BE1026600A1 - Procedes et utilisations pour determiner le potentiel osteogenique de cellules differenciees in vitro - Google Patents

Procedes et utilisations pour determiner le potentiel osteogenique de cellules differenciees in vitro Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de CD73, CD105, CD44 et/ou CD10 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro. L'invention concerne, en outre, une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et/ou CD44, et/ou la mesure de la quantité de CD73, CD105 et/ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro. L'invention concerne également une méthode de sélection d'un sujet pour la préparation de cellules différenciées in vitro de lignée chondro-ostéoblastique comprenant la récolte de CSM provenant d'un échantillon biologique d'un sujet ; l'obtention de cellules différenciées in vitro partir des CSM ; la détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro par une méthode décrite ici ; et la sélection du sujet pour préparer les cellules différenciées in vitro de lignées chondro-ostéoblastiques si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogéniquement utile.

Description

PROCÉDÉS ET UTILISATIONS POUR DÉTERMINER LE POTENTIEL OSTÉOGÉNIQUE
DE CELLULES DIFFÉRENCIÉES IN VITRO
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne des méthodes et des utilisations pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro. Plus particulièrement, l'invention concerne des méthodes et des utilisations pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, comprenant la mesure d'un ou de plusieurs marqueurs cellulaires.
CONTEXTE DE L'INVENTION
La greffe de cellules souches capables de subir une différenciation ostéogénique, de cellules engagées dans la différenciation ostéogénique ou de cellules ayant une capacité de formation osseuse est une voie prometteuse pour le traitement des maladies liées aux os, en particulier lorsque le traitement nécessite la production de nouveaux tissus osseux.
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont déjà été utilisées pour traiter des troubles osseux (Gangji et al., 2005 Expert Opinion Biol Ther 5 : 437-42). Cependant, bien que ces cellules souches relativement indifférenciées puissent être transplantées, elles ne sont pas liées à une lignée ostéoblastique et leur contribution à la formation du tissu osseux serait principalement médiée par des effets paracrines. De plus, la quantité de CSM que l'on peut obtenir des sujets pour un usage thérapeutique est souvent insatisfaisante.
Plusieurs méthodes d'expansion in vitro des CSM et d'obtention, à partir de CSM, d'ostéoprogéniteurs, d'ostéoblastes ou de cellules de phénotype d'ostéoblastique ont été développées. Les cellules obtenues par de telles méthodes peuvent avoir un potentiel ostéogénique in vitro et in vivo variable. Par conséquent, la quantité de nouveau tissu osseux produit in vivo lors de la greffe de ces cellules n'est pas toujours prévisible et, dans certains cas, pas optimale à des fins cliniques.
Il est nécessaire de déterminer, avant la greffe de cellules cultivées in vitro, comme les cellules dérivées de CSM différenciées in vitro, si les cellules ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
Comme le confirme la partie expérimentale, qui illustre certains modes de réalisation représentatifs de l'invention, les inventeurs ont réalisé que le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro, telles que les cellules dérivées des cellules souches mésenchymateuses (CSM), peut être évalué en déterminant un profil spécifique d'expression des marqueurs de surface cellulaire desdites cellules. Plus particulièrement, les inventeurs ont constaté qu'en mesurant la quantité de cellules différenciées
BE2019/5630 in vitro qui expriment un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence tous les CD73, CD105, CD10 et CD44, et en mesurant la quantité dün ou plusieurs des CD73, CD105 ou CD44, de préférence tous les CD73, CD105 et CD44 exprimés par les cellules, il peut être déterminé si les cellules ont un potentiel ostéogénique, plus précisément le potentiel ostéogénique qui rend les cellules utiles en milieux cliniques. En outre, les inventeurs actuels ont également découvert qu'en utilisant la méthode de détermination du potentiel ostéogénique des cellules dérivées de CSM telle qu'elle est décrite ici, il était possible de sélectionner un sujet particulièrement adapté en tant que donneur de CSM pour préparer des cellules dérivées de CSM de lignée chondro-ostéoblastique.
Par conséquent, dans un aspect, l'invention concerne lütilisation dün ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
De préférence, l'invention prévoit lütilisation des CD73, CD105, CD44 et CD10 pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, et la mesure de la quantité dün ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 exprimé par les cellules différenciées in vitro.
De préférence, l'invention concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et/ou la mesure de la quantité dün ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 exprimé par les cellules différenciées in vitro.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode de sélection dün sujet pour la préparation in vitro de cellules différenciées de lignée chrondro-ostéoblastique, la méthode comprenant :
-la collecte de CSM à partir dün échantillon biologique dün sujet ;
-l'obtention de cellules différenciées in vitro à partir de CSM ;
-la détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro par une méthode telle qu'enseignée ici ; et
-la sélection du sujet pour la préparation de cellules différenciées in vitro de lignée chondroostéoblastique si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
Ces aspects, ainsi que d'autres aspects et les réalisations privilégiées de l'invention sont décrits dans les sections suivantes et dans les revendications ci-annexées. L'objet des revendications ci-jointes est expressément incorporé dans la présente spécification.
BE2019/5630 DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre la néoformation osseuse sur une coupe coronale d'une voûte crânienne osseuse murine, mise en évidence par des fluorochromes murins et humains se liant au calcium, 2 semaines après l'administration d'excipient seul (condition témoin), de cellules A formatrices d’os dérivées de CSM (générées avec FGF-2 et TGFßl) ou de cellules B formatrices d’os dérivées de CSM (générées avec FGF-2, TGFßl et héparine).
La figure 2 illustre la quantification de la formation osseuse (%) effectuée sur des coupes coronales d'une voûte crânienne murine, 2 semaines après l'administration d'excipient seul (témoin négatif), de cellules A formatrices d’os dérivées de CSM (générées avec du FGF-2 et du TGFßl) ou de cellules B formatrices d’os (générées avec du FGF-2, du TGFßl et de l’héparine).
La figure 3 illustre le double immunomarquage (immunofluorescence) des collagènes de type I murin et humain effectué sur des sections coronales de voûte crânienne osseuse murine 2 semaines après l'administration de cellules B formatrices d’os dérivées de CSM (générées avec du FGF-2, du TGFßl et de l’héparine). La figure 3a illustre le double immunomarquage du collagène de type I anti-humain et anti-murine (fusion) tandis que les figures 3b et 3c montrent respectivement l'immunomarquage du collagène de type I anti-humain et anti-murin.
La figure 4 illustre la coloration histologique des sections coronales d'une voûte crânienne osseuse murine, 2 semaines après l'administration d'excipient seul, de CSM, de cellules A formatrices d’os dérivées de CSM générées avec du FGF-2 et du TGFßl (cellules b-f A), ou de cellules B formatrices d’os générées avec du FGF-2, du TGFßl et de l’héparine (cellules b-f B), dérivées de CSM. (A) des fluorochromes liés au calcium ont été injectés séquentiellement par voie intrapéritonéale (rouge d’alizarine —> vert calcéine —> bleu calcéine —> tétracycline) pour mettre en évidence la néoformation osseuse (flèches) et évaluer la dynamique de la formation osseuse ; (B) immunofluorescence (IF) du collagène humain + murin de type I ; (C) IF du collagène de type I murin ; (D) IF du collagène de type I humain. Une double immunofluorescence de collagène de type I anti-humain et anti-murine a été réalisée pour permettre la détection du collagène de type I humain et murin sécrété par la matrice osseuse ; (E) coloration ALP + Goldner : ALP : détection de l'activité ostéoblastique en noir (lignes complètes et zones), Trichrome de Masson Goldner : détection de l'ostéoïde (tissu osseux non minéralisé) en pointillés noirs, os minéralisé en gris foncé ; (F) phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) : détection de l'activité ostéoclastique en gris foncé / noir.
La figure 5 représente des images illustrant la néoformation osseuse sur des coupes coronales de voûte crânienne osseuse murine 2 semaines après l'administration de l’excipient seul ; CSM ; cellules A formatrice d’os dérivées de CSM générées avec du FGF-2, du TGFßl (cellules b-f A) ; ou cellules B formatrice d’os dérivées de CSM générées avec du FGF-2, du TGFßl et de l’héparine (cellules b-f B). La néoformation osseuse est mise en évidence par la fluorescence (marquée par l'intégration
BE2019/5630 séquentielle de différents fluorochromes : rouge d’alizarine —> calcéine vert —> calcéine bleu —> tétracycline jaune). Les colorations rouges, vertes et bleues apparaissent en gris clair et l'épaisseur de la néoformation osseuse est indiquée par des doubles flèches. Les colorations jaunes ont été entourées de lignes pointillées.
La figure 6 représente un graphique illustrant la surface totale de l'os néoformé (moyenne ± SEM, * p<0,05) mesurée sur des coupes de voûte crânienne murine 2 semaines après l'administration de CSM (gris foncé) ou de cellules B formatrices d’os (gris clair).
La figure 7 illustre la coloration à la safranine orange de la matrice cartilagineuse (entourée de lignes en tirets) de nodules minéralisés effectuée sur des sections sagittales de voûte crânienne osseuse murine un jour (Dl) après l'administration de cellules B formatrice d’os et dans le temps (D7, D14, D21) jusqu'à 28 jours (D28) après administration.
La figure 8 illustre l'effet des cellules dérivées de CSM dans un modèle de défaut fémorale segmentaire de taille sub-critique. (A) représente un graphique illustrant la mesure de la taille du défaut sur des images radiographiques le jour (DO) de l'intervention chirurgicale ou de l'administration de l'article et dans le temps (1, 2, 3, 4, 5 semaines) jusqu'à 6 semaines (6W) après administration de l'excipient seul, de cellules A formatrices d’os (b-f cellules A) ou de cellules B formatrices d’os (b-f cellules B) ; moyenne ± SEM, ** p<0.01, *** p<0.001 ; (B) représente des images radiographiques représentatives de défauts fémoraux segmentaires à DO et 6W après administration de l'excipient seul ou de cellules B formatrices d'os (cellules b-f B) ; (C) représente un graphique illustrant la mesure du volume de réparation osseuse par tomographie microscopique (micro-CT) à 6W après administration de l'excipient seul (n=7) et de cellules B formatrices d'os (n=8) ; moyenne ± SEM, p<0,05
La figure 9 illustre la stratégie de gating par cytométrie en flux utilisée dans l'exemple 5.
La figure 10 illustre les niveaux d'expression en CD73 (panneau supérieur) et CD44 (panneau inférieur) analysés par cytométrie en flux par les cellules A, B et C de CSM.
n=12, 6, 22, 15 (CD73) et n=22, 8, 22, 18 (CD44) pour les CSM et cellules A, B et C formatrices d’os respectivement, où n représente le nombre de tests individuels.
La figure 11 illustre l'ostéoinduction et l'ostéogénie évaluées par analyse radiographique. R : L'ostéoinduction (A, panneau de gauche) est évaluée en mesurant la valeur de l'intensité du gris qui est directement corrélée à l'opacité de l'os et donc à son épaisseur. L'ostéogénie (A, panneau de droite) est évaluée en mesurant la surface du nodule qui semble plus réfringent par imagerie radiographique. B : L'opacité osseuse est significativement plus élevée pour les cellules formatrices d’os C cryopréservées (cellules B-f C) que pour les excipients (n=20 (excipient) et n=34 (cellules B-L C de 5 lots différents). C : La surface de l'ostéogénie est significativement plus élevée que celle de l’excipient dans lequel aucun nodule minéralisé n'a été observé (n=20 (excipient) et n=34 (cellules B-f C de 5 lots différents). D-E : L'ostéoinduction avec (Lig. 8D) ou sans (LIG. 8E) ostéogénie (représentée par la
BE2019/5630 formation osseuse absolue) est significativement plus élevée pour les cellules C cryopréservées (cellules B-F C) que pour les excipients. Test U de Mann Whitney : ***p<0.001. F : en plus des activités d'ostéoinduction, les cellules formatrices d’os C cryopréservées (cellules B-F C) favorisent une activité ostéogénique élevée indiquée par la présence d'au moins un nodule minéralisé chez 4/5 donneurs de moelle osseuse (ou lots) et 65% des souris (n=20 (excipient) et n=34 (cellules B-F C de 5 lots distincts).
La figure 12 illustre la section histologique coronale 4 semaines après l’administration de cellules formatrices d’os C cryoconservées ou d'excipient. Les cellules formatrices d’os C cryoconservées présentent un double mécanisme d’action : (i) 1’ostéoinduction : stimulation de la formation osseuse de l'hôte par sécrétion paracrine conduisant à une ossification intramembranaire et (ii) 1’ ostéogenèse : promotion de la formation osseuse de façon directe (de l’origine du donneur, humaine) par ossification endochondrale.
La figure 13 illustre l'analyse histologique de voûte crânienne de souris 4 semaines après avoir reçu une seule injection de cellules formatrices d’os C cryopréservées. Les cellules formatrices d’os C cryopréservées présentent des propriétés ostéoinductrices et ostéogéniques (fluo). La formation osseuse humaine (collagène humain de type I) a été mise en évidence dans les nodules minéralisés (ostéogénie). L’activité des ostéoblastes (ALP indiquée par des flèches noires dans le troisième panneau) et des ostéoclastes (TRAP, indiquée par des flèches noires dans le quatrième panneau) à surtout été détectée dans les nodules minéralisés montrant que le processus de remodelage osseux des nodules était toujours en cours 4 semaines après leur administration. Aucun ostéoïde ( coloration au trichrome de Masson de Goldner ) n'a été mis en évidence indiquant que le processus de formation osseuse est terminé.
La figure 14 illustre l'effet de la cryoconservation des cellules formatrices d’os C ( cellules B-F C ) dans un modèle de défaut fémoral segmentaire de taille sub-critique. Les radiographies représentent les défauts fémoraux segmentaires au jour 0 jusqu'à la semaine 10 après administration de l'excipient seul ou des cellules formatrices C cryopréservées.
La figure 15 illustre l'effet de la cryoconservation des cellules C formatrices d’os dans un modèle de défaut segmentaire fémoral de taille sub-critique (modèle sub-CSD). Le graphique représente le pourcentage de réparation osseuse sur les images radiographiques le jour de l'intervention chirurgicale ou de l'administration du traitement (W0) et jusqu'à 10 semaines (W10) après l'administration de l'excipient seul, ou sur les cellules formatrices d’os C cryopréservées (cellules B-F C) ; moyenne ± SEM, *** p<0,001 (ANOVA).
La figure 16 illustre l'effet de la cryoconservation des cellules C formant les os dans un modèle de défaut segmentaire fémoral de taille sub-critique (modèle sub-CSD). Le graphique représente le score
BE2019/5630
RUS déterminé à partir d'images radiographiques le jour de l'intervention chirurgicale (WO) et jusqu'à 10 semaines (W10) après l'administration de l'excipient seul, ou des cellules formatrices d’os C cryopréservées (cellules B-F C) ; moyenne ± SEM, ** p<0,01, *** p<0.001 (ANOVA à mesures répétées bilatérales).
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Dans le présent contexte, les formes au singulier un, une et le/la comprennent à la fois des références au singulier et pluriel, sauf si cela est clairement contre-indiqué dans le contexte
Les termes comprenant, comprend et composé de, dans le présent contexte, sont synonymes de de comportant, comporte ou contenant, contient, et sont inclusifs ou ouverts et n'excluent pas les membres, éléments ou étapes de méthode supplémentaires, non mentionnés. Les termes couvrent en outre les termes constitué de et essentiellement constitué de, qui ont des significations bien établies dans la terminologie des brevets.
La récitation d'intervalles numériques par des limites comprend tous les nombres et fractions compris à l'intérieur des intervalles respectifs, ainsi que des limites mentionnées.
Les termes environ ou approximativement utilisés ici pour désigner une valeur mesurable telle qu'un paramètre, une quantité, une durée temporelle et autres, sont destinées à couvrir des variations de la valeur spécifiée, telles que des variations de ± 10% ou moins, de préférence ± 5% ou moins, plus préférablement ± 1% ou moins, et encore plus préférablement ± 0,1% ou moins, de la valeur spécifiée, dans la mesure où de telles variations conviennent à la présente invention. Il faut comprendre que la valeur à laquelle se réfère le modificateur environ est elle-même aussi spécifiquement, et de préférence, divulguée.
Bien que les termes un ou plusieurs ou au moins un, tels qu'un ou plusieurs membres ou au moins un membre d'un groupe de membres, soient clairs en soi, par le biais d'autres exemples, les termes couvrent notamment une référence à lün quelconque desdits membres, ou à deux ou plusieurs desdits membres, tels que, par exemple, trois ou plus, quatre ou plus, cinq ou davantage, six ou plus, sept ou davantage, ou encore davantage, desdits membres, et à tous desdits membres. Dans un autre exemple, un ou plusieurs ou au moins un peut se référer à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou plus.
L'exposé du contexte de l'invention est inclus dans le présent document pour expliquer le contexte de l'invention. Cela ne doit pas être considéré comme une admission que lün quelconque des documents auxquels il est fait référence a été publié, connu ou fait partie des connaissances générales courantes dans un pays quelconque à la date de priorité de l'une quelconque des revendications.
Dans l’ensemble de cette description, diverses publications, brevets et spécifications de brevets publiés sont référencés par une citation d'identification. Tous les documents cités dans la présente spécification sont intégrés en référence dans leur intégralité. En particulier, les enseignements ou les
BE2019/5630 sections de ces documents spécifiquement référencés dans le présent document sont incorporés en référence.
Sauf définition contraire, tous les termes utilisés dans la description de l'invention, y compris les termes techniques et scientifiques, ont leur signification couramment connue de l’homme du métier auquel cette invention appartient. A titre d’indication supplémentaire, les définitions des termes sont incluses pour mieux comprendre l’enseignement de ‘l’invention. Lorsque des termes spécifiques sont définis dans le contexte d’un aspect particulier de l'invention ou d’un mode de réalisation particulier de l'invention, cette connotation est destinée à s'appliquer à l’ensemble de la présente spécification, c'est-à-dire, également dans le contexte d'autres aspects ou modes de réalisation de l'invention, sauf indication contraire.
Dans les sections suivantes, différents aspects ou modes de réalisation de l'invention sont définis plus en détail. Chaque aspect ou mode de réalisation ainsi défini peut être combiné avec un ou plusieurs autre(s) aspect(s) ou mode(s) de réalisation, sauf indication claire du contraire. En particulier, toute caractéristique indiquée comme étant privilégiée ou avantageuse peut être combinée à toute autre caractéristique ou aux autres caractéristiques indiquées comme étant privilégiées ou avantageuses.
Dans la présente spécification, l'expression un mode de réalisation signifie qu'une caractéristique particulière, une structure ou une caractéristique décrite dans le contexte du mode de réalisation est incluse dans au moins un mode de réalisation de la présente invention. Par conséquent, les occurrences de 1’ expression dans un mode de réalisation en divers endroits de la présente spécification ne se réfèrent pas nécessairement toutes au même mode de réalisation , mais peuvent le faire. En outre, les éléments, structures ou caractéristiques particuliers(aires) peuvent être combinées de toute manière appropriée, comme il apparaîtra à l’homme du métrier d'après cette divulgation, en un ou plusieurs modes de réalisation. De plus, bien que certains modes de réalisation décrits dans le présent document comprennent certaines caractéristiques, mais pas d'autres, qui sont incluses dans d'autres modes de réalisation, les combinaisons de caractéristiques de différents modes de réalisation sont destinés à entrer dans le champ d'application de l'invention et à former différents modes de réalisation, comme l'entendent les auteurs de l'invention. Par exemple, dans les revendications annexées, l’un quelconque des modes de réalisation revendiquées peut être utilisé dans une combinaison quelconque.
Les présents inventeurs ont réalisé que certains marqueurs de surface cellulaire sont utiles pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro. Plus particulièrement, les inventeurs ont constaté que la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence tous les CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et la quantité d'un ou plusieurs des CD73, CD105 ou CD44, de préférence tous les CD73, CD105 et CD44, exprimée par les cellules différenciées in vitro, peuvent être utilisées pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
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Dans l'ensemble de la description, les références à CD73, CD105, CD44 ou CD10 désignent les peptides, polypeptides, protéines ou acides nucléiques respectifs, tels qu'ils ressortent du contexte, communément appelés dans l'art sous ces désignations. Ces termes couvrent les peptides, les polypeptides, les protéines ou les acides nucléiques de tout organisme où ils se trouvent, et en particulier les animaux, de préférence les animaux à sang chaud, plus particulièrement les vertébrés, mais plus particulièrement les mammifères, y compris les humains et les mammifères non humains, encore plus particulièrement les humains.
Le terme protéine utilisé dans cette spécification englobe généralement les macromolécules comprenant une ou plusieurs chaînes polypeptidiques, c'est-à-dire, les chaînes polymères de résidus d'acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Le terme peut englober les protéines produites naturellement, recombinantes, semi-synthétiquement ou synthétiquement. Le terme englobe également les protéines qui portent une ou plusieurs modifications de type co- ou post-expression de la ou des chaînes polypeptidiques, telles que, sans limitation, la glycosylation, l'acétylation, la phosphorylation, la sulfonation, la méthylation, l'ubiquitination, l'élimination du peptide signal, l'élimination N-terminal Met, la conversion des pro-enzymes ou pré-hormones en formes actives, etc. Le terme inclut également les variants ou mutants de protéines qui portent des variations de séquence d'acides aminés vis-à-vis d'une protéine native correspondante, comme par exemple, les délétions, additions et/ou substitutions d'acides aminés. Le terme englobe à la fois les protéines entières et les parties ou fragments de protéines, par exemple, les parties de protéines naturelles qui résultent de la transformation de ces protéines entières.
Le terme polypeptide utilisé dans cette spécification englobe généralement les chaînes polymères de résidus d'acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Ainsi, dans la mesure où une protéine n'est composée que d'une seule chaîne polypeptidique, les termes protéine et polypeptide peuvent être utilisés ici de manière interchangeable pour désigner une telle protéine. Le terme n'est pas limité à la longueur minimale de la chaîne polypeptidique. Le terme peut englober les polypeptides produits naturellement, recombinants, hémi-synthétiquement ou synthétiquement. Le terme englobe également les polypeptides qui portent une ou plusieurs modifications de type co- ou post-expression de la chaîne polypeptidique, telles que, sans limitation, la glycosylation, l'acétylation, la phosphorylation, la sulfonation, la méthylation, l'ubiquitination, l'élimination du peptide signal, l'élimination du Met Nterminal, la conversion des pro-enzyme ou pré-hormones en forme active, etc. Le terme inclut également les variants ou mutants de polypeptides qui portent des variations de séquence d'acides aminés par rapport à un polypeptide natif correspondant, tels que, par exemple, les délétions, additions et/ou substitutions d'acides aminés. Le terme englobe à la fois les polypeptides entiers et les parties ou fragments de polypeptides, par exemple les parties polypeptidiques naturelles qui résultent du traitement de ces polypeptides entiers.
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Le terme peptide utilisé dans la présente spécification désigne de préférence un polypeptide tel qu'il est utilisé dans la présente spécification, constitué essentiellement de 50 acides aminés ou moins, par exemple 45 acides aminés ou moins, de préférence 40 acides aminés ou moins, par exemple 35 acides aminés ou moins, plus préférablement 30 acides aminés ou moins, par exemple 25 ou moins, 20 ou moins, 15 ou moins, 10 ou moins ou 5 ou moins acides aminés.
Le terme acide nucléique utilisé dans la présente description désigne généralement un polymère (de préférence un polymère linéaire) de toute longueur, composé essentiellement de motifs nucléosidiques. Une unité nucléoside comprend généralement une base hétérocyclique et un groupement sucre. Les bases hétérocycliques peuvent comprendre, entte autres, les bases puriques et pyrimidiques telles que l'adénine (A), la guanine (G), la cytosine (C), la thymine (T) et l'uracile (U) qui sont répandues dans les acides nucléiques naturels, les autres bases naturelles (par exemple, xanthine, inosine, hypoxanthine) ainsi que les bases modifiées par voie chimique ou biochimique (par exemple, méthylées), non-naturelles ou dérivées. Les nucléobases types modifiées comprennent notamment les pyrimidines 5-substituées, les 6-azapyrimidines et les purines N-2, N-6 et O-6 substituées, y compris la 2-aminopropyladénine, le 5- propynyluracil et la 5-propynylcytosine. En particulier, il a été démontré que les substitutions de 5-méthylcytosine augmentent la stabilité du duplex de l'acide nucléique et peuvent être préférées comme substitutions de base dans les agents antisens, par exemple, encore plus lorsqu'elles sont associées à des modifications du sucre 2'-Ométhoxyéthyl. Les groupements sucre peuvent comprendre, entre autres, les groupes pentose (pentofuranose) tels que le ribose et/ou le 2-désoxyribose communs dans les acides nucléiques naturels, ou les groupes arabinose, 2-désoxyarabinose, triose ou hexose, ainsi que les groupes sucre modifié ou substitué (tels que 2'-O-alkylated, par exemple), les sucres 2'-O-méthylés ou 2'-0-éthylés tels que le ribose ; sucres 2'-O-alkyloxyalkylés, par exemple, sucres 2'-O-méthoxyéthylés tels que le ribose ; ou 2'-O,4'-C-alkylène lié, par exemple, 2'-O,4'-C-méthylène ou 2'-O,4'-C-éthylène lié comme le ribose ; 2'-fluoro-arabinose, etc). Les unités nucléosidiques peuvent être liées les unes aux autres par l'une quelconque des nombreuses liaisons internucléosidiques connues, y compris, entre autres, les liaisons phosphodiester courantes dans les acides nucléiques naturels, et les liaisons phosphatées ou phosphonates modifiées ultérieures, telles que le phosphorothioate, phosphorothioate d'alkyle tel que phosphorothioate de méthyle, phosphorodithioate, alkylphosphonate tel que méthylphosphonate, alkylphosphonothioate, phosphotriester tel que alkylphosphotriester, phosphoramidate, phosphoropipérazidate, phosphoromorpholidate, phosphoramidate ponté, méthylène phosphate ponté, phosphorothioate ponté ; et d'autres liaisons siloxane, carbonate, sulfamate, carboalcoxy, acétamrdate, carbamate telles que 3'-N-carbamate, morpholino, borano, thioéther, 3'-thioacétal, et internucléoside sulfone. De préférence, les liaisons internucléosidiques peuvent être des liaisons basées sur les phosphates, y compris les liaisons modifiées basées sur les phosphates, telles que les liaisons phosphodiester, phosphorothioate ou phosphorodithioate ou leurs combinaisons. Le terme acide
BE2019/5630 nucléique englobe également tous les autres polymères contenant des nucléobases tels que les mimétiques d'acides nucléiques, y compris, sans limitation, les acides nucléiques peptidiques (PNA), les acides nucléiques peptidiques à groupes phosphate (PHONA), les acides nucléiques verrouillés (LNA), les acides nucléiques morpholino phosphorodiamidate-backbone (PMO), les acides nucléiques cyclohexène (ADNch), tricyclo ADN (ADNct), les acides nucléiques à section squelettes avec liens alkyle ou amino (Kurreck 2003 (Eur J Biochem 270 : 1628-1644)). Alkyl, tel qu'il est utilisé ici, couvre en particulier les fractions hydrocarbonées inférieures, par exemple les hydrocarbures en ClC4 linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, tels que le méthyle, l'éthyle, l'éthényle, le propyle, le 1propényle, le 2-propényle, l'isopropyle. Les acides nucléiques tels que définis dans le présent document peuvent comprendre des nucléosides naturels, des nucléosides modifiés ou des mélanges de ceux-ci. Un nucléoside modifié peut comprendre une base hétérocyclique modifiée, un groupement sucre modifié, une liaison internucléoside modifiée ou une combinaison de ceux-ci. Le terme acide nucléique englobe en outre de préférence l'ADN, l'ARN et les molécules hybrides d'ADN/ARN, notamment l'ARNm, l'ARNm, l'ADNc, l'ADN génomique, les produits d'amplification, les oligonucléotides, l'ADN synthétique (par exemple, synthétisé chimiquement), l'ARN et les hybrides ADN/ARN. Un acide nucléique peut être d'origine naturelle, par exemple présent dans la nature ou isolé de la nature, peut être recombinant, c'est-à-dire produit par la technologie de l'ADN recombinant, et/ou peut être, partiellement ou entièrement, synthétisé chimiquement ou biochimiquement. Un acide nucléique peut être double brin, partiellement double brin ou simple brin. Lorsqu'il est monocaténaire, l'acide nucléique peut être le brin sensible ou le brin antisens. De plus, l'acide nucléique peut être circulaire ou linéaire.
Au moyen de conseils supplémentaires, CD73 est également connu dans l'art comme ecto-5'nucleotidase, NT, eN, NT5, NTE, eNT, E5NT et CALJA. CD73 est une enzyme de surface cellulaire liée au glycosyl-phosphatidylinositol (GPI). A titre d'exemple, le gène CD73 humain est annoté sous le gène NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 4907 et la protéine CD73 humaine est annotée sous Uniprot (www.uniprot.org) sous le numéro d'accès P21589.1. L'ARNm et les séquences de protéines du CD73 humain sont annotés sous les numéros de dépôt NCBI Genbank suivants : ARNm CD73 (NM_002526.3 ; NM_001204813.1), protéine CD73 (NP_002517.1; NP_001191742.1).
Au moyen de conseils supplémentaires, CD105 est également connu dans l'art comme endogline (ENG), END, FLJ41744, HHT1, ORW et 0RW1. La CD105 est une glycoprotéine membranaire de type I située à la surface de la cellule. A titre d'exemple, le gène CD105 humain est annoté sous l'ID 2022 du gène Genbank NCBI et la protéine CD105 humaine est annotée sous Uniprot sous le numéro d'accession P17813.2. L'ARNm et les séquences de protéines du CD105 humain sont annotés sous les numéros d'accession NCBI Genbank suivants : CD105 ((NM_001114753.2 ; NM_000118.3 ; NM_001278138.1), protéine CD105 (NP_001108225.l;NP_000109.1 ; NP_001265067.1). Au moyen
BE2019/5630 dün guidage supplémentaire, CD44 est également connu dans l'art sous le nom de molécule d'adhésion des cellules d'origine (HCAM), Pgp-1 (glycoprotéine phagocytaire-1), antigène Hermes, récepteur d’origine lymphocytaire (LHR), ECM-III, HUTCH-1, IN, MC56, MDU2, MDU3, MDU3, Pgpl, CDW44, CSPG8, HCELL, Hutchch-I et ECMR-III. La CD44 est une glycoprotéine de surface cellulaire impliquée dans les interactions cellule-cellule, l'adhésion cellulaire et la migration. A titre d'exemple, le gène CD44 humain est annoté sous le numéro d'ordre NCBI Genbank Gene ID 960 et la protéine CD44 humaine est annotée sous Uniprot sous le numéro d'ordre P16070.3. L'ARNm et les séquences de protéines du CD44 humain sont annotés sous les numéros d'ordre NCBI Genbank suivants : CD44 ARNm (NM_000610.3, NM_001001389.1, NM_001001390.1, NM_001001391.1, NM_001001392.1, NM_001202555.1, NM_001202556.1, NM_001202557.1), protéine CD44 (NP_000601.3, NP_001001389.1, NP_001001390.1, NP_001001391.1, NP_001001391.1,
NP_001189484.1, NP_001189484.1, NP_001189484.1, NP_001189485.1, NP_001189486.1).
Au moyen de conseils supplémentaires, CD 10 est également connu dans l'art comme membrane metalloendopeptidase (MME), NEP, SFE, CALLA, CMT2T et SCA43. CD 10 est une glycoprotéine transmembranaire de type II. A titre d'exemple, le gène CD10 humain est annoté sous NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Gene ID 4311 et la protéine CD10 humaine est annotée sous Uniprot sous le numéro d'accession P08473.2. L'ARNm et les séquences de protéines du CD10 humain sont annotés sous les numéros d'accession NCBI Genbank suivants : CD10 ARNm (NM_00090202.3, NM_007287.2, NM_007288.3, NM_007289.3, NM_001354642.1, NM_001354643.1,
NM_001354644.1), protéine CD10 (NP_000893.2, NP_009218.2, NP_009219.2, NP_009220.2, NP_009220.2, NP_001341571.1, NP_001341572.1, NP_001341573.1). Il est rappelé au lecteur que lorsque les entrées Genbank ou Uniprot fournissent la séquence de polypeptides ou de protéines précurseurs, les formes matures correspondantes (comme, par exemple, l'absence de peptides signal) devraient être présentes à la surface cellulaire des cellules.
Les termes CD73 , CD105 , CD44 et CD10 englobent en particulier les peptides, polypeptides, protéines ou acides nucléiques ayant une séquence native, c'est-à-dire dont la séquence primaire est la même que celle des peptides, polypeptides, protéines ou acides nucléiques présents ou dérivés dans la nature. Une personne compétente comprend que les séquences indigènes peuvent différer düne espèce à l'autre en raison de divergences génétiques entre ces espèces. De plus, les séquences indigènes peuvent différer dün individu à l'autre ou à l'intérieur d'individus différents de la même espèce en raison de la diversité génétique normale (variation) au sein düne espèce donnée. De plus, les séquences indigènes peuvent différer entre les individus düne même espèce ou même au sein d'individus différents en raison de mutations somatiques ou de modifications post-transcriptionnelles ou post-traductionnelles. Ces variantes ou isoformes de peptides, de polypeptides, de protéines ou d'acides nucléiques sont prévues ici. Par conséquent, toutes les séquences de peptides, polypeptides, protéines ou acides nucléiques trouvées dans la nature ou dérivées de la nature sont considérées
BE2019/5630 comme natives. Les termes englobent les peptides, les polypeptides, les protéines ou les acides nucléiques lorsqu'ils font partie d'une cellule vivante.
Un premier aspect prévoit l'utilisation d'un ou de plusieurs (par exemple, un, deux ou les trois) des CD73, CD 105 ou CD44 pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro. Par conséquent, il est également prévu d'utiliser l'un des CD73, CD 105 ou CD44 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro·, l'utilisation de deux des CD73, CD 105 ou CD44 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro ; et l'utilisation des trois des CD73, CD 105 et CD44 pour déterminer le potentiel ostéognique de cellules différenciées in vitro.
Certains modes de réalisation permettent l'utilisation d'un ou de plusieurs CD73, CD105, CD44 ou CD10 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux, trois ou les quatre).
Certains modes de réalisation permettent d'utiliser le CD44 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro. Certains modes de réalisation permettent d'utiliser le CD44 et l'un ou l'autre des CD73 et CD 105, ou les deux, pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro. Certaines représentations permettent l'utilisation de CD44 et d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD 10 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux ou les trois).
Certains modes de réalisation permettent d'utiliser le CD 10 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro. Certains modes de réalisation permettent d'utiliser le CD 10 et un ou plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 (par exemple, un, deux ou les trois) pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Le terme potentiel ostéogénique, tel qu'il est utilisé ici, fait référence à la capacité des cellules à se (trans)différencier en cellules sécrétant des matrices osseuses ou à la capacité des cellules à sécréter la matrice osseuse (c'est-à-dire sans avoir besoin d'une étape de (trans)différenciation), in vivo, et éventuellement in vitro. Le terme englobe la capacité des cellules à former du tissu osseux par ossification intramembranaire ou ossification endochondrale. La capacité des cellules à former du tissu osseux par ossification intramembranaire représente généralement la capacité des cellules à former du tissu osseux sans avoir besoin d'une matrice cartilagineuse calcifiée comme support. La capacité des cellules à former du tissu osseux par ossification endochondrale représente typiquement la capacité des cellules à former du tissu osseux en formant d'abord une matrice cartilagineuse calcifiée et en utilisant ensuite ladite matrice cartilagineuse calcifiée comme support pour la formation du tissu osseux. Le terme ne couvre pas le potentiel ostéoinductif des cellules, qui représente la capacité des cellules à attirer d'autres cellules sécrétant une matrice osseuse et/ou à induire la (trans)différenciation d'autres cellules en sécrétant une matrice osseuse. L'homme du métier comprendra que si l'objectif
BE2019/5630 actuel est de déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro, les cellules peuvent, mais ne doivent pas nécessairement, en plus du potentiel ostéogénique, avoir également un potentiel ostéoinducteur.
En particulier, le potentiel ostéogénique est le potentiel des cellules à former une matrice osseuse par ossification endochondrale.
L'expression ossification endochondrale utilisée tout au long de l'application fait référence à un processus de formation du tissu osseux dans lequel les premièrs chondrocytes forment une matrice extracellulaire cartilagineuse, qui est ensuite utilisée par les ostéoblastes comme support pour déposer la matrice osseuse. Au cours de l'ossification endochondrale, certains chondrocytes peuvent se transformer en ostéoblastes.
Dans les modes de réalisation préférés, tous les CD73, CD105 et CD44 sont utilisés pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
En particulier, le CD 10 est utilisé en plus d'un ou plusieurs des CD73, CD 105 et CD44, de préférence en plus de tous les CD73, CD 105 et CD44, pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro. Par conséquent, l'utilisation des CD73, CD 105, CD44 et CD 10 est également prévue pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Un autre aspect fournit une méthode pour déterminer le potentiel ostéogène de cellules différenciées in vitro comprenant (al) la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs (par exemple, une, deux, trois ou quatre) de CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, et/ou (a2) la mesure de la quantité d'une ou plusieurs (par exemple, une, deux ou les trois) de CD73, CD105 ou CD44 exprimé par les cellules différenciées in vitro. Par conséquent, une méthode de détermination du potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro est également fournie ici, comprenant (al) la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant l'une des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence la mesure de la quantité des cellules différenciées in vitro exprimant deux des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence en mesurant la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant trois des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence en mesurant la quantité des cellules différenciées in vitro exprimant les quatre des CD73, CD 105, CD 10 et CD44 ; et/ou (a2) mesurer la quantité d'un des CD73, CD105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro, de préférence mesurer la quantité de deux des CD73, CD 105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro, plus préférentiellement mesurer la quantité des trois de CD73, CD105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro. Par conséquent, une méthode de détermination du potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro est également fournie ici, comprenant (al) la mesure de la quantité des cellules différenciées in vitro exprimant les quatre CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et/ou (a2) la mesure de la quantité des trois CD73, CD 105 ou CD44 exprimée par les cellules
BE2019/5630 différenciées in vitro. En particulier, la méthode enseignée ici n'implique pas la mesure d'autres marqueurs en plus des CD73, CD 105, CD 10 et CD44.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs (par exemple, une, deux, trois ou quatre) de CD73,
CD 105, CD 10 ou CD44.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant le CD44. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant le CD44 et l'un ou l'autre des CD73 et CD 105, ou les deux. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD44 et un ou plusieurs cellules (par exemple, une, deux ou les trois) de CD73, CD 105 ou CD 10.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant le CD 10. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant le CD 10 et un ou plusieurs cellules (par exemple, une, deux ou les trois) de CD73, CD105 ou CD44.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux ou trois). Dans certains cas, les méthodes enseignées ici, consistent à mesurer la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimé par les cellules différenciées in vitro.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD73 exprimée par les cellules différenciées in vitro. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD73 et de CD105 et de CD44 exprimés par les cellules différenciées in vitro, ou de l'une quelconque d'entre elles. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD73 et d'un ou de plusieurs CD 105, CD44 ou CD 10 exprimés par les cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux ou les trois).
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD105 exprimée par les cellules différenciées in vitro. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD105 et de CD73 et de CD44 exprimés par les cellules différenciées in vitro, ou de l'une quelconque d'entre elles. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD 105 et d'un ou de plusieurs CD73, CD44 ou CD 10 exprimés par les cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux ou les trois).
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD44 et de CD73 et de CD105 exprimée par les cellules différenciées in vitro, ou de l'une quelconque d'entre elles. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la
BE2019/5630 quantité de CD44 et d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD 10 exprimés par les cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux ou les trois).
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 sur la surface cellulaire ou exprimée par les cellules différenciées in vitro (par exemple, un, deux, trois ou quatre). Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD73, CD 105, CD44 et CD 10 sur la surface cellulaire ou exprimée par les cellules différenciées in vitro.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD10 exprimée par les cellules différenciées in vitro. Dans certains cas, les méthodes enseignées ici consistent à mesurer la quantité de CD10 et d'un ou de plusieurs CD73, CD105 ou CD44 (par exemple, un, deux ou les trois) exprimée par les cellules différenciées in vitro.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici comprennent (al) la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et/ou (a2) la mesure de la quantité d'une ou plusieurs cellules (par exemple, une, deux ou les trois) de CD73, CD105 ou CD44 exprimées par les cellules différenciées in vitro. Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici comprennent (al) la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et CD44, et/ou (a2) la mesure de la quantité d'une ou plusieurs cellules (par exemple, une, deux, trois ou quatre) de CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 exprimées par les cellules différenciées in vitro.
Les termes expression ou expression utilisés dans cette spécification couvrent généralement la génération de tout produit de transcription ou de traduction, tel que l'ARN, les peptides, les polypeptides et les protéines, par une cellule, ainsi que la présentation de peptides, polypeptides ou protéines à la surface cellulaire.
Au moyen de directives supplémentaires, lorsqu'une cellule est dite positive pour ou qu’elle exprime ou comprend l'expression d'un gène, d'un peptide, d'un polypeptide ou d'une protéine donné(e), tel que CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44, une personne compétente concluerait la présence ou la preuve d'un signal distinct pour ce gène, peptide, polypeptide ou protéine en effectuant une mesure pouvant détecter ou quantifier le gène, peptide, polypeptide ou protéine dans ou sur la cellule. La présence ou la preuve du signal distinct pour le gène, le peptide, le polypeptide ou la protéine serait convenablement conclue sur la base d'une comparaison du résultat de la mesure obtenue pour la cellule avec un résultat de la même mesure effectuée pour un témoin négatif (par exemple, une cellule connue pour ne pas exprimer le marqueur) et/ou un témoin positif (par exemple, une cellule connue pour exprimer le marqueur).
Une molécule ou un analyte tel qu'un peptide, un polypeptide, une protéine ou un acide nucléique, ou un groupe de deux ou plusieurs molécules ou analytes tels que deux ou plusieurs peptides, polypeptides, protéines ou acides nucléiques, est mesuré dans un échantillon lorsque la présence ou
BE2019/5630 l'absence et/ou la quantité de ladite molécule ou analyte ou dudit groupe de molécules ou d'analytes est détectée ou déterminée dans l'échantillon, de préférence sensiblement à l'exclusion des autres molécules ou analytes. Les termes quantité, montant et niveau sont synonymes et généralement bien compris dans l'art. Les termes utilisés ici peuvent se référer en particulier à une quantification absolue d'un certain nombre de cellules, d'un peptide, d'un polypeptide, d'une protéine ou d'un acide nucléique dans un échantillon, ou à une quantification relative d'un certain nombre de cellules, un peptide, un polypeptide, une protéine ou un acide nucléique dans un échantillon, par exemple, par rapport à une autre valeur telle que celle indiquée ici. La quantité d'un peptide, d'un polypeptide ou d'une protéine peut également être représentée par l'activité d'un peptide, polypeptide ou protéine. L'activité d'un peptide, d'un polypeptide ou d'une protéine dans un échantillon peut également être exprimée en termes absolus, p. ex. en unités enzymatiques par volume ou en termes relatifs.
Une quantité absolue d'un peptide, d'un polypeptide, d'une protéine ou d'un acide nucléique dans un échantillon peut être avantageusement exprimée en poids ou en quantité molaire, ou plus généralement en concentration, par exemple en poids par volume ou en mole par volume.
Une quantité relative d'un peptide, d'un polypeptide, d'une protéine ou d'un acide nucléique dans un échantillon peut être avantageusement exprimée sous la forme d'une augmentation ou d'une diminution ou d'une augmentation du pli par rapport à ladite autre valeur, comme par rapport à une valeur de référence telle que décrite ailleurs. Pour effectuer une comparaison relative entre un premier et un deuxième paramètre (par exemple, première et deuxième grandeurs), il n'est pas nécessaire de déterminer d'abord les valeurs absolues desdits premier et deuxième paramètres. Par exemple, une méthode de mesure peut produire des lectures quantifiables (telles que, par exemple, des intensités de signal) pour lesdits premier et second paramètres, dans laquelle lesdites lectures sont fonction de la valeur desdits paramètres, et dans laquelle lesdites lectures peuvent être directement comparées pour produire une valeur relative pour le premier paramètre versus le second paramètre, sans la nécessité réelle de convertir les lectures en valeur absolue des paramètres respectifs au préalable.
Une quantité relative de cellules peut être exprimée en pourcentage (fraction) du nombre total de cellules analysées, plus particulièrement du nombre total de cellules dont l'expression de l'une ou plusieurs des cellules CD73, CD105, CD10 ou CD44 est déterminée. Par conséquent, la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs cellules (par exemple, une, deux, trois ou quatre) de CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44, telle qu'enseignée ici, peut typiquement impliquer (i) de déterminer l'expression (c’est-à-dire la présence) CD73, CD105, CD10 et/ou CD44 par les cellules différenciées in vitro, (ii) compter le nombre de cellules différenciées in vitro qui expriment CD73, CD 105, CD 10 et/ou CD44 à l'étape (i) ; et (iii) calculer la fraction des cellules différenciées in vitro qui expriment CD73, CD 105, CD 10 et/ou CD44 à l'étape (i) par rapport au nombre total des cellules différenciées in vitro examinées à l'étape (i). La quantité de cellules
BE2019/5630 différenciées in vitro qui expriment un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 peut être mesurée par tout moyen connu dans l'art. Par exemple, par cytométrie en flux.
En conséquence, dans des modes de réalisation particuliers, la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs (par exemple, une, deux, trois ou quatre) de CD73, CD105, CD10 ou CD44 est la fraction des cellules différenciées in vitro déterminée pour exprimer une ou plusieurs des CD73, CD105, CD10 ou CD44 par rapport à toutes les cellules différenciées in vitro analysées.
La détermination de la présence et/ou la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 par des cellules différenciées in vitro peut être effectuée par toute méthode de détection et/ou de quantification existante, disponible ou conventionnelle utilisée pour mesurer la présence ou l'absence (par exemple, la lecture étant présente ou absente, ou la quantité détectable ou la quantité absolue ou relative d'un peptide, polypeptide, protéine ou acide nucléique dans ou sur une cellule ou population cellulaire). Par exemple, ces méthodes peuvent comprendre des méthodes d'analyse biochimique, des méthodes d'immunoessais, des méthodes d'analyse par spectrométrie de masse, des méthodes de chromatographie ou des combinaisons de ces méthodes.
En particulier, la mesure de la présence et/ou de la quantité d'un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 comprend la mesure des peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD105, CD10 ou CD44 ou de l'ARNm CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 ou des deux.
Dans les modes de réalisation préférés, la mesure de la présence et/ou de la quantité d'un ou plusieurs des CD73, CD105, CD10 ou CD44 comprend la mesure des peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD 105, CD 10 ou CD44.
Comme chacun des peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD105, CD10 et CD44 est habituellement exprimé à la surface de la cellule, la personne compétente comprendra que s'il est fait référence à un ou plusieurs des CD73, CD105, CD10 ou CD44 à la surface cellulaire, le peptide, le polypeptide ou la protéine est sous forme est destiné à un ou plusieurs peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, ou qu'il est fait référence à un ou plusieurs peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD105, CD10 ou CD44 à la surface cellulaire.
En particulier, la mesure de la présence et/ou de la quantité d'un ou plusieurs CD73, CD105, CD10 ou CD44 comprend la mesure des peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD105, CD10 ou CD44 à la surface cellulaire.
Plus particulièrement, la présence et/ou la quantité d'un ou plusieurs peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 sous une forme non dénaturée à la surface cellulaire des cellules vivantes est mesurée.
Plus particulièrement, la mesure de la présence et/ou de la quantité d'un ou plusieurs peptides, polypeptides ou protéines CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 comprend l'utilisation d'une technique qui
BE2019/5630 utilise un ou plusieurs agents capables de se lier spécifiquement respectivement à CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence où le ou plusieurs agents sont, chacun indépendamment, un ou plusieurs anticorps, fragments d'anticorps, supports de protéines analogues aux anticorps ou aptamères.
Ces méthodes peuvent comprendre des méthodes d'essai fondées sur l'affinité, dans lesquelles la capacité d'un essai à détecter et/ou quantifier un peptide, un polypeptide, une protéine ou un acide nucléique est conférée par une liaison spécifique entre un agent liant détectable et/ou quantifiable et i) le peptide, polypeptide, protéine ou acide nucléique. Le liant peut être un liant immunologique (anticorps) ou non immunologique. Des exemples d'anticorps capables de se lier à la CD73 humaine comprennent, sans s'y limiter, les anticorps disponibles auprès des fournisseurs suivants (# signifie numéro de catalogue) : BD Biosciences (anticorps monoclonal de souris conjugué à l'allophycocyanine (APC), n° 560847 ; anticorps monoclonal de souris conjugué à la fluorescéine (FITC), n° 561254 ; anticorps monoclonal de souris conjugué à la R-phycoérythrine (PE) n° 55027), Abeam (anticorps monoclonal de souris, n°ab54217 ; monoclonal de lapin, #ab79423 ; monoclonal de souris #ab34199), systèmes R&D (anticorps de chèvre polyclonal biotinylé, #BAF1182 ; souris monoclonal, #MAB1182 ; anticorps de chèvre polyclonal conjugué PE, #FAB8160P). Des exemples d'anticorps capables de se lier au CD 105 humain comprennent, sans s'y limiter, les anticorps disponibles auprès des fournisseurs suivants ( # signifie numéro de catalogue) : BD Biosciences (anticorps monoclonal de souris conjugué APC, n° 562408 ; anticorps monoclonal de souris marqué PE, n° 560839), Abeam (monoclonal de souris, n°abl56756 ; monoclonal de souris, n°ab2529 ; (souris monoclonale conjuguée Alexa Fluor® 488, #FAB10971G ; souris monoclonale conjuguée Alexa Fluor® 647, #FAB10971R ; polyclonale chèvre, #AF1097). Des exemples d'anticorps capables de se lier à la CD44 humaine comprennent, sans s'y limiter, les anticorps disponibles auprès des fournisseurs suivants (# signifie numéro de catalogue) : BD Biosciences (anticorps monoclonal de souris conjugué PE, n° 550989 ; anticorps monoclonal de souris conjugué FITC, n° 555478), Abeam (lapin polyclonal, n°abl57107, souris monoclonal conjugué PE, n°ab46793 ; monoclonal de souris conjugué PE, #ab58754), systèmes R&D (monoclonal de rat conjugué Alexa Fluor®, #FAB6127 S ; monoclonal de souris conjugué PE, #FAB3660P). Des exemples d'anticorps capables de se lier aux CD10 humains comprennent, sans s'y limiter, les anticorps disponibles auprès des fournisseurs suivants (# signifie numéro de catalogue) :BD Biosciences (anticorps monoclonal de souris conjugué PE, #555375), Abeam (monoclonal de lapin, #ab79423 ; polyclonal de lapin, #ab82073 ; monoclonal de souris conjugué PE, #ab210380), systèmes R&D (monoclonal de souris Alexa Fluor®, #FAB1182N ; biotinylé de chèvre, #BAF1182). Les méthodes d'essai fondées sur l'affinité, telles que les méthodes d'essai immunologique, comprennent notamment l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, la cytométrie en flux, la cytométrie de masse, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), la microscopie par fluorescence, le tri cellulaire par fluorescence utilisant des systèmes microfluidique,
BE2019/5630 techniques basées sur l'adsorption par (immuno)affinité telles que la chromatographie d'affinité, le tri cellulaire activé magnétique ou le tri cellulaire par billes utilisant des systèmes microfluidiques, l'immunoprécipitation, le dosage immunoenzymatique (ELISA) et les techniques basées sur ELISPOT, le dosage radioimmuno (RIA), Western blot, etc.
D'autres techniques de détection et/ou de quantification des peptides, polypeptides ou protéines peuvent être utilisées, éventuellement en conjonction avec l'une des méthodes d'analyse décrites cidessus. Ces méthodes comprennent, sans s'y limiter, les techniques de spectrométrie de masse (SM), la séparation par extraction chimique, la focalisation isoélectrique (IEL), y compris la focalisation isoélectrique capillaire (CIEL), l'isotachophorèse capillaire (CITP), l'électrochromatographie capillaire (CEC), etc, électrophorèse sur gel de polyacrylamide unidimensionnelle (PAGE), électrophorèse sur gel de polyacrylamide bidimensionnelle (2D-PAGE), électrophorèse sur gel capillaire (CGE), électrophorèse sur zone capillaire (CZE), chromatographie électrocinétique micellaire (MEKC), électrophorèse à écoulement libre (LEE), etc.
La présence ou l'absence et/ou la quantité d'un acide nucléique, par exemple au niveau de l'ARNnh, du pré-ARNm, de l'ARNm ou de l'ADNc, peuvent être détectées en utilisant des outils de mesure quantitative standard connus dans cet art. Les exemples non limitatifs comprennent l'analyse fondée sur l'hybridation, l'analyse de l'expression des biopuces, l'expression génétique numérique (DGE), l'hybridation d'ARN in situ (EISH), l'analyse Northern blot et autres ; PCR, RT-PCR, RT-qPCR, PCR en point final, PCR numérique ou autres ; détection d'oligonucléotides supportés, pyroséquençage, séquençage cyclique polonymique par synthèse, séquençage bidirectionnel simultané, séquençage monomoléculaire, séquençage temps réel monomoléculaire, véritable séquençage monomoléculaire, séquençage de nanopores assisté par hybridation, séquence par synthèse ou similaire.
Dans d'autres exemples, il est possible d'utiliser toute combinaison de méthodes telles que celles qui sont décrites dans le présent document.
En particulier, CD73, CD105, CD105, CD10 ou CD44 désignent des peptides, des polypeptides ou des protéines et l'expression d'un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 désigne l'expression de la surface cellulaire d'un ou plusieurs des CD73, CD105, CD10 ou CD44, respectivement. L'expression de la surface cellulaire d'un peptide, d'un polypeptide ou d'une protéine est déterminée de préférence par cytométrie en flux.
En particulier, la méthode telle qu'enseignée ici comprend (al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et/ou (a2) la mesure de la quantité de l'un ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro. Par conséquent, est également fournie ici la méthode telle qu'enseignée ici comprenant (al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant l'une des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface
BE2019/5630 cellulaire des cellules différenciées in vitro, de préférence la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant deux des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro, plus préférentiellement la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant trois des CD73, CD105, CD10 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro, plus préférentiellement la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant la totalité des CD73, CD 105, CD 10 et CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et/ou (a2) mesurer la quantité d'un des CD73, CD 105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro, de préférence mesurer la quantité de deux des CD73, CD105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro, plus particulièrement mesurer la quantité totale des CD73, CD105 et CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes telles qu'enseignées ici peuvent comprendre :
(al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et
CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(a2) la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 (par exemple, un, deux ou des trois) à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentative des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(b2) la comparaison de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 (par exemple, un, deux ou des trois) mesurée en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils respectives représentaitives des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(cl) la détermination de l’écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) par rapport à ladite valeur seuil ;
(c2) la détermination de l’écart de la quantité de lün quelconque (par exemple, un, deux ou des trois) de CD73, CD 105 ou CD44 telle que mesurée en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) l’utilisation dudit écart pour déterminer un potentiel ostéogénique particulier des cellules différenciées in vitro.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes telles qu'enseignées ici peuvent comprendre :
(al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et
CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(a2) la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 (par exemple, un, deux, trois ou quatre) à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
BE2019/5630 (bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentative des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(b2) la comparaison de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD105, CD44 ou CD10 (par exemple, un, deux, trois ou quatre) mesurée en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils respectives représentatives des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(cl) la détermination de l’écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) par rapport à ladite valeur limite ;
(c2) la détermination de l’écart de la quantité de l'un quelconque (par exemple, un, deux, trois ou les quatre) de CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 tel que mesuré en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) l’utilisation dudit écart pour déterminer un potentiel ostéogénique particulier des cellules différenciées in vitro.
En particulier, la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et/ou la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro est effectuée en utilisant une technique choisie dans le groupe comprenant la cytométrie en flux, la cytométrie de masse, le tri cellulaire activé par fluorescence, la microscopie par fluorescence, la séparation par affinité, la séparation cellulaire magnétique, la séparation microfluidique et leurs combinaisons.
La cytométrie en flux couvre les méthodes par lesquelles les cellules individuelles d'une population cellulaire sont analysées en fonction de leurs propriétés optiques (par exemple, l'absorbance de la lumière, la diffusion de la lumière et les propriétés de fluorescence) lorsqu'elles passent dans un flux étroit en file indienne à travers un faisceau laser. Les méthodes de cytométrie en flux comprennent les méthodes de tri de cellules activées par fluorescence (FACS) par lesquelles une population de cellules ayant des propriétés optiques particulières est séparée des autres cellules.
La cytométrie élémentaire en flux continu, ou cytométrie de masse, fondée sur la spectrométrie de masse, permet d'analyser les cellules en remplaçant les réactifs de liaison marqués au fluorochrome par des réactifs de liaison marqués en masse, c'est-à-dire marqués avec un élément ou isotope ayant une masse définie. Dans ces méthodes, les particules marquées sont introduites dans un cytomètre de masse, où elles sont atomisées et ionisées individuellement. Les particules individuelles sont ensuite soumises à une analyse élémentaire qui identifie et mesure l'abondance des marques de masse utilisées. Les identités et les quantités des éléments isotopiques associés à chaque particule sont ensuite stockées et analysées. En raison de la résolution de l'analyse élémentaire et du nombre
BE2019/5630 d'isotopes élémentaires pouvant être utilisés, il est possible de mesurer simultanément jusqu'à 100 paramètres ou plus sur une seule particule.
La microscopie par fluorescence englobe largement les méthodes par lesquelles les cellules individuelles d'une population cellulaire sont analysées au microscope par leurs propriétés de fluorescence. Les méthodes de microscopie par fluorescence peuvent être manuelles ou, de préférence, semi-automatiques ou automatisées.
La séparation par affinité, aussi appelée chromatographie d'affinité, englobe de façon générale les techniques impliquant des interactions spécifiques de cellules présentes dans une phase mobile, telles qu'une phase liquide appropriée (par exemple, une population cellulaire en suspension aqueuse) avec une phase stationnaire, telle qu'une phase solide appropriée, et donc l'adsorption des cellules dans une phase stationnaire, suivie par la séparation de la phase stationnaire du reste de la phase mobile et la récupération (par exemple, élution) des cellules adsorbées de la phase stationnaire. La séparation par affinité peut être colonnaire, ou alternativement, peut impliquer un traitement par lots, dans lequel la phase stationnaire est collectée / séparée des phases liquides par des techniques appropriées, telles que la centrifugation ou l'application d'un champ magnétique (par exemple, lorsque la phase stationnaire comprend un substrat magnétique, comme des particules ou billes magnétiques). En conséquence, la séparation des cellules magnétiques est également envisagée ici.
Les systèmes microfluidiques permettent une détection, une quantification et/ou un tri précis et à haut débit des cellules, exploitant une variété de principes physiques. Le tri des cellules sur micropuces offre de nombreux avantages en réduisant la taille de l'équipement nécessaire, en éliminant les aérosols potentiellement biologiquement dangereux et en simplifiant les protocoles complexes généralement associés au tri des cellules. Le terme système microfluidique, tel qu'il est utilisé dans la présente spécification, se réfère généralement aux systèmes ayant un ou plusieurs microcanaux de fluide. Les microcanaux désignent des canaux de fluide ayant des dimensions en coupe transversale dont les plus grands sont généralement inférieurs à 1 mm, de préférence inférieurs à 500 μm, plus préférablement inférieurs à 400 μm, plus préférablement inférieurs à 300 μm, plus préférablement inférieurs à 200 μm, par exemple, 100 μm ou inférieurs. Ces systèmes microfluidiques peuvent être utilisés pour manipuler des fluides et/ou des objets tels que gouttelettes, bulles, capsules, particules, cellules, etc. Les systèmes microfluidiques peuvent permettre, par exemple, le triage de cellules sans étiquette (examiné dans Shields et al., Lab Chip. 2015, vol. 15 : 1230-1249) ou le triage de cellules sans étiquette (par exemple, en utilisant un ou plusieurs agents de liaison fluorescents à base de marqueurs conjugués (par exemple, un ou plusieurs agents de liaison fluorophore, comme un ou plusieurs anticorps conjugués avec des billes, comme le ou les anticorps conjugués à des billes). En particulier, la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et
BE2019/5630 la mesure de la quantité d'un ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro est réalisée en utilisant la cytométrie en flux.
Les cellules différenciées in vitro peuvent être marquées au moyen d'anticorps conjugués à un fluorochrome (par exemple, PE, PE, PE-Cy 7, PE-Cy5, APC, APC-Cy7, Alexa Fluor 647®, Alexa Fluor 700®, FITC, Pacifie Blue, Alexa Fluor 488®) pour un ou plusieurs des CD73, CD105, CD10 ou CD44 et ensuite excité par un laser à une certaine longueur d'onde (longueur d'onde d'excitation du fluorochrome) pour émettre la lumière à différentes longueurs d'ondes (longueur d'onde d'émission du fluorochrome). Par exemple, les cellules différenciées in vitro peuvent être étiquetées à l'aide d'un anticorps conjugué à une allophycocyanine (APC) contre CD105 (BD Biosciences®, Cat N° : 562408), un anticorps conjugué à un APC contre CD73 (BD Biosciences®, Cat N° :560847), un anticorps conjugué à la phycoérythrine (PE) contre CD10 (BD Biosciences®, Cat N° : 555375) et/ou un anticorps conjugué à la PE contre CD44 (BD Biosciences®, Cat N° : 550989). La personne compétente comprendra que la longueur d'onde du laser et la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome utilisé pour marquer l'anticorps doivent être compatibles. Par exemple, la longueur d'onde d'excitation pour le FITC est de 488 nm et la longueur d'onde d'émission est de 500-560 nm ; la longueur d'onde d'excitation pour le PE est de 488-561 nm et la longueur d'émission est de 560-595 nm. La présence ou la quantité de plus d'un des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 peut être mesurée simultanément en utilisant des anticorps qui sont chacun conjugués à un fluorochrome différent qui émet une lumière différente à une longueur d'onde différente.
La plupart des cellules n'émettent pas naturellement de lumière fluorescente. Par conséquent, si un anticorps conjugué au fluorochrome est lié à un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro, un signal lumineux fluorescent sera capté lorsque cette cellule traverse le faisceau laser du cytomètre en flux. Pour chacun des anticorps conjugués au fluorochrome utilisés dans l'analyse cytométrique en flux, on peut fixer un seuil de positivité. Par exemple, un seuil de positivité peut être fixé à 1 % de la positivité de l'anticorps isotype témoin.
La quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro peut être représentée par l'intensité moyenne ou moyenne du signal fluorescent émis par les cellules différenciées in vitro. L'intensité moyenne ou médiane du signal fluorescent est déterminée à partir du signal fluorescent détecté pour chaque cellule de l'ensemble de la population cellulaire analysée (c'est-à-dire, y compris les cellules qui n'ont pas émis de signal lumineux fluorescent). Plus particulièrement, la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD105, CD105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro peut être représentée par la médiane normalisée de l’intensité de fluorescence (nMFI). La MFI normalisée est généralement déterminé en divisant la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée par un ou plusieurs anticorps conjugués au fluorochrome par la MFI du témoin négatif (par exemple, les cellules
BE2019/5630 marquées par un ou plusieurs anticorps isotypes conjugués au fluorochrome, tels que l'immunoglobuline G (IgG), conjugués à FITC, APC et PE).
La médiane normalisée de l'intensité de fluorescence ou nMFI telle qu'elle est utilisée ici se réfère au rapport entre la nMFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un ou plusieurs anticorps conjugués au fluorochrome (MFI marker_channel) et la MFI de la population cellulaire marquée avec un ou plusieurs anticorps anti isotype conjugués au fluorochrome (MFI isotype_channel), comme le contrôle des immunoglobulines G (IgG) conjuguées à un fluorochrome tel que FITC, APC ou PE. Les résultats de la nMFI sont proportionnels à la quantité de marqueurs présents à la surface cellulaire d'une population d'intérêt. La (n)MFI est généralement liée à la longueur d'onde à laquelle l'émission du signal fluorescent est mesurée. Par exemple, les longueurs d'onde d'excitation peuvent être de 488 nm pour FITC, 488 nm pour PE et 633 nm pour APC. Par exemple, les longueurs d'onde d'émission peuvent être de 530 nm pour FITC, 580 nm pour PE et 660 nm pour APC.
Le cytomètre en flux peut compter le nombre total de cellules différenciées in vitro marquées qui traversent fe faser ainsi que fe nombre de cellules différenciées in vitro marquées qui émettent de fa fumière à une certaine fongueur d'onde. Ces informations peuvent être utifisées pour déterminer fa quantité, de préférence fa fraction, de ceHuies différenciées in vitro exprimant un ou pfusieurs des CD73, CDf05, CD 10 ou CD44, égafement connu sous fe nom de pourcentage de ceHuies fluorescentes positives (PPFC).
L'homme du métier comprendra qu'avant de mesurer fa présence ou fa quantité d'un ou de pfusieurs CD73, CDf05, CD10 ou CD44 à fa surface cefluiaire des cefluies différenciées in vitro, fa popuiation de cefluies d'intérêt peut être distinguée des autres ceHuies ou débris en fonction de ieurs propriétés de diffusion avant et iatéraie, par exempte par des stratégies de gating.
L'anaiyse des données de cytométrie en flux peut être effectuée sur un nombre fixe d'événements détectés (par exempte, un certain nombre de cefluies traversant fe faser du cytomètre en flux). Par exempte, i'anaiyse des données de cytométrie en flux peut être effectuée sur f0 000 événements de fa popuiation de cefluies porteuses.
La cytométrie en flux peut être réaiisée en utflisant n'importe quei cytomètre connu dans i'art. Par exempte, en utflisant FACS Cantoll (BD Biosciences®).
L'anaiyse des données de cytométrie en flux peut être effectuée à i'aide de tout iogiciei de cytométrie en flux connu dans i'art. Par exempte, fe iogiciei FACS Diva® 8.0 (BD Biosciences®). En particuiier, fa méthode teiie qu'enseignée ici comprend (bf) fa comparaison de fa quantité de ceHuies différenciées in vitro exprimant une ou pfusieurs (par exempte, une, deux, trois ou quatre) de CD73, CDf05, CDf05 ou CD44 teiie que mesurée comme décrite ailleurs dans le présent document avec une valeur de référence ou valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu et (b2) la
BE2019/5630 comparaison de la quantité de lüne ou plusieurs (par exemple, un, deux ou les trois) de CD73, CD105 ou CD44 exprimés par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs dans le présent document avec une valeur de référence ou une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu. Par conséquent, la méthode telle qu'enseignée est également fournie dans le présent document, comprenant (bl) la comparaison de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant la totalité de CD73, CD 105, CD 10 et CD44 telle que mesurée comme décrite ailleurs dans le présent document avec une valeur de référence ou une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu et (b2) la comparaison de la quantité de toutes les cellules différenciées in vitro CD73, CD 105 et CD44 exprimées par les cellules telles que mesurées comme décrit dans le présent document avec une valeur de référence ou valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu.
Dans des réalisations plus particulières, la méthode telle qu'enseignée ici comprend (bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs (par exemple, une, deux, trois ou quatre) de CD73, CD105, CD105 ou CD44 telle que mesurée comme décrite ailleurs ici avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu et/ou (b2) la comparaison de la quantité d'une ou plusieurs (par exemple, un, deux ou les trois) de CD73, CD 105 ou CD44 exprimés par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit dans le présent document avec une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu. Par conséquent, la méthode telle qu'enseignée ici comprend (bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant toutes les CD73, CD 105, CD 10 et CD44 telles que mesurées comme décrit ailleurs dans le présent document avec une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ; et/ou (b2) la comparaison de la quantité totale de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro comme mesuré comme décrit ailleurs dans le présent document avec une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu.
Dans des réalisations plus particulières, la méthode telle qu'enseignée ici comprend (bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ; et/ou (b2) la comparaison de la quantité d'un ou plusieurs (par exemple, un, deux ou trois) CD73, CD 105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro telle que mesurée comme décrite ailleurs dans le présent document avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu. Dans certains cas, la méthode enseignée ici comprend (bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et CD44 telle que mesurée comme décrite ailleurs dans le présent document avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ; et/ou (b2) la comparaison de la quantité de lüne ou plusieurs (par exemple, un, deux, trois ou
BE2019/5630 les quatre) de CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 exprimés par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs, avec une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu.
Les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu peuvent être des cellules ayant un certain degré de potentiel ostéogénique (par exemple, aucun potentiel ostéogénique, un faible potentiel ostéogénique, un potentiel ostéogénique élevé ou un degré souhaité de potentiel ostéogénique).
Le degré de potentiel ostéogénique peut être exprimé par la quantité de matrice osseuse formée et/ou par le taux de formation de matrice osseuse in vitro ou in vivo. La quantité de matrice osseuse et/ou le taux de formation de la matrice osseuse peuvent être déterminés par toute méthode connue dans l'art, comme rhistomorphométrie osseuse, l'histologie (par exemple, collagène I, trichrome de Masson Goldner) et l'immunofluorescence (par exemple, collagène I, tétracycline, marquage osseux). Par exemple, l'épaisseur de l'os nouvellement minéralisé, la surface de l'os néoformé ou la présence d'au moins un nodule minéralisé peuvent être évaluées in vivo après administration des cellules aux souris par injection sous-cutanée.
Par exemple, le degré de potentiel ostéogénique des cellules peut être déterminé en mesurant l'activité ostéogénique de ces cellules. L'activité ostéogénique de cellules humaines différenciées in vitro peut être mesurée in vivo par exemple en déterminant la présence d'au moins un nodule minéralisé (par exemple, d'origine humaine ou mixte humain-murine) après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne osseuse. L'activité ostéogénique de cellules humaines différenciées in vitro peut être mesurée in vivo, par exemple en évaluant l'épaisseur de nodules nouvellement minéralisés (par exemple, d'origine humaine ou mixte humain-murine) après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne, ou en évaluant le degré de réparation osseuse dans un modèle souris de défaut fémoral segmentaire souscritique (sub-CSD).
Par exemple, une quantité de cellules humaines, comme 2,5 x 106 cellules formulées dans 100 μΐ d'excipient, peut être administrée à des souris nudes par une seule administration sous-cutanée sur l'os de la voûte crânienne. Pour marquer la néoformation osseuse au fil du temps, des fluorochromes fixant le calcium comme le rouge d'alizarine (rouge), la calceine (verte), la calceine (bleue) et la tétracycline (jaune) peuvent être administrés successivement à des souris par injection intrapéritonéale 3 jours avant et 4, 8 et 12 jours après administration cellulaire des cellules, respectivement. Les souris peuvent être euthanasiées 2 semaines après l'administration cellulaire et la voûte crânienne de chaque souris peut être prélevée pour évaluer les propriétés de formation osseuse par histomorphométrie (par exemple, quantification de la formation osseuse). Les épaisseurs initiale et finale de la voûte crânienne peuvent être utilisées pour calculer le pourcentage de formation néo-osseuse après administration des cellules. De plus, les propriétés de formation osseuse peuvent également être évaluées par
BE2019/5630 immunofluorescence (par exemple, origine murine ou humaine de la formation osseuse). L'activité ostéoblastique peut être évaluée sur des sections de voûte crânienne en utilisant la méthode de détection de l'activité enzymatique ALP. L'activité ostéoclastique peut être évaluée sur des coupes de voûte crânienne à l'aide des méthodes de détection de l'activité enzymatique TRAP. L'état de minéralisation de l'os néoformé peut être évalué à l'aide de la coloration au trichrome de Masson Goldner sur les sections de la voûte crânienne teintées à l’ALP, par exemple en utilisant des kits disponibles dans le commerce (par exemple, Bio-Optica®). La formation du cartilage peut être évaluée à l'aide d'une coloration à la safranine orange sur les sections de paraffine sagittale de la voûte crânienne.
Dans un autre exemple, des cellules humaines différenciées in vitro, telles que 1,25 x 106 cellules formulées dans un excipient de 50 μΐ, peuvent être administrées localement à des souris au site du défaut osseux par injection percutanée un jour après avoir été soumises au défaut fémoral segmentaire de taille sub-critique. La réparation osseuse peut être quantifiée par radiographie. La taille du défaut osseux peut être quantifiée en mesurant la distance entre les deux bords du défaut osseux.
En particulier, les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu peuvent être des cellules connues pour former une matrice osseuse sans avoir besoin d'une matrice cartilagineuse calcifiée comme modèle (par exemple, des cellules connues pour former l'os par ossification intramembraneuse) ou des cellules connues pour former une matrice osseuse en formant d'abord une matrice cartilagineuse calcifiée et en utilisant ensuite ladite matrice cartilagineuse calcifiée comme modèle pour former des os (par exemple, les cellules connues pour former un os par ossification endochondrique). Le type de formation osseuse (p. ex. ossification endochondrale ou ossification intramembranaire) peut être déterminé par toute méthode connue dans l'art, comme l'histomorphométrie osseuse, l'histologie (p. ex. collagène I, trichrome de Masson Goldner, safranine-orange, SOX9, collagène de type II) et l'immunofluorescence (par exemple, collagène I, marquage osseux à la tétracycline, collagène de type II). Par exemple, la présence d'au moins un nodule minéralisé après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée comme décrit ailleurs dans le présent document peut indiquer que la matrice osseuse s’est formée par ossification endochondrale.
En particulier, les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu sont des cellules connues pour former de l'os par ossification endochondrale. Par exemple, les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu peuvent être des cellules humaines qui forment au moins un nodule minéralisé d'origine humaine in vivo après administration des cellules à des souris par injection sous-cutanée, l'injection sous-cutanée étant de préférence effectuée sur l'os de la voûte crânienne.
En particulier, les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu sont des cellules (par exemple, cellules humaines) qui présentent une augmentation de la formation osseuse in vivo (par exemple, d'origine humaine) d'au moins environ 20 % (environ 1,2 fois ou plus), ou d'au moins environ 30 %
BE2019/5630 (environ 1,3 fois ou plus), ou d'au moins environ 40 % (environ 1,4 fois ou plus), ou d'au moins environ 50 % (environ 1,5 fois ou plus), ou d'au moins environ 60 % (environ 1.6 fois ou plus), ou d'au moins environ 70 % (environ 1,7 fois ou plus), ou d'au moins environ 80 % (environ 1,8 fois ou plus), ou d'au moins environ 90 % (environ 1,9 fois ou plus), ou d'au moins environ 100 % (environ 2 fois ou plus) après administration des cellules, par exemple, à des souris par injection sous-cutanée, par rapport à la formation osseuse observée lors de l'administration de cellules témoins (par exemple, cellules sans potentiel ostéogénique ou cellules à faible potentiel ostéogénique) ou d'un véhicule, par exemple, à des souris par injection sous-cutanée, de préférence dans laquelle l'injection sous-cutanée est effectuée sur l'os de la voûte crânienne. Par exemple, des CSM indifférenciées obtenues du même donneur que les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu peuvent être utilisées comme cellules témoins.
Parmi les exemples non limitatifs de cellules connues pour avoir un faible potentiel ostéogénique, on peut citer les cellules dérivées in vitro de CSM différenciées (ci-après dénommées produit cellulaire A ou cellules formatrices d’os A) obtenues comme suit : des globules blancs de moelle osseuse sont ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans le milieu de culture, et incubés sur 37°C dans un incubateur humide contenant duCO2à 5%. 4 jours après l'ensemencement cellulaire, les cellules non adhérentes sont retirées et le milieu est renouvelé avec un milieu de culture conventionnel additionné d'Octaserum à 5 % (sérum autologue 50:50 et OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix), TGFß-Ι (Humanzyme). 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture est enlevée et remplacée par un milieu frais. Les cellules sont cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au 14iem jour, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple, avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires sont cryoconservées dans un milieu de congélation comprenant un milieu de culture, 10% d'Octaserum (sérum autologue 50:50 et OctaPlasLG® (Octapharma), 10% DMSO) et stockées dans l'azote liquide. Pour la culture secondaire, les cellules sont décongelées et ré-ensemencement à une densité de 1144 cellules/cm2. Les cellules sont cultivées pendant la culture secondaire pendant 14 jours. Au 28iem jour, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple, avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage vers le haut et vers le bas (passage 2 : P2). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules sont remises en suspension, par exemple, dans de l’OctaPlasLG®, à une concentration finale de 25 x 106 cellules/ml. Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document produit cellulaire A ou cellules formatrices d'os A.
Parmi les exemples non limitatifs de cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique élevé, on peut citer les cellules dérivées in vitro de CSM différenciées (ci-après dénommées produit cellulaire B ou cellules formatrice d’os B) obtenues comme suit : des globules blancs de moelle osseuse sont ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans un milieu de culture classique comprenant 5% d'OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 Ul/ml d'héparine (LEO Pharma), du FGF-b (CellGenix) et du
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TGFß-1 (Humanzyme), et incubé à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% deCO2. 4 jours après l'ensemencement, les cellules non adhérentes sont retirées et le milieu est renouvelé avec du milieu de culture. 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture est enlevée et remplacée par un milieu frais pour renouveler les facteurs de croissance. Les cellules sont cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au 14iem jour, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple, avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires sont cryoconservées (par exemple, dans CryoStor® CS 10 (BioLife Solutions)) et stockées dans l'azote liquide. Ensuite, les cellules intermédiaires sont décongelées et réensemencées pour une culture secondaire à une densité de 286 cellules/cm2. Les cellules sont cultivées pendant la culture secondaire pendant 14 jours. Au 28iem jour, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage vers le haut et vers le bas (passage 2 : P2). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules sont remises en suspension, par exemple, dans OctaPlasLG®, à une concentration finale de 25 x 106 cellules/ml. Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document produit cellulaire B ou cellules formatrices d’os B.
En particulier, les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu sont des cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
Dans certaines réalisations, la valeur seuil de (bl) et/ou lesdites valeurs seuils respectives de (b2) peuvent être des valeurs seuils représentatives des cellules ayant un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
Le terme cliniquement utile, lorsqu'il est utilisé en relation avec le potentiel ostéogénique des cellules, désigne un degré de potentiel ostéogénique des cellules permettant aux cellules de former, lors de la greffe des cellules dans un sujet, une matrice osseuse en une quantité et/ou par un mécanisme (par exemple, ossification endochondrale ou ossification intramembranaire) qui a une signification thérapeutique pour un sujet, tel que celui qui procure au sujet un bénéfice clinique pertinent, comme à un sujet atteint de maladie musculosquelettique ou un trouble lié aux os.
Dans certains cas, les cellules différenciées in vitro peuvent avoir un potentiel ostéogénique cliniquement utile si au moins 50 % des animaux (par exemple, à des souris) forment des nodules minéralisés (par exemple, d'origine humaine ou mixte humain-murine) après administration des cellules aux animaux (par exemple, à des souris) par injection sous-cutanée dans sur la voûte crânienne. Dans certaines manifestations, les cellules différenciées in vitro peuvent avoir un potentiel ostéogénique cliniquement utile si au moins 60%, au moins 65%, au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90 ou au moins 95% des animaux (par exemple, des souris) forment des nodules minéralisés (par exemple, origine humaine ou mixte humaine/souris) après
BE2019/5630 administration des cellules aux animaux (par exemple, à des souris) par injection sous-cutanée sur la voûte crânienne.
Les exemples non limitatifs de maladies musculo-squelettiques peuvent inclure des troubles locaux ou systémiques, tels que tout type d'ostéoporose ou d'ostéopénie, par exemple, primaire, postménopausique, sénile, corticoïde, bisphosphonates et radiothérapie ; toute ostéonécrose secondaire, mono ou multisite ; toute fracture, par exemple, non union, mal union, fractures ou compression d'union retardée, fractures maxillo-faciales ; affections nécessitant une fusion osseuse (par exemple, fusions et reconstruction de la colonne vertébrale) ; défaut osseux congénital ; reconstruction osseuse, par exemple, après une blessure traumatique ou une chirurgie du cancer, et reconstruction osseuse cranio-faciale ; arthrite traumatique, défaut focal du cartilage et/ou des articulations, arthrite dégénérative focale ; ostéoarthrite, arthrite dégénérative, gonarthrose et coxarthrose ; ostéogenèse imparfaite ; cancer ostéolytique ; maladie de Paget ; troubles endocrinologues ; hypophosphatémie ; hypocalcémie ; ostéodystrophie rénale ; ostéomalacie ; maladie osseuse adynamique, hyperparathyroïdie, hyperparathyroïdie primaire, hyperparathyroïdie secondaire ; maladie parodontale ; maladie de Gorham-Stout et syndrome de McCune-Albright ; arthrite rhumatoïde ; spondylarthropathies, y compris la spondylarthrite ankylosante, l'arthrite psoriasique, l'arthropathie entéropathique et la spondylarthrite indifférenciée et l'arthrite réactive ; lupus érythémateux systémique et syndromes apparentés ; sclérodermie et troubles connexes ; Syndrome de Sjögren ; vascularite systémique, y compris l'artérite à cellules géantes (maladie de Horton), l'artérite de Takayasu, la polyarthrite rhumatismale polymyalgique, la vascularite associée à l'ANCA (granulomatose de Wegener, polyangiite microscopique et syndrome de Churg-Strauss), le syndrome de Behcet et autres maladies polyartérites et maladies connexes (comme la polyartérite nodosa, le syndrome de Cogan et la maladie de Buerger) ; l'arthrite accompagnant d'autres maladies inflammatoires systémiques, y compris l'amylose et la sarcoïdose ; les arthropathies cristallines, y compris la goutte, la maladie à dihydrate de pyrophosphate de calcium, les troubles ou syndromes associés au dépôt articulaire de cristaux de phosphate de calcium ou de calcium oxalate ; la chondrocalcinose et l'arthropathie neuropathique ; le syndrome de Felty's et le syndrome de Reiter ; la maladie de Lyme et la rhumatose.
A titre d'exemple, mais sans s'y limiter, les troubles osseux qui peuvent bénéficier d'une greffe de cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile peuvent comprendre des troubles locaux ou systémiques, comme tout type d'ostéoporose ou d'ostéopénie, par exemple, primaire, postménopausique, sénile, corticoïde, toute ostéonécrose secondaire, mono- ou multisituée, toute fracture, par exemple, non union, malunion, fractures ou compression à retard, conditions qui nécessitent la fusion osseuse (par exemple, fusions et reconstruction de la colonne vertébrale), fractures maxillo-faciales, reconstruction osseuse, par exemple, après une blessure traumatique ou une chirurgie du cancer, reconstruction osseuse cranio-faciale, ostéogenèse imparfaite, cancer ostéolytique
BE2019/5630 des os, maladie de Paget, troubles endocrinologiques, hypophosphatémie, hypocalcémie, ostéodystrophie rénale, ostéomalacie, maladie adynamique, arthrite rhumatoïde, hyperparathyroïdie primaire, hyperparathyroïdie secondaire, maladie périodontale, maladie de Gorham-Stout et syndrome McCune-Albright.
Parmi les exemples non limitatifs de cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile connu, mentionnons produit cellulaire B ou cellules formatrices d’os B obtenues comme décrit ailleurs dans le présent document. D'autres exemples non limitatifs de cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile connu sont produit cellulaire C ou cellules formant des os C obtenues comme décrit ailleurs dans le présent document.
En particulier, les cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile connu sont les cellules produit cellulaire B ou cellules formatrices d'os B obtenues comme décrit ailleurs. En particulier, les cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile connu sont les cellules produit cellulaire C ou cellules formatrices d'os C obtenues comme décrit ailleurs, y compris produit cellulaire C - cryo ou cellules formatrices d'os C cryo(conservé).
En particulier, la valeur de référence pour la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs des cellules CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 peut être déterminée en déterminant la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs des cellules CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, respectivement, dans des cellules de référence (par exemple, des cellules dont le potentiel ostéogénique est utile sur le plan clinique), produisant ainsi une valeur de référence. De même, la valeur de référence pour la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro peut être déterminée en déterminant la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD105 ou CD44, respectivement, dans des cellules de référence (par exemple, des cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique cliniquement utile), produisant ainsi une valeur de référence.
Une ou plusieurs valeurs de référence obtenues à partir d'un ou de plusieurs types de cellules de référence peuvent être utilisées pour déterminer une valeur seuil ou une valeur seuil généralement connue dans l'art pour assurer un certain degré de potentiel ostéogénique des cellules, de préférence pour un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
En particulier, les valeurs de référence ou valeurs seuils indiquées en (bl) comparant la quantité (ou la fraction) des cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence toutes les CD73, CD 105, CD 10 et CD44, telle que mesurée comme décrite ailleurs avec une valeur de référence ou valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ; et/ou (b2) comparer la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44, de préférence la totalité des CD73, CD 105 et CD44, exprimée par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs, à une valeur de référence ou une valeur seuil représentant des
BE2019/5630 cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, sont des valeurs de référence ou des valeurs seuils représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique utile.
Par des recherches approfondies, les inventeurs actuels ont découvert qu'au moins 90 % d'une population cellulaire de cellules différenciées in vitro ayant un potentiel ostéogénique, et en particulier d'une population cellulaire de cellules différenciées in vitro ayant un potentiel ostéogénique élevé et formant une matrice osseuse in vivo par ossification endochondrale, exprime un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 et CD44, de préférence les CD73, CD 105 et CD44. En outre, ces cellules différenciées in vitro expriment également une quantité accrue de CD73 et/ou CD44 et une quantité réduite de CD105 par rapport aux quantités de CD73, CD44 et CD105, respectivement, dans les CSM.
En conséquence, dans des modes de réalisation particuliers, la méthode telle qu'enseignée ici comprend (cl) la détermination d’un écart ou d'aucun écart de la quantité (ou fraction) des cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence toutes les CD73, CD 105, CD 10 et CD44, mesurée comme décrit ailleurs ici de la valeur de référence ou valeur limite représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et/ou (c2) trouver une écart ou aucun écart de la quantité de lün quelconque des CD73, CD 105 ou CD44, de préférence la totalité des CD73, CD 105 et CD44, exprimée par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs ici par rapport à la valeur de référence ou la valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et (d) l’attribution de l’écart ou d’aucun écart trouvé dans (cl) et/ou (c2) à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro. Par conséquent, la méthode telle qu'enseignée ici comprenant (cl) la détermination d’un écart ou d'aucun écart de la quantité (ou fraction) des cellules différenciées in vitro exprimant toutes les CD73, CD 105, CD 10 et CD44 mesuré comme décrit ailleurs de la valeur de référence ou valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et/ou (c2) la détermination d'un écart ou d'aucun écart de la quantité de tous les CD73, CD105 et CD44 exprimés par les cellules différenciées in vitro mesurées tel que décrit ailleurs dans le présent document à partir de la valeur de référence ou de la valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et (d) l’attribuer de l'écart ou d’aucun écart trouvé dans (cl) et/ou (c2) à la détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent consister à (cl) trouver un écart ou aucun écart de la quantité (ou fraction) des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et CD44, telle que mesurée comme décrit ailleurs ici par rapport à la valeur de référence ou valeur limite représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et/ou (c2) trouver un écart ou aucun écart de la quantité de l'une ou l'autre (par exemple, un, deux ou les trois) de CD73, CD105 ou CD44 ; de préférence la totalité de CD73, CD 105 et CD44 ; exprimé par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs à partir de la valeur de référence ou de la valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et (d) attribuer l'écart ou aucun écart
BE2019/5630 trouvé dans (cl) et/ou (c2) à une détermination particulière du potentiel ostéogène des cellules différenciées in vitro.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent consister à (cl) trouver une déviation ou aucune déviation de la quantité (ou fraction) des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et CD44, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document par rapport à la valeur de référence ou valeur limite représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et/ou (c2) trouver un écart ou aucun écart de la quantité de l'une ou l'autre (par exemple, un, deux, trois ou les quatre) de CD73, CD105, CD44 ou CD10 ; de préférence la totalité de CD73, CD 105, CD44 et CD 10 ; exprimée par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs à partir de la valeur de référence ou de la valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, et (d) attribuer l'écart ou aucun écart trouvé dans (cl) et/ou (c2) à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Un écart d'une première valeur par rapport à une seconde valeur peut généralement couvrir n'importe quelle direction (par exemple, augmentation : première valeur > seconde valeur ; ou diminution : première valeur < seconde valeur) et n'importe quel degré de modification.
Par exemple, un écart peut comprendre une diminution d'une première valeur d'au moins environ 10 % (environ 0,9 fois ou moins), d'au moins 20 % (environ 0,8 fois ou moins), d'au moins 30 % (environ 0,7 fois ou moins), d'au moins 40 % (environ 0,6 fois ou moins), d'au moins 50 % (environ 0.5 fois ou moins), ou d'au moins environ 60 % (environ 0,4 fois ou moins), ou d'au moins environ 70 % (environ 0,3 fois ou moins), ou d'au moins environ 80 % (environ 0,2 fois ou moins), ou d'au moins environ 90 % (environ 0,1 fois ou moins), comparativement à une deuxième valeur avec laquelle une comparaison est effectuée.
Par exemple, un écart peut comprendre une augmentation d'une première valeur d'au moins environ 10 % (environ 1,1 fois ou plus), d'au moins 20 % (environ 1,2 fois ou plus), d'au moins 30 % (environ 1,3 fois ou plus), d'au moins 40 % (environ 1,4 fois ou plus), d'au moins environ 50 % (environ 1,5 fois ou plus), d'au moins 60 % (environ 1,6 fois ou plus), d'au moins 70 % (environ 1.7 fois ou plus), ou d'au moins environ 80 % (environ 1,8 fois ou plus), ou d'au moins environ 90 % (environ 1,9 fois ou plus), ou d'au moins environ 100 % (environ 2 fois ou plus), ou d'au moins environ 150 % (environ 2.5 fois ou plus), ou d'au moins environ 200 % (environ 3 fois ou plus), ou d'au moins environ 500 % (environ 6 fois ou plus), ou d'au moins environ 700 % (environ 8 fois ou plus), ou similaire, par rapport à une seconde valeur avec laquelle une comparaison est faite.
De préférence, un écart peut faire référence à une altération statistiquement significative observée. Par exemple, un écart peut se rapporter à une altération observée qui se situe en dehors des marges d'erreur des valeurs de référence dans des cellules de référence données (exprimées, par exemple, par écarttype ou erreur-type, ou par un multiple prédéterminé de ceux-ci, par exemple, ±lxSD ou ±2xSD ou
BE2019/5630 ±3xSD, ou ±lxSE ou ±2xSE ou ±3xSE). L'écart peut également se référer à une valeur se situant en dehors düne plage de référence définie par des valeurs dans des cellules de référence données (par exemple, en dehors düne plage qui comprend >40%, 50%, >>60%, >70%, >75% ou >80% ou >85% ou >90% ou >95% ou même >100% des valeurs dans des cellules de référence données).
Dans une autre réalisation, un écart peut être conclu si une altération observée se situe au-delà dün seuil ou dün seuil donné. Par exemple, un écart peut être conclu si une altération observée est inférieure, égale ou supérieure à un seuil ou à un seuil donné.
En particulier les modes de réalisation, la méthode telle qu'enseignée ici comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en :
(al) mesurer la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73,
CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(a2) mesurer la quantité dün ou plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(bl) comparer la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(b2) comparer la quantité dün ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 mesurée en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils respectives représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(cl) trouver un écart ou aucun écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 tel que mesuré en (al) par rapport à ladite valeur limite ;
(c2) trouver un écart ou aucun écart de la quantité de lün quelconque des CD73, CD 105 ou CD44 mesurée en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) attribuer ladite déviation ou aucune déviation à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Par conséquent, la méthode telle qu'elle est enseignée ici, comprend, consiste essentiellement en, ou consiste en, ou consiste en :
(al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et
CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(a2) mesurer la quantité de CD73, CD 105 et CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
BE2019/5630 (bl) comparer la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et
CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(b2) comparer la quantité de CD73, CD 105 et CD44 mesurée en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils respectives représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(cl) trouver un écart ou aucun écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) par rapport à ladite valeur limite ;
(c2) trouver un écart ou aucun écart de la quantité de CD73, CD 105 et CD44 mesurée en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) attribuer ladite déviation ou aucune déviation à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Dans des modes de réalisation particuliers, dans lesquelles les cellules de référence sont des cellules dont on sait qu'elles n'ont pas un potentiel ostéogénique cliniquement utile,
- la même quantité ou fraction identique ou diminuée des cellules différenciées in vitro exprimant une ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44, telle que mesurée comme décrit ailleurs, comparée aux valeurs seuils connues pour n'avoir aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile comme décrit ailleurs indique que les cellules différenciées in vitro n'ont aucun potentiel ostéogénique utile ; ou
-une quantité ou une fraction accrue des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD105, CD105, CD10 ou CD44, telle que mesurée comme décrit ailleurs, par rapport à la valeur seuil représentant les cellules connues pour n'avoir aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile comme décrit ailleurs indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile, et/ou
- la même quantité ou une quantité réduite de CD73, CD44 et/ou CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document, par rapport aux valeurs seuils respectives de représentation de cellules connues pour n'avoir aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile, telles que décrites ailleurs dans le présent document, et la même quantité ou une quantité accrue de CD 105 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs, par rapport aux valeurs seuils respectives représentant un potentiel ostéogénique connu pour n'avoir aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile telles que décrites dans un autre document, indiquent que les cellules différenciées in vitro n'ont aucun potentiel ostéogénique utile ; ou
- une quantité accrue de lün quelconque des CD73, CD44 et/ou CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs dans le présent document par
BE2019/5630 rapport aux valeurs seuils respectives représentant des cellules connues pour n'avoir aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile tel que décrit ailleurs dans le présent document, et/ou une quantité réduite de CD 105 exprimée par les cellules différenciées in vitro telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le document par rapport aux valeurs seuils respectives des cellules représentatives connues pour ne posséder aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile tel que décrit ailleurs dans le document indique que les cellules différenciées in vitro présentent un potentiel ostéogénique utile, de préférence dans laquelle l'expression d'un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 représente l'expression de CD73, CD105, CD10 ou CD44, respectivement, à la surface cellulaire.
En particulier des modes de réalisation, dans lesquelles les cellules de référence sont des cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique cliniquement utile,
-une diminution de la quantité ou de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD105, CD105, CD10 ou CD44, telle que mesurée comme décrit ailleurs, par rapport à la valeur seuil représentant les cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité comme décrit ailleurs indique que les cellules différenciées in vitro ne possèdent pas le potentiel ostéogénique souhaité, ou
- la même quantité ou une quantité ou fraction identique ou supérieure des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, telle que mesurée comme décrit ailleurs, par rapport aux cellules à valeur seuil connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité comme décrit ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique ; et/ou
- une quantité diminuée de l'un quelconque des CD73, CD44 et/ou CD10 exprimée par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs dans le présent document par rapport aux valeurs seuils respectives représentant les cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité tel que décrit ailleurs, et/ou une quantité accrue de CD105 exprimée par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs, par rapport aux valeurs seuils respectives des cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, comme décrit ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro ne possèdent pas le potentiel ostéogénique souhaité ou
- la même quantité ou une quantité accrue de CD73, CD44 et/ou CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document, par rapport aux valeurs seuils respectives de représentation de cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, telles que décrites ailleurs dans le présent document, et la même
BE2019/5630 quantité ou une quantité réduite de CD 105 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs, par rapport aux valeurs seuils respectives représentant les cellules reconnues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, tel que décrit ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile, de préférence un potentiel ostéogénique cliniquement, de préférence dans laquelle l'expression d'un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 représente l'expression de CD73, CD105, CD10 ou CD44, respectivement, à la surface cellulaire.
Dans des modes de réalisation particuliers, dans lesquelles les cellules de référence sont des cellules dont on sait qu'elles n'ont pas un potentiel ostéogénique cliniquement utile,
- la même quantité ou une quantité réduite de CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document, comparée aux valeurs seuils respectives de représentation de cellules connues pour n'avoir aucun potentiel ostéogénique cliniquement utile, telles que décrites ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro n'ont aucun potentiel ostéogénique utile ; ou
- une quantité accrue de CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document, par rapport aux valeurs seuils respectives représentant les cellules dont on sait qu'elles n'ont pas de potentiel ostéogénique cliniquement utile, comme décrit ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile, de préférence dans laquelle l'expression de CD 10 représente l'expression de CD 10 sur la surface cellulaire.
En particulier des modes de réalisation, dans lesquelles les cellules de référence sont des cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique cliniquement utile,
- une diminution de la quantité de CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document, par rapport aux valeurs seuils respectives représentant les cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, comme décrit ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro n'ont pas le potentiel ostéogénique souhaité, ou
- la même quantité ou une quantité accrue de CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro, telle que mesurée comme décrit ailleurs dans le présent document, comparée aux valeurs seuils respectives de représentation de cellules connues pour avoir un potentiel ostéogénique souhaité, telles que décrites ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique cliniquement utile,
BE2019/5630 de préférence dans laquelle l'expression de CD 10 représente l'expression de CD 10 sur la surface cellulaire.
Certaines modes de réalisation concernent les méthodes telles qu'enseignées ici, dans lesquelles :
une fraction identique ou accrue des cellules différenciées in vitro, telle que mesurée en (al) par rapport à la valeur limite de (bl), indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique ; et
-la même quantité ou une quantité accrue de CD73, CD44 et/ou CD 10 mesurée en (a2) par rapport aux valeurs seuils respectives de (b2), et la même quantité ou une quantité réduite de CD 105 mesurée en (a2) par rapport à la valeur seuil respective de (b2) indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (bl) est de 90% de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une médiane normalisée d'intensité de fluorescence (nMFI) de CD73 de 500, une nMFI de CD44 de 100, une nMFI de CD 105 de 150 et/ou une nMFI de CD 10 de 40. Dans certains modes de réalisation, ladite valeur seuil de (bl) est de 90 % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100, une nMFI pour CD 105 de 150 et une nMFI pour CD 10 de 50.
Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (bl) est de 90% de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI normalisée pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 150, une nMFI pour CD 105 de 150 et/ou une nMFI pour CD 10 de 40. Dans certaines modes de réalisation, ladite valeur seuil de (bl) est de 90 % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI normalisée pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 150, une nMFI pour CD 105 de 150 et/ou une nMFI pour CD10de50.
Dans certains cas, la quantité de CD73, CD105 et CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro est mesurée. Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100 et une nMFI pour CD 105 de 150.
Dans certains cas, la quantité de CD73, CD105, CD44 et CD10 exprimée par les cellules différenciées in vitro est mesurée. Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100, une nMFI pour CD 105 de 150, et une nMFI pour CD 10 de 40.
Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 150, une nMFI pour CD 105 de 150, et une nMFI pour CD 10 de 40. Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100,
BE2019/5630 une nMFI pour CD105 de 150, et une nMFI pour CD10 de 40. Dans certaines réalisations, ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 150, une nMFI pour CD 105 de 150 et une nMFI pour CD 10 de 50.
En particulier, la valeur seuil de (bl) comparant la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est de 90%, 91%, 92%, 93%, 94% et 95% ; 96% ; 97%, 98% ou 99%, de préférence 90%, de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence où l'expression d'un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 représente l'expression des CD73, CD105, CD10 ou CD44, respectivement à la surface cellulaire. Par conséquent, la valeur seuil de (bl) comparant la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant la totalité des CD73, CD 105, CD 10 et CD44 avec une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ; 96% ; 97%, 98% ou 99%, de préférence 90%, de cellules différenciées in vitro exprimant toutes les CD73, CD 105, CD 10 et CD44, de préférence dans lesquelles l'expression de toutes les CD73, CD 105, CD 10 et CD44 représente l'expression des CD73, CD 105, CD 10 et CD44, respectivement à la surface cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, si environ 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 94 %, 95 %, 96 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %, de préférence 90 % ou plus des cellules différenciées in vitro expriment l'un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, de préférence la totalité des CD73, CD 105, CD 10 et CD44, ces cellules ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile. Par conséquent, si environ 90 % ou plus des cellules différenciées in vitro expriment la totalité des CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et CD44, les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
En particulier, la valeur seuil de (b2) comparant la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 et/ou CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro à la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est une nMFICD73 de 500, 550, 600, 650, 700, 700, 750, 800, 850 ou 900, de préférence une nMFICD73 de 500, une nMFICD44 de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 ou 350, de préférence une nMFICD44 de 100, une nMFICDios de 180, 170, 160, 150, 150, 140, 130, 120, 110 ou 100, de préférence une nMFICDios de 150 et/ou une nMFICDio de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60, de préférence une nMFICDio de 50 ; de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC, et/ou la nMFICD10 est
BE2019/5630 mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Par conséquent, la valeur seuil de (b2) de (b2) comparant la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro à la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est une nMFICD73 de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou 900, de préférence une nMFICD73 de 500, un nMFICD44 de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 ou 350, de préférence une nMFICD44 de 100 et une nMFICD105 de 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110 ou 100, de préférence une nMFICD105 de 150, de préférence où la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, et la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Dans certaines représentations, la valeur seuil de (b2) comparant la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 et CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro à la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est une nMFICD73 de 500, 550, 600, 650, 700, 700, 750, 800, 850 ou 900, de préférence une nMFICD73 de 500, une nMFICD44 de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 ou 350, de préférence une nMFICD44 de 100, une nMFICDio5 de 180, 170, 160, 150, 150, 140, 130, 120, 110 ou 100, de préférence une nMFICD105 de 150 et une nMFICDiode 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60, de préférence une nMFICDio de 50 ; de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC et la nMFICDio est mesurée avec une longueur d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
En particulier, la valeur seuil de (b2) comparant la quantité de CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro à la surface de la cellule avec une valeur seuil représentant les cellules ayant un potentiel ostéogénique connu est une nMFICDio de 10, 15, 20, 25 ou 30, de préférence une nMFICDio de 20. En particulier, la valeur seuil de (b2) comparant la quantité de CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro à la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile est une nMFICDio de 40, 45, 50, 55 ou 60, de préférence une nMFIcDio de 40 ; plus préférentiellement une nMFICDio de 50 ; encore plus préférentiellement une nMFICD10 de 60. De préférence, la nMFICD10 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.
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Les récitations nMFI pour CD73 ou nMFICD73 utilisées ici font référence au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un anticorps conjugué APC contre CD73 (par exemple, BD Biosciences®, Cat N°:560847) et celle de la population cellulaire marquée avec contrôle IgG conjugué avec APC (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 555751). De préférence, le nMFICD73 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC.
Les récitations nMFI pour CD44 ou nMFICD44 utilisées ici se réfèrent au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un anticorps conjugué PE contre CD44 (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 550989) et celle de la population cellulaire marquée avec IgG conjugué avec PE (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 556650). De préférence, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.
La récitation nMFI pour CD105 ou nMFICD105 telle qu'utilisée ici se réfère au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec des anticorps conjugués APC contre CD105 (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 562408) et la MFI de la population cellulaire marquée avec contrôle IgG conjugué avec APC (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 555751). De préférence, la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC.
Les récitations nMFI pour CD10 ou nMFICD10 utilisées ici se réfèrent au rapport entre la MFI de l'ensemble de la population cellulaire analysée marquée avec un anticorps conjugué PE contre CD 10 (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 555375) et celle de la population cellulaire marquée avec IgG conjugué avec PE (par exemple, BD Biosciences®, Cat N° : 556650). De préférence, la nMFICD10 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.
En particulier, une nMFICD73 de 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou 900, de préférence 500, ou plus, exprimé par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs indique que les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile en clinique.
En particulier, une nMFICD44 de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 ou 350, de préférence 100, ou plus, exprimé par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs, indique que les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
En particulier, une nMFICDio5 de 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110 ou 100, de préférence 150, ou moins, exprimé par les cellules différenciées in vitro, tel que mesuré comme décrit ailleurs, indique
BE2019/5630 que les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
En particulier, une nMFICD10 d'au moins 10, au moins 15, au moins 20, au moins 25, au moins 30, au moins 30, au moins 40, au moins 45, au moins 50, au moins 50, au moins 55 ou au moins 60, de préférence au moins 50, exprimé par les cellules différenciées in vitro telles que mesurées comme décrit ailleurs indique que ces cellules ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile.
Dans les modes de réalisation préférés, une nMFICD73 de 500 ou plus, une nMFICD44 de 100 ou plus et une nMFICDio5 de 150 ou moins exprimés par les cellules différenciées in vitro, tels que mesurés de la manière décrite ailleurs, indiquent que les cellules différenciées in vitro ont le potentiel ostéogénique souhaité, de préférence un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, et/ou la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
En particulier, la valeur seuil de (b2) comparant la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 et/ou CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro à la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est une nMFICD73 de 500, une nMFICD44 de 100, une nMFICD105 de 150 et/ou une nMFICD10 de 40, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, la nMFI105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC, et/ou la nMFICD10est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
En particulier, la valeur seuil de (bl) comparant la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est de 90% de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 ; et/ou la valeur seuil de (b2) comparant la quantité de CD73, CD 105, CD44 et/ou CD 10 exprimée par les cellules différenciées in vitro sur la surface cellulaire avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu, de préférence un potentiel ostéogénique utile clinique connu, est une nMFICD73 de 500, une nMFICD44 de 100, une nMFICD105 de 150 et/ou une nMFICD10 de 40, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm
BE2019/5630 pour l'APC, la nMFICD44 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, la nMFI105 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC, et/ou la nMFICD10 est mesuré avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
En particulier, les cellules différenciées in vitro sont obtenues ou dérivées de cellules souches pluripotentes (PS), telles que les PS de mammifères et les PS humaines, de préférence les PS humaines.
L'expression cellules différenciées in vitro”, telle qu'elle est utilisée dans la spécification, désigne toutes les cellules qui ont été cultivées in vitro dans des conditions appropriées permettant aux cellules de passer d'un type cellulaire à un autre. La différenciation des cellules peut impliquer la culture de CSM dans des conditions capables d'induire la différenciation des cellules vers le type cellulaire désiré, plus typiquement la culture de cellules dans un milieu comprenant un ou plusieurs agents (par exemple, des facteurs de croissance) capables d'induire la différenciation des cellules vers le type cellulaire souhaité. Le terme cellule souche désigne généralement une cellule non spécialisée ou relativement moins spécialisée et compétente en matière de prolifération, capable de s'auto-renouveler, c'est-à-dire de proliférer sans différenciation, et dont la progéniture peut donner naissance à au moins un type cellulaire relativement plus spécialisé. Le terme englobe les cellules souches capables d'un auto-renouvellement sensiblement illimité, c'est-à-dire dans lesquelles la descendance d'une cellule souche ou au moins une partie de celle-ci conserve sensiblement le phénotype non spécialisé ou relativement moins spécialisé, le potentiel de différenciation et la capacité de prolifération de la cellule souche mère, ainsi que les cellules souches qui présentent un auto-renouvellement limité, c'est-à-dire dans lesquelles la capacité des produits ou d'une partie des produits de filiation de poursuivre la multiplication et/ou de différencier est manifestement réduite comparativement à la cellule-mère. Par exemple, une cellule souche peut donner naissance à des descendants capables de se différencier le long d'une ou de plusieurs lignées pour produire des cellules de plus en plus spécialisées, ces descendants et/ou des cellules de plus en plus spécialisées pouvant être eux-mêmes des cellules souches telles que définies ici, ou même pour produire des cellules différenciées en phase terminale, c'est-à-dire des cellules entièrement spécialisées, qui peuvent être postmitotiques.
Sont incluses dans la définition des cellules mPS les cellules souches embryonnaires de divers types, exemplifiées sans limitation par les cellules souches embryonnaires murines, telles que décrites par Evans & Kaufman 1981 (Nature 292 : 154-6) et Martin 1981 (PNAS 78 : 7634-8) ; les cellules souches pluripotentes de rats, par exemple, décrites par lannaccone et al. 1994 (Dev Biol 163 : 288292) ; les cellules souches embryonnaires de hamster, par exemple, telles que décrites par Doetschman et al. 1988 (Dev Biol 127 : 224-227) ; les cellules souches embryonnaires de lapin, par exemple, telles que décrites par Graves et al. 1993 (Mol Reprod Dev 36 : 424-433) ; les cellules souches pluripotentes de porc, telles que décrites par Notarianni et al. 1991 (J Reprod Fertil Suppl 43 : 255-60) et Wheeler
BE2019/5630 1994 (Reprod Fertil Dev 6 : 563-8) ; les cellules souches embryonnaires ovines, par exemple, telles que décrites par Notarianni et al. 1991 (supra) ; les cellules souches embryonnaires bovines, par exemple, telles que décrites par Roach et al. 2006 (Methods Enzymol 418 : 21-37) ; les cellules souches embryonnaires humaines (hES), telles que décrites par Thomson et al. 1998 (Science 282 : 1145-1147) ; les cellules germinales embryonnaires humaines (hEG), telles que décrites par Shamblott et al. 1998 (PNAS 95 : 13726) ; les cellules souches embryonnaires d'autres primates comme les cellules souches Rhésus, telles que décrites par Thomson et al. 1995 (PNAS 92 : 7844-7848) ou les cellules souches marmoset, par exemple décrites par Thomson et al. 1996 (Biol Reprod 55 : 254-259).
D'autres types de cellules mPS sont également inclus dans le terme, tout comme les cellules d'origine mammifère capables de produire une progéniture comprenant des dérivés des trois couches germinales, qu'elles proviennent de tissus embryonnaires, de tissus foetaux ou d'autres sources. Les cellules mPS sont de préférence non issues düne source maligne. Une cellule ou une lignée cellulaire provient düne source non maligne si elle a été établie à partir dün tissu primaire qui n'est pas cancéreux, ni modifié par un oncogène connu. Il peut être souhaitable que le mPS maintienne un caryotype normal tout au long düne culture prolongée dans des conditions appropriées. Il peut également être souhaitable, mais pas toujours nécessaire, que le mPS conserve un potentiel d'autorenouvellement substantiellement indéfini dans des conditions in vitro appropriées.
Dans le présent document, le qualificatif pluripotent désigne la capacité düne cellule à donner naissance à des types cellulaires provenant des trois couches germinales dün organisme, c'est-à-dire le mésoderme, l'endoderme et l'ectoderme, et potentiellement capables de donner naissance à tout type cellulaire dün organisme, bien que ne pouvant croître dans l'organisme entier.
Plus particulièrement, les cellules différenciées in vitro sont obtenues ou dérivées de cellules souches mésenchymateuses (CSM), de cellules souches embryonnaires (CSE) ou de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Plus particulièrement, les utilisations ou méthodes enseignées ici les cellules différenciées in vitro sont obtenues ou dérivées de CSM.
L'expression cellule souche mésenchymateuse ou CSM utilisée ici désigne une cellule souche adulte dérivée du mésoderme qui est capable de générer des cellules de lignées mésenchymateuses, généralement de deux ou plusieurs lignées mésenchymateuses, plus généralement trois ou plusieurs lignées mesenchymateuses, par exemple, chondro-ostéoblastique (os et cartilage), ostéoblastique (os), chondroblastique (cartilage), myocytaire (muscle), ténocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytaire (graisse) et stromogène (stroma médullaire). Les CMS peuvent être isolées à partir dün échantillon biologique, de préférence un échantillon biologique dün sujet humain, par exemple, moelle osseuse, os trabéculaire, sang, cordon ombilical, placenta, sac vitellin foetal, peau (derme), en particulier peau foetale et adolescente, périoste, pulpe dentaire, tendon et tissu adipeux.
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Les termes échantillon biologique ou échantillon, tels qu'ils sont utilisés ici, désignent un échantillon obtenu à partir d'une source biologique, par exemple d'un organisme, tel qu'un sujet animal ou humain, une culture cellulaire, un échantillon de tissu, etc. Un échantillon biologique d'un sujet animal ou humain se réfère à un échantillon prélevé sur un sujet animal ou humain et comprenant des cellules de celui-ci. L'échantillon biologique d'un sujet animal ou humain peut comprendre un ou plusieurs types de tissus et peut comprendre des cellules d'un ou plusieurs types de tissus. Les méthodes d'obtention d'échantillons biologiques d'un animal ou d'un sujet humain sont bien connues dans l'art, par exemple, la biopsie tissulaire ou le prélèvement sanguin. Le CSM humain, son isolement, son expansion in vitro et sa différenciation ont été décrits dans, par exemple, US Pat. No. 5,486,359 ; US Pat. No 5,811,094 ; US Pat. No. 5,736,396 ; US Pat. No. 5,837,539 ; ou US Pat. No. 5,827,740. Tout CSM décrit dans l'art et isolé par toute méthode décrite dans l'art peut convenir dans la présente méthode. En particulier, les CSM peuvent être définies comme présentant la capacité de différenciation mésenchymateuse trilignée in vitro en ostéoblastes, adipocytes et chondroblastes (Dominici et al., 2006, vol. 8, 315).
L'expression cellules souches embryonnaires ou CSE, telle qu'elle est utilisée ici, désigne les cellules souches pluripotentes qui sont dérivées d'un embryon, par exemple de la masse cellulaire interne du blastocyste, et qui sont capables, dans des conditions appropriées, de produire une descendance de différents types de cellules qui sont des dérivés des trois couches germinales, i.e., endoderme, mésoderme et ectoderme, selon un test standard accepté par l'art, tel que la capacité de former un tératome chez les souris SCID, ou la capacité de former des cellules identifiables des trois couches germinales en culture tissulaire. Le terme cellules hES couvre les cellules souches pluripotentes qui sont dérivées d'un embryon humain au stade de blastocyste, ou avant une différenciation substantielle des cellules en trois couches germinales. Les cellules ES, en particulier les cellules hES, sont généralement dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes ou de blastocystes entiers. La dérivation des lignées cellulaires hES du stade morula a été documentée et les cellules ES ainsi obtenues peuvent également être utilisées dans l'invention (Strelchenko et al. 2004. Reproductive BioMedicine Online 9 : 623-629). L'expression cellules souches pluripotentes induites ou cellules iPS, telle qu'elle est utilisée ici, désigne les cellules souches pluripotentes générées à partir de cellules adultes par reprogrammation. Les cellules iPS peuvent se renouveler d'elles-mêmes et donner naissance à des types de cellules provenant des trois couches germinales d'un organisme, c’est-à-dire le mesoderme, l'endoderme et l'ectoderme, et potentiellement de tout ou partie d'un organisme, mais ne peuvent croître dans l'organisme entier. Des exemples de cellules iPS sont ceux enseignés entre autres par Yamanaka et al. 2006 (Cell 126 : 663-676) et Yamanaka et al. 2007 (Cell 131 : 861-872).
Le terme CSM, ESC ou iPS englobe également la descendance de CSM, ESC ou iPS, respectivement, par exemple, la descendance obtenue par prolifération in vitro ou ex vivo
BE2019/5630 (propagation/expansion) de CSM, ESC ou iPS, respectivement, obtenue à partir dün échantillon biologique d'un sujet animal ou humain.
Le terme cellule souche adulte, tel qu'il est utilisé ici, désigne une cellule souche présente dans un organisme ou obtenue à partir dün organisme (par exemple isolée dün organisme) au stade foetal ou de préférence après la naissance (par exemple, en particulier, mais sans limitation pour un organisme humain, au moins un mois après la naissance, par exemple, au moins 2 mois, au moins 3 mois, par exemple au moins 4 mois, au moins 5 mois, par exemple au moins 6 mois après la naissance, comme par exemple 1 an ou plus, 5 ans ou plus, au moins 10 ans ou plus, 15 ans ou plus, 20 ans ou plus, ou 25 ans ou plus après la naissance), comme par exemple après avoir atteint la majorité. Par exemple, les cellules souches adultes peuvent être obtenues à partir de sujets humains qui seraient autrement décrits dans les termes conventionnels nourrisson, enfant, jeune, adolescent ou adulte.
Sauf indication contraire, les termes sujet, donneur ou patient sont utilisés indifféremment et désignent des animaux, de préférence des vertébrés, de préférence des mammifères, et plus particulièrement des patients humains et des mammifères non humains. Les patients préférés sont des sujets humains. Les sujets animaux comprennent les formes prénatales d'animaux, comme les foetus.
En particulier, les cellules différenciées in vitro sont des cellules humaines incarnent les utilisations ou méthodes enseignées ici.
Les méthodes et protocoles actuels peuvent de préférence s'écarter des populations de cellules souches pluripotentes (par exemple, les populations de cellules mPS ou hPS) qui sont indifférenciées, c'est-àdire dans laquelle une proportion substantielle (par exemple, au moins environ 60 %, de préférence au moins environ 70 %, de préférence au moins environ 70 %, encore plus préférablement au moins 80 %, encore plus préférablement au moins environ 90 % et jusqu'à 100 %) des cellules de la population de cellules souches présentent des caractéristiques (par exemple, caractéristiques morphologiques et/ou marqueurs) de cellules mPS indifférenciées, les différenciant clairement des cellules en voie de différentiation.
Les cellules mPS indifférenciées sont généralement facilement reconnaissables par les spécialistes et peuvent apparaître dans les deux dimensions d'une vue microscopique avec des rapports nucléaires/cytoplasmiques élevés et des nucléoles proéminents, comme des colonies compactes aux bords nets. Il est entendu que les colonies de cellules indifférenciées au sein de la population peuvent souvent être entourées de cellules voisines qui sont plus différenciées. Néanmoins, les colonies indifférenciées persistent lorsque la population est cultivée ou transmise dans des conditions appropriées connues en soi et que les cellules individuelles indifférenciées constituent une proportion substantielle de la population cellulaire. Les cellules mPS indifférenciées peuvent exprimer les antigènes embryonnaires spécifiques du stade 3 et 4 (SSEA) et les marqueurs détectables à l'aide d'anticorps appelés Tra-1-60 et Tra-1-81 (Thomson et al. 1998, supra). Les cellules mPS
BE2019/5630 indifférenciées peuvent aussi typiquement exprimer Nanog, Oct-4 et TERT. Les cellules mPS indifférenciées peuvent également comprendre l'expression de phosphatase alcaline (AP) (par exemple, déterminée par un test d'activité AP approprié).
En particulier, les cellules différenciées in vitro sont de lignée chondro-ostéoblastique (os et cartilage), de lignée ostéoblastique (os), comme par exemple les ostéochondrogènes et/ou ostéoprogéniteurs et/ou préostéoblastes et/ou ostéoblastes et/ou ostéocytes, etc. ; lignée chondroblastique (cartilage), comme par exemple, ostéochondrogènes et/ou chondrogènes et/ou chondrogènes et/ou préchondroblastes et/ou chondroblastes et/ou chondroblastes et/ou chondrocytes ; lignée adipogène (graisse) ; myogénique (muscle) ; ténogénique (ténocytes) ; fibroblastique (tissu conjonctif), comme, par exemple, fibroblastes, fibrocytes ou synoviale (liquide synovial).
Le terme lignée chondro-ostéoblastique, tel qu'il est utilisé ici en référence aux cellules différenciées in vitro, peut se référer à des cellules qui ont la capacité de se différencier en cellules de la lignée ostéoblastique, telles que les ostéochondrogènes, ostéoprogéniteurs et/ou préostéoblastes et/ou ostéoblastes et/ou ostéoblastes et/ou ostéocytes, etc, ou dans des cellules de la lignée chondroblastique, telles que les ostéochondrogènes, les chondrogènes et/ou les préchondroblastes et/ou chondroblastes et/ou chondroblastes et/ou chondrocytes. La personne qualifiée comprendra que les cellules se différencieront soit en cellules de la lignée ostéoblastique (par exemple, pré-ostéoblastes ou ostéoblastes), soit en cellules de la lignée chondroblastique (par exemple, pré- ou chondroblastes) selon les conditions auxquelles elles sont exposées, comme les facteurs physiques, chimiques ou biologiques, tels les facteurs de croissance.
En particulier, les cellules différenciées in vitro sont des cellules de la lignée ostéoblastique (p. ex. ostéoprogéniteurs, pré-ostéoblastes, ostéoblastes ou ostéocytes) ou chondroblastiques (chondrogéniteurs et/ou pré-chondroblastes ou chondroblastes).
La différenciation des CSM en cellules de la lignée chondro-ostéoblastique, ostéoblastique ou chondroblastique peut impliquer la culture des CSM dans des conditions capables d'induire la différenciation des CSM vers les cellules de la lignée chondro-ostéoblaste, ostéoblastique ou chondroblastique, plus généralement la culture des CSM dans un milieu comprenant un ou plusieurs agents (ex, facteurs de croissance) capables d'induire la différenciation des CSM vers les cellules de la lignée chondro-ostéoblaste, ostéoblastique ou chondroblastique. Les protocoles de différenciation des CSM en cellules de la lignée chondro-ostéoblaste, ostéoblastique ou chondroblastique comprennent le procédé de différenciation des CSM en cellules osseuses B comme décrit ailleurs ici et le procédé de différenciation des CSM en produit cellulaire C ou cellules osseuses C qui est comme suit : des globules blancs de moelle osseuse sont semés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans un milieu de culture classique comprenant 5% d'OctaPlasLG® (Octapharma) 0.1 UI/ml d'héparine (LEO Pharma), du LGL-b (CellGenix) et du TGLß-1 (Humanzyme)) et incubé à 37°C dans un incubateur humidifié
BE2019/5630 contenant 5% de CO2. 4 jours après l'ensemencement, les cellules non adhérentes sont retirées et le milieu est renouvelé avec un milieu de culture. 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture est enlevée et remplacée par un milieu frais pour renouveler les facteurs de croissance. Les cellules sont cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au 14e jour, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple, avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires sont cryoconservées (par ex. dans CryoStor® CS 10) et stockées dans l'azote liquide. Ensuite, les cellules intermédiaires sont décongelées et ré-ensemencées pour une culture secondaire à une densité de 572 cellules/cm2. Les cellules sont cultivées pendant la culture secondaire pendant 10 jours. Au 24e jour, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple, avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage vers le haut et vers le bas (passage 2 : P2). Les cellules intermédiaires sont cryoconservées (par exemple, dans CryoStor® CS10) et stockées dans l'azote liquide. Par la suite, les cellules intermédiaires sont décongelées et ré-ensemencées pour une culture tertiaire à une densité de 572 cellules/cm2. Les cellules sont cultivées en culture tertiaire pendant 10 jours. Au jour 34, les cellules sont prélevées par détachement, par exemple, avec du Trypzean (Lonza), et par tourbillonnement et pipetage (passage 3 : P3). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules sont remises en suspension, par exemple, dans OctaPlasLG®, à une concentration finale de 25 x 106 cellules/ml. Ce produit cellulaire sera ci-après dénommé produit cellulaire C - frais. A la fin de la culture tertiaire, les cellules sont également cryoconservées pour un stockage de longue durée. Pour ce faire, les cellules sont remises en suspension dans un milieu de cryoconservation pour atteindre la concentration souhaitée (25 x 106 cellules/ml). La suspension cellulaire est ensuite transférée dans des cryotubes qui sont stockés dans l'azote liquide. Ce produit cellulaire sera appelé ci-après produit cellulaire C cryo. Le milieu de cryoconservation peut l'être : CryoStor® CS10 (BioLife Solutions), ou 50% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc) et 50% (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma), ou 95 % (v/v) de CryoStor® CS 10 (BioLife Solutions Inc) et 5 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma), ou 80 % (v/v) d'Hypothermosol® (BioLife Solutions Inc) 10 % (v/v) de DMSO, et 10 % (v/v) d'albumine humaine (Octapharma)
D'autres protocoles de différenciation des CSM en cellules de la lignée ostéoblastique ou chondroblastique comprennent, entre autres, WO 2009/087213 ; WO 2007/093431 ; et REGER, R.L. et al. 'Differentiation and Characterization of Human MSCs'. Dans : Cellules souches mésenchymateuses : Méthodes et protocoles (Méthodes en biologie moléculaire), sous la direction de D.J. Prockop et al. Humana Press, 2008, vol. 449, p. 93-107 ; VERMURI, M.C. et al (Eds.). Essais et applications des cellules souches mésenchymateuses (méthodes en biologie moléculaire). Humana Press, 2011, vol. 698, en particulier pages 201 à 352).
Le terme facteur de croissance, tel qu'il est utilisé ici, désigne une substance biologiquement active qui influence la prolifération, la croissance, la différenciation, la survie et/ou la migration de divers
BE2019/5630 types de cellules et qui peut affecter les changements développementaux, morphologiques et fonctionnels d’un organisme, seul ou modulé par d'autres substances. Un facteur de croissance peut généralement agir en se liant, en tant que ligand, à un récepteur (par exemple, un récepteur de surface ou intracellulaire) présent dans les cellules sensibles au facteur de croissance. Un facteur de croissance peut être une entité protéique comprenant une ou plusieurs chaînes polypeptidiques. Par exemple et sans limitation, le terme facteur de croissance englobe les membres de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), de la famille des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), de la famille des facteurs de croissance dérivés des plaquettes (PDGF), de la famille des facteurs de croissance transformateurs bêta (TGFß), de la famille des facteurs de croissance nerveux (NGF) et de la famille des facteurs de croissance épidermique (EGF), famille des facteurs de croissance analogue à l'insuline (IGF), famille des facteurs de différenciation de la croissance (GDF), famille des facteurs de croissance des hépatocytes (HGF), famille des facteurs de croissance hématopoïétiques (HeGF), facteur de croissance des cellules endothéliales dérivé des plaquettes (PD-ECGF), angiopoïétine, famille des facteurs de croissance vasculaire endothéliale (VEGF), famille des glucocorticoïdes et similaires. La personne qualifiée comprendra que le facteur de croissance ou la combinaison de facteurs de croissance peut être n'importe quel facteur de croissance ou combinaison de facteurs de croissance connus pour être capables d'induire une différenciation des CSM vers un type cellulaire désiré. La personne qualifiée comprendra que les méthodes in vitro pour induire la différenciation des CSM vers un type de cellule désiré (par exemple, vers des cellules de lignée ostéochondroblastique, ostéoblastique ou chondroblastique) peuvent produire une population cellulaire sensiblement pure (c’est-à-dire composée principalement) du type cellulaire désiré. Sans limitation, la population cellulaire ainsi dérivée peut contenir au moins 90% (en nombre) du type de cellule désiré, tel que, par exemple, >91%, >92%, >93%, >94%, >95%, >95%, >96%, >96%, >97%, >98%, >99%, ou 100% du type cellulaire désiré.
L'homme du métier comprendra que, comme la méthode enseignée ici concerne l'évaluation du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro, les cellules différenciées in vitro telles que prévues ici sont généralement cultivées dans des conditions capables d'induire la différenciation de cellules pluripotentes, telles que CSM, en cellules de lignée chondro-ostéoblaste, ostéoblastique ou chondroblastique. Dans le même ordre d'idées, les cellules différenciées in vitro telles qu'elles sont prévues ici ne sont généralement pas cultivées dans des conditions capables d'induire la différenciation de cellules pluripotentes, telles que CSM, vers des cellules de la lignée myocytaire (muscle), ténocytaire (tendon), fibroblastique (tissu conjonctif), adipocytique (graisse) ou stroma (moelle) stromogénique.
Un autre aspect concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en :
BE2019/5630 la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90 % des cellules différenciées in vitro expriment un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont un ou plusieurs d’une nMFI pour CD73 d'au moins 500, d’une nMFI pour CD44 d'au moins 100 ou d’une nMFI pour CD 105 de 150 maximum, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, et/ou la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
De préférence, un autre aspect concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en :
la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105,
CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90 % des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une ou plusieurs d'une nMFI pour CD73 d'au moins 500, d’une nMFI pour CD44 d'au moins 100 ou d’une nMFI pour CD105 de 150 maximum, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE et/ou le nMFICDios est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Dans certaines modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90 % des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 105 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une ou plusieurs d’une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 150 ou une nMFI pour CD 105 de maximum 150, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission
BE2019/5630 de 580 nm pour PE et/ou la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Dans certains cas, les méthodes de détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro peuvent comprendre, consister essentiellement en ou consister en :
la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105,
CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
la mesure de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90 % des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une ou plusieurs d'une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100, une nMFI pour CD 105 de 150 au plus ou une nMFI pour CD 10 d'au moins 40, par exemple, au moins 50, au moins 55 ou au moins 60, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC et/ou la nMFICD10 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90 % des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une ou plusieurs nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100, une nMFI pour CD105 de 150 au plus ou une nMFI pour CD10 de 50 au moins, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC et/ou la nMFIcDio est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans certains cas, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90% des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une ou plusieurs nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 150, une nMFI pour CD 105 de 150 ou une nMFI pour CD10 de 40, par exemple, au moins 50, au moins 55 ou au moins 60, de
BE2019/5630 préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC et/ou la nMFICD10 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90% des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont un ou plusieurs des nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 150, une nMFI pour CD105 de 150 au plus ou une nMFI pour CD10 de 50 au moins, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, la nMFICDios est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC et/ou la nMFICD10 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans un aspect, l'invention concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, la méthode comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en :
la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73,
CD 105, CD 10 ou CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
la mesure de la quantité de CD 10 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90 % des cellules différenciées in vitro expriment un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une nMFI pour CD10 d'au moins 40, par exemple, au moins 50, au moins 55 ou au moins 60, la nMFICDlO est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE.
Dans certaines modes de réalisation privilégiées, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90% des cellules différenciées in vitro expriment un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une nMFI pour CD10 d'au moins 50, de préférence la nMFICDio est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans un aspect, l'invention fournit une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, la méthode comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en :
BE2019/5630 la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105,
CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
la mesure de la quantité de CD 10 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90% des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une nMFI pour CD10 d'au moins 40, par exemple, au moins 50, au moins 55 ou au moins 60, la nMFICDio est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans certains modes de réalisation privilégiées, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90% des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une nMFI pour CD10 d'au moins 50, de préférence la nMFICDio est mesurée avec une longueur d'ondes d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Par ailleurs, l'invention concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, la méthode comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en :
la mesure de la quantité en CD 10 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
et la détermination du potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro qui présentent une nMFI pour CD 10 d'au moins 40, la nMFICD10 est de préférence mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
Dans certains modes de réalisation préférés, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si les cellules différenciées in vitro ont une nMFI pour CD 10 d'au moins 50, de préférence la nMFICD10 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
De préférence, un autre aspect concerne une méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant, consistant essentiellement en ou consistant en :
la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105,
CD 10 et CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
la mesure la quantité de CD73, CD 105 et CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique si au moins 90% des cellules différenciées in vitro expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100 et une nMFI pour CD 105 d'au moins 150, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de
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660 nm pour l'APC, la nMFICD44est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, et/ou la nMFICD105 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique, en particulier un potentiel ostéogénique cliniquement utile, si au moins 90%, comme au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% des cellules différenciées in vitro expriment un ou plusieurs CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 et si elles ont été modifiées in vitro, les cellules différenciées :
-un ou plusieurs parmi une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100 ou une nMFI pour CD 105 d'au plus 150 ;
une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100 et une nMFI pour
CD 105 d'au plus 150 ;
un ou plusieurs d'une nMFICD73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 700, au moins 750, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; une nMFICD44 d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins 300 ou au moins 350 ; ou une nMFICD105 d'au plus 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100 ;
une nMFICD73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 650, au moins 700, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; une nMFICD44 d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins
300 ou au moins 350 ; et une nMFICD105 de 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100 ;
-un ou plusieurs parmi une nMFI pour CD73 d'au moins 700, une nMFI pour CD44 d'au moins
200 ou un nMFI pour CD 105 d'au plus 150 ; et/ou une nMFI pour CD73 d'au moins 700, une nMFI pour CD44 d'au moins 200 et une nMFI pour
CD 105 d'au plus 150, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, et/ou la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées ici peuvent consister à déterminer que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique, en particulier un potentiel ostéogénique cliniquement utile, si au moins 90%, comme au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins
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94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100%, des cellules différenciées in vitro exprime CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et si les cellules différenciées in vitro ont :
-une ou plusieurs parmi une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100 ou une nMFI pour CD 105 d'au plus 150 ;
une nMFI pour CD73 d'au moins 500, une nMFI pour CD44 d'au moins 100 et une nMFI pour
CD 105 d'au plus 150 ;
-une ou plusieurs parmi une nMFICD73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 700, au moins 700, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; une nMFICD44 d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins 300 ou au moins 350 ; ou une nMFICDios d'au plus 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100 ;
- une nMFICD73 d'au moins 550, au moins 600, au moins 650, au moins 700, au moins 750, au moins 800, au moins 850 ou au moins 900 ; une nMFICD44 d'au moins 110, au moins 120, au moins 130, au moins 140, au moins 150, au moins 200, au moins 250, au moins 300 ou au moins 350 ; et une nMFICD105 d'au plus 180, au plus 170, au plus 160, au plus 150, au plus 140, au plus 140, au plus 130, au plus 120, au plus 110 ou au plus 100 ;
-un ou plusieurs parmi une nMFI pour CD73 d'au moins 700, une nMFI pour CD44 d'au moins
200 ou une nMFI pour CD 105 d'au plus 150 ; et/ou une nMFI pour CD73 d'au moins 700, une nMFI pour CD44 d'au moins 200 et une nMFI pour
CD 105 d'au plus 150, de préférence dans laquelle la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour l'APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE, et/ou la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Les inventeurs actuels ont découvert que la méthode de détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro telle qu'enseignée ici peut être utilisée pour sélectionner les donneurs de CSM qui comprennent des CSM qui peuvent être différenciés in vitro en cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
En conséquence, un autre aspect concerne une méthode de sélection d'un sujet pour préparer des cellules différenciées in vitro de lignée chrondro-ostéogénique, la méthode comprenant :
-la collecte de CSM à partir d'un échantillon biologique d'un sujet ;
BE2019/5630 -l'obtention de cellules différenciées in vitro à partir des CSM ;
-la détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro par une méthode telle qu'enseignée ici ; et
-la sélection du sujet pour la préparation de cellules différenciées in vitro de lignée chondroostéoblastique si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
En particulier, la récupération de CSM à partir dün échantillon biologique dün sujet peut être effectuée de la manière décrite ailleurs dans le présent document. En particulier, l'obtention de cellules différenciées in vitro à partir de CSM peut être réalisée comme décrit ailleurs dans le présent document.
Dans des modes de réalisation particuliers, le sujet est un sujet humain.
L'homme du métier comprendra que les définitions et les modes de réalisation particuliers décrits dans le présent document s'appliquent à toutes les méthodes et utilisations décrites dans le présent document.
La présente demande fournit également des aspects et des modes de réalisation tels qu'ils sont énoncés dans les déclarations suivantes :
Déclaration 1 : Utilisation dün ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro.
Déclaration 2 : Méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, comprenant la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44, et la mesure de la quantité dün ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro.
Déclaration 3 : La méthode selon la déclaration 2, la méthode comprenant :
(al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73,
CD 105, CD 105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(a2) la mesure de la quantité dün ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD105, CD105, CD10 ou CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(b2) la comparaison de la quantité dün ou de plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 mesurée en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils respectives représentatives des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
BE2019/5630 (cl) l’indentification ou non d’un écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD105, CD10 ou CD44 tel que mesuré en (al) par rapport à ladite valeur limite ;
(c2) l’indentification ou non d’un écart de la quantité de l'un quelconque des CD73, CD105 ou CD44 mesurée en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) l’attribution dudit écart à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Déclaration 4 : Méthode selon la déclaration 3, dans laquelle ladite valeur seuil de (bl) et lesdites valeurs seuils respectives de (b2) sont des valeurs seuils représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
Déclaration 5 : Méthode selon la déclaration 4, dans laquelle :
une diminution de la fraction des cellules différenciées in vitro mesurée en (al) par rapport à la valeur limite de (bl) indique que les cellules différenciées in vitro n'ont pas de potentiel ostéogénique cliniquement utile, ou une fraction identique ou accrue des cellules différenciées in vitro, telle que mesurée en (al) par rapport à la valeur limite de (bl), indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique ; et
- une diminution de la quantité de l'un quelconque des CD73 et CD44 mesurée en (a2) par rapport aux valeurs seuils respectives de (b2), et/ou une augmentation de la quantité de CD 105 mesurée en (a2) par rapport à la valeur seuil respective de (b2) indique que les cellules différenciées in vitro n'ont aucun potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique, ou
- la même quantité ou une quantité accrue de CD73 et de CD44 mesurée en (a2) par rapport aux valeurs seuils respectives de (b2), et la même quantité ou une quantité réduite de CD105 mesurée en (a2) par rapport à la valeur seuil respective de (b2) indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile.
Déclaration 6 : Procédé selon l'une quelconque des déclarations 3 à 5, dans lequel ladite valeur seuil de (bl) est de 90 % de cellules différenciées in vitro exprimant un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 à la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une médiane normalisée de l’intensité de fluorescence (nMFI) pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100 et/ou une nMFI pour CD 105 de 150, de préférence où la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, et/ou la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
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Déclaration 7 : Méthode selon l'une quelconque des déclarations 1 à 6, dans laquelle on mesure la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro.
Déclaration 8 : Procédé selon la déclaration 7, dans lequel ladite valeur seuil de (bl) est de 90 % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 à la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100 et une nMFI pour CD 105 de 150, de préférence où la nMFICD73 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'onde d'émission de 660 nm pour APC, la nMFICD44 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 580 nm pour PE, et la nMFICDio5 est mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 633 nm et une longueur d'émission de 660 nm pour APC.
Déclaration 9 : Méthode selon l'une quelconque des déclarations 1 à 8, dans lequel les cellules différenciées in vitro sont obtenues à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM).
Déclaration 10 : Méthode selon l'une quelconque des déclarations 1 à 9, dans lequel les cellules différenciées in vitro sont des cellules humaines.
Déclaration 11 : Méthode de sélection d'un sujet pour la préparation in vitro de cellules différenciées de lignée chrondro-ostéoblastique, le procédé comprenant :
-la collecte de CSM à partir d'un échantillon biologique d'un sujet ;
-l'obtention de cellules différenciées in vitro à partir de CSM ;
-la détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro par une méthode telle que définie dans l'un quelconque des déclarations 1 à 10 ; et
-la sélection d’un sujet pour la préparation de cellules différenciées in vitro de lignée chondroostéoblastique si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
Déclaration 12 : Méthode selon la déclaration 11, dans laquelle le sujet est un sujet humain.
Déclaration 13 : Utilisation des CD73, CD 105, CD44 et CD 10 pour déterminer le potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Déclaration 14 : Procédé pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, comprenant la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et la mesure de la quantité d'un ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro.
Déclaration 15 : La méthode selon la déclaration 14, la méthode comprenant :
BE2019/5630 (al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et
CD44 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(a2) la mesure de la quantité d'un ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
(bl) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(b2) la comparaison de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 mesurée en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils respectives représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
(cl) déterminer l’écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) par rapport à ladite valeur limite ;
(c2) déterminer l’écart de la quantité de lün quelconque des CD73, CD105 ou CD44 mesurée en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) l’attribution dudit écart à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
Déclaration 16 : Méthode selon la déclaration 15, dans laquelle ladite valeur seuil de (bl) et lesdites valeurs seuils respectives de (b2) sont des valeurs seuils représentant des cellules ayant un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
Déclaration 17 : Méthode selon lün quelconque des déclarations 14 à 16, dans laquelle on mesure la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro.
Déclaration 18 : Méthode selon la déclaration 16 ou 17, dans laquelle :
une fraction identique ou accrue des cellules différenciées in vitro, telle que mesurée en (al) par rapport à la valeur limite de (bl), indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique ; et
- la même quantité ou une quantité accrue de CD73, CD44 et/ou CD 10 mesurée en (a2) par rapport aux valeurs seuils respectives de (b2), et la même quantité ou une quantité réduite de CD 105 mesurée en (a2) par rapport à la valeur seuil respective de (b2) indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
Déclaration 19 : Méthode selon les déclarations 15 à 18, dans lequel ladite valeur seuil de (bl) est de % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 à la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une médiane d'intensité de fluorescence
BE2019/5630 normalisée (nMFI) pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100, une nMFI pour CD 105 de 150 et une nMFI pour CD 10 de 40.
Déclaration 20 : Méthode selon les déclarations 15 à 18, dans laquelle ladite valeur seuil de (bl) est de % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 à la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une médiane d'intensité de fluorescence normalisée (nMFI) pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 150, une nMFI pour CD 105 de 150 et une nMFI pour CD 10 de 40.
Déclaration 21 : Méthode selon l'une quelconque des déclarations 14 à 20, dans laquelle la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro est mesurée.
Déclaration 22 : Méthode selon la déclaration 21, dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100 et une nMFI pour CD 105 de 150.
Déclaration 22 : Utilisation selon la déclaration 13 ou la méthode selon l'une quelconque des déclarations 14 à 22, dans laquelle les cellules différenciées in vitro sont obtenues à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM).
Déclaration 24 : Utilisation selon la déclaration 13 ou la méthode selon l'une quelconque des déclarations 14 à 23, dans laquelle les cellules différenciées in vitro sont des cellules humaines.
Déclaration 25 : Méthode de sélection d'un sujet pour la préparation in vitro de cellules différenciées de lignée chrondro-ostéoblastique, la méthode comprenant :
-la récolte de CSM à partir d'un échantillon biologique d'un sujet ;
-l'obtention de cellules différenciées in vitro à partir de CSM ;
-la détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro par une méthode telle que définie dans l'une quelconque des déclarations 14 à 24 ; et
- la sélection du sujet pour la préparation de cellules différenciées in vitro de lignée chondroostéoblastique si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
Déclaration 26 : Méthode selon la déclaration 25, dans laquelle le sujet est un sujet humain.
Déclaration 27 : Méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, la méthode comprenant, consistant essentiellement en, ou consistant en :
mesurer la quantité de CD 10 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro qui présentent une nMFI pour CD10 d'au moins 40, la nMFICDio est de préférence mesurée avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE. Bien que l'invention ait été
BE2019/5630 décrite en conjonction avec des modes de réalisation spécifiques de celle-ci, il est évident que de nombreuses alternatives, modifications et variations seront apparentes pour les personnes compétentes dans l'art à la lumière de la description qui précède. Par conséquent, il est prévu de couvrir toutes ces solutions de rechange, modifications et variations comme suit dans l'esprit et la portée générale des revendications ci-jointes.
Les aspects et les réalisations de l'invention divulgués dans le présent document sont étayés par les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Méthode d'obtention de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et de cellules dérivées de CSM
Cellules souches mésenchymateuses
Des CSM indifférenciés ont été préparés en prélevant des échantillons de moelle osseuse humaine (BM) de la crête iliaque de donneurs volontaires en bonne santé. Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans un milieu de culture classique et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2. Après 24h, le milieu de culture a été retiré et un milieu de culture frais de cellules a été ajouté. Le milieu de culture était remplacé tous les 2-3 jours. Lorsque plus de la moitié des colonies ont atteint une confluence de 80 % ou lorsque certaines colonies ont atteint une confluence de 100 %, les cellules ont été récoltées (passage 1 : PI). Lors de ce premier passage, les cellules ont été directement cryoconservées dans du CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.). Pour terminer le processus de culture, les CSM ont été décongelées, ensemencées à 572 cellules/cm2 pour la deuxième culture et cultivés. Les cellules ont été prélevées lorsque plus de la moitié des colonies ont atteint un confluent de 80 % ou lorsque certaines colonies ont atteint une confluence de 100 % pour obtenir des CSM au passage 2 (P2). Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document CSM.
Produit cellulaire A (également appelé dans le présent document cellules A formant les os)
Milieu de culture conventionnel comprenant 5% d'Octaserum (sérum autologue 50:50 et OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix), TGFß-Ι (Humanzyme).
Milieu de congélation : 80% milieu de culture conventionnel, 10% Octaserum [sérum autologue 50:50 et OctaPlasLG® (Octapharma)] et 10% DMSO.
Les cellules différenciées in vitro dérivées de CSM appelées ici produit cellulaire A ont été préparées en prélevant des échantillons humains de BM dans la crête iliaque de donneurs volontaires sains. Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans le milieu de culture et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2. 4 jours après l'ensemencement des cellules, les cellules non
BE2019/5630 adhérentes ont été retirées et le milieu a été renouvelé avec un milieu de culture. 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture a été enlevée et remplacée par un milieu frais. Les cellules ont été cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au jour 14, les cellules ont été prélevées par détachement avec Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires ont été cryoconservées dans du CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) ou du milieu de congélation et stockées dans l'azote liquide.
Pour la culture secondaire, les cellules ont été décongelées et re-ensemencées à une densité de 1 144 cellules/cm2. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours pendant la culture secondaire. Au jour 28, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 2 : P2). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules ont été remises en suspension dans de FOctaPlasLG® à une concentration finale de 25x106 cellules/ml. Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document produit cellulaire A.
Produit cellulaire B (également appelé dans le présent document cellules B formant les os)
Milieu de culture conventionnel comprenant 5% d'OctaPlasLG® (Octapharma), 0,1 Ul/ml d'héparine (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix), TGFß-Ι (Humanzyme).
Des cellules dérivées de CSM par différenciation in vitro ont été obtenues à partir de F aspiration de moelle osseuse de la crête iliaque de donneurs humains volontaires sains. Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans le milieu de culture et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% deCO2. Quatre jours après l'ensemencement des cellules, les cellules non adhérentes ont été retirées et le milieu a été renouvelé avec un milieu de culture. Sept jours et onze jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture a été enlevée et remplacée par un milieu frais pour renouveler les facteurs de croissance. Les cellules ont été cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au jour 14, les cellules ont été prélevées par détachement avec Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires ont été cryoconservées dans du CryoStor® CS 10 (BioLife Solutions Inc.) et stockées dans l'azote liquide.
Ensuite, les cellules intermédiaires ont été décongelées et ré-ensemencées pour une culture secondaire à une densité de 286 cellules/cm2. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours pendant la culture secondaire. Au jour 28, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 2 : P2). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules ont été remises en suspension dans de l’OctaPlasLG® à une concentration finale de 25xl06 cellules/ml. Ce produit cellulaire est appelé dans le présent document produit cellulaire B.
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Produit cellulaire C (c'est-à-dire produit cellulaire C produits frais et produits cellulaires C crvo ; aussi appelé ici cellules C formant les os)
Milieu de culture conventionnel comprenant 5% d'OctaPlasLG® (Octapharma), 0,1 Ul/ml d'héparine (LEO Pharma), LGL-b (CellGenix) et TGLß-1 (Humanzyme).
à 60 ml de moelle osseuse humaine (BM) ont été prélevés sur la crête iliaque dün donneur volontaire sain. Après la récolte, les globules blancs de la moelle osseuse ont été comptés, ensemencés à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans le milieu de culture et incubés à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO2. 4 jours après l'ensemencement des cellules, les cellules non adhérentes ont été retirées et le milieu a été renouvelé avec un milieu de culture. 7 jours et 11 jours après l'ensemencement, la moitié du milieu de culture a été enlevée et remplacée par un milieu frais pour renouveler les facteurs de croissance. Les cellules ont été cultivées pendant la culture primaire pendant 14 jours. Au jour 14, les cellules ont été détachées avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas puis collectées (passage 1 : PI). Les cellules intermédiaires ont été cryopréservées (dans du CryoStor® CS 10) et stockées dans l'azote liquide. Chaque stock de cellules provenait dün donneur, sans qu'il y ait de mise en commun entre les donneurs.
Ensuite, les cellules intermédiaires ont été décongelées et re-ensemencées pour une culture secondaire à une densité de 572 cellules/cm2. Les cellules ont été cultivées pendant 10 jours pendant la culture secondaire. Au jour 24, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 2 : P2). Les cellules intermédiaires ont été cryopréservées (dans CryoStor® CS10) et stockées dans l'azote liquide.
Par la suite, les cellules intermédiaires ont été décongelées et re-ensemencées pour une culture tertiaire à une densité de 572 cellules/cm2. Les cellules ont été cultivées pendant la culture tertiaire pendant 10 jours. Au jour 34, les cellules ont été prélevées par détachement avec du Trypzean (Lonza) et par tourbillonnement et pipetage de haut en bas (passage 3 : P3). Pour obtenir le produit cellulaire final, les cellules ont été remises en suspension dans de l’OctaPlasLG® à une concentration finale de 25xl06 cellules/ml. Ce produit cellulaire sera ci-après dénommé produit cellulaire C - frais.
A la fin de la culture tertiaire, les cellules ont également été cryoconservées pour un stockage de longue durée. Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu de cryoconservation pour atteindre la concentration souhaitée (25x106 cellules/ml). La suspension cellulaire a ensuite été transférée dans des cryotubes qui ont été stockés dans de l'azote liquide. Ce produit cellulaire sera appelé dans le présent document produit cellulaire C - cryo ou cellules formatrices d'os C cryo(préservées) , également abrégé en cellules B-E C. Le milieu de cryoconservation était :
-CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.), ou
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-50 % (v/v) de CryoStor® CS 10 (BioLife Solutions Inc.) et 50 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma), ou
-CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) et 5 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma), ou
-80 % (v/v) d'Hypothermosol® (BioLife Solutions Inc.), 10 % (v/v) de DMSO et 10 % (v/v) d'albumine sérique humaine (Octapharma).
Exemple 2 : Propriétés de formation osseuse in vivo de cellules de lignée chondro-ostéoblastique dérivées de CSM
Matériels et méthodes
Culture cellulaire
CSM, les cellules A, B et C formatrices d’os ont été préparées comme décrit dans l'exemple 1.
Souris
Des souris femelles NMRI-Nude (nu/nu) de 9-10 semaines ont été achetées chez Janvier S.A.S. (Le Genest-St-Isle, France) et logées dans des conditions standard avec nourriture et eau a libidum. 196 souris ont été utilisées au total pour la présente étude.
Modèle de formation osseuse de voûte crânienne chez la souris
Des souris femelles NMRI-Nude (nu/nu) âgées de 12 semaines (n=137) ont été anesthésiées avec de l'isoflurane (IsoFlo®) et ont reçu une seule administration sous-cutanée de CSM, de cellules A formatrices d’os (cultivées avec du FGF-2 et du TGFßl) ou de cellules B formatrices d’os (2,5 x 106 cellules dans 100 μΐ par souris ou excipient (100 μΐ) sur l'os de la voûte crânienne. Pour marquer la néoformation osseuse au fil du temps, des fluorochromes de liaison au calcium ont été administrés séquentiellement à des souris. Du rouge d'alizarine (rouge), des calcéines (vertes et bleues) et de la tétracycline (jaunes) (toutes de chez Sigma-Aldrich®) ont été injectées par voie intrapéritonéale 3 jours avant et 4, 8 et 12 jours après administration cellulaire, respectivement. Le poids corporel, les signes cliniques généraux et les signes cliniques des animaux de laboratoire ont été surveillés au site d'administration pendant deux semaines après l'administration. Les souris ont été euthanasiées 2 semaines après l'administration cellulaire par dislocation cervicale et la voûte crânienne de chaque souris a été prélevée pour évaluer les propriétés de formation osseuse des cellules osseuses par imagerie radiographique, histomorphométrie (quantification de la formation osseuse) et immunofluorescence.
Incorporation de l'échantillon et sectionnement histologique
Pour rhistomorphométrie, l’ALP, la TRAP (phosphatase acide tartrate-résistante), les colorants Trichrome Goldner de Masson et l'immunofluorescence, les voûtes crâniennes ont été fixées et
BE2019/5630 déshydratées par incubations successives dans des bains d'éthanol à 70%, 80% et 90% pendant 12 heures chacune, à 4°C et en agitant doucement, dans une résine plastique hydroxyéthylméthacrylate (HistoResin, Leica®). Quatre coupes coronales de 8 μm d'épaisseur ont été réalisées à l'aide d'un microtome (Leica®, RM2255). Pour la coloration à la safranine orange et l'immunoperoxydase, les voûtes crâniales osseuses ont été fixées dans 3,7 % de formaldéhyde pendant 24 heures, décalcifiées dans 10 % d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pH 7,4 pendant trois jours et incorporées dans de la paraffine. Sept sections de paraffine coronale et sagittale d'une épaisseur de 7 μm ont été coupées à l'aide d'un microtome (Leica®, RM2255).
Coloration par immunofluorescence
L'évaluation du collagène I humain et murin par immunofluorescence a été réalisée sur des coupes histologiques coronales plastiques de la voûte crânienne de 4 μm d'épaisseur. Brièvement, après une étape de perméabilisation à l'aide d'une solution de PBS IX/Triton 0,3 % pendant 30 minutes à température ambiante (RT), les coupes histologiques ont été incubées pendant 1 heure à RT dans la solution de blocage (i.e., PBS/BSA/sérum de chcval/Tiiton™) à des sites de fixation non spécifiques. Les lames histologiques ont ensuite été incubées pendant la nuit à 4°C avec des anticorps primaires au collagène I anti-humain et anti-murine de souris (Abeam ; #abl38492 et Abeam ; #ab21286 respectivement). Après 3 étapes de rinçage en PBS pendant 5 min à RT, le blocage a été réalisé avec la solution de blocage pendant 1 heure à RT. Les anticorps secondaires dilués dans la solution bloquante ont ensuite été ajoutés pendant 2 heures à la RT à l’abris de la lumière. Les anticorps secondaires Alexa Fluor® 488 âne anti-lapin IgG H&L (ThermoFisher, #A21206) et Alexa Fluor® Cy3® Goat antimouse IgG H&L (Abeam ; #ab97035) ont été utilisés pour visualiser le collagène I murin en vert et le collagène I humain en rouge. Les lames ont ensuite été rincées 3 fois dans PBS IX pendant 5 minutes à RT et incubées avec la solution NucBlue® pendant 1 minute à RT pour colorer le noyau. Enfin, les lames ont été brièvement rincées une fois dans du PBS puis montées dans le réactif GlycerGel®. Comme contrôle négatif de l'immunofluorescence, l'omission de l'anticorps primaire a été effectuée sur la lame histologique adjacente.
Coloration histologique
Les activités ostéoblastiques et ostéoclastiques ont été évaluées sur des sections de la voûte crânienne en utilisant respectivement les méthodes ALP et TRAP de détection d'activité enzymatique. Pour la coloration ALP, des sections coronales de voûtes crâniennes de 4 μm d'épaisseur ont été incubées pendant 1 heure avec une solution de sel RR bleu rapide (Sigma-Aldrich®) et de phosphate alcalin Naphtol AS-MX (Sigma-Aldrich®). La coloration TRAP a été effectuée sur des sections coronales de calvaire de 8 μm d'épaisseur à l'aide du kit TRAP (Acid Phosphatase, Leukocyte), (Sigma-Aldrich®) selon les instructions du fabricant. Pour évaluer l'état de minéralisation de l'os néo-formé, une coloration au Trichrome de Masson Goldner a été effectuée sur les sections de voûtes crâniennes
BE2019/5630 colorées avec ALP à l'aide d'un kit (Bio-Optica®) selon les instructions du fabricant. Pour mettre en évidence la formation du cartilage, une coloration à la safranine orange a été effectuée sur des sections de paraffine sagittale de voûte crânienne d'une épaisseur de 7 μm. Brièvement, après déparaffinage, les coupes histologiques ont été incubées successivement dans l'hématoxyline de Weigert (Klinipath®) pendant 10 min, 0,1% vert rapide (Klinipath®) pendant 5 min, 1% acide acétique (VWR Chemicals) pendant 15 sec et 0,1% safranine-orange (Fluka® ref : 84120) pendant 5 min. Après la déshydratation, les lames ont été montées avec des lamelles de verre en utilisant Pertex® (HistoLab®). Les images numériques ont été prises avec un microscope optique (Leica®) et le logiciel Leica® LAS EZ.
Immunoperoxydase
Après déparaffinage, des sections de paraffine coronale ou sagittale de voûte crânienne de 7 μm d'épaisseur ont été incubées successivement avec de l'hyaluronidase à 2,5 % (Sigma-Aldrich®) pendant 30 minutes à 37 °C, dans du H2O2 à 3 % (Sigma-Aldrich®) pendant 30 minutes à température ambiante, dans du PBS à 0,3 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich®) pendant 30 minutes à température ambiante et en solution de blocage (soit PBS/BSA/sérum de cheval/Triton) pendant 1 heure à température ambiante. Les coupes ont été incubées pendant la nuit à 4°C avec des anticorps primaires de collagène de type I anti-humain de souris (Abeam, ab90395), des anticorps primaires de collagène de type I anti-murine de lapin (Abeam, ab21286) ou des anticorps primaires anti-Ku80 de lapin (Abeam, ab80592). La coloration a été visualisée à l'aide dün kit Vectastain (Vector Laboratories, PK6200) et de 3,3' diaminobenzidine (Vector Laboratories), selon les instructions du fabricant. Les sections ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline de Mayer (Klinipath®). Les lames ont été montées avec des lamelles de verre en Pertex®.
Quantification de la formation osseuse par analyse radiographique (cellules C formatrices d'os)
Lors de l'euthanasie, l'imagerie radiographique ex vivo de la voûte crânienne de chaque souris placée côte à côte a été réalisée à l'aide du dispositif Faxitron® MX-20. Les images numériques ont été prises à un grossissement de 1,5X en mode manuel avec une tension réglée à 35 kV, un temps d'exposition de 4,8 secondes, une luminosité/contraste de 8300/6000. Les images radiographiques générées sont des images de niveau de gris avec des valeurs d'intensité de gris allant de 0 (région noire) à 255 (région blanche) et sont directement proportionnelles à la radio-opacité et donc à l'opacité ou à l'épaisseur osseuse. La valeur d'intensité du niveau de gris de la partie ostéoinductrice de la formation osseuse (nodules minéralisés rejetés de la sélection) sur les os pariétaux (sélection manuelle) a été analysée à l'aide de l'histogramme du logiciel AdobePhotoshop®.
L'imagerie par rayons X et le logiciel AdobePhotoshop® ont également été utilisés pour quantifier la surface des nodules minéralisés (sélection manuelle).
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Analyses histomorphométriques des voûtes crâniennes osseuses : Quantification de la formation osseuse
La quantification de la formation osseuse (c’est-à-dire la formation osseuse absolue) a été effectuée sur des tissus intégrés dans du plastique. L'épaisseur absolue de l'os néoformé (du front de minéralisation basale fluorescent marqué au rouge d'alizarine à la néoformation osseuse fluorescente marquée à la calcéine et à la tétracycline) avec et sans nodules minéralisés a été mesurée (en μm) sur section coronale de 4 μm d'épaisseur avec le logiciel ZEN® (Zeiss). Pour chaque animal, 4 mesures d'épaisseurs absolues ont été effectuées sur 5 niveaux indépendants, avec une distance de 200 μm entre chaque niveau. Dans un premier temps, la moyenne de l'épaisseur (avec ou sans nodules) ± écart type (c’est-à-dire, la moyenne des 4 mesures par niveau sur les 5 niveaux) a été calculée pour chaque animal.
Quantification de la surface de l'os néoformé sur des images histologiques (logiciel ImageJ®)
Pour l'analyse de surface des nodules ostéoinducteurs et ostéogéniques, des images numériques de 6 niveaux indépendants prises tous les 2 niveaux après la suture coronale ont été prises à partir de coupes histologiques en résine plastique (4 μm) de voûte crânienne, en utilisant une combinaison de multiples filtres fluorescents et en fond clair du microscope fluorescent (Zeiss Axioscope Al, Zeiss, Allemagne). A chaque niveau mesuré, la sélection de la néoformation osseuse ostéoinduite a été définie manuellement dans des images de points de suture à l'aide du logiciel ImageJ®. Les surfaces minéralisées et totales de cette sélection ont été mesurées (en mm2). La même procédure a été effectuée pour les surfaces minéralisées et totales des nodules ostéogéniques.
Pour l'ostéoinduction et les nodules ostéogéniques, la moyenne de la surface totale et la moyenne de la surface minéralisée ont ensuite été calculées par animal expérimental et par groupe. La surface totale de la néoformation osseuse a finalement été calculée en additionnant les surfaces osseuses ostéoinduites de les surfaces des nodules ostéoinducteurs.
Analyses statistiques
Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart type (ET ou SD). Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel JMP® (SAS Institute Inc.) ou GaphPad Prism®. Les différences entre les groupes étaient considérées comme statistiquement significatives lorsque p<0,05.
Résultats
Les cellules formatrices d’os A (générées avec du FGF-2 et du TGFßl) et les cellules formatrices d’os B (générées avec du FGF-2, du TGFßl et de l'héparine) ont montré toutes deux une formation osseuse significativement plus élevée que les témoins (excipient) 2 semaines après l'administration (figures 12, tableau 1). Plus particulièrement, la figure 3 montre que les cellules formatrices d’os B présentent
BE2019/5630 des propriétés ostéoinductrices (formation osseuse homogène d'origine murine sur la voûte crânienne) et ostéogéniques (nodules minéralisés d'origine humaine et murine).
Tableau 1 : Quantification de la formation osseuse (%) sur des coupes de voûte crânienne murine. Les voûtes crâniennes murines ont été traitées avec un excipient (témoin négatif), des cellules formatrices d’os A ou des cellules formatrices d’os B.
Nb. de lots Nb. d'animaux % de formation osseuse Moyenne ± SD
Excipient - 59 107 + 2
Cellules formatrices d'os A 10 39 165 + 19
Cellules formatrices d’os B 7 30 158 + 23
Abréviations : SD : écart type
Les propriétés ostéoinductrices (c’est-à-dire, la quantité d'os murin néoformé après l'implantation) étaient équivalentes pour les cellules formatrices d’os A et B (figures 1-2).
Il est très intéressant de noter que les cellules formatrices d’os B de la présente invention présentaient de puissantes propriétés ostéogéniques et ostéoinductrices, comme en témoigne la grande quantité d'os humains et murins nouvellement formés après l'implantation (coloration Coll IF humaine et murine, figure 3).
La présence de nodules a été observée chez 7/8 donneurs et 80 % des souris des cellules formatrices d’os B et chez 4/11 donneurs et 20 % des souris des cellules formatrices d’os A. Aucun nodule n'a été observé après administration de CSM ou d'excipient. En plus des activités d'ostéoinduction, les cellules formatrices d’os B favorisent une activité ostéogénique élevée mise en évidence par la présence de gros nodules minéralisés observés chez 80 % des souris traitées alors que les cellules formatrices d’os A présentent une faible activité ostéogénique, i.e., de petits nodules chez seulement 20 % des souris traitées (tableau 2).
Tableau 2 : Quantification de la présence de nodules minéralisés sur la voûte crânienne murine deux semaines après administration sur la voûte crânienne de l'excipient, CSM, cellules A formatrices d’ 'os ou cellules B formatrices d’os.
Fréquence de l'ostéogénie Doneur Lot Animal
Excipient NA NA 0/32 (0%)
CSM 0/2 0/2 0/14 (0%)
BE2019/5630
Cellules formatrices d'os A 4/10 (40%) 4/11 (36%) 9/45 (20%)
Cellules formatrices d’os B 7/8 (88%) 7/8 (88%) 37/46 (80%)
Abréviations : CSM : cellules souches mésenchymateuses ; NA : sans objet.
La coloration histologique des sections coronales de voûte crânienne osseuse murine deux semaines après l'administration (excipient seulement, CSM, cellules A formatrices d’os (générées avec FGF-2 et TGFßl ; cellules b-f A) ou cellules B formatrices d’os (générées avec FGF-2, TGFßl et héparine ; cellules b-f B)) a révélé que toutes les conditions traitées (CSM, cellules b-f A et cellules b-f B) ont un potentiel ostéoinducteur élevé avec une activité moyenne remodelage (coloration ALP et TRAP) dans les os formés par ostéoinduction.
Il est intéressant de noter que les nodules minéralisés observés chez des souris traitées avec des cellules formatrices d’os B étaient constitués à la fois de tissus osseux murins (hôtes) et humains (donneurs) (comme en témoigne la coloration au collagène de type I humain et murin), ce qui démontre que les nodules étaient formés par ces deux processus : ostéogénèse (formation osseuse du donneur) et ostéoinduction (formation osseuse de l’hôte). En plus düne forte activité ostéoblastique et ostéoclastique (coloration ALP + TRAP), les nodules présentaient des tissus ostéoïdes (tissus non minéralisés) suggérant que la formation osseuse progressait encore deux semaines après administration, alors que le processus d'ostéoinduction observé en toutes conditions était, quant à lui, terminé (Figure 4).
La figure 4 montre que la formation osseuse humaine (c’est-à-dire l'ostéogenèse) (observée avec une coloration au collagène anti-humain de type I) et les activités ostéoblastiques et ostéoclastiques élevées (observées avec une coloration ALP + Goldner et TRAP respectivement) ont été détectées principalement dans des nodules de souris administrés avec des cellules B formatrices d’os, montrant ainsi que le processus de formation osseuse était continu et non terminé après 2 semaines, contrairement à l'ostéoinduction des cellules A formatrices d’os et CSM qui semblait terminée. Toutes les affections traitées (CSM, cellules b-f A, cellules b-f B) présentaient un potentiel d'ostéoinduction élevé avec une activité de remodelage modérée (coloration ALP et TRAP) dans la formation osseuse ostéoinduite (Figure 4).
La néoformation osseuse a été évaluée par fluorescence deux semaines après le traitement par excipient seulement, CSM, cellules b-f A ou cellules b-f B (Figure 5). A cette fin, à des moments précis, on a administré aux souris des colorants fluorescents se liant au calcium osseux (c’est-à-dire alizarine rouge, calcéines verte et bleue, tétracycline jaune) pour marquer l'os néoformé. Le dernier fluorochrome administré a été la tétracycline, administrée 12 jours après l'administration des cellules.
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Comme le montre la figure 5, les nodules des souris ayant reçu des cellules B formatrices d’os ont été principalement colorés par du fluorochrome de tétracycline (les taches jaunes ont été entourées en pointillés à la figure 5) confirmant un stade de formation plus avancé par rapport à l'ostéoinduction observée dans la formation ostéoinduite (rouge d’alizarine (rouge), calcéine (vert) et bleu calcéine (bleu) : ces taches apparaissent en gris clair et les doubles flèches indiquent l'épaisseur de formation osseuse).
La néoformation osseuse des souris traitées a été évaluée par quantification de la surface de l'os néoformé sur des images histologiques (logiciel ImageJ®). La surface totale de l'os néoformé a été déterminée en additionnant les surfaces ostéo-induites et les surfaces de nodule osseux pour chaque niveau analysé et chaque souris.
Les résultats montrent que les cellules B formatrices d’os (n = 7 souris, illustrées en gris clair à la figure 6) ont significativement augmenté la néoformation osseuse 2 semaines après l'administration des cellules d'environ 2 fois plus que les cellules CSM (n = 6 souris, illustrées en gris foncé à la figure 6 ; tableau 3). Cette différence est due à la forte propriété ostéogénique des cellules B formatrices d’os et à l'absence d'une telle propriété pour les CSM.
Tableau 3 : La néoformation osseuse totale est mesurée sur des coupes coronales incluant l'ostéoinduction et la formation ostéogénique.
Type de cellule (du même donneur) Nombre d'animaux Ostéoinduction Ostéogénie (nodules) Total (ostéoinduction + ostéogénie)
Surface minéralisée (mm2) (moyenne ± SD) Surface totale (mm2) (moyenne ± SD) Surface minéralisée (mm2) (moyenne + SD) Surface totale (mm2) (moyenne + SD) Surface minéralisée (mm2) (moyenne + SD) Surface totale (mm2) (moyenne + SD)
CSM 6 0.42 ± 0.09 0.57 + 0.17 0 0 0.42 + 0.09 0.57 + 0.17
b-f cellules B 7 0.43 + 0.16 0.59 + 0.25 0.22 + 0.19 0.57 + 0.53 0.65 + 0.30 1.16 + 0.71
Abréviations : CSM : cellules souches mésenchymateuses ; SD : écart type
De plus, l'évaluation de la néoformation osseuse au fil du temps par coloration histologique a révélé que les nodules observés sur le dessus de la voûte crânienne de souris ayant reçu des cellules B formatrices d'os s'ossifiaient par un mécanisme d'ossification endochondrale. En figure 7, la coloration
BE2019/5630 à la safranine-orange montre la matrice protéoglycane (spécifique du cartilage) (zone entourée de lignes pointillées), les noyaux, le tissu osseux et le cytoplasme. Contrairement à la formatrion osseuse par ostéoinduction s’opérant par le biais de l’ossification intramembranaire, les nodules osseux ont été produits par ossification endochondrale, la matrice cartilagineuse se produisant entre 1 semaine et 3 semaines après administration (Figure 7).
Des colorations immunohistochimiques du collagène humain de type I, du collagène murin de type I et de noyau humain (Ku80) effectuées 4 semaines après l'administration de cellules B formatrices d’os ont confirmé la présence d'os humain dans les nodules. De plus, la coloration Ku80 a révélé que les cellules B formatrices d’os étaient greffées dans la matrice osseuse (nodules) et devenaient des ostéocytes après administration in vivo. Les souris auxquelles on a administré le produit cellulaire C cryo ont montré une formation osseuse supérieure à celle des témoins 4 semaines après l'administration (Figure 11 A-C). L'opacité osseuse était significativement plus élevée pour les cellules formatrices d’os C cryo que pour l'excipient (Figure 11B). La surface de l'ostéogénie était significativement plus élevée que celle de l'excipient dans lequel aucun nodule minéralisé n'a été observé (Figure 11C). Les mesures histomorphométriques de l'ostéoinduction avec ou sans ostéogénie (représentée par la formation osseuse absolue) étaient significativement plus élevées pour les cellules formatrices d’os C cryo que pour les excipients (Figure 11D et 11E). De plus, en plus des activités d'ostéoinduction, les cellules formatrices d’os C cryo osseuses ont favorisé une forte activité ostéogénique mise en évidence par la présence de nodules minéralisés. Cette activité ostéogénique a été observée chez 4/5 donneurs de moelle osseuse (ou production de lots) et 65% des souris (Figure 11F). Un donneur/lot a été considéré comme ostéogénique (positif) lorsqu'au moins un nodule minéralisé a été observé chez une souris par groupe. Aucun nodule n'a été observé après l'administration de l'excipient.
Plus particulièrement, les produits cellulaires C cryo présentaient des propriétés ostéoinductrices (formation osseuse homogène d'origine murine sur la voûte crânienne) et ostéogéniques (nodules minéralisés d'origine humaine et murine) (Figure 12).
Une ossification intramembranaire de l'hôte a été induite le long de la surface de la voûte crânienne (Figures 12 et 13). Plus particulièrement, les cellules C cryo ostéo-inductrices présentent des propriétés ostéoinductrices et ostéogéniques (Figure 13, fluo). La double immunomarquage souris/collagène humain de type I (Figure 13, collagène humain de type I) a révélé la présence d'os d'origine hôte et donneur (ostéogénie). Les activités des ostéoblastes (Figure 13, ALP+) et des ostéoclastes (Figure 13, TRAP) ont surtout été détectées dans les nodules minéralisés montrant que le processus de remodelage osseux des nodules était toujours en cours 4 semaines après leur administration. Cette observation dépendait de la taille du nodule : plus le nodule est grand, plus les activités ALP et TRAP sont encore présentes 4 semaines après son administration. Un ostéoïde faible
BE2019/5630 (Figure 13, Coloration au trichrome de Masson de Goldner) a été mis en évidence indiquant que le processus de formation osseuse est terminé.
Par conséquent, les cellules formatrices d’os C cryopréservées augmentent la néoformation osseuse.
Ceci démontre l'utilité des produits cellulaires et de la composition cellulaire tels que décrits dans la spécification et les exemples pour le traitement des défauts osseux des os plats ainsi que des os longs.
Exemple 3 : Défaut fémoral segmentaire de taille sous-critique in vivo de souris (sub-CSD) réparé par les cellules formatrices d’os A, les cellules formatrices d’os B et les cellules formatrices d’os C cryopréservées.
Procédures expérimentales
Culture cellulaire
Les cellules formatrices d’os A, les cellules formatrices d’os B et les cellules formatrices d’os C cryopréservées ont été préparées comme décrit dans l'exemple 1.
Modèle fémoral segmentaire sub-CSD
L'intervention chirurgicale a été pratiquée dans des conditions aseptiques selon la littérature (Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80 ; Manassero et al, 2016, Journal of Visualized Experiments ; (116) : 52940). Brièvement, des souris femelles NMRI-Nude (nu/nu) âgées de 13 semaines (n=73) ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale d'un mélange de chlorhydrate de dexmédétomidine (Dexdomitor®, Orion Pharma, 1 mg/kg du poids corporel) et de kétamine (Nimatek®, Euronet, 150 mg/kg du poids corporel), placées dans une position ventrale sur une plaque chauffante. Après l'application d'une plaque de micro-blocage en titane à 6 trous (RISystem AG®) fixée avec 4 ou 5 vis sur la face antérieure du fémur gauche, une ostéotomie fémorale mi-diaphysaire de 2 mm de long a été réalisée avec une scie Gigli et un dispositif (RISystem AG®). Comme médicament préventif, des antibiotiques (Baytril®, 10 mg/kg de poids corporel) ont été administrés la veille de l'intervention (dans l'eau potable) et des analgésiques (chlorhydrate de buprénorphine, Temgesic®, Schering-Plough, 0,1 mg/kg de poids corporel) la veille et chaque 12 heures pendant au moins 3 jours suivant l'intervention. Des cellules dérivées de CSM (2,25 x 106 cellules dans un volume de 30 μΐ par souris) ou l'excipient (groupe témoin) ont été administrés le jour de l'intervention (juste après la fermeture de la plaie avec des sutures chirurgicales), localement au site du défaut osseux, par injection percutanée avec une seringue Hamilton de 50 μΐ. Les souris ont été euthanasiées 6 ou 10 semaines après l'administration de cellules ou d'excipients par dislocation cervicale. Le fémur gauche de chaque souris a été disséqué, prélevé et maintenu à 0,9 % de NaCl à température ambiante jusqu'à l'imagerie radiographique.
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Quantification de la réparation osseuse par des analyses radiologiques
L'imagerie radiographique in vivo du fémur gauche de chaque souris a été réalisée à l'aide du dispositif Faxitron® MX-20 juste après l'intervention pour contrôler la fixation de la plaque, la taille du défaut fémoral segmentaire et pour obtenir une référence, et ce toutes les deux semaines. Les images numériques ont été prises en vue médiolatérale et antéro-postérieure à un grossissement 5X en mode manuel avec une tension réglée à 35 kV, un temps d'exposition de 4,8 secondes, une luminosité de 4 300 et un contraste de 7 100. Une radiographie ex vivo a été réalisée sur des fémurs gauches prélevés lors de l'euthanasie, 6 semaines après l'administration cellulaire. Pour les cellules formatrices d’os A de et les cellules formatrices d’os B, la taille du défaut a été quantifiée pour chaque souris au fil du temps en mesurant la distance (μm) entre les deux bords du défaut osseux à trois endroits (droit, milieu et gauche du défaut) sur des images radiographiques médiolatérales et antéropostérieures (6 mesures au total), en utilisant le logiciel ImageJ®. La moyenne des six mesures a été calculée pour chaque souris à chaque point dans le temps.
Pour les cellules formatrices d’os C, la taille du défaut a été quantifiée pour chaque souris au fil du temps en mesurant la distance (μm) entre les deux bords du défaut osseux à deux endroits (les deux corticales) sur des images radiographiques médiolatérales et antéropostérieures (4 mesures au total), en utilisant le logiciel ImageJ®. La moyenne des quatre mesures a été calculée pour chaque souris à chaque point dans le temps.
Le RUS (score d'union radiographique) adapté pour le modèle sub-CSD est une mesure semiquantitative basée sur la présence ou l'absence d'une néoformation osseuse, d'un pontage et d'une ligne de fracture (images radiographiques antéro-postérieures et médiolatérales). Le score correspond à la somme de 4 scores déterminés sur 2 sites de défauts corticaux sur les deux vues (total de 4 scores allant de 1 à 4 chacun). Le score varie donc de 4 (aucun signe de guérison) à 16 (fusion complète).
Le score de fusion est un score binaire qui évalue le taux de fusion entre les bords du défaut fémoral. Les critères radiologiques utilisés pour définir la fusion sont la visualisation du pontage du défaut dans au moins 3 corticales (Cekiç E et al, Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48(5), 533-40). Le score est 0 (pas de fusion) ou 1 (fusion). Pour ce paramètre, seul le dernier point dans le temps a été analysé (W10, ici).
Analyses par Tomographie (micro-CT)
Après prélèvement à l'euthanasie, les fémurs gauches ont été fixés avec 3,7% de formaldéhyde et transférés au Centre de microscopie et d'imagerie moléculaire (CMMI, ULB, Gosselies, Belgique) pour analyses micro-CT. Les échantillons ont été scannés à l'aide d'une caméra multimodale microPET/CT nanoScan® PET/CT (Mediso) et du logiciel NuclineTM v2.01 (Mediso). Les balayages ont été effectués en utilisant un balayage semi-circulaire, le zoom maximum, une tension de tube de 35 kVp, 720 projections par rotation du portique, un temps d'exposition de 300 ms par projection, un
BE2019/5630 binning de pixels du détecteur de 1 à 1. Les longueurs de balayage dans les dimensions X et Y ont été adaptées pour chaque acquisition. La durée totale du balayage micro-CT a été de 3 minutes 42 secondes. Chaque balayage micro-CT a été post-reconstruit avec un voxel cubique de 40 μm de coté en utilisant un filtre Shepp-Logan et un mode multi-échantillonnage de 8 échantillons réguliers. Les dimensions des images X et Y ont été adaptées à chaque reconstruction. La taille des images Z correspondait à la longueur de balayage définie pour l'acquisition. Une évaluation qualitative de la réparation osseuse a été réalisée sur les images micro-CT après réorientation de l'os avec l'axe Z (axe du scanner) et recadrage de l'image d'une vis proximale à l'autre dans l'os fémoral sur l'axe Z, et aussi étroit que possible dans le plan transversal (X-Y). Ensuite, un rendu de projection 3D à Intensité Maximum (MIP) a été produit. Pour évaluer quantitativement la réparation osseuse, un cylindre virtuel de 2 mm de diamètre et de 2 mm de longueur axiale a été placé dans l'espace des défauts sur les scanners micro-CT et le volume osseux moyen a été évalué dans ce cylindre par seuillage de voxels d'intensité radiologique supérieure ou égale à 1500 HU.
Résultats
Les cellules formatrices d’os B et les cellules formatrices d’os C cryo ont amélioré la réparation du défaut fémoral segmentaire de taille sub-critique chez la souris.
Dans le modèle de défaut fémoral segmentaire de taille sous-critique (sub-CSD) chez les souris NMRI-Nude, les cellules formatrices d’os B (n = 12 souris, 2 lots) ont amélioré la réparation des fractures, comme le montre une réduction significative de la taille du défaut osseux par rapport à l'excipient (n = 11 souris) et aux cellules formatrices d’os A (n = 4 souris) de 2 à 6 semaines après administration (figure 8A).
Des radiographies de défauts fémoraux segmentaires à D0 et 6W après l'administration de l'excipient, des cellules A (non montrées) ou des cellules B ont montré une réduction de la taille du défaut osseux chez des souris recevant des cellules B selon une réalisation de l'invention comparativement aux souris recevant l'excipient (figure 8B) ou aux cellules A (non montrées).
Les volumes de réparation osseuse du défaut fémoral segmentaire ont été quantifiés par tomographie (micro-CT) à 6W après administration de l'excipient et des cellules formatrices d’os B. Les résultats ont confirmé que les cellules formatrices d’os B induisaient une meilleure réparation osseuse que les excipients (Figure 8C).
La cryoconservation des cellules formatrices d’os C a amélioré et accéléré de façon significative le pourcentage de réparation des fractures osseuses dans le modèle fémoral segmentaire sub-CSD (Figures 14 et 15) comparativement à l'excipient de 2 à 10 semaines après administration (n = 38 souris ; 19 traitées et 19 témoins avec excipient, 2 lots ; p<0,001). De plus, le score RUS était significativement plus élevé pour le groupe cryopréservé des cellules formatrices d’os C que pour le groupe des excipients (Figure 16). Enfin, le taux de fusion a également été amélioré avec une fusion
BE2019/5630 chez 9/19 (47 %) des souris 10 semaines après l'administration de cellules formatrices d’os C cryo, comparativement à aucune fusion après l'administration d'excipient.
Exemple 4 : Caractérisation cellulaire in vitro de cellules dérivées de CSM présentant un potentiel ostéogénique dans les exemples 2 et 3
Matériels et méthodes
Culture cellulaire
CSM, produit cellulaire A et produit cellulaire B, produit cellulaire C frais et produits cellulaires C cryo sont obtenus comme décrit dans l'exemple 1.
Analyse par cytométrique en flux
La caractérisation des marqueurs de surface cellulaire a été réalisée par cytométrie en flux. 50 000 cellules à une concentration de IxlO6 cellules/ml dans du PBS - 1% BSA ont été incubées 10 min dans l'obscurité avec 5μ1 d'anticorps. Après cette période d'incubation, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS. Les différents anticorps utilisés pour la coloration extracellulaire sont les suivants : anticorps conjugués à l'allophycocyanine (APC) contre CD105 (BD Biosciences®, Cat N° : 562408), CD73 (BD Biosciences®, Cat N°:560847), Phycoérythrine (PE) - anticorps conjugués contre CD10 (BD Biosciences®, Cat N° : 555375), CD44 (BD Biosciences®, Cat N° : 550989). La coloration non spécifique a été déterminée par incubation de cellules avec un contrôle d'immunoglobuline G (IgG) conjugué à FITC, APC et PE (tous BD Biosciences®, Cat N° : 556649 ; 555751 ; 556650 respectivement). Avant l'analyse, on a procédé à l'évaluation des singulets et de la population d'intérêt, tel que décrit à la figure 9. L'analyse par cytométrie en flux a été effectuée sur 10 000 événements de la population fermée à l'aide de FACSCanto™!! (BD Biosciences®) et du logiciel FACSDiva™ 8.0 (BD Biosciences®). Les paramètres de réglage utilisés pour l'analyse ont été réalisés automatiquement avec des billes (BD CompBeads Plus®, Cat N°560497). Pour chaque conjugué, le seuil de positivité a été fixé à 1 % de la positivité de l'anticorps isotype témoin et la positivité de chaque marqueur a été déterminée. La médiane de fluorescence (MFI) de l'ensemble de la population analysée a également été déterminée et divisée par la MFI de l'anticorps de contrôle isotype correspondant pour obtenir l'IMF normalisée (nMFI).
Résultats
L'analyse par cytométrique en flux a révélé que l'identité cellulaire générale basée sur les profils d'expression des marqueurs de surface cebuiaire du produit cebuiaire A, du produit cebuiaire B (généré avec des méthodes comparatives seion fart antérieur) et des produits ceiiuiaires C avec ou sans cryopréservation finaie (générés avec une méthode iiiustrant rinvention) étaient comparabies.
Tous exprimaient ies marqueurs mésenchymateux CD73, CD90 et CDf05 et n'exprimaient pas ies marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34 et CD3 (moins de 5% de fa popuiation cebuiaire a exprimé
BE2019/5630 ces marqueurs) (Tableau 4). Le produit cellulaire A, le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) expriment de faibles niveaux de récepteur de surface cellulaire de classe II du CMH, comme le HLA-DR. La faible immunogénicité représentée par une faible expression de HLA-DR permet une greffe de cellules avantageuse par exemple sur des sujets 5 allogéniques (tableau 4). En outre, le produit cellulaire A, le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) expriment fortement l'enzyme ALP à leur surface comparativement aux CSM indifférenciées (tableaux 4 et 5). La haute expression de l'ALP souligne l'engagement du produit cellulaire A, du produit cellulaire B et des produits cellulaires C (avec ou sans cryopréservation finale) vers la lignée ostéoblastique. Le produit cellulaire A, le produit cellulaire B et 10 les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) ont également fortement exprimé le marqueur cellulaire CD10 comparativement aux CSM indifférenciées (tableau 4).
Tableau 4 : Profil d'expression des marqueurs de surface cellulaire des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et des produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire produits cellulaires C)
Expression du marqueur (en %) Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Produit cellulaire C cryopréservé
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HS A HTS 10% DMSO 10% HSA
CD73-APC Moyenn e 100. 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
Ecart type 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0
N 6 11 22 15 10 2 3 3
CD90-PE Moyenn e 100. 0 99.9 99.9 99.7 99.9 99.5 99.9 99.8
Ecart type 0.1 0.2 0.2 0.6 0.2 0.7 0.2 0.4
N 8 12 22 18 10 2 3 3
CD105-APC Moyenn e 100. 0 99.8 100.0 99.9 100.0 100.0 100.0 100.0
Ecart 0.0 0.5 0.1 0.3 0.0 0.0 0.0 0.0
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Expression du marqueur (en %) Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Produit cellulaire C cryopréservé
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HS A HTS 10% DMSO 10% HSA
type
N 8 12 20 18 10 2 3 3
CD45-FITC Moyenne ND ND ND 1.3 1.0 0.9 0.6 1.0
Ecart type 0.7 0.3 0.0 0.3 0.1
N 0 0 0 16 10 2 3 3
CD45-APC Moyenne 0.4 0.3 1.0 ND ND ND ND ND
Ecart type 0.2 0.2 2.9
N 8 12 19 0 0 0 0 0
CD34-APC Moyenne 0.6 1.0 1.6 2.1 1.6 2.8 3.3 1.5
Ecart type 0.4 0.6 1.8 1.6 0.9 2.2 2.2 1.0
N 8 12 22 16 10 2 3 3
CD3-PE Moyenne 0.2 0.1 0.2 0.0 0.1 0.1 0.0 0.0
Ecart type 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
N 6 10 17 16 10 1 3 3
HLA-DR-PE Moyenne 0.7 1.0 1.8 1.6 0.9 1.4 1.4 1.4
Ecart 1.2 0.6 2.0 1.8 0.7 0.8 0.8 0.9
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Expression du marqueur (en %) Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Produit cellulaire C cryopréservé
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HS A HTS 10%DMSO 10% HSA
type
N 8 12 22 16 10 2 3 3
HLA- DR/DP/DP/DQ -FITC Moyenne 1.0 1.6 1.6 2.0 1.5 1.8 1.8 1.6
Ecart type 0.4 1.1 1.1 1.6 0.7 0.6 0.8 0.2
N 8 12 22 16 10 2 3 3
ALP-PE Moyenne 40.7 88.7 94.8 96.2 96.2 97.7 98.7 98.4
Ecart type 5.6 6.6 4.4 3.6 2.0 0.9 1.7
N 1 5 10 18 10 3 2 3
CD49e-PE Moyenne 92.7 99.6 99.8 99.9 100.0 99.9 99.8 99.9
Ecart type 20.5 1.1 0.5 0.4 0.1 0.2 0.4 0.2
N 8 12 19 18 10 3 2 3
CD44-PE Moyenne 99.9 99.7 100.0 100.0 100.0 100.0 99.9 100.0
Ecart type 0.2 0.5 0.0 0.1 0.0 0.1 0.2 0.1
N 8 12 22 18 10 3 2 3
CD10-PE Moyenne 19.6 99.6 98.8 99.3 99.5 99.3 99.1 98.9
Ecart 14 0.4 1.5 16 0.5 0.6 0.4 0.7
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Expression du marqueur (en %) Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Produit cellulaire C cryopréservé
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HS A HTS 10%DMSO 10% HSA
type
N 10 12 25 16 10 2 3 3
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-DR : antigène leucocytaire humain - isotype DR ; HLA-DR/DP/DQ : antigène leucocytaire humain - isotypes DR/DP/DQ ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; SD : écart type
Tableau 5 : Niveaux d'expression en ALP des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire
CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et produits cellulaires illustrant l'invention (c’est-à-dire produits cellulaires C)
Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Cryopréservation du produit cellulaire C
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HS A HTS 10%D MSO 10%H SA
Population ALP- PE positive (%) Moyenne 40.7 88.7 94.8 96.2 96.2 98.7 97.7 98.4
écart type 5.6 6.6 4.4 3.6 0.9 2.0 1.7
N 1 5 10 18 10 2 3 3
Niveau d'expression de la surface cellulaire ALPPE (nMFI) Moyenne 2.4 19.8 56.1 60.3 38.0 57.7 42.7 41.2
Std Dev 10.8 27.4 38.9 24.2 43.1 37.2 31.3
N 1 5 10 18 10 2 3 3
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Activité enzymatique ALP (mU/mg de protéine totale) Moyenne 176.3 671.9 874.7 895.5 801.5 ND 719.9 633.6
Std Dev 252.9 305.8 772.9 387.3 351.3 277.0 263.9
N 3 9 26 12 5 0 2 2
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ;
Le profil d'expression des marqueurs de surface cellulaire a été caractérisé non seulement par la présence de marqueurs à la surface cellulaire (pourcentage de positivité de la population) mais aussi par l'analyse de la quantité de marqueurs exprimés à la surface cellulaire (médiane de fluorescence normalisée de la population) de différents marqueurs. Ces analyses ont mis en évidence certaines différences entre les différentes cellules dérivées de CMS.
Le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale) cultivés en présence d'héparine expriment un niveau d'ALP plus élevé que les CSM et le produit cellulaire A cultivé en l'absence d'héparine (résultats ALP-PE nMFI) renforçant leur engagement vers la lignée ostéoblastique des cellules formatrices d’os.
L'expression des marqueurs mésenchymateux CD73 et CD 105 à la surface des cellules dépendait également des types de cellules. Les produits cellulaires générés en présence d'héparine (produit cellulaire B et produits cellulaires C avec ou sans cryoconservation finale) exprimaient des taux plus élevés de CD73 et de CD105 que le produit cellulaire A. De plus, les produits cellulaires C semblaient posséder plus de CD73 et de CD 105 à leur surface que le produit cellulaire B, surtout lorsque le produit cellulaire C ne subissait pas une cryopréservation finale (tableau 6). Les produits cellulaires différenciés A, B et C expriment une quantité plus élevée de marqueur cellulaire CD 10 que les CSM indifférenciées. De plus, les produits cellulaires C possèdent plus de CD10 à leur surface que les produits cellulaires A et B (tableau 6).
Compte tenu de ce qui précède, il apparaît que le produit cellulaire B et les produits cellulaires C (avec ou sans cryoconservation finale), dont les produits B et C ont montré un potentiel ostéoinductif et un potentiel ostéogénique élevé dans les exemples 2 et 3, peuvent être distingués du produit cellulaire A, dont le produit A a montré un potentiel ostéoinductif et un faible potentiel ostéogénique dans les exemples 2 et 3, en fonction de la quantité exprimée d’un ou plusieurs des CD73, CD 105, CD 10 ou CD44 et/ou de la quantité exprimée sur la cellule d'un ou plusieurs des CD73, CD 105 ou CD44
Plus particulièrement, sur la base des tableaux 4 et 6, il apparaît qu'au moins 90 % des cellules du produit cellulaire B et des produits cellulaires C expriment CD73, CD 105, CD 10 et CD44 à la surface cellulaire (tableau 4) et que les cellules du produit cellulaire B et des produits cellulaires C ont une nMFICD73 d'au moins 500, une nMFICD44 d'au moins 100 (ou 150) et une nMFICDios de 150 (tableau 6).
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Par contre, les cellules du produit cellulaire A ont une nMFICD73 inférieur à 500 et une nMFICD44 inférieure à 100 (ou inférieur à 150) ; et les CSM ont une nMFICD73 inférieur à 500 et une nMFICD105 supérieure à 150 (tableau 6).
En conséquence, la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD105, CD10 et CD44 en combinaison avec la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par des cellules différenciées in vitro est appropriée et suffisante pour distinguer les cellules du produit cellulaire B et les produits cellulaires C des cellules CSM ou cellules du produit cellulaire A. Dans le même ordre d'idées, la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et CD44 en combinaison avec la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par des cellules différenciées in 10 vitro est appropriée et suffisante pour déterminer si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique, et notamment pour déterminer si elles ont un fort potentiel ostéogénique.
Tableau 6 : Autres résultats de l'expression des marqueurs de surface cellulaire des produits cellulaires comparatifs (c’est-à-dire CSM, produit cellulaire A, produit cellulaire B) et produits cellulaires C
Expression en marqueur (nMFI) Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Cryopréservation du produit cellulaire C
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10% HSA
ALP-PE Moyenne 2.4 19.8 56.1 60.3 38.0 57.7 42.7 41.2
Ecart type / 10.8 27.4 38.9 24.2 43.1 37.2 31.3
N 1 5 10 18 10 2 3 3
CD73-APC Moyenne 234.8 130.7 646.3 996.9 703.9 777.8 719.2 784.2
Ecart type 84.3 80.1 138.8 181.1 150.0 73.3 90.6 47.3
N 6 11 22 15 10 2 3 3
CD105- APC Moyenne 207.7 26.6 59.1 99.7 70.2 74.6 72.6 67.0
Ecart type 67.6 15.2 13.1 27.0 13.1 2.3 4.2 3.9
N 8 12 20 18 10 2 3 3
CD44-PE Moyenne 139.8 62.0 156.6 362.8 378.4 185.5 227.5 261.3
Ecart 57.5 19.1 40.7 250.4 205.3 19.6 80.1 147.7
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Expression en marqueur (nMFI) Statistiques CSM Produit cellulaire A Produit cellulaire B Produit cellulaire C frais Cryopréservation du produit cellulaire C
CS10 CS10 dilué HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10% HSA
type
N 8 12 22 18 10 2 3 3
CD49e-PE Moyenne 81.0 22.5 33.5 44.3 39.6 35.7 35.2 36.87
Ecart type 51.4 9.9 11.0 8.0 7.4 3.3 3.5 10.0
N 8 12 19 18 10 2 3 3
HLAABC-FITC Moyenne 26.1 21.6 80.2 115.7 104.7 71.5 79.5 70.1
Ecart type / 5.2 17.4 22.0 24.9 27.2 22.1 18.0
N 1 4 8 16 10 2 3 3
CD10-PE Moyenne 0.8 36.2 32.2 64.0 59.3 63.8 64.1 57.9
Ecart type 1.1 16.4 16.8 38.5 30.5 45.5 35.4 32.9
N 8 12 22 18 10 2 3 3
Abréviations : ALP : phosphatase alcaline ; APC : allophycocyanine ; FITC : isothiocyanate de fluorescéine ; HLA-ABC : Antigène de leucocytes humains ABC ; HLA-DR : Antigène de leucocytes humains - isotype DR ; CSM : cellules souches mésenchymateuses ; NA : non disponible ; ND : non déterminé ; PE : phycoérythrine ; SD : écart type
De plus, l'analyse par cytométrie en flux nMFI a révélé que les expressions des protéines CD73 et CD44 étaient plus élevées dans les cellules formatrices d’os C que dans tes autres types de ceHuies (Figure f0), y compris tes ceHuies formatrices d’os B.

Claims (13)

  1. REVENDICATIONS
    1. L’utilisation de CD73, CD105, CD44 et CD10 pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro.
    1. Une méthode permettant de déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro comprenant la mesure de la quantité de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44, et la mesure de la quantité dün ou plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 exprimés par les cellules différenciées in vitro.
  2. 3. La méthode selon la revendication 2, la méthode comprenant :
    (al) la mesure de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD105, CD10 et
    CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
    (a2) la mesure de la quantité d'un ou plusieurs CD73, CD105 ou CD44 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ;
    (bl) la comparaison de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD105, CD10 et CD44 telle que mesurée en (al) avec une valeur seuil représentative des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
    (b2) la comparaison de la quantité d'un ou de plusieurs CD73, CD 105 ou CD44 mesurés en (a2) avec une ou plusieurs valeurs seuils représentatives des cellules ayant un potentiel ostéogénique connu ;
    (cl) l’indentification ou non d’un écart de la fraction des cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 105, CD 10 et CD44 telle que mesurée en (al) par rapport à ladite valeur limite ;
    (c2) l’indentification ou non d’un écart de la quantité de l'un quelconque des CD73, CD105 ou CD44 mesurée en (a2) par rapport à ladite valeur seuil ; et (d) l’attribution dudit écart à une détermination particulière du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro.
  3. 4. La méthode selon la revendication 3, dans laquelle ladite valeur seuil de (bl) et lesdites valeurs seuils respectives de (b2) sont des valeurs seuils représentatives des cellules ayant un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
  4. 5. La méthode selon lüne quelconque des revendications 2 à 4, dans laquelle la quantité dün ou de plusieurs CD73, CD 105, CD44 ou CD 10 sur la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro est mesurée.
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  5. 6. La méthode selon la revendication 4 ou 5, dans laquelle :
    une fraction identique ou accrue de cellules différenciées in vitro, telle que mesurée en (al) par rapport à la valeur limite de (bl), indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique ; et la même quantité ou une quantité accrue de CD73, CD44 et/ou CD10 mesurée en (a2) par rapport aux valeurs seuils respectives de (b2), et la même quantité ou une quantité réduite de CD 105 mesurée en (a2) par rapport à la valeur seuil respective de (b2) indique que les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique utile sur le plan clinique.
  6. 7. La méthode selon les revendications 3 à 6, dans laquelle ladite valeur seuil de (bl) est de 90 % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 à la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une médiane d'intensité de fluorescence normalisée (nMFI) pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100, une nMFI pour CD 105 de 150 et/ou une nMFI pour CD 10 de 40.
  7. 8. La méthode selon les revendications 3 à 6, dans laquelle ladite valeur seuil de (bl) est de 90 % de cellules différenciées in vitro exprimant CD73, CD 105, CD 10 et CD44 à la surface cellulaire ; et dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une médiane d'intensité de fluorescence normalisée (nMFI) pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 150, une nMFI pour CD 105 de 150 et/ou une nMFI pour CD 10 de 40.
  8. 9. La méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 8, dans laquelle la quantité de CD73, CD 105 et CD44 exprimée par les cellules différenciées in vitro est mesurée.
  9. 10. La méthode selon la revendication 9, dans laquelle ladite valeur seuil de (b2) est une nMFI pour CD73 de 500, une nMFI pour CD44 de 100 et une nMFI pour CD105 de 150.
  10. 11. L’utilisation selon la revendication 1 ou la méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à
    10, dans laquelle les cellules différenciées in vitro sont obtenues à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM).
  11. 12. L’utilisation selon la revendication 1 ou méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 11, dans laquelle les cellules différenciées in vitro sont des cellules humaines.
  12. 13. Une méthode de sélection d'un sujet pour la préparation in vitro de cellules différenciées de lignée chrondro-ostéoblastique la méthode comprenant :
    -la collecte de CSM à partir d'un échantillon biologique d'un sujet ;
    -l'obtention de cellules différenciées in vitro à partir de CSM ;
    -la détermination du potentiel ostéogénique des cellules différenciées in vitro par un procédé tel que défini dans l'une quelconque des revendications 2 à 12 ; et
    BE2019/5630
    -la sélection du sujet pour la préparation de cellules différenciées in vitro de lignée chondroostéoblastique si les cellules différenciées in vitro ont un potentiel ostéogénique cliniquement utile.
  13. 14 La méthode selon la revendication 13, dans laquelle le sujet est un sujet humain.
    5 15. La méthode pour déterminer le potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro, la méthode comprenant :
    la mesure de la quantité en CD 10 à la surface cellulaire des cellules différenciées in vitro ; et la détermination du potentiel ostéogénique de cellules différenciées in vitro qui présentent une nMFI pour CD 10 d'au moins 40, la nMFICD10 est de préférence mesurée avec une
    10 longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'émission de 580 nm pour PE.
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