故若在这两种情况下筛选活性物质一定会有很多活性物被漏筛或忽略掉，因此不能在这两种情况下寻找那些活力还较弱的未完全精制或未浓缩的活性成份。另外，要直接测定某一活性成份对细胞增殖的影响一般需要2至5天时间。这么长的时间既影响效率又不利于活性不稳定成份的筛选。
本发明通过几种温和方法的有机组合在不同的变性临界点把鸡蛋清中阻碍活性的蛋白质逐级除去后以CV-1细胞株在无血清培养液中的贴壁和伸展速率作为快速且灵敏的生物活性成份的初筛工具，再通过使用PC12，Jurket等多种哺乳动物细胞株在低浓度的胎牛血清下的进一步检测，首次分离出具有促进神经细胞分化和神经突起的生长，促进免疫细胞和上皮纤维细胞增殖等效果的多功能的生物活性组分---鸡蛋清活性抽出物，简称为CEWAE(Chicken Egg White Active Extract)。
发明内容：
需解决的技术问题：
由于天然鸡蛋清中的碱性环境和蛋清中某些蛋白(如粘蛋白)的抑制作用，鸡蛋清活性组分本身的不稳定性以及缺乏合适有效的生物活性检测方法制约了人们对鸡蛋清中所含的生物活性物质的关注和应用。因此，如何提取和稳定鸡蛋清中的生物活性成份以及如何测定其活性以避免误失已提取到的生物活性成份是本发明所需解决的技术问题。
技术方案：
本发明通过对鸡蛋清进行超声波处理，稀释，改变pH值，电泳，硫酸铵沉淀等温和方法的有机组合在不同的变性临界点将蛋清中那些阻碍活性的蛋白质逐级除去后，再重新调节其缓冲体系以活化和稳定蛋清中的生物活性成份，并以CV-1细胞株在低血清培养液中的贴壁和伸展速率作为快速筛选蛋清生物活性成份的方法，再配合使用PC12，Jurket等多种哺乳动物细胞株在低浓度的胎牛血清下检测被测成份的活性，从而获得了具有高生物活性的鸡蛋清活性抽出物CEWAE(Chichen Egg White Active Extract)。其基本技术路线如下(细节另见“具体实施方式”)：
新鲜鸡蛋->除去蛋黄分离出蛋清->超声波处理->稀释蛋清->酸化->超高速离心->分离出上清液->电泳->硫酸铵沉淀->搅拌过夜->超高速离心->除去上清液->溶解沉淀->透析过夜->无菌过滤->细胞培养鉴定活性组分->低温保存。
有益效果：
以本发明所述的技术分离和鉴定出来的鸡蛋清活性抽出物CEWAE(Chicken EggWhite Active Extract)是一组多功能的活性复合物。经动物细胞培养试验证明：CEWAE可刺激PC12细胞的分化和神经突起的生长，促进淋巴T细胞Jurket，巨噬细胞MG7，巨大细胞HMC-1的增长，促进或保护纤维细胞CV-1，UC373，BHK2，A549；上皮细胞IEC-18的生长。可望用来开发生产一系列既有助于健脑，增强免疫力，防止皮肤老化等功能，又无副作用适合长期使用的纯天然多功能的生物药剂，保健营养品，食品添加剂，化妆品和生物医药以及供科学试验及动物细胞培养用的试剂等。
本技术也适合于提取其它禽蛋蛋清生物活性抽出物。本发明者应用该提取技术已成功地从鸭蛋清和鹌鹑蛋清中提取到了类似于CEWAE的活性组分，并发现鹌鹑蛋蛋清活性抽出物QEWAE(Quail Egg White ActiveExtract)的活力与CEWAE的活力相近，而鸭蛋蛋清活性抽出物DEWAE(Duck Egg WhiteActiveExtract)的活力却不到CEWAE活力的三分之一。相对而言，由于鸡蛋来源广泛且价格便宜从而使大规模生产鸡蛋清活性抽出物CEWAE具有更高的经济效益。
具体实施方式：
I，CEWAE的提取：
新鲜鸡蛋破壳除去蛋黄分离出蛋清，在0至4℃下用超声波间歇地处理蛋清5次每次1分钟，再于每100ml的蛋清中加入200ml的蒸馏水并搅拌，在搅拌的同时用盐酸调此稀释的蛋清pH值至5，然后放在冷库(0至4℃)里静置2小时。随后用超高速离心机离心20分钟(30000g，4℃)，弃去沉淀收集上清液。将此上清液静置于卧式电泳槽的阴极槽上同时加缓冲液于阳极槽上，电泳过夜。次日收集阳极槽上溶液，加入等量的饱和硫酸氨溶液，搅拌60分钟后再放在冷库(0至4℃)里静置过夜。次日用超高速离心机离心20分钟(40000g，4℃)，弃去上清液收集沉淀物，用100ml的PBS缓冲液溶解所收集的沉淀物，将此溶液装入透析袋并于3立升的PBS缓冲液中透析过夜，如此再重复透析一次。然后用高速离心机离心20分钟(10000g，4℃)，弃去沉淀收集上清液，用0.2u的滤膜无菌过滤后即为鸡蛋清活性抽出物CEWAE(Chicken Egg White Active Extract)。取出5ml作细胞培养以鉴定其活性，其余的保存于冷库中。
II，CEWAE的活性鉴定：
本发明通过对多种哺乳动物细胞株对CEWAE之生物活性反应的反复考察后，确立了以CV-1细胞株为代表的生物活性成份的快速初筛方法，以PC12细胞株为代表的神经细胞模型和以T-细胞株Jurket为代表的免疫细胞模型作为CEWAE生物活性的鉴定方法，现分述如下：
1，用CV-1细胞株在无血清培养中快速测定CEWAE促进纤维细胞贴壁及伸展的活性：将Confluent CV-1细胞用PBS缓冲液轻荡两遍后以0.5％Tripsin-0.5％EDTA悬浮，再以10倍以上含2％FBS(胎牛血清)的细胞培养液MEM稀释细胞至密度为100000cells/ml；准备一个6槽的细胞培养盘(6-well plate)，在每个槽中分别注入1.8毫升上述细胞悬浮液，将其成两组(每组各三个槽)：测试组和对照组。在测试组的每个槽中添加0.2毫升(即10％)CEWAE，而在对照组的每个槽中添加0.2毫升PBS缓冲液(无CEWAE)，然后在37℃，5％ CO2保温箱里培养。在接种后3，6，24及48小时等不同时间用显微镜观察细胞生长情况。试验结果是：接种3小时后，在测试组的每个培养槽中约有80％的细胞都贴壁甚至伸展出纤维突起；而在对照组的每个培养槽中大多细胞仍然和刚接种时一样圆滚滚的。3天后计数活细胞并比较两组培养液中的平均活细胞数。其试验结果是：在添加了10％CEWAE的培养液中的CV-1细胞密度比接种时高出一倍以上，而对照组(无CEWAE)的每个培养槽中的细胞80％以上都已死亡。本实验在细胞接种3小时后的观察结果可以用作快速初筛以判断被测组分是否含有生物活性的方法。
2，用PC12细胞株在低浓度的血清培养中鉴定CEWAE诱导神经生长的活性：将ConfluentPC12细胞用PBS缓冲液轻荡两遍后以0.5％tripsin/0.5％EDTA悬浮，再以10倍以上的含有15％FBS(胎牛血清)的细胞培养液RPMI-1640稀释细胞至密度为50,000cells/ml；准备一个6-槽的细胞培养盘(6-well plate)，在每个槽中注入2毫升上述细胞悬浮液，并放在37℃，5％ CO2保温箱里培养。一天后，将上述6个接种PC12细胞的培养槽分成两组(每组各三个槽)：测试组和对照组。除去每个槽中的旧培养液，加入3ml的PBS缓冲液轻荡后也除去，再在测试组的每个槽中加入1.8ml含有1％FBS的细胞培养液EME和0.2ml的CEWAE(终浓度为10％)，而在对照组的每个槽中加入1.8ml含1％FBS的细胞培养液EME和0.2ml的PBS缓冲液(无CEWAE)。然后置于37℃，5％ CO2保温箱里继续培养。重复上述方法，每天更换培养液并持续培养7天。用显微镜观察细胞生长情况。试验结果是：7天后在测试组的每个培养槽中有30％的细胞长出细长的神经纤维；而在对照组的每个培养槽中大多细胞都已死亡并无明显的神经纤维被观察到。
3，用Jurket细胞株在低浓度的血清培养中鉴定CEWAE促进淋巴T细胞增殖的活性：取5毫升悬浮培养于RPMI-1640/10％FBS细胞培养液中密度约为1,000,000cells/ml的Jurkat细胞，在室温下离心(1000rpm/5min)后除去旧培养液，再以含2％FBS的细胞培养液RPMI-1640悬浮细胞并调至细胞密度为300,000cells/ml：准备一个6-槽的细胞培养盘(6-well plate)，在每个槽中分别注入1.8毫升上述细胞悬浮液，将其分成两组(每组各三个槽)：测试组和对照组。在测试组的每个槽中添加0.2毫升(即10％)CEWAE，而在对照组的每个槽中添加0.2毫升PBS缓冲液(无CEWAE)，然后在37℃，5％ CO2保温箱里培养5天，计数活细胞并比较两组培养液中的平均活细胞数。其试验结果是：在添加了10％CEWAE的培养液中的Jurkat细胞密度比对照组(无添加CEWAE)的培养液中的细胞密度高出1倍以上。
Claims (9)
1.一种鸡蛋清活性抽出物之提取技术，其特征在于：将新鲜蛋清在0至4℃下用超声波间歇地处理，再于每100ml的蛋清中加入200ml的蒸馏水并搅拌，在搅拌的同时用盐酸调此稀释的蛋清pH值至5，然后放在冷库里静置2小时；随后用超高速离心机离心20分钟，30000g，4℃；弃去沉淀收集上清液；将此上清液静置于卧式电泳槽的阴极槽上同时加缓冲液于阳极槽上，电泳过夜；次日收集阳极槽上溶液，加入等量的饱和硫酸氨溶液，搅拌60分钟后再放在冷库里静置过夜；次日用超高速离心机离心20分钟，40000g，4℃；弃去上清液收集沉淀物，用100ml的PBS缓冲液溶解所收集的沉淀物，将此溶液装入透析袋并于3立升的PBS缓冲液中透析过夜，如此再重复透析一次；然后用高速离心机离心20分钟，10000g，4℃，弃去沉淀收集上清液，用0.2u的滤膜无菌过滤后即为鸡蛋清活性抽出物。
2.根据权利要求1所述的鸡蛋清活性抽出物之提取技术，其特征在于：所述蛋清用超声波间歇地处理5次，每次1分钟。
3.根据权利要求1所述的鸡蛋清活性抽出物之提取技术，其特征在于：所述冷库的温度为0至4℃。
4.一种如权利要求1、2或3所述技术提取的鸡蛋清活性抽出物的活性测定方法，其特征在于：采用CV-1细胞株在无血清培养中快速测鸡蛋清活性抽出物促进纤维细胞贴壁及伸展的活性：将Confluent CV-1细胞用PBS缓冲液轻荡两遍后以0.5％Tripsin-0.5％EDTA悬浮，再以10倍以上含2％胎牛血清FBS的细胞培养液MEM稀释细胞至密度为100000cells/ml；准备一个6槽的细胞培养盘，在每个槽中分别注入1.8毫升上述细胞悬浮液，将其成两组：测试组和对照组，每组各三个槽；在测试组的每个槽中添加0.2毫升，即10％的鸡蛋清活性抽出物，而在对照组的每个槽中添加0.2毫升PBS缓冲液，所述对照组中无鸡蛋清活性抽出物，然后在37℃，5％CO2保温箱里培养；在接种后在不同时间用显微镜观察细胞生长情况。
5.根据权利要求4所述的鸡蛋清活性抽出物的活性测定方法，其特征在于：所述在接种后用显微镜观察细胞生长情况的不同时间为3，6，24及48小时。
6.根据权利要求4所述的鸡蛋清活性抽出物的活性测定方法，其特征在于：所述测定方法以在细胞接种3小时后的观察结果可以用作快速初筛以判断被测组分是否含有生物活性的方法。
7.一种如权利要求1、2或3所述技术提取的鸡蛋清活性抽出物的活性测定方法，其特征在于：采用PC12细胞株在低浓度的血清培养中鉴定鸡蛋清活性抽出物诱导神经生长的活性：将Confluent PC12细胞用PBS缓冲液轻荡两遍后以0.5％tripsin-0.5％EDTA悬浮，再以10倍以上的含有15％胎牛血清FBS的细胞培养液RPMI-1640稀释细胞至密度为50,000cells/ml；准备一个6槽的细胞培养盘，在每个槽中注入2毫升上述细胞悬浮液，并放在37℃，5％ CO2保温箱里培养；一天后，将上述6个接种PC12细胞的培养槽分成两组：测试组和对照组，每组各三个槽；除去每个槽中的旧培养液，加入3ml的PBS缓冲液轻荡后也除去，再在测试组的每个槽中加入1.8ml含有1％FBS的细胞培养液EME和0.2ml的鸡蛋清活性抽出物，鸡蛋清活性抽出物的终浓度为10％，而在对照组的每个槽中加入1.8ml含1％FBS的细胞培养液EME和0.2ml的PBS缓冲液；所述对照组无鸡蛋清活性抽出物；然后置于37℃，5％CO2保温箱里继续培养；重复上述方法，每天更换培养液并持续培养7天；用显微镜观察细胞生长情况。
8.一种如权利要求1、2或3所述技术提取的鸡蛋清活性抽出物的活性测定方法，其特征在于：采用Jurket细胞株在低浓度的血清培养中鉴定CEWAE促进淋巴T细胞增殖的活性：取5毫升悬浮培养于RPMI-1640-10％FBS细胞培养液中密度为1,000,000cells/ml的Jurkat细胞，在室温下离心后除去旧培养液，再以含2％FBS的细胞培养液RPMI-1640悬浮细胞并调至细胞密度为300,000cells/ml；准备一个6槽的细胞培养盘，在每个槽中分别注入1.8毫升上述细胞悬浮液，将其分成两组：测试组和对照组，每组各三个槽；在测试组的每个槽中添加0.2毫升鸡蛋清活性抽出物，浓度为10％，而在对照组的每个槽中添加0.2毫升PBS缓冲液；所述的对照组中无鸡蛋清活性抽出物，然后在37℃，5％CO2保温箱里培养5天，计数活细胞并比较两组培养液中的平均活细胞数。
9.根据权利要求8所述的鸡蛋清活性抽出物的活性测定方法，其特征在于：所述在室温下离心后除去旧培养液中离心分离的条件为1000rpm/5min。
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