JP5695073B2 - 骨発生マーカーとしてのhla−gのアイソフォームの使用 - Google Patents
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Description
- 骨細胞外マトリックス(約22%〜25%)。これは実質的にI型コラーゲンと、さらにオステオネクチンおよびオステオカルシンなどのその他のタンパク質から構成されている有機マトリックスである、
- カルシウムに非常に富むミネラルマトリックス(約70%)、
- 2種類の骨の細胞:骨芽細胞性細胞(骨芽細胞、骨細胞およびライニング細胞。これらは間葉系幹細胞に由来する)および破骨細胞(造血幹細胞に由来する細胞)、ならびに
- 水(5%〜8%)。
ライニング細胞は、扁平で細長い形状を有する休止細胞であり、骨形成(bone formation)も骨吸収もなされていない不活性な区画における骨の表面に存在している。該細胞が刺激されると、それらは骨芽細胞に分化することができる。
破骨細胞は直径20〜100μmの多核細胞である。これらは骨吸収を担っている。
- アルカリフォスファターゼ(ALPまたはALPL)は偏在酵素である。ヒトでは、6種のアイソエンザイム:肝臓、腸、骨、腎臓、胎盤および腫瘍のアイソエンザイムに分類することができる。正常な肝機能を有する成人では、ALPの血清活性のおよそ60〜70%は肝臓に由来し、30〜40%は骨に由来し、5%未満は腸に由来する。骨ALPの血中レベル(circulating level)は、骨芽細胞の活性のみならず、その肝臓での除去にも依存している;したがって、肝臓の状態により、血中の骨ALPのレベルが変化しうる;
近年、本発明者らの幾人かは、培養中の間葉系幹細胞(MSC)がHLA-G5を分泌し、それにより、TおよびNK(ナチュラルキラー)免疫反応について免疫抑制活性を発揮することを示した(Selmaniら、2008)。
成人骨髄に由来する間葉系幹細胞は、骨芽細胞の前駆体、軟骨芽細胞の前駆体および脂肪細胞の前駆体である多能性細胞である(Friedensteinら、1976;Pittengerら、1999)。
a)骨折と診断された対象からの生物学的液体の検体における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度を測定する工程と、
b)工程a)で測定したHLA-Gのアイソフォームの濃度を、健常対象の生物学的液体における該HLA-Gのアイソフォームの基準濃度と比較する工程と
を含み、上記対象からの上記生物学的液体の検体において、該基準濃度よりも高い、少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度が、上記対象の骨再形成(骨発生)を示す、
骨折と診断された対象の骨再形成のインビトロでのモニタリング方法である。
本発明の目的のために、用語「健常対象」とは、骨の損傷のない、すなわち骨折していない対象を意味することを意図している。
本発明の目的のために、用語「生物学的液体」とは、血液およびその派生物(例えば血漿および血清)、並びに滑液も意味することを意図しており、好ましくは血液である。
当然に、生物学的液体におけるHLA-Gの膜アイソフォームの濃度を測定する場合、これは、このアイソフォームが(例えばタンパク質分解により)細胞膜から分離し、且つ上記の生物学的液体に含まれていることを意味する。
上記の骨再形成のモニタリング方法の別の好ましい実施形態によれば、2種の異なるHLA-Gのアイソフォーム、好ましくはHLA-G1およびHLA-G5、またはHLA-G5およびHLA-G6の濃度を測定する。
血液検体を用いるHLA-Gのアイソフォームの血漿濃度の測定は当業者に公知である。これは、該HLA-Gのアイソフォームに特異的な少なくとも1種の抗体を用いた適切な免疫学的方法(例えばELISA、RIA、免疫蛍光法、免疫組織化学法)を実施することにより行うことができる。
したがって、この実施形態における特定の規定によれば、骨折であると診断された上記のヒト対象からの血液検体を用いて、抗HLA-G1および抗HLA-G5の両方である抗体(例えば、MEM-G/9クローンから得られたモノクローナル抗体)を用いた適切な免疫学的方法により、好ましくはELISAにより測定された20 ng/mlより大きい、好ましくは50 ng/mlより大きい、より好ましくは100 ng/mlより大きいアイソフォームHLA-G1(HLA-G1s)およびHLA-G5の血漿濃度は、該対象の骨再形成を示す。
したがって、この実施形態における別の特定の規定によれば、骨折であると診断された上記のヒト対象からの血液検体を用いて、抗HLA-G5および抗HLA-G6の両方である抗体(例えば、5A6G7クローンから得られたモノクローナル抗体)を用いた適切な免疫学的方法により、好ましくはELISAにより測定された10 ng/mlより大きい、好ましくは50 ng/mlより大きい、より好ましくは100 ng/mlより大きいアイソフォームHLA-G5およびHLA-G6の血漿濃度は、該対象の骨再形成を示す。
したがって、この実施形態における別の特定の規定によれば、骨折であると診断された上記のヒト対象からの血液検体を用いて、抗HLA-G1および抗HLA-G5の両方である抗体(例えば、MEM-G/9クローンから得られたモノクローナル抗体)を用いた適切な免疫学的方法により、好ましくはELISAにより測定された25 ng/mlより大きい、好ましくは50 ng/mlより大きい、より好ましくは100 ng/mlより大きいアイソフォームHLA-G1(HLA-G1s)およびHLA-G5の血漿濃度は、該対象の骨再形成を示す。
- 時刻t0およびt1の間における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度または発現レベルの増加が、上記の対象における骨腫瘍の進行を示し、
- 時刻t0およびt1の間における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度または発現レベルの減少が、上記の対象における骨腫瘍の寛解(または軽減)を示す。
生検材料は、例えば脊椎、骨盤、大腿骨、脛骨、上腕骨、肩甲骨、頭蓋骨などの骨格のいずれの部位から得られた検体であってもよい。
骨腫瘍は、骨肉腫、骨芽細胞腫、ユーイング肉腫および巨細胞腫からなる群より選択される。
この実施形態の有利な規定によれば、2種の異なるHLA-Gのアイソフォーム、好ましくはHLA-G1およびHLA-G5、またはHLA-G5およびHLA-G6の濃度を測定する。
この実施形態の有利な規定によれば、骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を、上記で定義された免疫学的方法、好ましくは、上記で定義された該HLA-Gのアイソフォームに特異的な少なくとも1種の抗体を用いた適切な免疫組織化学的方法によりインビトロで測定する。
a)骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を定量的に測定する工程、
b)該骨芽細胞を被験剤と接触させる工程、および
c)該骨芽細胞による上記少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を定量的に測定する工程
を含み、工程a)およびc)との間における該骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現レベルの差違が、上記の剤が骨発生を調節することを示す。
上記の工程a)およびc)との間における上記の骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォーム発現レベルの減少は、上記の剤が骨発生の進行を抑制することを示す。
上記のスクリーニング方法の別の好ましい実施形態によれば、HLA-G1およびHLA-G5の発現、またはHLA-G5およびHLA-G6の発現を測定する。
本発明の好ましい実施形態によれば、上記のHLA-Gのアイソフォームは、HLA-G1、HLA-G5およびHLA-G6から選択される。
1)材料および方法
細胞および細胞培養:
成人ヒト骨髄(BM)検体を、整形外科手術を受けている健常ボランティアから収集した。フランス、トゥールのトルソーCHU[大学付属教育病院]の倫理委員会の提言にしたがって、これらの検体を取り扱った。10%ウシ胎仔血清(FCS)(Perbio Hyclone社;ローガン)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(InVitrogen Ltd社;ペーズリー、UK)を添加したアルファ-MEM培地(MEM)に単核細胞(MNC)を播種した。14日目において、80%コンフルエントで、間葉系幹細胞(MSC)を二つに分けて増殖させた。全ての実験は、少なくとも3人の異なる提供者について行った。
SaOs2骨肉腫株(ECECC社、ソールズベリー、UK)をMSCの拡張と同じ条件下で培養した。
Pittengerら、1999に記載のプロトコールにしたがって、MSCを骨芽細胞および軟骨芽細胞へ誘導した。
簡潔には、骨発生の誘導のために、培地は、DMEM 4.5 g/lグルコース、3mM NaH2PO4(InVitrogen社)、25 mg/lアスコルビン酸(Sigma社)および10-7 Mデキサメタゾン (InVitrogen社)からなる。この培地により、培養14日後に細胞を骨芽細胞へと分化させることができる。
膜および細胞質内の抗原の検出のために、200,000個の細胞を、蛍光色素と連結した特異的抗体で標識した。膜の標識は、暗闇において4℃で30分のインキュベーションでなされた。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、そしてCellFIX(登録商標)(Becton Dickinson社、エーレムボーデゲム、ベルギー)で固定した。細胞質内の標識のために、CytoFix/CytoPermキットを用いて細胞を固定し透過処理した。次いで、488 nmの波長を射出するアルゴンレーザを搭載したフローサイトメータ(FACS Calibur(登録商標)、Becton Dickinson社)に細胞をかけた。データをCellQuest 3.1(登録商標)ソフトウェア(Becton Dickinson社)を用いて解析した。その結果を、検出シグナルの平均蛍光強度(RMFI)のバックグラウンドノイズのそれに対する比として示した。以下のモノクローナル抗体(mAb)を用いた:Alexa 488結合抗HLA-G1/-G5 mAb(クローン87G)(Exbio社、ベステツ、チェコ共和国)、抗HLA-G5/-G6 mAb(クローン5A6G7、Exbio社)およびフィコエリスリン(PE)結合抗アルカリフォスファターゼ(ALP)。
骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞および血管への誘導後のMSC培養物の濾過上清における可溶性HLA-Gの濃度を測定した。M8-HLA-G5株の細胞の培養上清を陽性対照として用いた(Le Rondら、2006)。用いたELISA法は、吸着抗体として抗HLA-G5/-G6抗体(クローン5A6G7、Exbio社)およびHLAクラスIa分子の検出用抗体としての全HLAクラスI W6/32(Bettsら、2003)(Rebmannら、2005)の使用を含む。
3つの新鮮腫瘍から選択された細胞を、1cm2の表面積のウェルを有する培養チャンバ(Labteks(登録商標)、Nunc International社、ロチェスター、ニューヨーク、USA)に10000個/ウェルで播種した。増殖培地での培養の48時間後、それらを3.7%ホルムアルデヒド(Sigma社)または純メタノール(InVitrogen社)で10分間固定した。PBS、0.5% FCSおよび0.2% Tween 20(BioRad社、ハーキュリーズ、カリフォルニア、US)の溶液による周囲温度での30分間の透過処理工程が、細胞内タンパク質の同定のために必要であった。次いで、細胞を4℃で1時間、モノクローナル一次抗体、および、一次抗体を認識し、Alexa 488または594型の蛍光色素(InVitrogen社)が結合した二次抗体と連続的にインキュベートした。すすいだ後、4,6-ジ-アミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Vector Cliniscience社、モンルージュ、フランス)を含む封入剤を添加して、細胞核を視覚化した。抗体溶液のないウェルを陰性対照とした。カメラ(DMX 1200、Nikon Europe社、バトヒューフェドルプ、オランダ)を搭載したエピ蛍光顕微鏡(Leica(登録商標)社、ゾルムス、ドイツ)の下でスライドを読み取った。画像処理はLuciaソフトウェアを用いて行った。以下の抗体を用いた:抗HLA-G1/-G5モノクローナル抗体(クローン87G、Exbio社)、抗オステオカルシン(Santa Cruz社、Tebu、ル・ペレ・アン・イヴリン、フランス)、抗オステオポンチン(RnD)および抗コラーゲン1a1(Santa Cruz社)ポリクローナル抗体。
生検検体を10%ホルムアルデヒド(Sigma社)で固定した。次いで、それらを、連続した75%、90%および100%のエタノールバス(Merck and Carbo Erba社、サン・テルブラン、フランス)を用いて脱水した。最後に、それらをキシレンバス中に4℃で30分間置いた後、パラフィン包埋(InVitrogen社)して、マイクロトーム上で切片を切った。そして、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。抗原検出のための免疫標識化は、抗HLA-G5/-G6抗体(クローン5A6G7)およびペルオキシダーゼ結合抗マウスポリクローナル抗体を用いて行った。
Trizol(登録商標)(InVitrogen社)での細胞溶解の後、200μlのクロロホルム(Sigma社)を添加して、細胞およびタンパク質デブリス、上清中に含まれているデオキシリボ核酸(DNA)並びにリボ核酸(RNA)を分離した。次いで、回収したRNAを500μlのイソプロパノール(Sigma社)で沈殿させ、そして75℃で1mlのエタノール(Merck and Carbo Erba社)ですすぎ、外気下で30分間乾燥させて、DNアーゼおよびRNアーゼフリーDEPC水50 mlに再溶解させた。
Takara PrimeScript(商標)1stストランドcDNA合成キット(Takara Bio Inc.社)を用いて、RNAからの逆転写により相補DNA(cDNA)合成を行った。
そして、20μlの最終混合物をサーモサイクラー(Applied Biosystems社、フォスターシティ、CA、USA)に置いた。用いた条件は、30℃で10分間のプライマー/RNAハイブリダイゼーション、42℃で60分間のcDNA合成、および95℃で5分間の酵素変性である。
50 ng/μlのcDNA溶液を、2.5μlのバッファー、2μlのdNTP混合物、2μlの検討されるDNAに対するプライマー、0.125μlのTaqポリメラーゼ酵素、およびDEPC水からなる反応混合物に添加して、合計25μlの混合物量とした。RT-PCRを、次のプログラムにしたがって行った:94℃で5分、(94℃で45秒、55℃で45秒、72℃で1分)を35サイクル、70℃で7分。
骨発生分化、未分化および細胞腫瘍形成性に特徴的な種々の遺伝子の増幅用プライマーを、以下の表Iに示した。
a)骨形成時の骨芽細胞によるHLA-Gのインビボ発現
抗HLA-G5/-G6抗体(クローン5A6G7)で得られた骨芽細胞染色によって立証されているように(図1A参照)、新生児において、海綿質骨(または骨髄)の骨梁の内側を覆う骨芽細胞は、HLA-G5および-G6を発現している。反対に、増殖性肥大性軟骨細胞は、HLA-G5/-G6を発現しない。さらに、(抗HLA-G5/-G6抗体で標識された)HLA-G+骨芽細胞に近接した特定の血管周囲の細胞もこのタンパク質を発現していることに留意すべきである。
骨肉腫、骨芽細胞腫、ユーイング肉腫または巨細胞腫(GCT)から生じたヒト病態の骨髄の切片に基づいてHLA-G5および-G6発現プロファイルを検討した。
図2に表された結果は、検討した病態の骨髄に関係なく、骨芽細胞が抗HLA-G5/-G6抗体で標識されていること(HLA-G+)を示している。しかしながら、HLA-G5および-G6の発現は病態の状態に依存して増減する。
より詳細には、骨肉腫および骨芽細胞腫から生じた異常骨芽細胞、また、正常であるが腫瘍の周辺にある骨芽細胞は、HLA-G+である(図2Aおよび2B参照)。
巨細胞腫(GCT)またはユーイング肉腫から生じた骨髄の切片では、腫瘍環境の骨芽細胞においてのみHLA-G5および-G6が検出された(図2C参照)。
これらの結果から、正常骨芽細胞、および病態の、特に腫瘍の骨芽細胞はHLA-Gを発現していることがわかる。
間葉系幹細胞からの培養で生じた正常骨芽細胞によるHLA-Gの発現を検討した。間葉系幹細胞(MSC)の培養物を、デキサメタゾンおよび骨形成タンパク質(BMP)のような種々の骨芽細胞の誘導剤とともにインキュベートした。
アルカリフォスファターゼ(ALP)、骨サイアロタンパク質(BSP)、上皮小体ホルモン受容体1(PTHR1)、オステオネクチン(SPARC)、オステリックス転写因子(OSX)、α-平滑筋アクチン(ASMA)のmRNAの発現を、間葉系起源の培養細胞中で検出した(図4A参照)。これらの種々の転写産物の組み合わせが骨芽細胞に特徴的であることが知られている(Cohen、2006)。
得られた骨芽細胞も、HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4およびHLA-G5のmRNAを発現していた(図4B参照)。
図6に、フローサイトメトリ技術を用いて得られた結果を示した。HLA-Gおよびアルカリフォスファターゼ(ALP)の共同表示によって表されているように、骨芽細胞の大多数はHLA-G1/-G5を発現している。しかし、この発現は時間経過により減少する:誘導の2週間後には66%のHLA-G+骨芽細胞が検出されたが、誘導の4週間後では10%のHLA-G+骨芽細胞が検出された。
さらに、小塊技術による培養で生じた軟骨芽細胞はHLA-Gを発現していなかった(図8)。また、脂肪細胞ではHLA-Gは検出されなかった。
1)材料および方法
細胞:
骨肉腫株:HOS-154732(McAllisterら、1971)、U2OS(Pontenら、1967)、MG-63(Billiauら、1977)、SaOS2(Foghら、1975)、CAL72(Rochetら、1999)およびSaOS2 RUNX2 DNN(Ghaliら、2010)。
検討した種々の生検材料は、トゥールのトルソー中央病院大学(Centre Hospitalier Universitaire:CHU)[大学付属病院教育センター]の病理解剖学科(フランス)から入手した。
用いたMSCは、トゥールのCHUの整形・災害外科部門(フランス)にて処置され、股関節全置換移植のため入院している健常ドナーから入手した。患者のインフォームド・コンセントは書面で得た。処置の際に後部腸骨稜から骨髄を20 ml取得した。これらの細胞を、この研究で実施された全ての試験の対照として用いた。
- 標準培養:種々の株の細胞を、5000個/cm2の密度で、培養フラスコ(Falcon(登録商標)、BD Biosciences社、VWR、ストラスブール、フランス)中で培養した。培養培地は、10% (v/v)ウシ胎仔血清(FCS)(Perbio Hyclone社、ローガン、USA)、1% (v/v) L-グルタミン、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(InVitrogen社)ならびに100μMファンギゾン(Bristol Myers Squibb社、リュエーユマルメゾン、フランス)を添加したアルファ-MEM最小必須培地からなる。培養培地は2〜3日ごとに交換した。
- MSCを、FGF2(AbCys社、パリ、フランス)を1ng/mlでさらに含む同じ培地を用いた同一方法で培養した。
- 分化培地:骨細胞分化のために、培地は、2% (v/v) FCSおよび50 ng/mlのBMP4(Peprotech社、ロンドン、UK)を添加したアルファMEMからなる。この培地の持続期間は8〜10日である。
蛍光色素フィコエリスリン(PE)またはフルオロセイン・イソシアネート(FITC)が結合した抗体を用いて200000個の細胞を標識した。単離された生細胞を、これらの抗原を認識する抗体とともに45分間インキュベートして洗浄し、そしてCell Fix(商標)(Becton Dickinson社、エーレムボーデゲム、フランス)で固定して、細胞の表面に発現している抗原を明らかにした。細胞内抗原を明らかにするために、免疫標識の前に細胞透過処理の前工程が必要であった。非特異的免疫グロブリンを用いて陰性対照を得た。
alexa 488結合抗HLA-G1および-G5抗体87G、およびAPC結合MEM/G9、または4H84(Exbio社;プラハ、チェコ共和国)、および抗ALPL抗体(R&D Systems社)を用いた。
・Trizol(登録商標)抽出:
Trizol(登録商標)(InVitrogen社)を用いて細胞を溶解した後、200μlのクロロホルム(Sigma社)を添加して遠心分離し、タンパク質を含んでいる下層、デオキシリボ核酸(DNA)を含んでいる中間層、およびリボ核酸(RNA)を含んでいる上層の三層を得た。該上層を抽出し、次いで500μlのイソプロパノール(Sigma社)で沈殿させ、1mlの75%エタノール(Merck and Carbo Erba社)ですすぎ、完全に透明になるまで外気中に放置して乾燥させた。最終的に、RNAをジエチルピロカーボネート(DEPC−RNアーゼ阻害用)水50 mlに再溶解させた。
2μlのRNAを98μlのDEPC水に希釈し、これを、ブランク(水のみ)の用意をした後、Gene Quant II線量計(Amersham Pharmacia社、Sarclay、オルセー、フランス)の石英キュベットに入れた。この分析は、260 nmで照射するレーザを用いて光学密度を測定することにより行った。
1μgのRNAをDEPC水で8μlとなるまで希釈した。ランダムヘキサマーおよびdNTP(Takara PrimeScript(商標)1stストランドcDNA合成キット(Takara Bio Inc.社))を添加した。サーモサイクラー(Applied Biosystems社、フォスターシティ、CA、USA)での変性(65℃で5分)の後、Prime Script(商標)逆転写酵素を添加した。この溶液を、次のプログラムにしたがってサーモサイクラーでインキュベートした:30℃で10分間の第1ステップ、42℃で60分間の第2ステップ、そして95℃で5分間の第3ステップ。得られた相補DNA(cDNA)を−20℃で保存した。
25 ngのcDNAを、dNTP、興味対象の配列を標的とするプライマー(下記の表II参照)およびTaqポリメラーゼ酵素(TaKaRa(商標)Ex Taqキット)と混合した。そして、全混合物を、35サイクルからなる次のプログラムにしたがってサーモサイクラーでインキュベートした。各サイクルは、98℃で1分、続いて55℃で30秒、続いて72℃で1分からなる。
PCR産物を、0.01%のエチジウムブロマイド(Sigma社)を含む1%アガロース(Sigma社)ゲルに載せた。次いで、紫外線ランプ(Vilbert Lourmat社、エバーハルツェル、ドイツ)を用いて、ゲルを視覚化した。そして、Chemicapt(商標)ソフトウェア(BioRad社、CA、USA)を用いて、バンドを解析した。
50 ngのcDNAを、蛍光分子(Syber Green、InVitrogen社)を含む溶液と混合した。次いで、この溶液を、あらかじめプライマーを入れたウェル(96ウェルプレート)に入れた。
プレートをサーモサイクラー(BioRad社)に置いた。次のプログラムを用いた:95℃で30秒、56℃で30秒、72℃で30秒を39サイクル。融解曲線をプロットして、増幅DNAの質を確認した。
以下の式を用いて、DNAの量を求めた。
2-(遺伝子のC(t)-C(t)GAPDH) または2-Δc(t)
細胞をはがして円心分離し、そして0.1% (v/v) Triton X-100(Sigma社)からなる500μlの溶解バッファー中に回収した。円心分離後、上清を取り出して、そしてタンパク質抽出物をレムリ(Laemmli)バッファーで希釈して2分間煮沸した。
サンプルを、ブラッドフォード技術にしたがって、MRX II(Dynex technologies社、シャンティイ、USA)を用いて光学密度により分析した。
興味対象のタンパク質に応じた様々な濃度のポリアクリルアミドゲル(アルカリフォスファターゼおよびHLA-Gには10%)で、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS − Biorad社)バッファー中で電気泳動を行った。タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜上にブロットし、そしてミルクタンパク質で飽和させ、興味対象の抗体とともに一晩インキュベートした。二次抗体を用いた後、化学発光(ECLキット、Amersham社)により視覚化を行った。
RUNX2を標的とするsiRNA(Select RNAi(商標)、siRNA、カタログNo. 1299003)またはDLX5標的とするsiRNA(Stealth Select RNAi(商標)、siRNA、カタログNo. 1299003)の3種の異なるsiRNA(InVitrogen社)を細胞にトランスフェクションした。非特異的siRNAを対照として用いた(InVitrogen社)。20 nMのsiRNAをトランスフェクションに用い、これはAmaxa Nucleofactorキット(Lonza社、フランス)を供給元の説明書に従って用いて行った。24時間後、細胞を骨発生分化培地中で誘導して分化させた。2、4および6日後、細胞を回収し、それらについて、骨芽細胞に特徴的である遺伝子またはHLA-Gをコードする遺伝子の発現を分析した。
ヒト起源の種々の骨芽細胞株CAL72、MG-63、HOSおよびU2OSにおけるアイソフォームHLA-G1(膜HLA-G)およびHLA-G5(細胞内HLA-G)の発現を、フローサイトメトリおよび免疫標識化(ウェスタンブロット法)により検討した。結果を図9に示した。全ての株においてアイソフォームHLA-G1およびHLA-G5が検出されたが、発現の程度には違いがあった。HLA-G5は常に強く発現していたが、一方で、HLA-G1についてはCAL72およびMG-63株においてのみであり、それを発現しているHOSおよびU2OSは非常に少なかったことが観察された。
次いで、HLA-G(アイソフォームHLA-G1およびHLA-G5)の発現を、フローサイトメトリおよびウェスタンブロットにより検討した。HLA-Gの発現は、Δ4A5において実質的に失われ、Δ6A2では対照株C-よりもさらに弱い発現となることがわかった。
Claims (19)
- 以下の工程:
a)骨折と診断された対象からの生物学的液体の検体における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度を測定する工程であって、前記生物学的液体の検体が、血液の検体または滑液の検体である工程と、
b)工程a)で測定したHLA-Gのアイソフォームの濃度を、健常対象の前記生物学的液体における該アイソフォームの基準濃度と比較する工程と
を含むことを特徴とし、
前記対象からの前記生物学的液体の検体において、前記基準濃度よりも高い、少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度が、前記対象の骨再形成を示す、
骨折と診断された対象の骨再形成のインビトロでのモニタリング方法。 - 前記対象がヒトであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的液体の検体が血液検体であり、且つ、少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの血漿濃度または血清濃度を測定することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの血漿濃度または血清濃度を、適切な免疫学的方法により測定することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- HLA-G1およびHLA-G5の濃度、またはHLA-G5およびHLA-G6の濃度を測定することを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象がヒトであり、且つ、前記対象からの血液検体を用いて適切な免疫学的方法により測定された、20 ng/mlよりも大きいHLA-G1およびHLA-G5アイソフォームの血漿濃度が、前記対象の骨再形成を示すことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記対象がヒトであり、且つ、前記対象からの血液検体を用いて適切な免疫学的方法により測定された、10 ng/mlよりも大きいHLA-G5およびHLA-G6アイソフォームの血漿濃度が、前記対象の骨再形成を示すことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記対象がヒトであり、且つ、前記対象からの血液検体を用いて適切な免疫学的方法により測定された、25 ng/mlよりも大きいHLA-G1およびHLA-G5アイソフォームの血清濃度が、前記対象の骨再形成を示すことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 時刻t0および時刻t1にて得た対象からの生物学的検体を用いて、前記生物学的検体における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度を測定するか、または発現を定量的に測定する工程を含むことを特徴とし、前記生物学的液体の検体が、血液の検体もしくは滑液の検体、または、骨腫瘍の骨生検により得られた、骨芽細胞を含む生物学的検体であり、
- 時刻t0およびt1の間における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度または発現レベルの増加が、前記対象における骨腫瘍の進行を示し、
- 時刻t0およびt1の間における少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度または発現レベルの減少が、前記対象における骨腫瘍の寛解を示す、
対象の骨腫瘍の変化のインビトロでのモニタリング方法。 - 前記対象がヒトであることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの血漿濃度または血清濃度を、前記対象からの血液検体を用いて測定することを特徴とする請求項9または10に記載の方法。
- 骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を、骨芽細胞を含む生物学的検体を用いて定量的に測定することを特徴とし、該生物学的検体が前記腫瘍の骨生検により得られたものである請求項9または10に記載の方法。
- 前記生物学的検体における前記少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの濃度または発現を、適切な免疫学的方法により測定することを特徴とする請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を、少なくとも1種のHLA-GのアイソフォームをコードするmRNAを測定することによって定量的に測定することを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記骨腫瘍が、骨肉腫、骨芽細胞腫、ユーイング肉腫および巨細胞腫から選択されることを特徴とする請求項9〜14のいずれか1項に記載の方法。
- HLA-G1およびHLA-G5の濃度もしくは発現、またはHLA-G5およびHLA-G6の濃度もしくは発現を測定することを特徴とする請求項9〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の工程:
a)骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を定量的に測定する工程、
b)前記骨芽細胞を被験剤と接触させる工程、および
c)前記骨芽細胞による前記少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現を定量的に測定する工程
を含むことを特徴とし、
工程a)およびc)との間における前記骨芽細胞による少なくとも1種のHLA-Gのアイソフォームの発現レベルの差違が、前記剤が骨発生を調節することを示す、
骨発生の調節剤のインビトロでのスクリーニング方法。 - HLA-G1およびHLA-G5の発現、またはHLA-G5およびHLA-G6の発現を測定することを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 対象における骨発生マーカーとしての、前記対象から単離されたHLA-GのアイソフォームまたはHLA-Gのアイソフォームをコードする核酸分子の使用。
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