PL211005B1 - Sposób wytwarzania szczepionki zespolonej - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211005 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 369433 (51) Int.Cl.

(22) Data zgłoszenia: 09.01.2002 A61K 39/29 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

09.01.2002, PCT/KR02/000034 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

18.07.2002, WO02/055105 (54)

Sposób wytwarzania szczepionki zespolonej (73) Uprawniony z patentu:

LG LIFE SCIENCES LTD., Seoul, KR (30) Pierwszeństwo:

10.01.2001, KR, 2001-0001290 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

18.04.2005 BUP 08/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.03.2012 WUP 03/12 (72) Twórca(y) wynalazku:

KYU-WAN KIM, Daejeon, KR HYI-JEONG JI, Daejeon, KR YOUN-KYEONG LEE, Daejeon, KR WAN-KYU KIM, Daejeon, KR HEE-KU LEE, Daejeon, KR WON-KYUM KIM, Daejeon, KR (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Urszula Bartnik

PL 211 005 B1

Opis wynalazku

Dziedzina techniki

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki zespolonej. Szczepionka ta jest zdolna do jednoczesnego zapobiegania kilku chorobom wieku dziecięcego, takim jak błonica, tężec, krztusiec i wirusowe zapalenie wątroby typu B, przed którymi dzieci powinny być chronione.

Stan techniki

Szczepionka zespolona oznacza szczepionkę wytworzoną przez połączenie kilku antygenów chroniących przed pojedynczą chorobą dla różnych chorób zakaźnych lub szczepionkę wytworzoną przez połączenie różnych pokrewnych antygenów w celu zapobieżenia jednej chorobie zakaźnej.

Przykładem pierwszego typu szczepionek są: szczepionka DTP zdolna do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na błonicę, tężec i krztusiec i szczepionka MMR zdolna do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na odrę, świnkę i różyczkę. Szczepionki te używane są od 20 lat. Przykładem drugiego typu szczepionek są: szczepionka przeciw pneumokokom wytworzona przez połączenie 14 lub 23 polisacharydów pneumokokowych i zdolna do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na zapalenie płuc, i szczepionka przeciw meningokokom wytworzona przez połączenie 4 polisacharydów meningokokowych i zdolna do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na zapalenie opon mózgowych. Szczepionki te używane są od kilku lat.

Powyższe szczepionki używane są od wielu lat, a ich silne działanie immunizujące i zmniejszone działanie uboczne w stosunku do poszczególnych chorób zakaźnych są dobrze znane od czasu ich wytworzenia, tak jak i ich dobre przystosowanie do zapobiegania różnym chorobom. Z tych powodów badacze szczepionek opracowują różne nowe szczepionki zespolone. Tak jak powyższe szczepionki zespolone opracowano szczepionkę (Międzynarodowa Publikacja WO99/13906) wytwarzaną przez połączenie szczepionki DTP, bakteryjnej szczepionki przeciw zapaleniu mózgu (szczepionka Hib), inaktywowanej szczepionki przeciw polio i szczepionki przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B. Pewne szczepionki zespolone wytwarza się przez połączenie polisacharydów pneumokokowych i meningokokowych sprzężonych z białkiem. Wkrótce zostanie wytworzona szczepionka zespolona zdolna do zapobiegania zakażeniom pokarmowym spowodowanym przez odpowiednie bakterie takie jak bakterie cholery, tyfusu, czerwonki i biegunki.

Szczepionki zespolone wytwarzane w ten sposób, że łączy się antygeny chroniące przed różnymi chorobami zakaźnymi, mają zalety bo zmniejszają liczbę koniecznych szczepień i łatwiejsze jest dostarczenie szczepionki co zmniejsza koszty. Zgodnie z planem szczepień dzieci zalecanym przez Związek Pediatryczny (1997), dzieci dostają szczepienia wiele razy w ciągu 1 roku po urodzeniu, a ze względów praktycznych lub z powodu choroby szczepienie czasami nakłada się na inne szczepienie. Ważne jest więc, żeby noworodki były szczepione w oparciu o odpowiednią metodę, co jest wygodne zarówno dla osób szczepionych jak i osoby szczepiącej. Na przykład, w standardowym schemacie szczepień zaleca się, żeby szczepienie DTP i szczepienie przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B przeprowadzić trzy razy w ciągu 1 roku po urodzeniu, jako szczepienie podstawowe i szczepienia przypominające. Ponieważ zalecane schematy szczepienia są podobne może się zdarzyć, że szczepienia nałożą się.

Twórcy niniejszego wynalazku przeprowadzili badania w celu zapewnienia pewnej wygody szczepień zarówno dla osób szczepionych jak i osoby szczepiącej i opracowali szczepionkę zespoloną DTP i przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, stabilizując podaż szczepionki i dając w ten sposób korzyść większej liczbie ludzi.

Ponieważ badania szczepionki zespolonej są ukierunkowane przede wszystkim na łączenie składowych antygenów ze szczepionek, w celu osiągnięcia immunogenności i stabilności, to dla takich badań ważne jest więc wynalezienie metody łączenia, która zmniejsza różnice w reaktywności i immunogenności antygenów występujące ze względu na oddziaływania pomiędzy każdym z antygenów ochronnych i adsorbentem. Po zakończeniu badań, sprawdza się homogenność i stabilność opracowanej postaci szczepionki zespolonej. Sposobem według wynalazku przeprowadzono badania szczepionki opartej na szczepionce DTP i szczepionce przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B, które znane są ze swojej immunogenności i stabilności.

Wśród metod łączenia składników szczepionki znane są: metoda (Międzynarodowe Publikacje WO99/13906 i WO00/7623) polegająca po prostu na połączeniu poszczególnych składników każdej ze szczepionek, metoda (Międzynarodowa Publikacja WO99/13906) polegające na jednoczesnym podaniu szczepionek w czasie szczepienia, za pomocą specjalnie zaprojektowanego kontenera i mePL 211 005 B1 toda wytwarzania szczepionki zespolonej polegająca na zmieszaniu każdego składnika szczepionki i zawartości w jeden preparat. Co do dostarczania szczepionki, to zastosowanie szczepionki zespolonej wytworzonej dwoma wcześniejszymi metodami jest podobne do zastosowania pojedynczych szczepionek, tak więc zastosowanie szczepionek zespolonych tego typu nie przynosi żadnej korzyści. Ponadto nie można prowadzić przy ich użyciu badań zmienności immunogenności i działania ubocznego. Dlatego, do badań szczepionki zespolonej korzystnie jest aby każdy składnik szczepionki zmieszany był do postaci jednego preparatu.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania szczepionki zespolonej zdolnej do jednoczesnego zapobiegania kilku chorobom, takim jak błonica, tężec, krztusiec i wirusowe zapalenie wątroby typu B, przed którymi dzieci powinny być chronione.

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania szczepionki zespolonej zdolnej do jednoczesnego zapobiegania kilku chorobom wieku dziecięcego, takim jak błonica, tężec, krztusiec i wirusowe zapalenie wątroby typu B, przed którymi dzieci powinny być chronione.

W celu osiągnięcia tego celu dostarcza się sposobu wytwarzania szczepionki zespolonej, który charakteryzuje się tym, że:

- dostarcza się poszczególne antygeny ochronne zawierające antygen błonicy, antygen tężca, antygen krztuśca i antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B;

- adsorbuje się niezależnie każdy antygen ochronny na adsorbencie będącym żelem wodorotlenku glinu; i

- łączy się każdy niezależnie zaadsorbowany antygen ochronny.

Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje także dodatkowe dodanie żelu wodorotlenku glinowego po połączeniu każdego niezależnie zaadsorbowanego antygenu ochronnego.

W bardziej korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, końcowe stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinu wynosi od 0,5 do 1,25 mg/ml.

W sposób według wynalazku zespolony antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B jest korzystnie rekombinowanym powierzchniowym antygenem wirusa zapalenia wątroby typu B w ilości 5 - 10 pg na dawkę.

W jeszcze bardziej korzystnym rozwiązaniu sposób według wynalazku zawiera także etap dodania neutralnego środka powierzchniowo czynnego, wybranego z grupy obejmującej monolaurynian polioksyetylenosorbitolu (20), monooleinian polioksyetylenosorbitolu (80) i eter fenylowy polioksyetylenu oktylu.

W sposób według wynalazku antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B jest łączony z wodorotlenkim glinu przez mieszanie na mieszadle w temperaturze 2-8°C przez 3-20 godzin.

W innym korzystnym rozwiązaniu antygen błonicy jest toksoidem błonicy w ilości 10-25 Lf na dawkę, lub także korzystnie antygen tężca jest toksoidem tężca w ilości 1-5 Lf na dawkę.

W następnym korzystnym rozwiązaniu antygen krztuśca może być oczyszczonym antygenem krztuśca w ilości mniejszej niż 20 pg PN na dawkę; lub pełnokomórkowym antygenem krztuśca w ilości mniejszej niż 20 OU na dawkę.

Jeszcze bardziej korzystnie oczyszczony antygen krztuśca jest toksoidem krztuśca, FHA krztuśca (nitkowatą hemaglutyniną) lub ich mieszaniną.

Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka zespolona wytworzona zgodnie z jednym ze sposobem zdefiniowanym powyżej, lub jego korzystnymi wykonaniami.

Bardziej szczegółowo, sposób według wynalazku dostarcza sposobu wytwarzania szczepionki zespolonej obejmującego etapy niezależnej adsorpcji każdego antygenu ochronnego dla każdej z chorób na adsorbencie będącym żelem wodorotlenku glinu, w odniesieniu do różnych chorób, takich jak błonica, tężec, krztusiec i zapalenie wątroby wirusowe B, przed którymi dzieci powinny być chronione; i etap połączenia po adsorpcji każdego z antygenów ochronnych zaadsorbowanych na adsorbencie.

Antygeny użyte sposobem według wynalazku nie są ograniczone przez wymienione powyżej choroby, ale odnoszą się do różnych antygenów różnych chorób.

Krótki opis figur

Sposób według wynalazku będzie lepiej zrozumiały w odniesieniu do załączonych figur, które zamieszczone są wyłącznie w celach ilustracyjnych i nie stanowią ograniczenia niniejszego wynalazku.

Figura 1 jest rysunkiem ilustrującym współczynnik adsorpcji każdego antygenu składowego w oparciu o stężenie adsorbentu. Anatoksyna błonicy, anatoksyna tężca i antygen powierzchniowy

PL 211 005 B1 wirusa zapalenia wątroby typu B są składnikami antygenu błonicy, antygenu tężca i antygenu zapalenia wątroby wirusowego B, a anatoksyna krztuśca i antygen FHA krztuśca (ciałko nitkowate krztuścowej aglutyniny krwi) są składnikami oczyszczonego antygenu krztuśca.

Figury 2a do 2d są rysunkami ilustrującymi antygenowość i immunogenność określoną metodą adsorpcyjną, na których próbka 1 jest próbką do której dodany jest nadmiar żelu wodorotlenku glinu po zakończonym połączeniu każdego ze składników szczepionki, próbka 2 jest próbką do której dodano adsorbentu w tym samym stężeniu co poprzednio, ale przed zakończeniem łączenia. Figury 2a i 2b są rysunkami ilustrującymi względną antygenowość, odpowiednio, próbek 1 i 2, a Figury 2c do 2d są rysunkami ilustrującymi względny poziom wytwarzania przeciwciał przeciw każdemu antygenowi, odpowiednio, próbek 1 i 2.

Figura 3 jest rysunkiem ilustrującym względny poziom wytwarzania przeciwciał przeciw każdemu antygenowi w surowicy uzyskanej od małp którym podawano szczepionkę zespoloną wytworzoną sposobem według wynalazku lub współbieżnie każdą ze szczepionek przeciw DTP i zapaleniu wątroby wirusowemu B zmierzone w dniu pobrania próbki krwi od każdej małpy. Grupa 1 oznacza, że szczepionkę DTP i szczepionkę przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B podaje się współbieżnie, a grupa 2 oznacza, że podaje się szczepionkę zespoloną.

Przykłady wykonania wynalazku

Sposób wytwarzania szczepionki zespolonej, zawierającej każdy składnik szczepionki jako jeden produkt, podzielony został na dwa etapy: etap łączenia antygenów tworzących każdy ze składników szczepionki i adsorpcji przy użyciu adsorbentu oraz etap łączenia wcześniej zaadsorbowanych antygenów, w przypadku w którym adsorbent jest używany jako składnik sposobu według wynalazku. Jednakże, w przypadku w którym każdy antygen składowy najpierw miesza się, zdolność adsorpcji adsorbentu każdego antygenu może się zmniejszyć ze względu na oddziaływania pomiędzy antygenami i składnikami roztworu. Ponadto, adsorpcję pomiędzy adsorbentem i antygenem składowym optymalizuje się dla każdych niezależnych warunków. Jeżeli powyższe procesy adsorpcji prowadzi się równolegle współczynnik adsorpcji może się zmniejszyć ze względu na różnice w warunkach adsorpcji każdego z antygenów składowych. Ponieważ współzależności pomiędzy współczynnikiem adsorpcji adsorbentu antygenu składowego i immunogennością szczepionki jest zależnością odwrotnie proporcjonalną, immunogenność szczepionki zespolonej wytworzonej sposobem współbieżnym może być mniejsza niż immunogenność każdej pojedynczej szczepionki.

Dlatego wydaje się, że właściwym sposobem wytwarzania szczepionki zespolonej jest wytworzenie dużej ilości każdego antygenu składowego, niezależne przeprowadzenie adsorpcji każdego antygenu i połączenie razem zaadsorbowanych antygenów.

Ponadto, w przypadku w którym każdy antygen składowy jest połączony w każdym typie adsorpcji, żeby porównać immunogenność i charakterystyki antygenów szczepionki w szczepionkach, końcowe stężenie każdego antygenu składowego w szczepionce zespolonej powinno być takie same jak stężenie antygenu składowego w każdej tradycyjnej pojedynczej szczepionce. Dlatego, żeby wytworzyć szczepionkę zespoloną adsorbuje się i następnie łączy antygeny składowe bardziej stężone niż w pojedynczej szczepionce. Szczepionkę DTP wytwarza się przez adsorpcję przy użyciu antygenu, który jest 1,5-2 razy bardziej stężony, a szczepionkę przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B wytwarza się przy użyciu antygenu, który jest 2-3 razy bardziej stężony. Końcowe stężenie każdego z antygenów składowych szczepionki zespolonej wytworzonej sposobem według wynalazku dopasowuje się do stężenia każdej pojedynczej szczepionki przez dopasowanie stosunku łączonych antygenów.

Sposobem według wynalazku, żeby wytworzyć szczepionkę zespoloną twórcy przeprowadzili różne badania połączeń. W tym przypadku, ostateczna zawartość każdego immunogennego składnika szczepionki jest taka sama jak składnika pojedynczej szczepionki. Ponadto, zmianę stosunku adsorpcji każdego z antygenów monitoruje się kontrolując zawartość adsorbentu i innych składników. Każdą próbką wykazującą małe zmiany stosunków adsorpcji immunizuje się małe zwierzęta i porównuje poziom wytwarzania przeciwciał. Porównując wyniki tworzenia przeciwciał w małych zwierzętach wybiera się odpowiedni sposób łączenia.

W czasie przeglądu literatury pod kątem adsorbentów używanych obecnie w dostępnych w handlu szczepionkach DTP i przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B stwierdzono, że używane są głównie żel wodorotlenku glinu i żel fosforanu glinu. Wiadomo, że adsorpcja białka na każdym z żeli glinowych spowodowana jest przez powierzchniowy ładunek elektryczny białka i żelu. Wiadomo także, że w fizjologicznym zakresie wartości pH żel wodorotlenku glinu ma dodatni powierzchniowy ładunek elektryczny, a żel fosforanu glinu ma ujemny powierzchniowy ładunek elektryczny (Vaccine Design PL 211 005 B1

The subunit and adjuvant approach, ed. M.F. Powell, M.J. Newman, 1995, str. 229-239). W przypadku, w którym współbieżnie używa się obu typów żelu glinowego, zachodzą pewne oddziaływania, które mogą powodować zwiększenie się wielkości cząstek w roztworze i zmniejszenie się ich zdolności adsorpcji białek. Ponadto, powierzchniowe ładunki elektryczne każdego antygenu składowego szczepionki przeciw zapaleniu wątroby wirusowemu B i szczepionki zespolonej są w fizjologicznym zakresie wartości pH ujemne. Dlatego odpowiednim adsorbentem jest żel wodorotlenku glinu.

W tradycyjnych szczepionkach składników sorpcyjnych takich jak żel wodorotlenku glinu lub żel fosforanu glinu używa się razem (Międzynarodowa Publikacja WO93/24148), ale biorąc pod uwagę powyższe przyczyny, twórcy sposobu według wynalazku uważają, że adsorbent szczepionki zespolonej powinien być solą tego samego typu, a żel wodorotlenku glinu, który jest użyty sposobem według wynalazku jako adsorbent jest ważnym czynnikiem biorącym udział w wytwarzaniu określonego stosunku adsorpcji każdego z antygenów składowych.

Jednak oczywiste jest, że termin adsorbent użyty sposobem według wynalazku obejmuje nie tylko żel wodorotlenku glinu, ale także jego odpowiedniki.

W szczepionce zespolonej wytworzonej sposobem według wynalazku antygeny składowe inne niż antygen wirusowego zapalenia typu B zawierają jako główny składnik białka, natomiast w przypadku szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B antygen ma postać cząsteczek zawierających warstwę fosfolipidową. Dlatego w celu zmniejszenia pewnych oddziaływań innych antygenów na składnik fosfolipidowy antygenu szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, który zawiera warstwę fosfolipidową, w czasie wytwarzania szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B jako szczepionki zespolonej sposobem według wynalazku korzystne jest dodanie neutralnego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak Polisorbat 20 (Tween 20), Polisorbat 80 (Tween 80) i Triton X-100.

Ponieważ miano szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B zmniejsza się jeżeli ilość neutralnego środka powierzchniowo czynnego jest duża, korzystne jest jeżeli neutralny środek powierzchniowo czynny dodaje się w stosunku wagowym poniżej 50% w odniesieniu do ilości białka antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby wirusowego B, ale ilość ta nie stanowi ograniczenia.

Sposobem według wynalazku jako antygen błonicy przygotowuje się Corynebacterium diphtheria PW No 8 i hoduje w odpowiednim podłożu do hodowli. Korzystna jest anatoksyna błonicy wytworzona przez detoksyfikację toksyny błonicy oczyszczonej w tradycyjny sposób. Ilość antygenu korzystnie wynosi 10-25 Lf w odniesieniu do dawki pediatrycznej. Jako antygen tężca przygotowuje się Clostridium tetani. Harvard i hoduje w odpowiednim podłożu do hodowli w warunkach beztlenowych. Właściwa jest anatoksyna tężca wytworzona przez detoksyfikację toksyny tężca oczyszczonej w tradycyjny sposób. Ilość antygenu korzystnie wynosi 1-5 Lf w odniesieniu do dawki pediatrycznej. Ponadto, antygen krztuśca hoduje się w odpowiednim podłożu do hodowli przy użyciu Bordetella pertussis, Tohama faza I, i tradycyjnym sposobem z nadsączu oczyszcza się i detoksyfikuje wiele rodzajów antygenów białkowych, włączając anatoksynę krztuśca. Odpowiednie są oczyszczone antygeny krztuśca lub antygen w postaci całych komórek bakterii krztuśca. Dostarcza się sposobu wytwarzania szczepionki zespolonej, w którym w przypadku różnych rodzajów antygenów całkowita ilość antygenów wynosi poniżej 20 pg PN w odniesieniu do dawki pediatrycznej, a w przypadku antygenu w postaci całych komórek bakterii krztuśca ilość antygenu korzystnie wynosi poniżej 20 OE w odniesieniu do dawki pediatrycznej. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania szczepionki zespolonej, której oczyszczone wielokrotne białka antygenowe obejmują detoksyfikowaną anatoksynę krztuśca i antygen nitkowatej hemaglutyniny (FHA).

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki zespolonej w taki sposób, że ilość rekombinowanego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B, który wytwarza się metodą inżynierii genetycznej jako antygen zapalenia wątroby typu B, wynosi 5-10 pg w odniesieniu do dawki pediatrycznej. Bardziej korzystnie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki zespolonej w taki sposób, że antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B jest zaadsorbowany na adsorbencie w wyniku mieszania przez 3-20 godzin w temperaturze 2-8°C. W celu znalezienia optymalnej zawartości adsorbentu do wytwarzania szczepionki zespolonej, dla każdego stężenia adsorbentu bada się stosunek adsorpcji każdego antygenu składowego. Stwierdzono, że kiedy końcowe stężenie jonów glinu w momencie ukończenia łączenia szczepionki wynosi poniżej 0,5 mg/ml, stosunek adsorpcji dla każdego antygenu jest stosunkowo niski (tak jak pokazano na Figurze 1). Ponadto, przepisy (WHO, Requirements for diphteria, tetanus, pertussis and combined

PL 211 005 B1 vaccines w Technical Report Series No 800, 1990, str. 87-179) zalecają, żeby do wytwarzania szczepionek używać żelu glinowego o stężenie jonów glinu poniżej 1,25 mg/ml. Dlatego, końcowe stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi korzystnie od 0,5 do 1,25 mg/ml, a bardziej korzystnie wynosi 0,7 mg/ml.

Ponadto w celu wykluczenia możliwości, że stosunek adsorpcji każdego antygenu składowego zmniejsza się w wyniku działania sił odpychających pomiędzy antygenami składowymi nawet po zakończeniu łączenia antygenów składowych, żeby porównać antygenowość i poziom wytwarzania przeciwciał dla każdego antygenu składowego, odpowiednie wartości przelicza się na względny procent: próbka, w której inny składnik niż żel wodorotlenku glinowego został wcześniej połączony i następnie dodano dodatkowo nadmiar żelu wodorotlenku glinowego i próbka do której dodano adsorbentu w tym samym stężeniu co poprzednio przed zakończeniem łączenia. Zmiana antygenowości i poziomu wytwarzania przeciwciał zmniejsza się kiedy dodaje się nadmiar adsorbantu, nawet po zakończeniu łączenia wszystkich składników (tak ja pokazano na Figurze 2).

W przypadku, kiedy do próbki dodaje się polisorbatu 80 (tween 80) antygenowość i miano antygenu wirusowego zapalenia typu B utrzymuje się (tak ja pokazano na Figurze 2). Spodziewamy się, że podobne wyniki można otrzymać nawet jeżeli używa się obojętnego środka czynnego powierzchniowo, takiego jak polisorbat 20 i triton X-100 w odpowiednim stężeniu. Na Figurze 2 pokazano, że próbka 1 i próbka 2, które są przygotowane w ten sposób, że odpowiednio, nadmiar żelu wodorotlenku glinowego dodaje się dodatkowo po zakończeniu łączenia wszystkich składników, i że adsorbent w tym samym stężeniu dodany jest przed zakończeniem łączenia wszystkich składników.

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki zespolonej w której stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi od 0,5 do 1,25 mg/ml. Bardziej korzystnie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki zespolonej, który obejmuje dodanie nadmiaru adsorbentu w ilości, która nie przekracza stężenia jonów glinu od 0,5 do 1,25 mg/ml, po połączeniu ochronnych antygenów zaadsorbowanych na adsorbencie. W korzystnym przykładzie sposobu według wynalazku, w szczepionce zespolonej możliwe jest utrzymanie oryginalnej adsorpcji każdego antygenu składowego i zwiększenie jej immunogenności.

W Korei i kilku innych krajach jako antygenu krztuśca używa się oczyszczonego antygenu krztuśca. Ponieważ, w niektórych krajach Ameryki i krajach trzeciego świata używa się jako antygenu całych komórek bakterii krztuśca po ich detoksyfikacji, sposobem według wynalazku rozszerzono więc zakres możliwych do użycia szczepionek poprzez zbadanie sposobu łączenia antygenów przy użyciu antygenu z całych komórek bakterii krztuśca. W tym przypadku łączenie prowadzi się tym samym sposobem, jakiego używa się w przypadku oczyszczonego antygenu krztuśca, i w ten sposób otrzymuje się próbkę zachowującą immunogenność każdego ze składników (tak jak pokazano w Tablicy 1).

W przypadku szczepionki DTP, która zawiera antygen z całych komórek bakterii krztuśca, jako adsorbentu używa się żelu fosforanu glinowego. Jednakże do wytworzenia szczepionki zespolonej z antygenem zapalenia wątroby wirusowego B, szczepionkę DTP przygotowuje się przy użyciu żelu wodorotlenku glinowego. W tym przypadku immunogenność antygenu krztuśca spadła, ale kiedy po zakończeniu łączenia wszystkich składników, dodatkowo dodano nadmiar żelu wodorotlenku glinowego (próbka A) udało się utrzymać pożądaną immunogenność. Jako odnośnik przygotowano próbkę B, w ten sposób, że adsorbent w tym samym stężeniu dodano przed zakończeniem łączenia wszystkich składników.

Bezpieczeństwo i wydajność szczepionki zespolonej wytworzonej sposobem według wynalazku sprawdzono w oparciu o następujące metody. Po pierwsze, gryzoniom podano nadmiar szczepionki zespolonej i metodą biopsji sprawdzono, że nie powstały żadne uszkodzenia (wyników nie zamieszczono). Ponadto, zmierzono poziom przeciwciał przeciw każdemu antygenowi w grupie, w której szczepionkę zespoloną podano małpom (grupa 2) i w grupie w której małpom podano współbieżnie szczepionkę DPT i szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B osobno (grupa 1). Gdy testem t porównano dla każdej grupy ilość przeciwciał wytworzonych w grupie 1 i w grupie 2 okazało się, że szczepionka zespolona wykazuje podobną albo lepszą immunogenność w stosunku do każdego z antygenów niż współbieżnie podane szczepionki każdego z tych antygenów (tak jak pokazano na Figurze 3. Wyników statystycznych nie pokazano).

Podsumowując, sposobem według wynalazku opracowano sposób łączenia, którym minimalizuje się oddziaływania pomiędzy różnymi składnikami immunologicznymi, i którym nie powoduje się zmniejszenia działania immunogennego składników. Dzieląc każdy składnik immunologiczny użyty w szczepionce zespolonej pod kątem właściwości chemicznych i fizycznych, można je podzielić na

PL 211 005 B1 antygeny białkowe (antygen błonicy, antygen tężca, oczyszczony antygen krztuśca), antygeny zawierające białka i warstwę fosfolipidową (antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B) i antygeny zawierające zabite całe komórki (antygen pełnokomórkowy krztuśca). Dlatego, na podstawie chemicznej i fizycznej charakterystyki składników można przewidzieć możliwość połączenia różnych antygenów z pojedynczych szczepionek. Tak więc w szczepionce zespolonej wytworzonej sposobem według wynalazku możliwe jest połączenie dodatkowej szczepionki przeciw innej chorobie (grypa, polio), przed którą dzieci powinny być chronione.

Główny czas szczepienia szczepionką zespoloną wytworzoną sposobem według wynalazku może być taki jak okres szczepienia szczepionką DTP lub okres szczepienia szczepionką przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B. W przypadku kiedy w organizmie matki występuje antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B, korzystnie jest szczepić trzy razy, drugiego, czwartego i szóstego miesiąca. W przypadku kiedy w organizmie matki nie występuje antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B, właściwym czasem szczepienia jest jednorazowe zaszczepienie po urodzeniu, a następnie zaszczepienie szczepionką zespoloną. Właściwym sposobem szczepienia w odniesieniu do dzieci jest szczepienie przez wstrzyknięcie domięśniowe lub podskórne. Dawka antygenu błonicy, antygen tężca, krztuśca i wirusowego zapalenia typu B w szczepionce zespolonej wytworzonej sposobem według wynalazku jest taka sama jak dawka antygenu dla dzieci w każdej pojedynczej szczepionce.

P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie antygenu wirusowego zapalenia wątroby typu B

Hoduje się komórki drożdży zdolne do ekspresji antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia wątroby typu B dzięki metodom inżynierii genetycznej. 1 kg precypitatu komórek drożdży otrzymanego przez wirowanie zawiesza się w stosunku 1:2 w roztworze buforu (0,5 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,01% Thimerosal, 0,1 M fosforan, pH 7,0). Zawiesinę przepuszcza się przez szklane złoże rozdrabniające (lub Dynomil) i w ten sposób rozbija się ściany komórkowe. Do otrzymanego roztworu dodaje się obojętnego środka powierzchniowo czynnego (z grupy Tweenu lub z grupy Tritonu) do stężenia 0,5% i miesza na mieszadle w temperaturze 4°C do uzyskania jednorodności. Do otrzymanego roztworu dodaje się wodorotlenku sodowego do uzyskania pH 11 i miesza na mieszadle w temperaturze 4°C przez 5 godzin. Do roztworu dodaje się rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego do uzyskania pH 4. Precypitat usuwa się przez wirowanie w wirówce (ROTOR: JA-14, Beckman Inc., USA) z szybkością 6000 obrotów/minutę przez 15 minut. Wierzchnia warstwa roztworu zawiera antygen powierzchniowy wirusowego zapalenia wątroby typu B. Kwasowość wierzchniej warstwy roztworu doprowadza się do wartości pH 7. Do tak przygotowanej wierzchniej warstwy roztworu dodaje się krzemionki i miesza w temperaturze 4-25°C przez 3-16 godzin, co powoduje zaadsorbowanie się antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia typu B na krzemionce. Żelem krzemionkowym którego korzystnie używa się sposobem według wynalazku jest Aerosil 380 (Degussa, USA), który zawiera lekko ₂ uwodnioną krzemionkę i krzemionkę bezwodną o rzeczywistej powierzchni 100-500 mm²/g. W celu usunięcia zanieczyszczeń z krzemionki na której zaadsorbował się antygen powierzchniowy wirusowego zapalenia wątroby typu B, powstający roztwór przemywa się dwa razy roztworem buforu fosforan sodowy - chlorek sodowy, pH 7. Przemytą krzemionkę poddaje się działaniu roztworu buforu węglanu sodowego pH 9,6 przez około 2 godziny, co powoduje desorpcję antygenu powierzchniowego. Wyizolowany w ten sposób antygen powierzchniowy ma czystość białka powyżej 90% w roztworze. Otrzymany roztwór przepuszcza się przez DEAE-Sepharose (Pharmacia, Szwecja) zrównoważoną przy użyciu buforu sodowego. Powoduje to specyficzne związanie antygenu powierzchniowego i usunięcie substancji rozdzielonych przez tę kolumnę przy użyciu tego buforu. Zanieczyszczenia lekko związane z kolumną wymywa się przy użyciu roztworu buforu zawierającego 0,05~0,1 M chlorku sodowego. Następnie przy użyciu roztworu tego buforu zawierającego 0,2 M chlorku sodowego wymywa się antygen powierzchniowy zapalenia wątroby wirusowego B. Eluat zatęża się metodą ultrafiltracji błonowej, zdolnej do rozdzielenia substancji o masie cząsteczkowej powyżej 100 000. Precypitat oddziela się przez wirowanie i usuwa, a wierzchni roztwór zbiera się i poddaje chromatografii żelowej (Sepharose CL-4B, Pharmacia, Szwecja). Jako antygenu wirusowego zapalenia typu B używa się frakcji zawierających antygen powierzchniowy, którego czystość potwierdzono metodą elektroforezy. W celu zmniejszenia oddziaływań pomiędzy antygenami powierzchniowymi zapalenia wątroby dodaje się Tween 80 w ilości 0, 5, 10 pg na 1 ml i obserwuje jego działanie (tak jak pokazano na Figurze 2).

PL 211 005 B1

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie anatoksyny błonicy

Corynebacterium diphteria PW No. 8 hoduje się w temperaturze 35°C przez 24 godziny w agarze odżywczym jako podłoże do hodowli (Difco, USA) i przesiewa się dwa razy. Jedną z kolonii hoduje się w temperaturze 35°C przez 24 godziny w 2 ml podłoża do hodowli z wyciągiem z mózgu i serca (Difco, USA). 1,2 ml tej hodowli dodaje się do 300 ml zmodyfikowanego podłoża Mullera (patrz: Stainer i wsp., Canadian J. Microbiol., 14:155, 1968) i hoduje się w temperaturze 35°C przez 36 godzin. Po zakończeniu hodowli, komórki usuwa się z podłoża do hodowli, zbiera się roztwór toksyny i dodaje do niego siarczanu amonowego w temperaturze 4°C. Stężenie końcowe doprowadza się do 25% (wagowo/objętościowych), a kwasowość do pH 8,0. Podłoże do hodowli z ustawionym pH i stężenie soli nanosi się kroplami na kolumnę z fenylosefarozową, uprzednio zrównoważoną 10 mM roztworem buforu Tris, pH 8,0, zawierającym do 25% (wagowo/objętościowych) siarczanu amonowego. W celu usunięcia zanieczyszczeń, które nie są związane przez kolumnę, przemywa się ją kolejno roztworem buforu takiego samego jak roztwór do równoważenia kolumny i 10 mM roztworem buforu Tris, pH 8,0, zawierającym do 15% (wagowo/objętościowych) siarczanu amonowego. Toksynę wymywa się 10 mM roztworem buforu Tris (pH 8,0) bez soli. Wymyty roztwór toksyny błonicy zbiera się i dializuje wobec 10 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) zawierającego 150 mM chlorku sodowego. Po zakończeniu dializy dodaje się formaliny do stężenia końcowego 0,05% (wagowo/objętościowe), i powstający roztwór pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie do roztworu dodaje się lizyny do stężenia końcowego 0,05 M i powstający roztwór pozostawia się w temperaturze 37°C na 4 tygodnie w celu detoksyfikacji. W celu całkowitego usunięcia formaliny roztwór anatoksyny dializuje się wobec 10 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) zawierającego chlorek sodowy, i dodaje się thimerosal do stężenia końcowego 0,01% (wagowo/objętościowe). Tak wytworzonego roztworu używa się jako roztworu anatoksyny błonicy.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie anatoksyny tężca

Clostridium tetanii (szczep Harward) hoduje się metodą hodowli w półpłynnym agarze w sterylnym podłożu agarowym z żółcią (Difco, USA). Kilka kolonii z takiej hodowli przenosi się do 2 ml podłoża do hodowli z wyciągiem z mózgu i serca (Difco, USA), o obniżonym poziomie tlenu, zawierającego 0,3% (wagowo/objętościowego) ekstraktu drożdżowego (Difco, USA) i hoduje się w temperaturze 35°C przez 24 godziny w warunkach beztlenowych. Taką hodowlę dodaje się do 500 ml całkowicie nasyconego azotem podłoża do hodowli z wyciągiem z mózgu i serca (Difco, USA) zawierającego 0,3% (wagowo/objętościowego) ekstraktu drożdżowego (Difco, USA) i hoduje się w temperaturze 35°C przez 7 dni w warunkach beztlenowych. Po zakończeniu hodowli, komórki usuwa się z podłoża do hodowli, zbiera się roztwór toksyny i dodaje do niego siarczanu amonowego w temperaturze 4°C do stężenia końcowego 60% (wagowo/objętościowych) i miesza przez 24 godziny. Po wymieszaniu precypitat odzyskuje się przez wirowanie. Precypitat rozpuszcza się w niewielkiej ilości wody destylowanej i usuwa się materiał nierozpuszczalny. Powstający roztwór nanosi się kroplami się na kolumnę Sephagrill S-100, uprzednio zrównoważoną 10 mM roztworem buforu Tris, pH 8,0, zawierającym do 0,5 M chlorku sodowego. Tego samego roztworu buforu używa się do wymycia toksyny. Roztwór toksyny tężca zbiera się i dializuje wobec 10 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) zawierającego 150 mM chlorku sodowego. Po zakończeniu dializy dodaje się formaliny do stężenia końcowego 0,025% (wagowo/objętościowe) i roztwór pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie do roztworu dodaje się lizyny i wodorowęglanu sodowego do stężenia końcowego odpowiednio 0,05 M i 0,04 M, i pozostawia się w temperaturze 37°C na 4 tygodnie w celu detoksyfikacji. Po detoksyfikacji w celu całkowitego usunięcia formaliny roztwór anatoksyny dializuje się wobec 10 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) zawierającego 150 mM chlorku sodowego. Następnie dodaje się thimerosal do stężenia końcowego 0,01% (wagowo/objętościowe). Tak wytworzonego roztworu używa się jako roztworu anatoksyny tężca.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie oczyszczonego białkowego antygenu krztuśca

Bordetella pertussis, Tahoma faza I hoduje się w agarowym podłożu do hodowli Bodet-Gengo (Difco, USA) zawierającym 15% krwi królika w temperaturze 35°C przez 72 godziny pasażując dwa razy. Kilka kolonii z takiej hodowli przenosi się do 50 ml podłoża do hodowli Stanor-sholte i hoduje się w temperaturze 35°C przez 48 godzin. Taką hodowlę dodaje się do 500 ml podłoża do hodowli Stanor-sholte (patrz Imazumi i wsp., Infect.-Immun., 1983, tom 41, strona 1138) i hoduje się w temperatuPL 211 005 B1 rze 35°C przez 36 godzin. W celu zahamowania wzrostu bakterii krztuśca, do hodowli dodaje się następnie 10% wodnego roztworu timerosalu do stężenia końcowego 0,01% i komórki bakteryjne usuwa się przez wirowanie. Do otrzymanego roztworu dodaje się trzy objętości wody destylowanej i dobrze miesza. Za pomocą 1 N kwasu siarkowego obniża się pH roztworu do 6,0. Powstający roztwór nanosi się kroplami na kolumnę CM-Sepharose, uprzednio zrównoważoną 10 mM roztworem buforu fosforanu sodowego, pH 6,0. W celu usunięcia zanieczyszczeń, które nie są związane przez kolumnę, przemywa się ją kolejno roztworem buforu takiego samego jak roztwór do równoważenia kolumny, a zanieczyszczenia lekko związane z kolumną wymywa się roztworem buforu takiego samego jak roztwór do równoważenia kolumny zawierającego 100 mM chlorku sodowego. W momencie w którym z kolumny nie wymywają się już zanieczyszczenia, związany z nią materiał wymywa się liniowym gradientem utworzonym przez bufor do równoważenia kolumny zawierający 100 mM chlorku sodowego i zawierający 600 mM chlorku sodowego o tej samej objętości. W ten sposób rozdziela się frakcje zawierające białkowe antygeny krztuśca, takie jak toksyna krztuśca i FHA (hemaglutynina nitkowata). Frakcję antygenową rozcieńcza się dwoma objętościami 10 mM roztworu buforu fosforanu sodowego, pH 8,0, do otrzymania pH 8,0. Powstający roztwór nanosi się kroplami na kolumnę hydroksyapatytu, uprzednio zrównoważoną 10 mM roztworem buforu fosforanu sodowego, pH 8,0. W celu usunięcia zanieczyszczeń, które nie są związane przez kolumnę, przemywa się ją roztworem buforu takiego samego jak roztwór do równoważenia kolumny i zawierającego 100 mM chlorku sodowego. W celu oddzielenia frakcji zawierającej toksynę krztuśca kolumnę wymywa się nanosząc kroplami 80 mM roztwór buforu fosforanu sodowego pH 8,0 zawierający 100 mM chlorku sodowego. Po oddzieleniu toksyny krztuśca, w celu oddzielenia frakcji zawierającej FHA (hemaglutyninę nitkowatą) kolumnę wymywa się nanosząc kroplami 250 mM roztwór buforu fosforanu sodowego pH 8,0 zawierający 100 mM chlorku sodowego. Rozdzielone toksynę krztuśca i FHA (hemaglutyninę nitkowatą) dializuje się wobec 10 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) zawierającego 0,15% chlorku sodowego w temperaturze 4°C.

Do dializowanego roztworu toksyny krztuśca dodaje się glicerolu i aldehydu glutarowego do stężenia końcowego odpowiednio 50% (wagowo/objętościowy) i 0,05% (wagowo/objętościowy) i roztwór pozostawia się na 4 godziny w temperaturze 37°C w celu detoksyfikacji. W celu zakończenia procesu detoksyfikacji do roztworu dodaje się asparaginianu sodowego do stężenia końcowego 0,025 M. Do dializowanego roztworu FHA (hemaglutyniny nitkowatej) dodaje się glicerolu i formaliny do stężenia końcowego odpowiednio 50% (wagowo/objętościowy) i 0,025% (wagowo/objętościowy) i roztwór pozostawia się na 24 godziny w temperaturze 37°C w celu detoksyfikacji. W celu zakończenia procesu detoksyfikacji do roztworu dodaje się lizyny do stężenia końcowego odpowiednio 0,025 M. Po detoksyfikacji każdą próbkę dializuje się wobec 10 mM roztworu buforu fosforanu sodowego (pH 7,4) zawierającego 0,15% chlorku sodowego w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się timerosal do stężenia końcowego 0,01% (wagowo/objętościowy). Detoksyfikowany roztwór toksyny krztuśca i roztwór FHA (hemaglutyniny nitkowatej) miesza się w stosunku 1:4 i używa się jako antygenu białkowego krztuśca.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie pełnokomórkowego antygenu krztuśca

Bordetella pertussis, Tahoma faza I hoduje się w agarowym podłożu do hodowli Bodet-Gengo (Difco, USA) zawierającym 15% krwi królika w temperaturze 35°C przez 72 godziny pasażując dwa razy. Kilka kolonii z takiej hodowli przenosi się do 50 ml podłoża do hodowli Stanor-sholte i hoduje się w temperaturze 35°C przez 48 godzin. Taką hodowlę dodaje się do 500 ml podłoża do hodowli Stanor-sholte (patrz Imazumi i wsp., Infect.-Immun., 1983, tom 41, strona 1138) i hoduje się w temperaturze 35°C przez 36 godzin. W celu zahamowania wzrostu bakterii krztuśca, do hodowli dodaje się następnie 10% wodnego roztworu timerosalu do stężenia końcowego 0,01% i komórki bakteryjne zbiera się przez wirowanie. Otrzymaną zawiesinę bakterii dializuje się wobec 10 mM roztworu buforu fosforanowego (pH 7,4) zawierającego 0,15% chlorku sodowego w temperaturze 4°C. Do dializowanej zawiesiny bakterii dodaje się formaliny do stężenia końcowego odpowiednio 0,025% (wagowo/objętościowy) i roztwór pozostawia się na 4 tygodnie w temperaturze 37°C w celu detoksyfikacji. W celu zakończenia procesu detoksyfikacji do roztworu dodaje się lizyny do stężenia końcowego odpowiednio 0,025 M. Po detoksyfikacji każdą próbkę dializuje się wobec 10 mM roztworu buforu fosforanu sodowego (pH 7,4) zawierającego 0,15% chlorku sodowego i dodaje się timerosal do stężenia końcowego 0,01% (wagowo/objętościowe). Takiej zawiesiny bakterii używa się jako pełnokomórkowego antygenu białkowego krztuśca.

PL 211 005 B1

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie szczepionki zespolonej zawierającej oczyszczony antygen krztuśca

Etap 1. Wytwarzanie szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B

Szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B wytwarza się przy użyciu antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia typu B wytworzonego tak jak opisano w Przykładzie 1. Roztwór wodorotlenku glinowego wytwarza się przez dodanie żelu wodorotlenku glinowego do roztworu buforu fosforanowego. Powstający roztwór miesza się wolno i kroplami dodaje się roztwór opisanego powyżej antygenu. W celu wytworzenia szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B mieszaninę miesza się powoli na mieszadle w temperaturze 4°C przez 15 godzin. W tym czasie stężenie antygenu powierzchniowego zapalenia wątroby wynosi 60 pg/ml, czyli jest trzy razy bardziej stężony niż powszechnie używany antygen powierzchniowy zapalenia wątroby wirusowego B. W przypadku pierwszej próbki stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 0,9 mg/ml. W przypadku drugiej próbki stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 1,5 mg/ml (tak jak pokazano na Figurze 2).

Etap 2. Wytwarzanie szczepionki zespolonej DTP

Szczepionkę zespoloną DTP wytwarza się używając antygenów wytworzonych w drugim, trzecim i czwartym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku. Roztwór wodorotlenku glinowego wytwarza się przez dodanie żelu wodorotlenku glinowego do roztworu buforu fosforanowego metodą tradycyjną. W celu wytworzenia szczepionki zespolonej DTP powstający roztwór miesza się wolno i kroplami dodaje się roztwór każdego z antygenów miesza się powoli na mieszadle, uzyskując w ten sposób jednorodną adsorpcję antygenów. W tym czasie stężenie każdego z antygenów jest 1,5 raza większe w porównaniu ze stężeniem każdego z antygenów składowych w tradycyjnej szczepionce DTP. Stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 0,3 mg/ml.

Etap 3. Wytwarzanie szczepionki zespolonej DTP-zapalenie wątroby wirusowe B

Szczepionkę DTP i szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B wytwarza się tak jak opisano w Etapie 1 i Etapie 2 i powoli miesza w stosunku objętościowym 2:1. W przypadku pierwszej próbki dodaje się nadmiar żelu wodorotlenku glinowego, tak że stężenie końcowe jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 0,7 mg/ml. W celu wytworzenia stabilnej szczepionki zespolonej, która nie oddziałuje z innymi składnikami, zawiesinę miesza się na mieszadle w temperaturze 25°C przez 1 godzinę, W przypadku drugiej próbki nie dodaje się nadmiaru żelu wodorotlenku glinowego, a w celu wytworzenia stabilnej szczepionki zespolonej, która nie oddziałuje z innymi składnikami, zawiesinę miesza się na mieszadle w temperaturze 25°C przez 1 godzinę. Stężenie końcowe jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego w szczepionkach zespolonych wytworzonych z pierwszej i drugiej próbki wynosi 0,7 mg/ml. Do badań miana przeciwciał, kompozycja szczepionki zespolonej zawierała 20 pg antygenu powierzchniowego zapalenia wątroby wirusowego B, 25 Lf anatoksyny błonicy, 3 Lf anatoksyny tężca, 2,5 pg PN anatoksyny krztuśca i 10 pg PN antygenu FHA krztuśca (FHA krztuśca (ciałko nitkowate krztuścowej aglutyniny krwi)) na 1 ml (tak jak pokazano na Figurze 2).

P r z y k ł a d 7

Wytwarzanie szczepionki zespolonej zawierającej pełnokomórkowy antygen krztuśca

Etap 1. Wytwarzanie szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B

Szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B wytwarza się przy użyciu antygenu powierzchniowego wirusowego zapalenia typu B wytworzonego tak jak opisano w Przykładzie 1. W celu wytworzenia roztworu wodorotlenku glinowego żel wodorotlenku glinowego dodaje się do roztworu buforu fosforanowego. Powstający roztwór miesza się wolno i kroplami dodaje się roztwór opisanego powyżej antygenu. W celu wytworzenia szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B mieszaninę miesza się powoli na mieszadle w temperaturze 4°C przez 15 godzin. W tym czasie stężenie antygenu powierzchniowego zapalenia wątroby wynosi 60 pg/ml, czyli jest trzy razy bardziej stężony niż powszechnie używany antygen powierzchniowy zapalenia wątroby wirusowego B. W przypadku pierwszej próbki stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 0,9 mg/ml. W przypadku drugiej próbki stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 1,5 mg/ml (tak jak pokazano na Figurze 2).

Etap 2. Wytwarzanie szczepionki zespolonej DTP

Szczepionkę zespoloną DTP wytwarza się używając antygenów wytworzonych w drugim, trzecim i piątym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku. Roztwór wodorotlenku glinowego wytwarza się przez dodanie żelu wodorotlenku glinowego do roztworu buforu fosforanowego metodą tradycyjną. Mieszając wolno powstającą zawiesinę, kroplami dodaje się roztwór każdego z powyżPL 211 005 B1 szych antygenów i miesza się powoli na mieszadle do całkowitego wymieszania. W ten sposób uzyskuje się jednorodną adsorpcję antygenów konieczną do wytworzenia szczepionki zespolonej DTP. W tym czasie stężenie każdego z antygenów jest 1,5 raza większe w porównaniu ze stężeniem każdego z antygenów składowych w tradycyjnej szczepionce DTP. Stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 0,3 mg/ml.

Etap 3. Wytwarzanie szczepionki zespolonej DTP-zapalenie wątroby wirusowe B

Szczepionkę DTP i szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B wytwarza się tak jak opisano w Etapie 1 i Etapie 2 i powoli miesza w stosunku objętościowym 2:1. W przypadku pierwszej próbki dodaje się nadmiar żelu wodorotlenku glinowego, tak że stężenie końcowe jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego wynosi 0,7 mg/ml. W celu wytworzenia stabilnej szczepionki zespolonej, która nie oddziałuje z innymi składnikami, powstającą zawiesinę miesza się na mieszadle w temperaturze 25°C przez 1 godzinę. W przypadku drugiej próbki nie dodaje się nadmiaru żelu wodorotlenku glinowego, a w celu wytworzenia stabilnej szczepionki zespolonej, która nie oddziałuje z innymi składnikami, zawiesinę miesza się na mieszadle w temperaturze 25°C przez 1 godzinę. Stężenie końcowe jonów glinu w żelu wodorotlenku glinowego w szczepionkach zespolonych wytworzonych z 1 i 2 próbki wynosi 0,7 mg/ml. Do badań miana przeciwciał, kompozycja szczepionki zespolonej zawierała 20 μg antygenu powierzchniowego zapalenia wątroby wirusowego B, 50 Lf anatoksyny błonicy, 10 Lf anatoksyny tężca, 20 OE pełnokomórkowego antygenu krztuśca w przeliczeniu na 1 ml (tak jak pokazano na Figurze 2).

P r z y k ł a d 8

Badanie antygenowości wytworzonej szczepionki zespolonej

Badanie antygenowości szczepionki zespolonej wytworzonej według Przykładów 6 i 7 wykonuje się enzymatyczną metodą immunosorbcyjną (EIA) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i przeciwciał poliklonalnych, biorąc pod uwagę zawartość każdego antygenu i porównując ze standardami dla każdego antygenu.

Ponadto, w celu zmierzenia współczynnika adsorpcji każdego antygenu, zaadsorbowane na solach glinu antygeny usuwa się przez wirowanie. Wykorzystując wierzchni roztwór mierzy się ilość oddzielonego antygenu.

Średnie dla każdego wyniku pokazane są na Figurach 1 i 2 pokazują względną antygenowość każdego antygenu.

P r z y k ł a d 9

Badanie wytwarzania przeciwciał przez szczepionkę zespoloną

Badanie wytwarzania przeciwciał przez antygen powierzchniowy zapalenia wątroby wirusowego B

Szczepionkę zespoloną i szczepionkę przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B wytwarza się tak jak opisano w Przykładach 6 i 7 i szczepi się nimi myszy ICR, grupując 16 myszy w grupę 1. Po 18 dniach z myszy ICR pobiera się krew. Z krwi oddziela się surowicę. Poziom przeciwciał przeciw antygenowi powierzchniowemu zapalenia wątroby wirusowemu B oznacza się metodą EIA (enzymatyczny test immunosorbcyjny) w jednostkach międzynarodowych na mililitr (lU/ml) i oblicza się średnią geometryczną miana przeciwciał. Miano szczepionki zespolonej oblicza się w odniesieniu do szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B.

Na Figurach 2c i 2d pokazano względne miano przeciwciał szczepionki zespolonej w odniesieniu do każdego antygenu, a Tablica 1 pokazuje wartości liczbowe każdego miana.

Badanie wytwarzania przeciwciał przez antygen błonicy

Szczepionkę zespoloną i szczepionkę DTP wytwarza się tak jak opisano w Przykładach 6 i 7 i szczepi się nimi myszy ICR, grupując 16 myszy w grupę 1. Po 28 dniach z myszy ICR pobiera się krew. Z krwi oddziela się surowicę. Poziom przeciwciał przeciw antygenowi błonicy oznacza się metodą EIA (enzymatyczny test immunosorbcyjny) w jednostkach międzynarodowych na mililitr (lU/ml) i oblicza się średnią geometryczną miana przeciwciał. Miano szczepionki zespolonej oblicza się w odniesieniu do szczepionki DTP.

Na Figurach 2c i 2d pokazano względne miano przeciwciał szczepionki zespolonej w odniesieniu do każdego antygenu, a Tablica 1 pokazuje wartości liczbowe każdego miana.

Badanie wytwarzania przeciwciał przez antygen tężca

Szczepionkę zespoloną i szczepionkę DTP wytwarza się tak jak opisano w Przykładach 6 i 7 i szczepi się nimi myszy ICR, grupując 16 myszy w grupę 1. Po 28 dniach z myszy ICR pobiera się krew. Z krwi oddziela się surowicę. Poziom przeciwciał przeciw antygenowi tężca oznacza się metodą EIA (enzymatyczny test immunosorbcyjny) w jednostkach międzynarodowych na mililitr (lU/ml) i obli12

PL 211 005 B1 cza się średnią geometryczną miana przeciwciał. Miano szczepionki zespolonej oblicza się w odniesieniu do szczepionki DTP.

Na Figurach 2c i 2d pokazano względne miano przeciwciał szczepionki zespolonej w odniesieniu do każdego antygenu, a Tablica 1 pokazuje wartości liczbowe każdego miana.

Badanie wytwarzania przeciwciał przez antygen krztuśca

Szczepionkę zespoloną i szczepionkę DTP wytwarza się tak jak opisano w Przykładach 6 i 7 i szczepi się nimi myszy ICR, grupując 16 myszy w grupę 1. Po 28 dniach z myszy ICR pobiera się krew. Z krwi oddziela się surowicę. Poziom przeciwciał przeciw antygenowi krztuśca oznacza się metodą EIA (enzymatyczny test immunosorbcyjny) w jednostkach międzynarodowych na mililitr (lU/ml) i oblicza się średnią geometryczną miana przeciwciał. Miano szczepionki zespolonej oblicza się w odniesieniu do szczepionki DTP.

Na Figurach 2c i 2d pokazano względne miano przeciwciał szczepionki zespolonej w odniesieniu do każdego antygenu, a Tablica 1 pokazuje wartości liczbowe każdego miana.

T a b l i c a 1

	Szczepionka DTwP (jako adsorbent fosforan glinowy)	Szczepionka DTwP (jako adsorbent wodorotlenek glinowy)	Szczepionka zespolona DTwP-HepB (próbka A)	Szczepionka zespolona DTwP-HepB (próbka B)	Miano
Siła błonicy (IU/ml)	>800	249,0	601,1	128,1	Ponad 30 lU/ml
Siła tężca (IU/ml)	176,5	196,0	216,9	230,7	Ponad 40 IU/ml
Siła krztuśca (IU/ml)	20,2	3,2	25,4	5,5	Ponad 8 IPU/ml
Względna siła wirusowego zapalenia typu B (lU/ml)	---	---	196,8	103,9	Równa lub większa niż Wartość Próbki standardowej

P r z y k ł a d 10

Badanie porównawcze skuteczności w małpach

Badanie prowadzi się w celu wykazania immunogenności szczepionki zespolonej w naczelnych i porównania jej z tradycyjnymi pojedynczymi szczepionkami. Szczepionkę zespoloną wytwarza się tak jak opisano w Przykładzie 6 i szczepi się nią sześć małp (grupa 2) zawierającą taką samą liczbę samców i samic. Jednocześnie każdym składnikiem szczepionki szczepi się sześć małp (grupa 1) zawierającą taką samą liczbę samców i samic. Tymi samymi szczepionkami szczepi się powtórnie każdą grupę 30 i 60 dnia. Od każdego zwierzęcia doświadczalnego pobiera się krew 1, 29, 58, i 86 dnia po podaniu pierwszej dawki i metodą ELIZA odpowiednią dla surowicy małp oznacza się miano przeciwciał przeciw każdej z chorób.

Figura 3 przedstawia średnią geometryczną miana przeciwciał w każdej grupie przeciw każdemu antygenowi.

Zastosowanie w przemyśle

Sposób według wynalazku umożliwia wytwarzanie szczepionki zespolonej zdolnej do jednoczesnego zapobiegania chorobom, takim jak błonica, tężec, krztusiec i wirusowe zapalenie wątroby typu B, przed którymi dzieci powinny być chronione. Dzięki szczepionce zespolonej wytworzonej sposobem według wynalazku możliwe jest jednoczesne zapobieganie chorobom, takim jak błonica, tężec, krztusiec i zapalenie wątroby wirusowe B, przed którymi dzieci powinny być chronione.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania szczepionki zespolonej, znamienny tym, że:

   - dostarcza się poszczególne antygeny ochronne zawierające antygen błonicy, antygen tężca, antygen krztuśca i antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B;

   PL 211 005 B1

   - adsorbuje się niezależnie każdy antygen ochronny na adsorbencie będącym żelem wodorotlenku glinu; i

   - łączy się każdy niezależnie zaadsorbowany antygen ochronny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto dodaje się dodatkowy żel wodorotlenku glinowego po połączeniu każdego niezależnie zaadsorbowanego antygenu ochronnego.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że końcowe stężenie jonów glinu w żelu wodorotlenku glinu wynosi od 0,5 do 1,25 mg/ml.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zespolony antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B jest rekombinowanym powierzchniowym antygenem wirusa zapalenia wątroby typu B w ilości 5-10 pg na dawkę.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera także etap dodania neutralnego środka powierzchniowo czynnego, wybranego z grupy obejmującej monolaurynian polioksyetylenosorbitolu (20), monooleinian polioksyetylenosorbitolu (80) i eter fenylowy polioksyetylenu oktylu.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że antygen wirusowego zapalenia wątroby typu B jest łączony z wodorotlenkim glinu przez mieszanie na mieszadle w temperaturze 2-8°C przez 3-20 godzin.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen błonicy jest toksoidem błonicy w ilości 10-25 Lf na dawkę.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen tężca jest toksoidem tężca w ilości 1-5 Lf na dawkę.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen krztuśca jest oczyszczonym antygenem krztuśca w ilości mniejszej niż 20 pg PN na dawkę; lub pełnokomórkowym antygenem krztuśca w ilości mniejszej niż 20 OU na dawkę.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że oczyszczony antygen krztuśca jest toksoidem krztuśca, FHA krztuśca (nitkowatą hemaglutyniną) lub ich mieszaniną.
11. 11. Szczepionka zespolona wytworzona zgodnie z jednym ze sposobów zdefiniowanych w zastrz. 1 do 10.