CN1425465A - 一种多糖－蛋白结合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明将A群、C群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、B型流感嗜血杆菌多糖通过化学的方法以共价键结合到有效的蛋白载体上，制备出可供人体免疫接种用的多糖－蛋白结合疫苗，用于预防A群、C群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、B型流感嗜血杆菌引起的感染。
Description
技术领域：
本发明涉及一种细菌荚膜多糖与蛋白结合的疫苗制剂，特别是一种A群、C群流行性脑脊髓膜炎荚膜多糖-蛋白结合疫苗和流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合疫苗。
背景技术：
流行性脑脊髓膜炎是一种具有悠久历史的传染性疾病，流行地域极广，遍及全球各大洲，至今仍未得到有效的控制。
流脑是一种人类常见的传染性疾病，只感染人类。人与人之间通过飞沫或分泌物直接传染，通常情况下，这种接触使对方成为一个健康带菌者，根据年龄和环境的不同，10-50％的人可成为带菌者。在人体抵抗力下降及特定环境影响下，奈瑟氏脑膜炎球菌可以侵入血流，继而发病，通常发生在接触该菌后的一周内。该病来势非常凶猛，伴有严重脑膜感染的综合症状，严重的全身症状主要有败血症、休克、出血、紫癜、弥散性血管内凝血或内脏出血，病死率较高，尽管抗生素有较好的治疗效果，病死率仍维持在5-10％之间。
脑膜炎奈瑟氏菌是引起流行性脑脊髓膜炎(以下简称流脑)的病原菌，根据其荚膜多糖的特异性可将脑膜炎奈瑟氏菌分成A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z 13个血清群，所有血清群的细菌均可致病，但A、B、C、Y和W135毒力最强，上述5个血清群占病例数的95％以上，其中A群、C群传染性最强，是引起流脑流行最常见的菌株。
A群流行性脑脊髓膜炎球菌荚膜多糖疫苗是第一个用于预防A群流行性脑脊髓膜炎球菌感染的疫苗，应用以后，使A群流行性脑脊髓膜炎的发病率及病死率得以大幅度的降低。
受A群流脑多糖疫苗的启示，相继研制出了C群、Y群、以及W135群流脑多糖单价疫苗以及含A、C、Y、W135四种流脑多糖成分的联合疫苗。由于各国均以A群流脑、C群流脑流行为主，因此，目前各国使用的疫苗主要为A群流脑多糖疫苗、C群流脑多糖疫苗等。
B型流感嗜血杆菌(Hib)是引起儿童细菌性脑炎、肺炎、蜂窝组织炎等疾病的主要病原体，在使用有效的疫苗前，美国每年有16000～25000多名儿童因Hib引起感染。其中60％的儿童患上最严重的Hib感染并发症——细菌性脑炎。其中10％因脑炎致死，许多幸存者则造成严重的永久性功能丧失。其他感染包括菌血症、肺炎、脓胸、心包炎、蜂窝组织炎、脓毒性关节炎及会咽炎等。1988～1991年期间，最初获准对大婴幼儿进行Hib结合疫苗接种，以后又获准对小婴幼儿进行接种，使Hib侵袭性疾病及相关的发病率及死亡率明显减少。过去几年里，Hib疾病患病人数降低了95％，美国疾病控制及预防中心将5岁以下儿童的Hib疾病作为一种可采用疫苗加以控制的疾病，并计划1996年消除；到1997年7月，该目标已接近实现但尚未完全达到。值得说明的是，在对18个月以下儿童广泛使用疫苗前，Hib疾病发病率已开始下降。其可能是由于Hib结合疫苗降低了较大儿童的无症状携带率，而导致了18个月以下儿童的感染风险降低。这种“群体免疫”作用所达到的效果是使用疫苗前未预料到的，Hib结合疫苗的成功免疫，为研究及预防由其他含多糖荚膜的细菌引起的感染提供了可借鉴的经验。
Hib及其他荚膜细菌的荚膜多糖抗原是其毒力的重要决定因素，因此其一直是疫苗研制的标靶。已知这些多糖的特异性抗体可使机体产生保护作用抵抗疾病侵袭。尽管多糖抗原在婴儿中通常没有免疫原性，但当其与载体蛋白共价结合时，则免疫原性明显增强。多糖蛋白结合物可为机体对多糖的免疫应答提供T细胞介导的途径，从而影响了结合疫苗再免疫后产生的抗体的数量和类型。近年来，这种结合疫苗已广泛用于婴儿免疫以预防Hib侵袭性疾病。
细菌多糖属T细胞非依赖性抗原，具有以下特点：(1)在幼小动物或婴幼儿体内只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强；(2)产生低亲和力的抗体，主要为IgM和少量的IgG抗体；(3)只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强效应；(4)容易产生免疫耐受；(5)普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强作用。
2岁以下的婴幼儿胸腺发育不成熟，对多糖抗原的反应性较差，多糖进入机体后不能被机体的免疫系统识别，不能产生有效的抗体，因此对2岁以下的儿童注射多糖疫苗不能产生保护性抗体。
为了增强细菌多糖疫苗刺激机体免疫应答反应的能力，Goebel和Avery早于1929年就首次成功地用化学方法将肺炎球菌的第3型荚膜多糖共价结合至蛋白质载体上去制备多糖—蛋白质结合疫苗。这种结合疫苗能大大增强家兔对多糖抗原的免疫反应。这是因为蛋白质载体将T细胞非依赖性的多糖抗原转变成T细胞依赖性抗原，从而能启动T辅助淋巴细胞产生一系列的免疫增强效应。
鉴于2岁以下儿童对多糖免疫接种无反应的事实，为了保护此年龄段的儿童免受感染，可将流脑多糖抗原偶联到载体蛋白上，改变抗原的提呈方式，刺激机体对多糖产生有效的保护性抗体，动物实验表明此举大大地增强了多糖的免疫原性，人体临床观察表明，用此种多糖-蛋白结合疫苗免疫3月龄的婴儿，可以产生有效的免疫。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗——B型流感嗜血杆菌结合疫苗(Hib)被美国FDA批准进入市场。
作为结合疫苗的载体，必须选择安全有效的蛋白质。这种蛋白质必须对人体没有毒性，也不会引起变态反应，同时又能增强多糖的免疫原性，因此可供选择的种类并不多。目前使用的载体主要为微生物来源的蛋白质，例如现成的白喉和破伤风类毒素疫苗，经基因突变发生减毒的白喉毒素以及细菌的外膜蛋白质等，而且已经用于临床。蛋白质载体也可以源于与多糖同一菌种的致病菌，例如B型嗜血流感杆菌多糖偶联疫苗可以用该菌的外膜蛋白质作为载体；肺炎球菌多糖偶联疫苗可以用肺炎的溶血素蛋白质作为载体，其优点是能具有对不同型别的肺炎球菌感染有交叉免疫保护效果。还有一些细菌的毒素蛋白质也可作为载体，例如霍乱毒素、霍乱毒素的B亚单位和大肠杆菌的不耐热肠毒素，因为它们具有佐剂的效应。另外还有绿脓杆菌的外毒素A、P6和一些高分子外膜蛋白质，以及不相关的蛋白质，如人血清蛋白等，但是这些蛋白质载体仍处于动物实验阶段，尚未用于临床。
至今已经研制成功多种不同的单价细菌多糖—蛋白结合疫苗。结合疫苗具有以下一些特点。(1)能增强婴幼儿对细菌多糖的免疫反应。由于结合疫苗能激活T辅助性淋巴细胞和形成T记忆细胞，重复接种能产生记忆性免疫增强作用，使主要为IgG的抗细菌多糖抗原的抗体水平剧增，对婴幼儿接种后能产生较为持久的免疫保护力。(2)细菌的多糖—蛋白质结合疫苗可成为二价疫苗。这是因为结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白质载体的抗体反应(3)能增强老年人和某些免疫功能低下或有缺陷的病人对细菌多糖抗原的免疫反应。老年人的免疫功能随年龄的增大而下降，因此对细菌多糖的免疫应答能力很差。例如肺炎是老年人的常见病，肺炎多糖和蛋白质的结合疫苗就可以增强疫苗对老年人的免疫保护力。也有报道免疫功能低下的艾滋病患者对结合疫苗产生的抗体反应要远胜于多糖疫苗。结合疫苗也可使一些缺乏对细菌多糖抗原产生免疫反应的个体产生高效价的抗多糖抗原的抗体。(4)结合疫苗具有载体蛋白质的效应。事先或同时接种蛋白质载体会刺激T淋巴细胞的增殖，因而能增强结合疫苗的免疫原性。在动物实验中观察到，给预先接种过破伤风类毒素的动物注射B型嗜血流感杆菌多糖和破伤风类毒素结合疫苗，只需要接种一次就能使动物产生达到免疫保护水平的抗B型嗜血流感杆菌多糖的抗体。此外，如果将两种混合接种，也能增强对疫苗多糖抗原的免疫反应。但是，如果先接种多糖结合疫苗，再接种破伤风类毒素，仅见破伤风类毒素抗体反应的增强，对疫苗多糖抗原的免疫原性却没有什么增强作用。
发明内容：
本发明提供了一种含A群和C群流脑多糖-蛋白结合疫苗及B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合疫苗的联合疫苗制剂，该制剂含有A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物、C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物以及B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物。本发明的联合疫苗制剂，其中三种结合产物混合的比例为1∶1～4，该比例可以代表以下关系，即A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物、C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物的比例可以是1∶1～4，C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物、A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物的比例可以是1∶1～4，C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物和B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物的比例是1∶1～4，B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物和C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物的比例是1∶1～4，A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物和B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物的比例是1∶1～4，B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物和A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与蛋白载体结合物的比例是1∶1～4，
每一剂中含有A群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖及C群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、B型流感嗜血杆菌多糖的量分别为5-100μg，所述每一剂表示每一制剂单位，如每支注射剂或每次用量。
本发明的联合疫苗制剂，其中的蛋白载体为破伤风类毒素、白喉类毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白等。
本发明的联合疫苗制剂，其中多糖与蛋白载体的结合是以多糖用溴化氰或硼氰酸钠活化，然后与己二酰肼或其他同功能的化合物反应，在碳二亚胺的作用下与蛋白载体共价结合的。
本发明的联合疫苗制剂，其特征在于，还可含有氢氧化铝或磷酸铝作为铝佐剂，加入量为0.25～1.5mg铝佐剂/剂量。
本发明的联合疫苗制剂，其特征在于，还可含有其他已知的可提高机体免疫的人体、植物或微生物蛋白质、多糖、磷脂或小分子化合物。
本发明的联合疫苗制剂是注射剂，可皮下或肌肉注射。
本发明的联合疫苗制剂，可与其他含铝佐剂的蛋白类疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗)联合使用。
本发明的联合疫苗制剂，可与其他含铝佐剂的疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、灭活日本脑炎病毒疫苗)联合组成多价疫苗。
本发明的疫苗可用于免疫3月龄以上各年龄段的儿童，预防儿童罹患A、C群流行性脑脊髓膜炎球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染性疾病。它的特点是既能增强多糖抗原的免疫原性，又能减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦和家长的精神负担。降低免疫接种成本，提高免疫覆盖率。
本发明的联合疫苗制剂，以破伤风类毒素、白喉类毒素作为流脑多糖的载体蛋白免疫儿童，可唤起免疫系统对破伤风类毒素、白喉类毒素的回忆反应，从而得到较好的对流脑多糖的免疫反应。
本发明的联合疫苗制剂，以人血清IgG作为载体蛋白制备的结合疫苗，其所含的蛋白载体——IgG的Fc片段可与人体内抗原呈递细胞表面的Fc受体结合，使其主动吞噬并处理抗原，增强多糖抗原的免疫原性。
本发明的联合疫苗制剂，可通过以下制备工艺制备。
选用A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、B型流感嗜血杆菌菌种生产A群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌多糖、B型流感嗜血杆菌多糖。精制破伤风类毒素系用破伤风梭状芽孢杆菌菌种，在适宜的培养基中培养产生的毒素经甲醛脱毒、精制而成；人血清IgG系市售的静脉注射用生物制剂。在碳二亚胺的作用下将已活化的流脑多糖与载体蛋白通过共价键结合，形成多糖—蛋白结合疫苗。A群流行性脑膜炎球菌多糖、C群流行性脑膜炎球菌多糖、B型流感嗜血杆菌多糖分别与蛋白结合，制备各自的多糖—蛋白结合疫苗原液，按一定比例将三者混合制备多糖—蛋白结合疫苗。加入氢氧化铝或磷酸铝佐剂后即为含铝佐剂的疫苗。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明
实施例一A+C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗(一)多糖的提纯
生产多糖疫苗可选用适宜培养基。生产用的液体培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。培养基中不应含有对人体有害或其它过敏原物质。
在适宜的培养基中接种菌种后，于对数生产期后或静止期前期收获。将培养物加入甲醛溶液杀菌或加热杀菌，以确保杀菌安全并不损伤菌体多糖为宜。将已杀菌的单一收获物(或合并收获物)离心去菌体，收集上清液，于其中加入十六烷基三甲基溴化铵混匀，离心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化钙溶液，使最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(V/V)。0～10℃静置3小时以上，离心去沉淀，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(v/v)，充分振摇。离心收集沉淀，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待进行一步提取。将粗制品溶解于中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，然后按1∶2体积用冷酚提取2～3次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或适宜溶液透析。必要时可用其它方法去除内毒素。再加乙醇至最终浓度为75％～80％(v/v)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上。离心后倾去上清液，用注射用水溶解沉淀的多糖，所得溶液即为提取的多糖原液。原液经截留分子量为100KD的超滤器过滤，除去分子量小于100KD的多糖分子，超滤后的多糖溶液经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应在15℃以下进行。纯化后的多糖应保存在-20℃或以下，待下一步与蛋白偶联。(二)精制破伤风类毒素(TT)
系用破伤风梭状芽孢杆菌菌种，在适宜的培养基中培养产生的毒素经甲醛脱毒、精制而成。按2000年版《中国生物制品规程》吸附破伤风类毒素疫苗制造及检定规程的3.1项进行检定，检定合格后方可用于下一步与多糖抗原的偶联。(三)多糖与破伤风类毒素偶联1.活化多糖
取A群(或C群)流脑(或Hib)多糖100mg(4mg/ml，25m1)，用0.5M NaOH调pH至10.8，加入50mg溴化氰，用0.5M NaOH维持pH在10.8±0.5左右1小时(22℃)。然后用0.5M HCl调pH至8.8，加入350mg己二酰肼(ADH)，反应6分钟；用0.5M NaOH调pH至8.5，维持pH在8.5±0.5的范围内15分钟；4～8℃轻轻搅拌12小时。用预冷0.05M NaCl溶液透析48小时(4～8℃)，在此期间换液5次(或用100KD的超滤膜超滤)。用0.45μm滤膜过滤活化多糖-ADH衍生物。2.活化多糖与破伤风类毒素(TT)偶联(4～8℃冰水浴下操作)
将破伤风类毒素溶液的蛋白浓度调整为4mg/ml，取25ml加入到已活化的多糖-ADH衍生物溶液中，充分混匀后，用0.5M HCl调pH至5.7。加碳二亚胺(EDAC)1000mg，滴加盐酸维持溶液的pH在5.7±0.2范围内90分钟；用0.5MNaOH调pH至6.8，用预冷0.2M NaCl溶液透析12小时(4～8℃，或用截流分子量为300KD的滤膜超滤)，除去碳二亚胺(EDAC)及低分子物质。(四)多糖-蛋白结合物纯化(4～8℃条件)
将多糖—蛋白结合物溶液超滤浓缩为20ml，经Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4 FF、TSK Toyopearl-65等)层析柱(2.6×100cm)纯化，以0.2M NaCl流洗，流速为1.5ml/分钟，以206nm/280nm波长的在线式紫外检测器检测流出液的吸光值变化，收集V0附近的洗脱峰，经0.22μm滤膜过滤后即为多糖-蛋白结合疫苗原液。(五)氢氧化铝佐剂吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备
将A群流脑多糖-TT结合疫苗原液、C群流脑多糖-TT结合疫苗原液、B型流感嗜血杆菌-TT结合疫苗原液分别稀释至120μg/ml(按多糖计算)，将以上三种稀释后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角烧瓶内，充分混合后，加入30ml氢氧化铝佐剂(浓度为1.66mg/ml，按铝离子计算)，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg的氢氧化铝吸附多糖-TT结合疫苗。
动物试验：按上述方法制备氢氧化铝吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-TT结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设氢氧化铝及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表1。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)；第3次免后1周的抗体滴度显著高于第2次免后1周的抗体滴度(p＜0.02)。(六)磷酸铝佐剂吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备
将A群流脑多糖-TT结合疫苗原液、C群流脑多糖-TT结合疫苗原液、B型流感嗜血杆菌-TT结合疫苗原液分别稀释至120μg/ml(按多糖计算)，将以上三种稀释后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角烧瓶内，，充分混合后，加入30ml磷酸铝佐剂(浓度为1.66mg/ml，按铝离子计算)，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg的磷酸铝吸附多糖-TT结合疫苗。
动物试验：按上述方法制备氢氧化铝吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-TT结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设氢氧化铝及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表1。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周的抗体滴度显著高于第2次免后1周的抗体滴度(p＜0.05)。(七)A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的制备
将A群流脑多糖-TT结合疫苗原液、C群流脑多糖-TT结合疫苗原液、B型流感嗜血杆菌-TT结合疫苗原液分别稀释至60μg/ml(按多糖计算)，将以上三种稀释后的疫苗液各取20ml放于一100ml容量的三角烧瓶内，充分混合后，按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg的多糖-TT结合疫苗。
动物试验：按上述方法制备A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-TT结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。加三倍体积的稀释剂稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设氢氧化铝及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表1。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周的抗体滴度除A群流脑多糖抗体滴度增加无显著性外，C群流脑多糖抗体、Hib多糖抗体滴度均显著高于第2次免后1周的抗体滴度(p＜0.01)。
表1、A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-TT结合疫苗
免疫BALB/C小鼠的血清抗体滴度*
*血清的起始稀释度为1∶100，连续2倍稀释，最高稀释度为1∶102400。免前血清、铝佐剂、生理盐水对照组血清的稀释方法同其他试验组，1∶100阴性的，血清抗体滴度按1计算。免前血清、铝佐剂、生理盐水对照组血清的稀释方法同其他试验组，1∶100阴性的，血清抗体滴度按1计算。实施例二A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖联合疫苗
| 组别 | 动物只数 | 血清采集时间 | 血清抗体滴度 | |||||
| 抗A群多糖 | 抗C群多糖 | 抗Hib多糖 | ||||||
| GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | |||
| 氢氧化铝佐剂 | 15 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 16889 | 2.25 | 6859 | 2.29 | 4850 | 1.95 | ||
| 第3次 | 38802 | 1.79 | 14703 | 1.73 | 12800 | 2.23 | ||
| 磷酸铝佐剂 | 15 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 16889 | 2.11 | 3939 | 2.23 | 2425 | 1.95 | ||
| 第3次 | 41587 | 1.93 | 16890 | 1.79 | 4850 | 1.95 | ||
| 无佐剂 | 15 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 16889 | 2.40 | 1970 | 2.67 | 1056 | 2.40 | ||
| 第3次 | 20794 | 2.08 | 7351 | 1.89 | 3430 | 1.99 | ||
| 铝佐剂 | 10 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
| 第3次 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
| 生理盐水 | 10 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
| 第3次 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | ||
将A群流脑多糖、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖分别稀释为60μg/ml，各取25ml混合。按0.5ml/支的量分装，即为含A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg/支的疫苗。
动物试验：按上述方法制备A+C群流脑多糖疫苗、B型流感嗜血杆菌多糖，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。以3倍体积的生理盐水稀释后即为含A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各5μg/ml的动物实验用疫苗。分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设只含A群流脑多糖、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖(5μg/ml)的单价疫苗对照组及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表2。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)，加强免疫后不能使抗体滴度升高。
表2、多糖疫苗免疫BALB/c小鼠后的血清抗体滴度*
*抗A群流脑多糖、抗C群流脑多糖血清自1∶100开始倍比稀释；抗Hib多糖血清自1∶25开始倍比稀释。
| 组别 | 动物只数 | 血清采集时间 | 血清抗体滴度 | |||||
| 抗A群流脑多糖 | 抗C群流脑多糖 | 抗Hib多糖 | ||||||
| GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | |||
| A+C群流脑多糖+Hib多糖 | 10 | 免前 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 第2次 | 200.00 | 2.08 | 200.00 | 2.67 | 39.26 | 1.52 | ||
| 第3次 | 200.00 | 2.67 | 174.11 | 2.64 | 43.53 | 1.34 | ||
| A群流脑多糖 | 10 | 免前 | 1.00 | 1.00 | ||||
| 第2次 | 131.95 | 1.79 | ||||||
| 第3次 | 200.00 | 1.00 | ||||||
| C群流脑多糖 | 10 | 免前 | 1.00 | 1.00 | ||||
| 第2次 | 125.12 | 2.51 | ||||||
| 第3次 | 179.81 | 2.37 | ||||||
| Hib多糖 | 免前 | 1.00 | 1.00 | |||||
| 第2次 | 33.62 | 2.27 | ||||||
| 第3次 | 40.53 | 2.14 | ||||||
| 生理盐水 | 10 | 免前 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 第2次 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | ||
| 第3次 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | ||
实施例三A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠免疫球蛋白(IgG)结合疫苗(一)多糖与小鼠免疫球蛋白(IgG)的偶联1.活化多糖
取A群(或C群)流脑(或Hib)多糖100mg(4mg/ml，25ml)，用0.5M NaOH调pH至10.8，加入50mg溴化氰，用0.5M NaOH维持pH在10.8±0.5左右1小时(22C)。然后用0.5M HCl调pH至8.8，加入350mg己二酰肼(ADH)，反应6分钟；用0.5M NaOH调pH至8.5，维持pH在8.5±0.5的范围内15分钟；4～8℃轻轻搅拌12小时。用预冷0.05M NaCl溶液透析48小时(4～8℃)，在此期间换液5次(或用100KD的超滤膜超滤)。用0.45μm滤膜过滤活化多糖-ADH衍生物。2.活化多糖与小鼠血清免疫球蛋白偶联(4～8℃冰水浴下操作)
将鼠血清免疫球蛋白(IgG，自未经免疫的BALB/c小鼠血清提取，HPLC纯度96％)溶液的蛋白浓度调整为4mg/ml，取25ml加入到已活化的多糖-ADH衍生物溶液中，充分混匀后，用0.5M HCl调pH至5.7。加碳二亚胺(EDAC)1000mg，滴加盐酸维持溶液的pH在5.7±0.2范围内90分钟；用0.5M NaOH调pH至6.8，用预冷0.2M NaCl溶液透析12小时(4～8℃，或用截流分子量为300KD的滤膜超滤)，除去碳二亚胺(EDAC)及低分子物质。(二)多糖-小鼠IgG结合物纯化(4～8℃条件)
将多糖-小鼠IgG结合物溶液超滤浓缩为20ml，经Sephacryl S-400HR(或Sephacryl S-1000、Sepharose CL-4B、Sepharose 4 FF、TSK Toyopearl-65等)层析柱(柱长2.6×70～100cm)纯化，以0.2M NaCl流洗，流速为1.5ml/分钟，以206nm/280nm波长的在线式紫外检测器检测流出液的吸光值变化，收集V0附近的洗脱峰，经0.22μm滤膜过滤后即为多糖-小鼠IgG结合疫苗原液。(三)氢氧化铝佐剂吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗的制备
将A群流脑多糖-小鼠IgG结合疫苗原液、C群流脑多糖-小鼠IgG结合疫苗原液、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗原液分别稀释至120μg/ml(按多糖计算)，将以上三种稀释后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角烧瓶内，充分混合后，加入30ml氢氧化铝佐剂(浓度为1.66mg/ml，按铝离子计算)，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg的氢氧化铝吸附多糖-TT结合疫苗。
动物试验：按上述方法制备氢氧化铝吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设氢氧化铝及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表3。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周的抗体滴度显著高于第2次免后1周的抗体滴度(p＜0.02)。(四)磷酸铝佐剂吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗的制备
将A群流脑多糖-小鼠IgG结合疫苗原液、C群流脑多糖-小鼠IgG结合疫苗原液、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗原液分别稀释至120μg/ml(按多糖计算)，将以上三种稀释后的疫苗液各取10ml放于一100ml容量的三角烧瓶内，充分混合后，加入30ml磷酸铝佐剂(浓度为1.66mg/ml，按铝离子计算)，充分混匀后4～8℃放置。按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg的磷酸铝吸附多糖结合疫苗。
动物试验：按上述方法制备氢氧化铝吸附A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。加三倍体积的铝稀释剂稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设氢氧化铝及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表3。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)；第3次免后1周，抗体的滴度显著高于第2次免后1周的抗体滴度(p＜0.01)。(五)A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗的制备
将A群流脑多糖-小鼠IgG结合疫苗原液、C群流脑多糖-小鼠IgG结合疫苗原液、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗原液分别稀释至60μg/ml(按多糖计算)，将以上三种稀释后的疫苗液各取20ml放于一100ml容量的三角烧瓶内，充分混合后，按0.5ml/支的量分装，即为每剂含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各10μg的多糖-TT结合疫苗。
动物试验：按上述方法制备A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-小鼠IgG结合疫苗，每毫升疫苗含A群、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各20μg。加三倍体积的稀释剂稀释后，即为动物实验用疫苗，分别于0、14、21天皮下免疫SPF级BALB/C小鼠，免疫剂量为0.5ml(含每种多糖2.5μg)。分别于0、21、28天采集血液，分离血清，测定抗体滴度前将血清放置于-20℃。免疫动物的同时设氢氧化铝及生理盐水对照组，以酶联免疫法测定血清抗体滴度。结果见表3。第2次免后1周小鼠血清抗体滴度显著高于免前(p＜0.01)，第3次免后1周，除C群流脑抗体滴度增加无著性外，A群流脑多糖抗体、Hib多糖的抗体滴度显著高于第2次免后1周的抗体滴度(p＜0.01)。
表3、A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-鼠IgG结合疫苗
免疫BALB/C小鼠的血清抗体滴度*
*血清的起始稀释度为1∶100，连续2倍稀释，最高稀释度为1∶102400。免前血清、铝佐剂、生理盐水对照组血清的稀释方法同其他试验组，1∶100阴性的，血清抗体滴度按1计算。
| 组别 | 动物只数 | 血清采集时间 | 血清抗体滴度 | |||||
| 抗A群多糖 | 抗C群多糖 | 抗Hib多糖 | ||||||
| GMT | SD | GMT | SD | GMT | SD | |||
| 氢氧化铝佐剂 | 15 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 6400 | 1.39 | 8445 | 2.11 | 6859 | 2.29 | ||
| 第3次 | 11143 | 1.73 | 27437 | 1.83 | 19401 | 1.43 | ||
| 磷酸铝佐剂 | 15 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 6400 | 2.08 | 9701 | 2.40 | 8445 | 2.98 | ||
| 第3次 | 15759 | 2.08 | 44572 | 2.49 | 22286 | 1.55 | ||
| 无佐剂 | 15 | 免前 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 | 1 | 1.00 |
| 第2次 | 5198 | 1.59 | 5971 | 2.44 | 3200 | 2.37 | ||
| 第3次 | 14703 | 2.04 | 11943 | 1.83 | 14703 | 2.04 | ||
氢氧化铝、生理盐水对照组的结果见表1。
实施例四A、C群流脑多糖、B型流感嗜血杆菌多糖-人免疫球蛋白(IgG)结合疫苗
本实施例的操作同实施例三，不同的是将实施例三中使用的小鼠血清免疫球蛋白替换为静脉注射用人免疫球蛋白。
以人免疫球蛋白为载体制备的结合疫苗可用于3月龄以上各年龄段人群的免疫。使用剂量范围为5-100μg/剂(按多糖计算)，免疫次数2-3次，免疫间隔4-8周。
Claims (10)
1、一种多糖-蛋白结合疫苗制剂，其特征在于，含有A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，B型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物。
2、权利要求1的联合疫苗制剂，其中三种结合产物混合的比例为1∶1-4，每剂含有A群、C群流行性脑脊髓膜炎球菌夹膜多糖、B型流感嗜血杆菌多糖各5-100μg(按多糖计)。
3、权利要求1的联合疫苗制剂，其中的蛋白载体为破伤风类毒素、白喉类毒素、人血清免疫球蛋白、B群流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白。
4、权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，还可含有氢氧化铝或磷酸铝作为铝佐剂，加入量为0.25～1.5mg铝佐剂/剂。
5、权利要求1的联合疫苗制剂是注射剂。
6、权利要求1的联合疫苗制剂，可与其他含铝佐剂的蛋白类疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗等)联合使用。
7、权利要求1的联合疫苗制剂，可与其他含铝佐剂的疫苗(如DTP，乙型肝炎疫苗、灭活脊髓灰质炎病毒疫苗、灭活日本脑炎病毒疫苗)联合组成多价疫苗。
8、权利要求1的联合疫苗制剂，其中三种多糖-蛋白结合物的多糖和蛋白载体结合是通过化学键共价结合的。
9、权利要求1的联合疫苗制剂制备方法，其特征在于，三种多糖-蛋白结合物的多糖和蛋白载体是通过多糖与蛋白偶联结合的，其中，多糖与蛋白的加入量可以等量，也可有1～5倍量的差别，偶联过程可加入己二酰肼、碳二亚胺。
10、用权利要求1的联合疫苗制剂制备用于预防A群、C群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、B型流感嗜血杆菌引起的感染的疫苗药物。
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