KR20210076018A - 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법 및 용도 - Google Patents

체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법 및 용도 Download PDF

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산드라 피에트리
델핀 데 트로이
카로라인 트러스
실바인 노르만드
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본 테라퓨틱스 소시에테아노님
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Abstract

본 출원은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105, CD44 및/또는 CD10의 용도를 제공한다. 본 출원은 추가로 CD73, CD105, CD10 및/또는 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및/또는 CD44의 양을 측정하는 단계를 포함하는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 연골 골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체의 선택 방법으로서, 피험체의 생체 샘플로부터 MSC를 회수하고; MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하며; 본원에서 개시된 방법에 의해 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하고; 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다면 연골 골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 단계를 포함하는 피험체의 선택 방법을 제공한다.

Description

체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법 및 용도
본 발명은 체외 분화 세포(in vitro differentiated cell)의 골형성능을 판정하기 위한 방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 하나 이상의 세포 마커(marker)를 측정하는 것을 포함하는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법 및 용도에 관한 것이다.
골형성 분화로 경도되어 있는 세포 또는 조골 능력이 있는 세포의 골형성 분화를 수행할 수 있는 줄기세포의 이식은 특히 치료가 새로운 골 조직의 생성을 필요로 하는 경우 골 관련 질환의 치료를 위한 유망한 수단이다.
간엽 줄기세포(MSC)는 이전에 골 질병을 치료하는데 사용되어 왔다(Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42). 그러나, 비교적 미분화된 이러한 줄기세포가 이식될 수 있지만, 이들은 골아세포계에 관여하지 않으며 골 조직의 형성에 대한 기여는 주로 파라크린(paracrine) 작용에 의해 매개된다. 더구나, 피험체(subject)로부터 수득할 수 있는 치료용 MSC의 양은 종종 만족스럽지 않다.
MSC를 체외 확장하고 MSC로부터 골 전구세포, 골아세포 또는 골아세포 표현형 세포를 수득하기 위한 일부 방법이 개발된 바 있다. 이러한 방법에 의해 수득된 세포는 다양한 정도의 체외 및 체내 골형성능을 가질 수 있다. 그 결과, 이러한 세포의 이식 시 체내 생성된 새로운 골 조직의 양은 항상 예측 가능하지 않을 수 있으며 경우에 따라 임상 목적에 최적이지 않을 수 있다.
체외 배양 세포, 예컨대 체외 분화 MSC-유래 세포의 이식 전에 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 지 판정할 필요가 있다.
본 발명의 특정 대표 실시형태를 예시하는 실험 단락에 의해 입증되는 바와 같이, 체외 분화 세포, 예컨대 간엽 줄기 세포(MSC)-유래 세포의 골형성능이 상기 세포의 특이 세포 표면 마커 발현 프로파일을 판정함으로써 평가될 수 있다고 본 발명자들은 인식하였다. 보다 구체적으로는, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고, 그 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양을 측정함으로써, 세포가 골형성능, 보다 구체적으로는 임상 환경에서 세포를 유용하게 하는 골형성능을 가지는지를 판정할 수 있다는 사실을 본 발명자들이 밝혀냈다. 아울러, 본원에서 개시된 MSC-유래 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 이용하여 연골 골아세포계의 MSC-유래 세포를 제조하기 위한 MSC의 공여자로서 특히 적합한 피험체가 선택될 수 있다는 사실을 본 발명자들은 또한 밝혀냈다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 용도를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105, CD44 및 CD10의 용도를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 체외 분하 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법으로서, CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법으로서, CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 연골 골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 방법으로서,
- 피험체의 생체 샘플로부터 MSC를 회수하고;
- MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하며;
- 본원에서 교시된 방법에 의해 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하고;
- 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다면 연골 골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 단계를 포함하는 선택 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 추가 양태와 바람직한 실시형태를 하기 단락과 첨부된 특허청구범위에 기재한다. 첨부된 특허청구범위의 주제는 본 문서로서 본 명세서에 구체적으로 원용된다.
도 1은 부형제 단독(대조 조건), MSC-유래 골 형성 세포 A(FGF-2와 TGFβ1로 생성) 또는 MSC-유래 골 형성 세포 B(FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성)의 투여 2주 후에 뮤린(murine) 및 인간 칼슘 결합 형광 색소에 의해 증명된 뮤린 골 두개관 관상 단면상의 골 신형성(neo-formation)을 도시한다.
도 2는 부형제 단독(음성 대조), MSC-유래 골 형성 세포 A(FGF-2와 TGFβ1로 생성) 또는 MSC-유래 골 형성 세포 B(FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성)의 투여 2주 후에 뮤린 두개관 관상 단면 상에 수행된 골 형성의 정량화(%)를 도시한다.
도 3은 MSC-유래 골 형성 세포 B(FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성)의 투여 2주 후에 뮤린 골 두개관 관상 단면상에 수행된 항-뮤린 및 항-인간 I형 콜라겐 면역 염색(면역 형광)을 도시한다. 도 3a는 항-인간 및 항-뮤린 I형 콜라겐 이중 면역 염색(병합)을 도시하며 반면에 도 3b 및 3c는 항-인간 및 항-뮤린 I형 콜라겐 면역 염색을 각각 보여준다.
도 4는 부형제 단독, MSC, FGF-2와 TFGβ1로 생성된 MSC-유래 골 형성 세포 A(b-f 세포 A), 또는 FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성된 MSC-유래 골 형성 세포 B(b-f 세포 B)의 투여 2주 후에 뮤린 골 두개관 관상 단면의 조직 구조 염색을 도시한다. (A) 칼슘 결합 형광 색소를 복강 내로 순차로 주사하여(알리자린 레드 → 칼세인 그린 → 칼세인 블루 → 테트라사이클린) 골 신형성을 증명하였고(화살표) 골 형성의 다이나믹을 평가하였음; (B) 면역 형광(IF) 인간 + 뮤린 I형 콜라겐; (C) IF 뮤린 I형 콜라겐; (D) IF 인간 I형 콜라겐. 항-인간 및 항-뮤린 I형 콜라겐 이중 면역 형광을 수행하여 골 기질에 의해 분비된 인간 및 뮤린 I형 콜라겐의 검출을 허용하였음; (E) ALP + 골드너(Goldner) 염색: ALP: 검정(실선 및 영역)으로 골아세포 활성의 검출, 마슨(Masson)의 삼색 골드너: 검정 점선으로 유골(미석회화 골 조직) 및 진한 회색 선으로 석회화 골의 검출; (F) 주석산염 내성 산 포스파타제(TRAP): 진한 회색/검정으로 파골세포 활성의 검출.
도 5는 부형제 단독; MSC; FGF-2와 TFGβ1로 생성된 MSC-유래 골 형성 세포 A(b-f 세포 A); 또는 FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성된 MSC-유래 골 형성 세포 B(b-f 세포 B)의 투여 2주 후에 뮤린 골 두개관 관상 단면 상의 골 신형성을 도시한 사진을 나타낸다. 골 신형성은 형광(서로 다른 형광 색소의 순차 통합에 의해 표지됨: 알리자린 레드 → 칼세인 그린 → 칼세인 블루 →테트라사이클린 옐로우)에 의해 증명된다. 레드, 그린 및 블루 염색은 연회색으로 나타나고 골 신형성 두께는 이중 화살표로 표시된다. 옐로우 염색은 점선으로 둘러싸였다.
도 6은 MSC(진한 회색) 또는 골 형성 세포 B(연회색)의 투여 2주 후에 뮤린 두개관 단면 상에서 측정된 신형성된 골의 전체 표면적(평균 ± SEM, *P<0.05)을 도시한 그래프를 나타낸다.
도 7은 골 형성 세포 B의 투여 1일 후(D1) 및 시간 경과(D7, D14, D21) 투여 후 28일까지(D28) 뮤린 골 두개관 시상 단면 상에 수행된 석회화 결절의 연골 기질(대시선으로 둘러싸인)의 사프라닌 오렌지(safranin-orange) 염색을 도시한다.
도 8은 구역 대퇴부 아임계 크기(segmental femoral sub-critical size) 결함 모델에서 MSC-유래 세포의 효과를 도시한다. (A)는 부형제 단독, 골 형성 세포 A(b-f 세포 A) 또는 골 형성 세포 B(b-f 세포 B)의 외과 처치/아이템(item) 투여 일자(D0) 및 시간 경과(1, 2, 3, 4, 5주) 투여 후 6주까지(6W)에 X-선 이미지 상의 결함 크기의 측정치; 평균 ± SEM, **p<0.01, ***p<0.001를 도시한 그래프를 나타내며; (B)는 D0 및 부형제 단독 또는 골 형성 세포 B(b-f 세포 B)의 투여 6주 후에 구역 대퇴부 결함의 대표적인 X-선 이미지를 나타내며; (C)는 부형제 단독(n=7) 및 골 형성 세포 B(n=8)의 투여 6주 후에 마이크로컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 분석에 의한 골 수복의 부피 측정치; 평균 ± SEM, *p<0.05를 도시한 그래프를 나타낸다.
도 9는 실시예 5에 사용된 유세포 분석(flow cytometry) 게이팅 전략(gating stragey)을 도시한다.
도 10은 MSC, 골 형성 세포 A, B 및 C에서 유세포 분석에 의해 분석된 CD73(상부 패널) 및 CD44(하부 패널) 발현 수준을 도시한다(MSC, 골 형성 세포 A, B 및 C 각각에 대해 N=12, 6, 22, 15(CD73) 및 N=22, 8, 22, 18(CD44), 여기서 N은 개별 실험수를 나타낸다).
도 11은 X-선 분석에 의해 평가된 골 유도 및 골 형성을 도시한다. A: 골 유도(A, 좌측 패널)는 골 불투명도(opacity)에 직접 상관관계가 있고 따라서 골 두께에 직접 상관관계가 있는 회색 강도치를 측정함으로써 평가된다. 골 형성(A, 우측 패널)은 X-선 이미지화에 의해 더 굴절한 것으로 보이는 결절의 표면을 측정함으로써 평가된다. B: 골 불투명도는 부형제에 비해 동결보존된 골 형성 세포 C("B-F 세포 C")에 대해 상당히 크다(n=20(부형제) 및 n=34(5개의 서로 다른 배치로부터 B-F 세포 C)). C: 골 형성의 표면은 석회화 결절이 관찰되지 않았던 부형제에 비해 상당히 크다(n=20(부형제) 및 n=34(5개의 서로 다른 배치로부터 B-F 세포 C)). D-F: 골 형성이 있거나(도 8D) 없는(도 8E) 골 유도(절대 골 형성에 의해 표시됨)는 부형제에 비해 동결보존된 골 형성 세포("B-F 세포 C")에 대해 상당히 크다. 만 휘트니(Mann Whitney) U-시험: ***p≤0.001. F: 골 유도 활성 외에, 동결보존된 골 형성 세포("B-F 세포 C")는 4/5 골수 공여자(또는 배치 생성) 및 65%의 마우스(mouse)에서 적어도 하나의 석회화 결절의 존재에 의해 표시된 큰 골형성 활성을 촉진한다(n=20(부형제) 및 n=34(5개의 서로 다른 배치로부터 B-F 세포 C)).
도 12는 동결보존된 골 형성 세포 C 또는 부형제의 단일 투여 4주 후에 관상 조직 절편을 도시한다. 동결보존된 골 형성 세포 C는 두 가지 메커니즘을 통해 활성을 나타낸다: (i) "골 유도": 막내 골화로 이어지는 파라크린 분비를 통한 숙주 골 형성의 자극 및 (ii) "골 형성": 연골내 골화에 의한 "직접" 골 형성(공여자/인간 기원으로부터)의 촉진.
도 13은 동결보존된 골 형성 세포 C의 단일 주사를 받은 4주 후에 마우스 두개관의 조직 구조 분석을 도시한다. 동결보존된 골 형성 세포 C는 골 유도 및 골 형성 특성을 나타냈다("fluo"). 결절에서 골 재형성 과정이 4주 투여 후에 여전히 진행중이었음을 나타내는 석회화 결절에서 인간 골 형성("인간 I형 콜라겐")은 석회화 결절에서 강조되었다(골 형성). 골아세포(세 번째 패널에서 검정 화살표로 표시된 "ALP") 및 파골세포(네 번째 패널에서 검정 화살표로 표시된, "TRAP") 활성이 대부분 검출되었다. 골 형성 과정이 완료됨을 나타내는 유골("골드너의 마슨 삼색 염색")이 강조되지 않았다.
도 14는 구역 대퇴부 아임계 크기 결함 모델에서 동결보존된 골 형성 세포 C("B-F 세포 C")의 효과를 도시한다. X-선 이미지는 0일에서 부형제 단독 또는 동결보존된 골 형성 세포 C의 투여 10주 후까지 구역 대퇴부 결함을 나타낸다.
도 15는 구역 대퇴부 아임계 크기 결함 모델(sub-CSD model)에서 동결보존된 골 형성 세포 C의 효과를 도시한다. 그래프는 부형제 단독, 또는 동결보존된 골 형성 세포 C("B-F 세포 C")의 외과 처치/아이템 투여일("W0") 및 시간 경과 투여 10주 후("W10")까지에 X-선 이미지 상의 골 수복 퍼센트; 평균 ± SEM, ***p<0.001를 나타낸다(양방향 반복 측정 ANOVA).
도 16은 구역 대퇴부 아임계 크기 결함 모델(sub-CSD model)에서 동결보존된 골 형성 세포 C의 효과를 도시한다. 그래프는 부형제 단독, 또는 동결보존된 골 형성 세포 C(B-F 세포 C)의 외과 처치/아이템 투여일("W0") 및 시간 경과 투여 10주 후("W10")까지에 X-선 이미지로부터 측정된 RUS 스코어; 평균 ± SEM, **P<0.01, ***p≤0.001를 나타낸다(양방향 반복 측정 ANOVA).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 지시 대상을 둘 다 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는", "포함한다" 및 "포함된"은 "포함하는", "포함한다" 또는 "함유하는", "함유한다"와 동의어이며, 포괄적이거나 제한을 두지 않으며 추가의, 상술 안 된 부재, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어는 또한 특허 전문 용어에서 확립된 의미를 향유하는 "이루어진" 및 "기본적으로 이루어진"을 포함한다.
단점들에 의한 수치 범위의 설명은 각 범위 내에 포함된 모든 수와 분수, 뿐만 아니라 상술된 단점들을 포함한다.
파라미터, 양, 시간, 등의 측정 가능한 수치를 언급할 때 본 명세서에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 특정 수치의 및 이로부터 ± 10% 이하, 바람직하게는 ± 5% 이하, 더 바람직하게는 ± 1% 이하, 및 더욱더 바람직하게는 ±0.1% 이하의 편차와 같은, 특정 수치의 및 이로부터 편차를 포함하는 것을 의미하며, 이와 같은 한 이러한 편차는 개시된 발명에서 수행하기에 적절하다. 수식어 "약"이 지칭하는 값 자체는 또한 구체적이고 바람직하게 개시되어 있음이 이해될 것이다.
멤버의 군 중 하나 이상의 멤버 또는 적어도 하나의 멤버와 같은, 용어 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 그 자체로서 명백한 반면에, 추가 예시에 의해, 용어는 특히 상기 멤버의 어느 하나, 또는 상기 멤버의 2 이상, 예컨대 예를 들어, 상기 멤버의 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7 이상 등, 및 모든 상기 멤버까지 참조로 포함한다. 또 다른 예시에서, "하나 이상" 또는 "적어도 하나"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 이상을 언급할 수 있다.
발명의 문맥을 설명하기 위해 본원에서 발명에 대한 배경의 논의가 포함된다. 이는 언급된 임의의 자료가 공개되었고, 공지되었다는 승인, 또는 어느 하나의 청구범위의 우선일 현재 임의 국가에서 일반적인 주지 사실의 일부로서 받아들이지 않는다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 식별 인용으로 참조된다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌은 본 문서로서 이들의 전체가 원용된다. 특히, 본 명세서에서 특히 언급된 이러한 문헌의 교시 내용 또는 단락은 원용된다.
달리 정의되지 않는 한, 기술적 및 과학적 용어를 포함하여, 발명을 개시하는데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 통상의 기술자에 의해 통상 이해된 의미를 갖는다. 추가 지침에 의해, 용어 정의는 발명의 교시 내용을 더 양호하게 통찰하도록 포함된다. 특정 용어가 발명의 특별한 양태 또는 발명의 특별한 실시형태와 관련하여 정의되는 경우, 달리 정의되지 않는 한, 이러한 함축은 본 명세서 전반에 걸쳐, 즉 또한 발명의 다른 양태 또는 실시형태의 문맥에 적용되는 것을 의미한다.
하기 구절에서, 발명의 다른 양태 또는 실시형태가 더 상세히 정의된다. 이와 같이 정의된 각 양태 또는 실시형태는 명백히 반대로 지시되지 않는 한 임의의 다른 양태(들) 또는 실시형태(들)와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로서 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로서 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 실시형태"에 참고하여, "실시형태"는 그 실시형태와 관련하여 기재된 특별한 특징, 구조 또는 특성은 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 구 "일 실시형태에서" 또는 "실시형태에서"의 출현은 모두가 반드시 동일 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만, 지칭할 수도 있다. 또한, 하나 이상의 실시형태에서, 본 개시내용으로부터 통상의 기술자에게 명백하듯이, 특별한 특징, 구조 또는 특성은 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 아울러, 본 명세서에 기재된 일부 실시형태가 다른 실시형태에 포함된 일부 특징을 포함하나 다른 특징을 포함하지 않으면서, 서로 다른 실시형태의 특징들의 조합은 통상의 기술자에 의해 이해되듯이 발명의 범위 내에 있고, 서로 다른 실시형태를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 첨부된 특허청구범위에서, 임의의 청구된 실시형태가 임의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는데 유용한 특정 세포 표면 마커를 실현하였다. 보다 구체적으로는, 본 발명자들은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양, 및 체외 분화 세포에 의해 발현된, CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양이 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 마커로서 사용될 수 있다는 사실을 밝혀냈다.
명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 'CD73', 'CD105', 'CD44' 또는 'CD10'에 대한 참조는 문맥으로부터 명백하듯이 본 기술에서 상기 명칭하에 통상적으로 알려진 각각의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 나타낸다. 용어들은 발견된 임의 유기체의, 특히 동물, 바람직하게는 온혈 동물, 더 바람직하게는 척추 동물, 더욱더 바람직하게는 인간 및 비인간 포유 동물을 포함한 포유 동물의, 더더욱 더 바람직하게는 인간의 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "단백질"은 일반적으로 하나 이상의 폴리펩티드 사슬, 즉 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체 사슬을 포함하는 매크로분자를 포함한다. 용어는 천연으로, 재조합으로, 반합성으로 또는 합성으로 제조된 단백질을 포함할 수 있다. 용어는 또한 폴리펩티드 사슬(들)의 하나 이상의 공- 또는 후-발현형 변형, 예컨대 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 설폰화, 메틸화, 유비퀴틴화, 시그널 펩티드 제거, N-말단 Met 제거, 전효소 또는 전호르몬의 활성형으로 전환, 등을 지닌 단백질을 포함한다. 용어는 추가로 상응하는 천연 단백질과 비교하여 아미노산 서열 변형, 예컨대 예를 들어, 아미노산 결실, 부가 및/또는 치환을 지닌 단백질 변이체 또는 돌연변이체를 또한 포함한다. 용어는 전장 단백질 및 단백질 부분 또는 단편, 예를 들어 이러한 전장 단백질의 처리 결과로 뒤따라 발생하는 천연 발생 단백질 부분 둘 다를 고려한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체 사슬을 포함한다. 따라서, 단백질이 단일 폴리펩티드 사슬만으로 구성되는 한, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되어 이러한 단백질을 정의할 수 있다. 용어는 폴리펩티드 사슬의 최소 길이로 제한되지 않는다. 용어는 천연으로, 재조합으로, 반합성으로 또는 합성으로 제조된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 용어는 또한 폴리펩티드 사슬의 하나 이상의 공- 또는 후-발현형 변형, 예컨대 제한 없이, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 설폰화, 메틸화, 유비퀴틴화, 시그널 펩티드 제거, N-말단 Met 제거, 전효소 또는 전호르몬의 활성형으로 전환, 등을 지닌 폴리펩티드를 포함한다. 용어는 추가로 상응하는 천연 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 서열 변형, 예컨대 예를 들어, 아미노산 결실, 부가 및/또는 치환을 지닌 폴리펩티드 변이체 또는 돌연변이체를 또한 포함한다. 용어는 전장 폴리펩티드 및 폴리펩티드 부분 또는 단편, 예를 들어 이러한 전장 폴리펩티드의 처리 결과로 뒤따라 발생하는 천연 발생 폴리펩티드 부분 둘 다를 고려한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "펩티드"는 바람직하게는 50개 이하의 아미노산, 예를 들어, 45개 이하의 아미노산, 바람직하게는 40개 이하의 아미노산, 예를 들어, 35개 이하의 아미노산, 더 바람직하게는 30개 이하의 아미노산, 예를 들어, 25개 이하, 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산으로 기본적으로 이루어진, 본원에서 사용된 폴리펩티드를 나타낸다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "핵산"은 전형적으로 뉴클레오시드 단위로 기본적으로 구성된 임의 길이의 중합체(바람직하게는 선형 중합체)를 나타낸다. 뉴클레오시드 단위는 흔히 복소환 염기와 당 기를 포함한다. 복소환 염기는 특히 천연 발생 핵산으로 널리 퍼진 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)과 같은 퓨린 및 피리미딘 염기, 다른 천연 발생 염기(예를 들어, 크산틴, 이노신, 하이포크산틴) 및 뿐만 아니라 화학적으로 또는 생화학적으로 개질된(예를 들어, 메틸화된), 비천연 또는 유도체화 염기를 포함할 수 있다. 일예의 개질된 핵산 염기는 제한 없이 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 특히, 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중쇄 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며 예를 들어 안티센스제(antisense agents)에서, 더 구체적으로는 2'-O-메톡시에틸 당 변이와 조합되는 경우에도 바림직한 염기 치환일 수 있다. 당 기는 특히 천연 발생 핵산에서 흔한 바람직하게는 리보오스 및/또는 2-데옥시리보오스와 같은 펜토오스(펜토퓨라노오스) 기, 또는 아라비노오스, 2-데옥시아라비노오스, 트레오스 또는 헥소오스 당 기, 및 뿐만 아니라 개질되거나 치환된 당 기(예컨대 제한 없이 2'-O-알킬화, 예를 들어, 2'-O-메틸화 또는 2'-O-에틸화 당 예컨대 리보오스; 2'-O-알킬옥시알킬화, 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸화 당 예컨대 리보오스; 또는 2'-O,4'-C-알킬렌-연결된, 예를 들어, 2'-O,4'-C-메틸렌-연결된 또는 2'-O,4'-C-에틸렌-연결된 당 예컨대 리보오스; 2'-플루오로-아라비노오스, 등)를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 단위는 특히 천연 발생 핵산에서 흔한 포스포디에스테르 결합(linkage), 및 추가의 개질된 포스페이트- 또는 포스포네이트-계 결합 예컨대 포스포로티오에이트, 알킬 포스포로티오에이트 예컨대 메틸 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트 예컨대 메틸포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르 예컨대 알킬포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 포스포로피페라지데이트, 포스포로모르폴리데이트, 가교된 포스포르아미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포로티오에이트; 및 추가의 실록산, 카르보네이트, 설파메이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카르바메이트 예컨대 3'-N-카르바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 3'-티오아세탈, 및 설폰 뉴클레오시드간(internucleoside) 결합을 포함하여, 다수의 공지 뉴클레오시드간 결합 중 어느 하나에 의해 서로 연결될 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오시드간 결합은 개질된 포스페이트계 결합, 예컨대 더 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합 또는 이들의 조합을 포함하는 포스페이트계 결합일 수 있다. 용어 "핵산"은 또한 제한 없이 펩티드 핵산(PNA), 포스페이트 기가 있는 펩티드 핵산(PHONA), 고정된(locked) 핵산(LNA), 모르폴리노 포스포로디아미데이트 골격 핵산(PMO), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 트리사이클로-DNA(tcDNA), 알킬 링커 또는 아미노 링커가 있는 골격 섹션을 가진 핵산을 포함하여, 중합체를 함유한 임의의 다른 핵산 염기 예컨대 핵산 유사체를 포함한다(참조, 예를 들어, Kurreck 2003 (Eur J Biochem 270: 1628-1644)). 본 명세서에서 사용된 "알킬"은 구체적으로 저급 탄화수소 부분, 예를 들어, C1-C4 선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소, 예컨대 메틸, 에틸, 에텐일, 프로필, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 및 이소프로필을 포함한다. 본원에서 의도된 핵산은 천연 발생 뉴클레오시드, 개질된 뉴클레오시드 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 개질된 뉴클레오시드는 개질된 복소환 염기, 개질된 당 부분, 개질된 뉴클레오시드간 결합 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 추가로 바람직하게는 DNA, RNA 및 DNA/RNA 혼성 분자를 포함하며, 구체적으로는 hnRNA, pre-mRNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, 증폭산물, 올리고뉴클레오티드, 및 합성(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성물을 포함한다. 핵산은 천연 발생될 수 있으며, 예를 들어, 자연에 존재하거나 이로부터 단리될 수 있고, 재조합될 수 있으며, 즉 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있고/있거나 부분적으로 또는 전체적으로 화학적 또는 생화학적으로 합성될 수 있다. "핵산"은 이중 가닥일 수 있거나, 부분적으로 이중 가닥일 수 있거나, 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 또한, 핵산은 환형 또는 선형일 수 있다.
추가 지침에 의해, CD73은 또한 본 기술에서 엑토-5'-뉴클레오티다아제, NT, eN, NT5, NTE, eNT, E5NT 및 CALJA로서 알려져 있다. CD73은 글리코실-포스파티딜이노시톨(GPI)-연결 세포 표면 효소이다. 일예에 의해, 인간 CD73 유전자는 NCBI Genbank (http://www.nchi.nlm.nih.gov/) 하에 주석을 달고 있고 인간 CD73 단백질은 Uniprot (www.uniprot.org) 하에 기탁번호 P21589.1로 주석을 달고 있다. 인간 CD73의 mRNA 및 단백질 서열은 하기 NCBI Genbank 기탁번호로 주석을 달고 있다: CD73 mRNA (NM_002526.3; NM_001204813.1), CD73 단백질 (NP_002517.l;NP_00l 191742.1).
추가 지침에 의해, CD105는 또한 본 기술에서 엔도글린(ENG), END, FLJ41744, HHT1, ORW 및 ORW1로서 알려져 있다. CD105는 세포 표면에 위치한 I형 막 당단백질이다. 일예에 의해, 인간 CD105 유전자는 NCBI Genbank Gene ID 2022 하에 주석을 달고 있고 인간 CD105 단백질은 Uniprot 하에 기탁번호 P17813.2로 주석을 달고 있다. 인간 CD105의 mRNA 및 단백질 서열은 하기 NCBI Genbank 기탁번호로 주석을 달고 있다: CD105 (NM_00l 114753.2; NM_000118.3; NM_001278138.1), CD105 단백질 (NP 001108225.l ;NP_000l09.l ; NP OO 1265067.1). 추가 지침에 의해, CD44는 또한 본 기술에서 호밍(homing) 세포 접착 분자(HCAM), Pgp-1(식세포 당단백질-1), 헤르메스(Hermes) 항원, 림프구 호밍 수용체(LHR), ECM-III, HUTCH- 1, IN, MC56, MDU2, MDU3, MIC4, Pgpl, CDW44, CSPG8, HCELL, HUTCH-I 및 ECMR-III로서 알려져 있다. CD44는 세포-세포 상호작용, 세포 접착 및 이동에 관련된 세포 표면 당단백질이다. 일예에 의해, 인간 CD44 유전자는 NCBI Genbank Gene ID 960 하에 주석을 달고 있고 인간 CD44 단백질은 Uniprot 하에 기탁번호 P16070.3로 주석을 달고 있다. 인간 CD44의 mRNA 및 단백질 서열은 하기 NCBI Benbank 기탁번호 하에 주석을 달고 있다: CD44 mRNA (NM_000610.3, NM 001001389.1, NM 001001390.1, NM 001001391.1, NM 001001392.1, NM 001202555.1, NM_001202556.1, NM_001202557.1), CD44 단백질 (NP 000601.3, NP_001001389.1, NP 001001390.1, NP_001001391.1, NP_001189484.1, NP 001189484.1, NP_001189485.1, NR OOI 189486.1).
추가 지침에 의해, CD10은 또한 본 기술에서 막 메탈로엔도펩티다아제(MME), NEP, SFE, CALLA, CMT2T 및 SCA43로서 알려져 있다. CD10은 II형 막투과 당단백질이다. 일예에 의해, 인간 CD10 유전자는 NCBI Genbank (http://www.nchi.nlm.nih.gov/) Gene ID 4311 하에 주석을 달고 있고 인간 CD10 단백질은 Uniprot 하에 기탁번호 P08473.2로 주석을 달고 있다. 인간 CD10의 mRNA 및 단백질 서열은 하기 NCBI Genbank 기탁번호 하에 주석을 달고 있다: CD10 mRNA (NM 000902.3, NM 007287.2, NM_007288.3, NM_007289.3, NM 001354642.1, NM 001354643.1, NM_001354644.1), CD10 단백질 (NP_000893.2, NP_009218.2, NP_009219.2, NP_009220.2, NP 001341571.1, Genbank 또는 Uniprot 등록으로 전구체 폴리펩티드 또는 단백질의 서열을 제공하는 경우, 상응하는 성숙형(예컨대, 예를 들어, 결손 시그널 펩티드)이 세포의 세포 표면상에 존재할 것으로 예상된다는 사실을 독자에게 상기한다.
용어 'CD73', 'CD105', 'CD44' 및 'CD10'은 구체적으로 천연 서열이 있는, 이러한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산, 즉 일차 서열이 자연에서 발견되거나 이로부터 유래한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 서열과 동일한 것들을 포함한다. 통상의 기술자는 천연 서열이 서로 다른 종 사이에서 이러한 종들 사이의 유전적 다양성으로 인해 달라질 수 있다는 사실을 이해한다. 더구나, 천연 서열은 동일한 종들의 서로 다른 개체 사이에서 또는 내에서 제공된 종들 내의 정상적인 유전적 다양성(변이)으로 인해 달라질 수 있다. 또한, 천연 서열은 동일한 종들의 서로 다른 개체 사이에서 또는 심지어 내에서 체세포 변이, 또는 전사 후 또는 번역 후 수식으로 인해 달라질 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 임의의 이러한 변이체 또는 이소형(isoform)이 본원에서 의도된다. 따라서, 자연에서 발견되거나 이로부터 유래한 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 모든 서열은 "천연"으로 고려된다. 용어들은 생존 세포의 일부를 형성할 때 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산을 포함한다.
제1 양태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 용도를 제공한다. 따라서, 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나의 용도; 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105 또는 CD44 중 둘의 용도; 및 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105 및 CD44의 3개 모두의 용도를 제공한다.
특정 실시형태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 용도를 제공한다.
특정 실시형태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD44의 용도를 제공한다. 특정 실시형태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD44 및 CD73과 CD105 중 어느 하나 또는 둘 다의 용도를 제공한다. 특정 실시형태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD44 및 CD73, CD105 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 용도를 제공한다.
특정 실시형태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD10의 용도를 제공한다. 특정 실시형태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD10 및 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 용도를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "골형성능"은 체내, 및 임의로 체외에서 골 기질 분비 세포로 분화(형질전환)하는 세포의 능력 또는 골 기질을 분비하는 세포의 능력(즉 분화(형질전환) 단계의 필요 없이)을 나타낸다. 용어는 막내 골화 또는 연골내 골화에 의해 골 조직을 형성하는 세포의 능력을 포함한다. 막내 골화에 의해 골 조직을 형성하는 세포의 능력은 전형적으로 주형으로서 석회화 연골 기질의 필요 없이 골 조직을 형성하는 세포의 능력을 나타낸다. 연골내 골화에 의해 골 조직을 형성하는 세포의 능력은 전형적으로 처음에 석회화 연골 기질을 형성한 다음 이후 상기 석회화 연골 기질을 골 조직 형성을 위한 주형으로서 사용함으로써 골 조직을 형성하는 세포의 능력을 나타낸다. 용어는 세포의 골유도능을 포함하지 않으며, 이 능력은 다른 골 기질 분비 세포를 끌어 당기고/당기거나 다른 세포의 골 기질 분비 세포로 분화(형질전환)를 유도하는 세포의 능력을 나타낸다. 본 발명의 목적은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 것인 반면에, 세포는 골형성능 외에 또한 골유도능을 가질 수 있지만 필요하지 않다는 사실을 통상의 기술자는 이해한다.
특별한 실시형태에서, 골형성능은 연골내 골화에 의해 골 기질을 형성하는 세포의 가능성이다.
본원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "연골내 골화"는 제1 연골 세포가 연골 세포외 기질을 형성하는 골 조직 형성 과정을 나타내며, 이 기질은 나중에 골 기질을 침착시키기 위한 주형으로서 골아세포에 의해 사용된다. 연골내 골화 중에, 연골 세포의 일부는 골아세포로 분화 형질전환될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, CD73, CD105 및 CD44 모두는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는데 사용된다.
특별한 실시형태에서, CD10은 CD73, CD105 및 CD44 중 하나 이상 외에, 바람직하게는 CD73, CD105 및 CD44 모두 외에 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위해 사용된다. 따라서, 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105, CD44 및 CD10의 용도가 또한 제공된다.
추가 양태는 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법으로서 (a1) CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법을 제공한다. 따라서, 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법으로서 (a1) CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 하나를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 둘을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고, 더 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 셋을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고, 가장 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 넷을 모두 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 하나의 양을 측정하고, 바람직하게는 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 둘의 양을 측정하고, 가장 바람직하게는 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 셋 모두의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법이 또한 본원에서 제공된다. 따라서, 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 방법으로서 (a1) CD73, CD105, CD10 및 CD44의 넷 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 셋 모두의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법이 또한 본원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD73, CD105, CD10 및 CD44 외에 다른 마커를 측정하는 것을 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD44 및 CD73과 CD105 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD44 및 CD73, CD105 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD10을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 CD10 및 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73 및 CD105와 CD44의 어느 하나 또는 둘 다의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73 및 CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD105의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD105 및 CD73과 CD44의 어느 하나 또는 둘 다의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD105 및 CD73, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD44의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD44 및 CD73과 CD105의 어느 하나 또는 둘 다의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD44 및 CD73, CD105 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 세포 표면 상에 또는 이에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 또는 CD10의 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 세포 표면 상에 또는 이에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 및 CD10의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10 및 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (a1) CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (a1) CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "발현하는" 또는 "발현"은 세포에 의한 임의의 전사산물 또는 번역산물, 예컨대 RNA, 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 생성 및 뿐만 아니라 세포 표면 상에 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 제시(presentation)를 포함한다.
추가 지침에 의해, 세포가 제공된 유전자, 펩티드 폴리펩티드 또는 단백질, 예컨대 CD73, CD105, CD10 또는 CD44에 대해 양성이거나 이를 발현하거나 이의 발현을 포함한다고 일컬어지는 경우, 통상의 기술자는 그 세포 내에 또는 상에 그 유전자, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 검출하거나 정량화할 수 있는 측정을 수행할 때 유전자, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 분명한 신호의 존재 또는 증거를 결론 지을 것이다. 적합하게는, 유전자, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 분명한 신호의 존재 또는 증거는 음성 대조(예를 들어, 마커를 발현하지 않는다고 알려진 세포) 및/또는 양성 대조(예를 들어, 마커를 발현한다고 알려진 세포)에 대해 수행된 동일한 측정 결과에 대한 세포에 대해 얻어진 측정 결과의 비교를 기반으로 결론지워질 것이다.
분자 또는 검체 예컨대 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산, 또는 2 이상의 분자 또는 검체 예컨대 2 이상의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 군은 상기 분자 또는 검체의 또는 상기 분자들 또는 검체들의 군의 존재 또는 부재 및/또는 양이 바람직하게는 실질적으로 다른 분자와 검체를 제외하고 샘플에서 검출되거나 판정될 때 샘플에서 "측정"된다. 용어 "수량", "양" 및 "수준"은 동의어이며 일반적으로 본 기술에서 잘 이해되고 있다. 본원에서 사용된 용어는 샘플에서 다수의 세포, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 절대적 정량, 또는 즉 또 다른 값에 대해 예컨대 본원에서 교시된 기준 값에 대해, 샘플에서 다수의 세포, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 상대적 정량을 특히 나타낼 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 수량은 또한 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 활성에 의해 표시될 수 있다. 샘플에서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 활성은 또한 절대적으로, 예를 들어 부피당 효소 단위로, 또는 상대적으로 표현될 수 있다.
샘플에서 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 절대량은 유리하게는 중량으로 또는 몰량으로, 또는 더 일반적으로 농도, 예를 들어, 부피당 중량 또는 부피당 몰로 표현될 수 있다.
샘플에서 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 상대량은 유리하게는 증가 또는 감소로서 또는 상기 또 다른 값에 대해, 예컨대 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 기준 값에 대해 폴드(fold) 증가 또는 폴드 감소로서 표현될 수 있다. 제1 및 제2 파라미터(예를 들어, 제1 및 제2 수량) 사이의 상대 비교의 수행은 상기 제1 및 제2 파라미터의 절대 값을 우선 판정하는 것을 요구할 수 있으나 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 측정 방법은 상기 제1 및 제2 파라미터에 대한 정량화 가능한 해독 정보(예컨대, 예를 들어, 신호 강도)를 생성할 수 있으며, 여기서 상기 해독 정보는 상기 파라미터의 값의 함수이고, 상기 해독 정보는 제1 파라미터 대 제2 파라미터에 대한 상대 값을 생성하도록 해독 정보를 우선 각 파라미터의 절대 값으로 전환하는 실제 요구 없이 직접 비교될 수 있다.
세포의 상대 수량은 분석된 세포 총수에 대해, 더 구체적으로는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 발현이 판정되는 세포 총수에 대해 세포의 퍼센트(분율)으로서 표현될 수 있다. 이에 따라, 본원에서 교시된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 것은 전형적으로 (i) 체외 분화 세포에 의해 CD73, CD105, CD10 및/또는 CD44의 발현(즉 존재)을 판정하고, (ii) 단계 (i)에서 CD73, CD105, CD10 및/또는 CD44를 발현한다고 판정된 체외 분화 세포의 수를 세며, (iii) 단계 (i)에서 시험된 체외 분화 세포의 총수에 대해 단계 (i)에서 CD73, CD105, CD10 및/또는 CD44를 발현한다고 판정된 체외 분화 세포의 분율을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 수량은 본 기술에서 공지된 임의 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석에 의한다.
이에 따라, 특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 수량은 분석된 모든 체외 분화 세포에 대해 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현한다고 판정된 체외 분화 세포의 분율이다.
체외 분화 세포에 의한 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 존재를 판정하는 것 및/또는 이의 수량을 측정하는 것은 세포 또는 세포 집단 내에 또는 상에 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산의 존재 또는 부재(예를 들어, 해독 정보의 존재 대 부재; 또는 검출 가능한 양 대 검출 불가능한 양) 및/또는 양(예를 들어, 해독 정보는 절대 또는 상대 수량임)을 측정하는데 사용된 임의의 현존하는, 이용가능하거나 종래의 검출 및/또는 정량화 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 생화학 검정법, 면역 검정법, 질량 분석법, 또는 크로마토그래피법, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 존재 및/또는 수량의 측정은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 mRNA 또는 둘 다를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 존재 및/또는 수량의 측정은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 측정하는 단계를 포함한다.
CD73, CD105, CD10 및 CD44 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 각각이 전형적으로 세포 표면상에 발현됨에 따라, 통상의 기술자는 세포 표면상의 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상에 참조하는 경우, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 의도되거나 즉 하나 이상의 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 참조하는 경우, 세포 표면상의 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상이 의도된다는 사실을 이해할 것이다.
특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 존재 및/또는 수량의 측정은 세포 표면상의 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 측정하는 단계를 포함한다.
더 특별한 실시형태에서, 생존 세포의 세포 표면상에 비변성 형태로 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 중 하나 이상의 존재 및/또는 수량이 측정된다.
더 특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 중 하나 이상의 존재 및/또는 수량의 측정은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44에 각각 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 작용제(agent)를 채용하는 기술을 사용하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 하나 이상의 작용제는 각각 독립적으로 하나 이상의 항체, 항체 단편, 항체 유사 단백질 골격, 또는 압타머(aptamers)이다.
이러한 방법은 친화성 기반 검정법을 포함할 수 있으며, 여기서 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산을 검출하고/하거나 정량화하는 검정의 능력은 검출가능하고/하거나 정량화 가능한 결합제 및 i) 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 핵산 사이의 특이 결합에 의해 부여된다. 결합제는 면역 결합제(항체) 또는 비면역 결합제일 수 있다. 인간 CD73에 결합할 수 있는 항체의 예는 제한 없이 하기 공급업자로부터 수득 가능한 것들을 포함한다("＃"는 카탈로그 번호를 나타낸다): BD Biosciences (알로피코시아닌(APC)-공액(conjugated) 마우스 단일 클론 항체, #560847; 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-공액 마우스 단일 클론 항체, #561254; R-피코에리트린(PE)-공액 마우스 단일 클론 항체 #55027), Abeam (마우스 단일 클론 항체, #ab542l7; 토끼 단일 클론, #ab79423; 마우스 단일 클론 #ab34l99), R&D systems (비오틴일화 다클론 염소 항체, #BAFll82; 단일 클론 마우스, #MABll82; PE-공액 다클론 염소 항체, #FAB8l60P). 인간 CD105에 결합할 수 있는 항체의 예는 제한 없이 하기 공급업자로부터 수득 가능한 것들을 포함한다("＃"는 카탈로그 번호를 나타낸다): BD Biosciences (APC-공액 마우스 단일 클론 항체, #562408; PE-표지 마우스 단일 클론 항체, #560839), Abeam (마우스 단일 클론, #ab156756; 마우스 단일 클론, #ab2529; 토끼 단일 클론, #ab22l675), R&D systems (Alexa Fluor® 488-공액 단일 클론 마우스, #FABl097lG; Alexa Fluor® 647-공액 단일 클론 마우스, #FABl097lR; 염소 다클론, #AFl097). 인간 CD44에 결합할 수 있는 항체의 예는 제한 없이 하기 공급업자로부터 수득 가능한 것들을 포함한다("＃"는 카탈로그 번호를 나타낸다): BD Biosciences (PE-공액 마우스 단일 클론 항체, #550989; FITC-공액 마우스 단일 클론 항체, #555478), Abeam (토끼 다클론, #abl57l07, PE-공액 마우스 단일 클론, #ab46793; PE-공액 마우스 단일 클론, #ab58754), R&D systems (Alexa Fluor®-공액 래트(rat) 단일 클론, #FAB6l27 S; PE- 공액 마우스 단일 클론, #FAB3660P). 인간 CD10에 결합할 수 있는 항체의 예는 제한 없이 하기 공급업자로부터 수득 가능한 것들을 포함한다("＃"는 카탈로그 번호를 나타낸다): BD Biosciences (PE-공액 마우스 단일 클론 항체, #555375), Abeam (토끼 단일 클론, #ab79423; 토끼 다클론, #ab82073; PE-공액 마우스 단일 클론, #ab2l0380), R&D systems (Alexa Fluor®-공액 마우스 단일 클론, #FAB1182N; 비오틴일화 염소 다클론, #BAFl182). 친화성 기반 검정법, 이러한 면역 검정법은 제한 없이 면역 조직 화학, 면역 세포 화학, 유세포 분석, 질량 세포 분석, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 형광 현미경 검사, 마이크로유체 시스템을 이용한 형광 기반 세포 분류, 친화성 크로마토그래피와 같은 (면역)친화성 흡착 기반 기술, 마이크로유체 시스템을 이용한 자기 활성화 세포 분류 또는 비드 기판 세포 분류, 면역 침강, 효소 결합 면역 흡착 검사(ELISA) 및 ELISPOT 기반 기술, 방사 면역 측정(RIA), 웨스턴 블롯, 등을 포함한다.
펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 검출하고/하거나 정량화하기 위한 추가 기술은 임의로 상기에 기재한 분석법 중 어느 것과 함께 사용될 수 있다. 이러한 방법은 제한 없이 질량 분광(MS) 기술, 화학 추출 분별, 모세관 등전점 전기영동(CIEF), 모세관 등속 전기영동(CITP), 모세관 전기 크로마토그래피(CEC) 등을 포함한 등전점 전기영동(IEF), 일차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 이차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2D-PAGE), 모세관 겔 전기영동(CGE), 모세관 존 전기영동(CZE), 미셀 동전 크로마토그래피(MEKC), 자유 유동 전기영동(FFE), 등을 포함한다.
예컨대 RNA 수준에서(예를 들어, hnRNA, pre-mRNA, mRNA, 또는 cDNA의 수준에서) 핵산의 존재 또는 부재 및/또는 수량은 본 기술에서 공지된 표준 정량 RNA 또는 cDNA 측정 기구를 이용하여 검출될 수 있다. 비제한적인 예는 혼성화 기반 분석, 마이크로어레이(microarray) 발현 분석, 디지탈 유전자 발현(DGE), RNA 계내 혼성화(RISH), 노던 블롯 분석 등; PCR, RT-PCR, RT-qPCR, 종말점 PCR, 디지탈 PCR 등; 지지된 올리고뉴클레오티드 검출, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 합성에 의한 폴로니 사이클릭 시퀀싱(polony cyclic sequencing), 동시 양방향 시퀀싱, 단일 분자 시퀀싱, 단일 분자 실시간 시퀀싱, 정확한(true) 단일 분자 시퀀싱, 혼성화 보조 나노세공 시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 등을 포함한다.
추가 예에서, 본원에서 논의된 것과 같은 방법의 임의 조합이 채용될 수 있다.
특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 나타내며 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 발현은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상 각각의 세포 표면 발현을 나타낸다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질의 세포 표면 발현은 바람직하게는 유세포 분석에 의해 판정된다.
특별한 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 따라서, (a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 하나를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하고, 바람직하게는 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 둘을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하며, 더 바람직하게는 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 셋을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하고, 가장 바람직하게는 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하고/하거나 (a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나의 양을 측정하고, 바람직하게는 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 둘의 양을 측정하며, 더 바람직하게는 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 본원에서 교시된 방법이 또한 본원에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
(a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 측정하는 단계;
(b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계;
(b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
(c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차(no deviation)를 찾는 단계;
(c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
(d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
(a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 양을 측정하는 단계;
(b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계;
(b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
(c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차(no deviation)를 찾는 단계;
(c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105, CD44 또는 CD10의 어느 하나(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
(d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율의 측정 및/또는 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양의 측정은 유세포 분석, 질량 세포 분석, 형광 활성화 세포 분류, 형광 현미경 검사, 친화성 분리, 자기 세포 분리, 마이크로유체 분리, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 기술을 이용하여 수행된다.
유세포 분석은 세포 집단의 개별 세포가 좁은 스트림에서 일렬 종대로 레이저 빔을 통과할 때 이들의 광학 특성(예를 들어, 흡광도, 광산란 및 형광 특성, 등)에 의해 분석되는 방법을 포함한다. 유세포 분석 방법은 특별한 광학 특성을 가진 세포의 집단이 다른 세포로부터 분리되는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법을 포함한다.
원소 질량 분광 기반 유세포 분석, 또는 질량 분광은 형광 색소 표지 결합 시약을 질량 태그된(tagged), 즉 정의된 질량을 가진 원소 또는 동위 원소로 태그된 결합 시약으로 대체함으로써 세포를 분석하는 수단을 제공한다. 이들 방법에서, 표지된 입자가 질량 세포 측정기로 도입되며, 여기서 이들은 개별적으로 원자화 되고 이온화 된다. 그 후 개별 입자를 원소 분석 처리하며, 원소 분석에서 사용된 다수의 질량 태그를 확인하고 측정한다. 그 후 각 입자와 연관된 동위 원소의 동일성(identities)과 양을 저장하고 분석한다. 원소 분석의 해상도(resolution)와 사용될 수 있는 원소 동위체의 수로 인해, 단일 입자에 대한 100개 이상의 파라미터까지 동시에 측정할 수 있다.
형광 현미경 검사는 세포 집단의 개별 세포가 이들의 형광 특성에 의해 현미경적으로 분석되는 방법을 광범위하게 포함한다. 형광 현미경 검사 수단은 수동으로 또는 바람직하게는 반자동화 또는 자동화될 수 있다.
친화성 크로마토그래피로서도 지칭된 친화성 분리는 이동 상, 예컨대 적합한 액상에 존재한 세포(예를 들어, 수성 현탁액 내 세포 집단)의 정지 상, 예컨대 적합한 고상과 특이 상호작용 및 이로써 이에 대한 세포의 흡착; 이어서 나머지 이동 상으로부터 정지 상의 분리; 및 정지 상으로부터 흡착된 세포의 회수(예를 들어, 용출)를 포함한 기술을 광범위하게 포함한다. 친화성 분리는 칼럼형일 수 있거나, 대안으로 배치 처리를 수반할 수 있으며, 여기서 정지 상은 적합한 기술, 예컨대 원심분리 또는 자기장의 적용(예를 들어, 정지 상이 자성 기질(substrate), 예컨대 자성 입자 또는 비드를 포함한다)에 의해 액상으로부터 수집/분리된다. 이에 따라, 자기 세포 분리도 본원에서 예상된다.
마이크로유체 시스템은 정확하고 높은 처리량의 세포 검출, 정량화 및/또는 분류를 가능하게 하여, 다양한 물리적 원리를 활용한다. 마이크로칩 상의 세포 분류는 필요한 장비의 크기를 줄이고, 잠재적으로 생체 유해한 에어로졸을 제거하며, 통상 세포 분류와 연관된 복잡한 프로토콜을 단순화함으로써 다수 이점을 제공한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "마이크로유체 시스템"은 하나 이상의 유체 마이크로채널을 가진 시스템을 광범위하게 나타낸다. 마이크로채널은 가장 큰 단면 치수가 전형적으로 1 mm 미만, 바람직하게는 500 μm 미만, 더 바람직하게는 400 μm 미만, 더 바람직하게는 300 μm 미만, 더 바람직하게는 200 μm 미만, 예를 들어, 100 μm 이하인 유체 채널을 나타낸다. 이러한 마이크로유체 시스템은 유체 및/또는 물체 예컨대 소적, 기포, 캡슐, 입자, 셀 등을 다루는데 사용될 수 있다. 마이크로유체 시스템은 예를 들어 형광 표지 기반(예를 들어, 형광 색소 분자 공액 결합제(들), 예컨대 형광 색소 분자 공액 항체(들)을 채용), 비드 기판(예를 들어, 비드 공액 결합제(들), 예컨대 비드 공액 항체(들)), 또는 표지 없는 세포 분류(Shields et al., Lab Chip. 2015, vol. 15: 1230-1249에서 검토됨)를 허용하게 할 수 있다. 특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포의 세포 표면 상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율의 측정; 및 체외 분화 세포의 세포 표면 상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양의 측정은 유세포 분석을 이용하여 수행된다.
체외 분화 세포는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상에 대해 형광 색소(예를 들어, PE, PE-Cy 7, PE-Cy5, APC, APC-Cy7, Alexa Fluor 647®, Alexa Fluor 700®, FITC, 패시픽 블루(Pacific Blue), Alexa Fluor 488®)에 공액된 다음 특정 파장(형광 색소의 여기 파장)에서 레이저에 의해 여기시켜 다양한 파장(형광 색소의 방출 파장)에서 발광하는 항체를 이용하여 표지될 수 있다. 예를 들어, 체외 분화 세포는 CD105에 대해 알로피코시아닌(APC)-공액 항체(BD Biosciences®, Cat N°: 562408), CD73에 대해 APC-공액 항체(BD Biosciences®, Cat N°:560847), CD10에 대해 피코에리트린(PE)-공액 항체(BD Biosciences®, Cat N°: 555375) 및/또는 CD44에 대해 PE-공액 항체(BD Biosciences®, Cat N°: 550989)를 사용하여 표지될 수 있다. 통상의 기술자는 레이저의 파장과 항체를 표지하는데 사용된 형광 색소의 파장이 양립하여야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, FITC에 대한 여기 파장은 488nm이고 방출 파장은 500-560 nm이며; PE에 대한 여기 파장은 488-561 nm이고 방출 파장은 560-595 nm이다. CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 초과의 존재 또는 수량은 서로 다른 파장에서 서로 다른 광을 방출하는 서로 다른 형광 색소에 각각 공액되어 있는 항체를 사용함으로써 동시에 측정될 수 있다.
대부분의 세포는 자연적으로 형광을 방출하지 않는다. 이에 따라, 형광 색소 공액 항체가 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상에 결합되는 경우, 그 세포가 유세포 분석기의 레이저 빔을 통과할 때 형광 신호가 수신될 것이다. 유세포 분석에 사용된 형광 색소 공액 항체 각각에 대해 양성 컷오프가 설정될 수 있다. 예를 들어, 양성 컷오프는 대조 아이소타이프(isotype) 항체의 양성의 1%에서 설정될 수 있다.
체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 양은 체외 분화 세포에 의해 방출된 형광 신호의 평균 또는 중간 강도로서 표시될 수 있다. 형광 신호의 평균 또는 중간 강도는 분석된 전체 세포 집단(즉 형광 신호를 방출하지 않았던 세포를 포함)의 각 세포에 대해 검출된 형광 신호로부터 결정된다. 더 구체적으로는, 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 양은 정규화 중간 형광 강도(nMFI)에 의해 표시될 수 있다. 정규화 nMFI는 전형적으로 하나 이상의 형광 색소 공액 항체로 표지된 분석된 전체 세포 집단의 MFI를 음성 대조(예를 들어, 하나 이상의 형광 색소 공액 아이소타이프 대조 항체, 예컨대 FITC, APC 및 PE와 공액된 면역글로불린 G(IgG) 대조로 표지된 세포)의 MFI로 나눔으로써 결정된다.
본원에서 사용된 "정규화 중간 형광 강도" 또는 "nMFI"는 하나 이상의 형광 색소 공액 항체로 표지된 분석된 전체 세포 집단의 MFI(MFImarker _channel) 대 하나 이상의 형광 색소 공액 아이소타이프 대조 항체, 예컨대 FITC, APC 또는 PE와 같은 형광 색소와 공액된 면역글로불린 G(IgG) 대조로 표지된 세포 집단의 MFI(MFIisotype_channel)의 비율을 나타낸다. nMFI 결과는 관심있는 집단의 세포 표면상에 존재한 마커의 양에 비례한다. (n)MFI는 전형적으로 형광 신호의 방출이 측정되는 파장에 연관된다. 예를 들어, 여기 파장은 FITC에 대해 488 nm, PE에 대해 488 nm 및 APC에 대해 633 nm일 수 있다. 예를 들어, 방출 파장은 FITC에 대해 530 nm, PE에 대해 580 nm 및 APC에 대해 660 nm일 수 있다.
유세포 분석기는 레이저를 통과하는 표지된 체외 분화 세포의 총수 및 뿐만 아니라 특정 파장에서 발광하는 표지된 체외 분화 세포의 수를 셀 수 있다. 이러한 정보는 양성 형광 세포의 퍼센트(PPFC)로서도 알려진, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 양, 바람직하게는 분율을 판정하는데 사용될 수 있다.
체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 존재 또는 양을 측정하기 전에 관심있는 세포의 집단이 이들의 전방 및 측면 산란 특성을 기준으로, 예를 들어 게이팅 전략에 의해 다른 세포 또는 잔해로부터 구분될 수 있다.
유세포 측정 데이터 분석은 고정된 수의 검출된 이벤트(events)(예를 들어, 유세포 분석기의 레이저를 통과하는 다수 세포)에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, 유세포 측정 데이터 분석은 게이팅된 세포 집단의 10000 이벤트에 대해 수행될 수 있다.
유세포 분석은 본 기술에 공지된 임의의 세포 측정기를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, FACS CantoII (BD Biosciences®)를 이용한다.
유세포 측정 데이터 분석은 본 기술에서 공지된 임의의 유세포 측정 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, FACS Diva® 8.0 소프트웨어 (BD Biosciences®). 특별한 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (b1) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 기준 값 또는 컷오프 값과 비교하고 (b2) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 기준 값 또는 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함한다. 따라서, (b1) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 기준 값 또는 컷오프 값과 비교하고 (b2) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 기준 값 또는 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함하는 본원에서 교시된 방법이 또한 본원에서 제공된다.
더 특별한 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (b1) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하고/하거나 (b2) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함한다. 따라서, (b1) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하고/하거나 (b2) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함하는 본원에서 교시된 방법이 또한 본원에서 제공된다.
더 특별한 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (b1) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하고/하거나 (b2) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두)의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (b1) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하고/하거나 (b2) 본원에서 다른 곳에서 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두)의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 나타내는 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함한다.
공지된 골형성능을 가진 세포는 특정 정도의 골형성능(예를 들어, 골형성능 무, 낮은 골형성능, 높은 골형성능 또는 원하는 정도의 골형성능)을 가진 것으로 알려진 세포일 수 있다.
골형성능 정도는 형성된 골 기질의 양으로서 및/또는 체외 또는 체내 골 기질 형성 비율에 의해 표현될 수 있다. 골 기질의 양 및/또는 골 기질 형성 비율은 본 기술에 공지된 임의 방법, 예컨대 골 조직학, 조직학(예를 들어, 콜라겐 I, 마슨의 삼색 골드너) 및 면역 형광(예를 들어, 콜라겐 I, 테트라사이클린 골 표지)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 새로 석회화된 골의 두께, 신형성 골의 표면적, 또는 적어도 하나의 석회화된 결절의 존재는 피하 주사에 의한 세포의 마우스로 투여 후 체내에서 평가될 수 있다.
세포의 골형성능의 정도는 이러한 세포의 골형성 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 인간 체외 분화 세포의 골형성 활성은 예를 들어 두개관 위에 피하 주사에 의한 세포의 마우스로 투여 후 적어도 하나의 석회화 결절(예를 들어, 인간 또는 혼합된 인간-뮤린 유래의)의 존재를 판정함으로써 체내에서 측정될 수 있다. 인간 체외 분화 세포의 골형성 활성은 예를 들어 두개관 위에 피하 주사에 의한 세포의 마우스로 투여 후 새로 석회화된 결절(예를 들어, 인간 또는 혼합된 인간-뮤린 유래의)의 두께를 평가하거나, 대퇴부 구역 아임계 크기 결함(sub-CSD)의 마우스 모델에서 골 수복의 정도를 평가함으로써 체내에서 측정될 수 있다.
예를 들어, 인간 세포의, 예컨대 100 μl의 부형제에 제제화된 2.5 x 106 세포의 양을 두개관 골 위에 1회 피하 투여에 의해 누드 마우스에 투여할 수 있다. 시간 경과에 따라 골 신형성을 표시하기 위해, 알리자린 레드(적색), 칼세인(녹색), 칼세인(청색) 및 테트라사이클린(황색)과 같은 칼슘 결합 형광 색소를 각각 세포의 세포 투여 3일 전 및 4, 8, 및 12일 후에 복강 내 주사로 마우스에 연속으로 투여할 수 있다. 세포 투여 2주 후에 마우스를 안락사시킬 수 있으며 각 마우스의 두개관을 적출하여 조직학(예를 들어, 골 형성의 정량화)에 의해 골 형성 특성을 평가할 수 있다. 두개관의 초기 및 최종 두께를 사용하여 세포의 투여에 이어서 신 골형성의 퍼센트를 산출할 수 있다. 또한, 골 형성 특성을 또한 면역 형광에 의해 평가할 수 있다(예를 들어, 골 형성의 뮤린 또는 인간 유래). ALP 효소 활성 검출법을 이용하여 두개관 절편 상에서 골아세포 활성을 평가할 수 있다. TRAP 효소 활성 검출법을 이용하여 두개관 절편 상에서 파골 세포 활성을 평가할 수 있다. 예를 들어 상용 키트(예를 들어, Bio-Optica®)를 사용한 ALP로 염색된 두개관 절편 상에서 마슨 삼색 골드너 염색을 이용하여 신형성된 골의 석회화 상태를 평가할 수 있다. 두개관 시상 파라핀 단면상에서 사프라닌-오렌지 염색을 이용하여 연골 형성을 평가할 수 있다.
추가 예에서, 마우스를 대퇴부 구역 아임계 크기 결함으로 처리한 1일 후에 경피 주사로 골 결함 부위에 국소로 예컨대 50 μl의 부형제에 제제화된 1.25 x 106 세포의 인간 체외 분화 세포를 투여할 수 있다. 골 수복을 X-선 이미지화에 의해 정량화할 수 있다. 골 결함의 두 가장자리 사이 거리를 측정함으로써 골 결함 크기를 정량화할 수 있다.
특별한 실시형태에서, 공지된 골형성능을 가진 세포는 석회화 연골 기질의 필요 없이 주형으로서 골 기질을 형성한다고 알려진 세포(예를 들어, 막내 골화에 의해 골을 형성한다고 알려진 세포) 또는 처음에 석회화 연골 기질을 형성한 다음 골 조직 형성을 위한 주형으로서 상기 석회화 연골 기질을 이용함으로써 골 기질을 형성한다고 알려진 세포(예를 들어, 연골내 골화에 의해 골을 형성한다고 알려진 세포)일 수 있다. 골 형성의 종류(예를 들어, 연골내 골화 또는 막내 골화)는 본 기술에서 알려진 임의 방법, 예컨대 골 조직학, 조직학(예를 들어, 콜라겐 I, 마슨의 삼색 골드너, 사프라닌-오렌지, SOX9, 콜라겐 II형) 및 면역 형광(예를 들어, 콜라겐 I, 테트라사이클린 골 표지, 콜라겐 II형)에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 다른 곳에서 기재된 피하 주사에 의한 세포의 마우스로 투여 후 적어도 하나의 석회화 결절의 존재는 골 기질이 연골내 골화에 의해 형성된다는 것을 나타낼 수 있다.
특별한 실시형태에서, 공지된 골형성능을 가진 세포는 연골내 골화에 의해 골을 형성한다고 알려진 세포이다. 예를 들어, 공지된 골형성능을 가지는 세포는 피하 주사에 의한 세포의 마우스로 투여 후 인간 유래의 적어도 하나의 석회화 결절을 체내에서 형성하는 인간 세포일 수 있으며, 바람직하게는 피하 주사는 두개관 골 위에서 수행된다.
특별한 실시형태에서, 공지된 골형성능을 가진 세포는 대조 세포(예를 들어, 골형성능이 없는 세포 또는 골형성능이 낮은 세포) 또는 부형제가 예를 들어 피하 주사에 의해 마우스에 투여될 때 관찰된 골 형성에 대해, 예를 들어 피하 주사에 의한 세포의 마우스로 투여 후 적어도 약 20%(약 1.2 배 이상)로, 또는 적어도 약 30%(약 1.3 배 이상)로, 또는 적어도 약 40%(약 1.4 배 이상)로, 또는 적어도 약 50%(약 1.5 배 이상)로, 또는 적어도 약 60%(약 1.6 배 이상)로, 또는 적어도 약 70%(약 1.7 배 이상)로, 또는 적어도 약 80%(약 1.8 배 이상)로, 또는 적어도 약 90%(약 1.9 배 이상)로, 또는 적어도 약 100%(약 2 배 이상)로 체내 골 형성(예를 들어, 인간 유래의) 증가를 보여주는 세포(예를 들어, 인간 세포)이며, 바람직하게는 피하 주사는 두개관 골 위에서 수행된다. 예를 들어, 공지된 골형성능을 가진 세포와 동일한 공여자로부터 얻어진 미분화 MSC는 대조 세포로서 사용될 수 있다.
골형성능이 낮다고 알려진 세포의 비제한적인 예는 다음과 같이 얻어진 체외 분화 MSC 유래 세포(본원에서 "세포산물 A" 또는 "골형성 세포 A"로서 지칭됨)를 포함한다: 골수 백혈구를 배양 배지에 50,000 세포/cm2의 밀도에서 파종하고, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양한다. 세포 파종 4일 후, 비접착 세포를 제거하고 배지를 5% 옥타세룸(Octaserum)(50:50 자기 혈청 및 OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix), TGFβ-1 (Humanzyme)로서 보충된 종래 배양 배지로 바꾼다. 파종 7일 및 11일 후, 배양 배지의 반을 제거하고 새로운 것으로 대체한다. 세포를 14일간 일차 배양 동안 배양한다. 14일째에 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링(swirling) 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 1: P1). 배양 배지, 10% 옥타세룸(50:50 자기 혈청 및 OctaPlasLG® (Octapharma), 10% DMSO)을 포함하는 동결 배지에 중간 세포를 동결 보전하고 액체 질소에 저장한다. 이차 배양을 위해, 세포를 해동하고 1144 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅한다(re-plated). 14일간 이차 배양 동안 세포를 배양한다. 28일째에, 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 2: P2). 최종 세포산물을 얻기 위해, 25 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 예를 들어 OctaPlasLG®에 세포를 재현탁한다. 이 세포산물을 본원에서 "세포산물 A" 또는 "골 형성 세포 A"로서 지칭한다.
골형성능이 높다고 알려진 세포의 비제한적인 예는 다음과 같이 얻어진 체외 분화 MSC 유래 세포(본원에서 "세포산물 B" 또는 "골형성 세포 B"로서 지칭됨)를 포함한다: 골수 백혈구를 5% OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 Ul/ml Heparin (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix), TGFfL 1 (Humanzyme)를 포함하는 종래 배양 배지에 50,000 세포/cm2의 밀도에서 파종하고, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양한다. 세포 파종 4일 후, 비접착 세포를 제거하고 배지를 배양 배지로 바꾼다. 파종 7일 및 11일 후, 배양 배지의 반을 제거하고 새로운 것으로 대체하여 성장 인자를 바꾼다. 세포를 14일간 일차 배양 동안 배양한다. 14일째에 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 1: P1). 중간 세포를 동결 보전하고(예를 들어, CryoStor® CS10 (BioLife Solutions)에서) 액체 질소에 저장한다. 다음에, 이차 배양을 위해, 중간 세포를 해동하고 286 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅한다. 14일간 이차 배양 동안 세포를 배양한다. 28일째에, 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 2: P2). 최종 세포산물을 얻기 위해, 25 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 예를 들어 OctaPlasLG®에 세포를 재현탁한다. 이 세포산물을 본원에서 "세포산물 B" 또는 "골 형성 세포 B"로서 지칭한다.
특별한 실시형태에서, 공지된 골형성능을 가진 세포는 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포이다.
특정 실시형태에서, (b1)의 컷오프 값 및/또는 (b2)의 상기 각각의 컷오프 값은 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값일 수 있다.
세포의 골형성능과 관련하여 사용될 때 용어 "임상적으로 유용한"은 피험체에 세포의 이식 시 피험체에 치료학적으로 의미 있는, 예컨대 근골격 질환 또는 골 관련 장애를 앓고 있는 피험체와 같은 피험체에 임상적으로 관계있는 이점을 제공하는 양으로 및/또는 메커니즘(예를 들어, 연골내 골화 또는 막내 골화)에 의해 세포가 골 기질을 형성하게 하는 세포의 골형성능 정도를 나타낸다.
특정 실시형태에서, 적어도 50%의 동물들(예, 뮤린)이 두개관 위에 피하 주사에 의해 동물(예를 들어, 뮤린)에게 세포의 투여 후 석회화 결절(예를 들어, 인간 또는 혼합된 인간-뮤린 유래의)을 형성하는 경우, 체외 분화 세포는 임상적으로 유용한 골형성능을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90, 또는 적어도 95%의 동물들(예, 뮤린)이 두개관 위에 피하 주사에 의해 동물(예를 들어, 뮤린)에게 세포의 투여 후 석회화 결절(예를 들어, 인간 또는 혼합된 인간-뮤린 유래의)을 형성하는 경우, 체외 분화 세포는 임상적으로 유용한 골형성능을 가질 수 있다.
근골격 질환의 비제한적인 예는 국소 또는 전신 장애, 예컨대 임의 유형의 골다공증 또는 골감소증, 예를 들어, 원발성, 폐경 후, 노인성, 코르티코이드 유발, 비스포스포네이트 유발 및 방사선 요법 유발; 임의의 속발성, 단일 또는 다중 부위 골괴사; 임의 유형의 골절, 예를 들어, 유착 불능, 변형 치유, 지연된 유착 골절 또는 압박, 상악 안면 골절; 골 유착이 필요한 상태(예를 들어, 척추 고정 및 재건); 선천성 골 결손; 골 재건, 예를 들어, 외상성 손상 또는 암 수술 후 및 두개 안면 골 재건; 외상성 관절염, 국소 연골 및/또는 관절 결함, 국소 퇴행성 관절염; 골관절염, 퇴행성 관절염, 변형성 슬관절염 및 변형성 고관절염; 골 형성 불완전; 골 용해성 골암; 파젯병(Paget's disease); 내분비 장애; 저인산혈증; 저칼슘혈증; 신장 골이영양증; 골연화증; 무력성 골 질환, 부갑상선 기능 항진증, 원발성 부갑상선 기능 항진증, 이차 부갑상선 기능 항진증; 치주 질환; 고함-스타우트병(Gorham-Stout disease) 및 맥쿤-올브라이트 증후군(McCune-Albright syndrome); 류머티스성 관절염; 강직성 척추염, 건선성 관절염, 장 질환성 관절 병증 및 미분화 척추 관절염 및 반응성 관절염을 포함하는 척추 관절 병증; 전신성 홍반성 낭창 및 관련 증후군; 경피증 및 관련 장애; 쇼그렌 증후군; 거대 세포 동맥염 (호튼 병), 타카야수 동맥염, 류마티스성 다발 근통, ANCA 관련 혈관염 (예컨대 베게너 육아 종증, 현미경 다발 혈관염, 처그-스트라우스 증후군), 베체트 증후군, 및 기타 다발 동맥염과 관련 장애(예컨대 결절성 다발 동맥염, 코건 증후군 및 버거병)를 포함한 전신 혈관염; 아밀로이드증 및 유육종증을 포함한 기타 전신 염증성 질환을 수반하는 관절염; 통풍, 피로인산 칼슘 이수화물 질환, 인산칼슘 또는 옥살산 칼슘 결정의 관절 침착과 관련된 장애 또는 증후군을 포함하는 결정 관절 병증; 연골 석회증 및 신경 병성 관절 병증; 펠티 증후군 및 라이터 증후군; 라임 병과 류마티스 열을 들 수 있다.
제한은 아니지만 예로서, 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포의 이식으로부터 이익을 얻을 수 있는 골 관련 장애는 국소 또는 전신 장애, 예컨대 임의 유형의 골다공증 또는 골감소증, 예를 들어 원발성, 폐경 후, 노인성, 코르티코이드 유발, 임의의 속발성, 단일 또는 다중 부위 골괴사, 임의 유형의 골절, 예를 들어, 유착 블능, 변형 치유, 지연된 유착 골절 또는 압박, 골 유착이 필요한 상태 (예를 들어, 척추 고정 및 재건), 상악 안면 골절, 골 재건, 예를 들어, 외상성 손상 또는 암 수술 후, 두개 안면 골 재건, 골 형성 불완전, 골 용해성 골암, 파젯병, 내분비 장애, 저인산혈증, 저칼슘혈증, 신장 골이영양증, 골연화증, 무력성 골 질환, 류마티스성 관절염, 부갑상선 기능 항진증, 원발성 부갑상선 기능 항진증, 이차 부갑상선 기능 항진증, 치주 질환, 고함-스타우트병 및 멕쿤-올브라이트 증후군을 들 수 있다.
공지된 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포의 비제한적인 예는 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 얻어진 "세포산물 B" 또는 "골형성 세포 B"를 포함한다. 공지된 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포의 비제한적인 추가 예는 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 얻어진 "세포산물 C" 또는 "골형성 세포 C"를 포함한다.
특별한 실시형태에서, 공지된 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포는 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 얻어진 "세포산물 B" 또는 "골형성 세포 B"이다. 특별한 실시형태에서, 공지된 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포는 "세포산물 C-동결" 또는 "골형성 세포 C 동결(보존)"을 포함하여, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 얻어진 "세포산물 C" 또는 "골형성 세포 C"이다.
특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 양에 대한 기준치는 기준 세포(예를 들어, 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포)에서 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 각각 발현하는 체외 분화 세포의 양을 판정함으로써 결정될 수 있으며, 이로써 기준치를 생성할 수 있다. 유사하게도, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양에 대한 기준치는 기준 세포(예를 들어, 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포)에서 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 판정함으로써 결정될 수 있으며, 이로써 기준치를 생성할 수 있다.
하나 이상의 기준 세포 유형으로부터 얻어진 하나 이상의 기준치는 세포의 어느 정도의 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 제공하도록 본 기술에 일반적으로 공지된 역치 또는 컷오프 값을 결정하는데 사용될 수 있다.
특별한 실시형태에서, (b1) 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양(또는 분율)을 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값과 비교하고/하거나 (b2) 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양을 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값과 비교하는 데 있어서 기준치 또는 컷오프 값은 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값이다.
광범위 연구에 의해, 본 발명자들은 골형성능이 있는 체외 분화 세포의 세포 집단, 특히 높은 골형성능을 가지며 연골내 골화에 의해 체내 골 기질을 형성하는 체외 분화 세포의 세포 집단 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현한다는 사실을 밝혔다. 또한, 이들 체외 분화 세포도 MSC에서 CD73, CD44 및 CD105의 양에 비해 각각 증가된 양의 CD73 및/또는 CD44 및 감소된 양의 CD105를 발현한다.
이에 따라, 특별한 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (c1) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양(또는 분율)의 편차 또는 무 편차를 찾고/찾거나 (c2) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나, 바람직하게는 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양의 편차 또는 무 편차를 찾으며, (d) 단계 (c1) 및/또는 (c2)에서 찾은 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능의 특별한 판정으로 귀착시키는 단계를 포함한다. 따라서, (c1) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 양(또는 분율)의 편차 또는 무 편차를 찾고/찾거나 (c2) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양의 편차 또는 무 편차를 찾으며, (d) 단계 (c1) 및/또는 (c2)에서 찾은 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능의 특별한 판정으로 귀착시키는 단계를 포함하는 본원에서 교시된 방법이 또한 본원에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (c1) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양(또는 분율)의 편차 또는 무 편차를 찾고/찾거나 (c2) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나(예를 들어, 1, 2 또는 3 모두), 바람직하게는 CD73, CD105 및 CD44 모두의 양의 편차 또는 무 편차를 찾으며, (d) 단계 (c1) 및/또는 (c2)에서 찾은 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능의 특별한 판정으로 귀착시키는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 (c1) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양(또는 분율)의 편차 또는 무 편차를 찾고/찾거나 (c2) 공지된 골형성능을 가진 세포를 대표하는 기준치 또는 컷오프 값으로부터 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 또는 CD10의 어느 하나(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4 모두), 바람직하게는 CD73, CD105, CD44 및 CD10 모두의 양의 편차 또는 무 편차를 찾으며, (d) 단계 (c1) 및/또는 (c2)에서 찾은 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능의 특별한 판정으로 귀착시키는 단계를 포함할 수 있다.
제2 값으로부터 제1 값의 "편차"는 일반적으로 임의 방향(예를 들어, 증가: 제1 값 > 제2 값; 또는 감소: 제1 값 < 제2 값) 및 임의의 변경 범위를 포함할 수 있다.
예를 들어, 편차는 제한 없이 비교되는 제2 값에 대해, 적어도 약 10%(약 0.9 배 이하)로, 또는 적어도 약 20%(약 0.8 배 이하)로, 또는 적어도 약 30%(약 0.7 배 이하)로, 또는 적어도 약 40%(약 0.6 배 이하)로, 또는 적어도 약 50%(약 0.5 배 이하)로, 또는 적어도 약 60%(약 0.4 배 이하)로, 또는 적어도 약 70%(약 0.3 배 이하)로, 또는 적어도 약 80%(약 0.2 배 이하)로, 또는 적어도 약 90%(약 0.1 배 이하)로 제1 값에서 감소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 편차는 제한 없이 비교되는 제2 값에 대해, 적어도 약 10%(약 1.1 배 이상)로, 또는 적어도 약 20%(약 1.2 배 이상)로, 또는 적어도 약 30%(약 1.3 배 이상)로, 또는 적어도 약 40%(약 1.4 배 이상)로, 또는 적어도 약 50%(약 1.5 배 이상)로, 또는 적어도 약 60%(약 1.6 배 이상)로, 또는 적어도 약 70%(약 1.7 배 이상)로, 또는 적어도 약 80%(약 1.8 배 이상)로, 또는 적어도 약 90%(약 1.9 배 이상)로, 또는 적어도 약 100%(약 2 배 이상)로, 또는 적어도 약 150%(약 2.5 배 이상)로, 또는 적어도 약 200%(약 3 배 이상)로, 또는 적어도 약 500%(약 6 배 이상)로, 또는 적어도 약 700%(약 8 배 이상)로, 등으로 제1 값의 증가를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 편차는 통계적으로 유의한 관찰된 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 편차는 관찰된 변화를 의미할 수 있으며, 이는 제공된 기준 세포에서 기준치의 오차 한계를 벗어난다(예를 들어, 표준 편차 또는 표준 오차로, 또는 이의 소정 배수, 예를 들어, ±lxSD 또는 ±2xSD 또는 ±3xSD, 또는 ±lxSE 또는 ±2xSE 또는 ±3xSE로 표현됨). 편차는 또한 제공된 기준 세포에서 값으로 한정된 기준 범위를 벗어나는 값을 의미할 수 있다(예를 들어, 제공된 기준 세포에서 값의 ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥75% 또는 ≥80% 또는 ≥85% 또는 ≥90% 또는 ≥95% 또는 심지어 ≥100%를 포함하는 범위 외에).
추가 실시형태에서, 관찰된 변화가 제공된 역치 또는 컷오프를 초과하는 경우 편차를 종결할 수 있다. 예를 들어, 관찰된 변화가 제공된 역치 또는 컷오프 아래, 동일 또는 위일 경우 편차를 종결할 수 있다.
특별한 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나, 이루어진다:
(a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
(a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계;
(b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하는 단계;
(b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
(c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계;
(c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
(d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
따라서, 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나, 이루어진 본원에서 교시된 방법이 또한 제공된다:
(a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
(a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 및 CD44의 양을 측정하는 단계;
(b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하는 단계;
(b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 및 CD44의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
(c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계;
(c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 및 CD44의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
(d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
특별한 실시형태에서, 기준 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다고 알려진 세포인 것이며,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능이 없다고 알려진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 동일하거나 감소된 양 또는 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다는 것을 나타내거나;
- 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능이 없다고 알려진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 증가된 양 또는 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내고/내거나
- 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능이 없다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD44 및/또는 CD10의 동일하거나 감소된 양, 및 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD105의 동일하거나 증가된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다는 것을 나타내거나;
- 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능이 없다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD44 및/또는 CD10의 증가된 양, 및 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD105의 동일하거나 증가된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내며,
바람직하게는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 발현은 세포 표면상에 각각 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 발현을 나타내는 것이다.
특별한 실시형태에서, 기준 세포는 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있는 것으로 알려진 세포인 것이며,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 감소된 양 또는 분율은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능을 가지지 않은 것을 나타내거나,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 동일하거나 감소된 양 또는 분율은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내고/내거나;
- 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD44 및/또는 CD10의 어느 하나의 감소된 양, 및/또는 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD105의 증가된 양은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능을 가지고 있지 않다는 것을 나타내거나,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD44 및/또는 CD10의 동일하거나 증가된 양, 및 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비료하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 세포 분화 세포에 의해 발현된 CD105의 동일하거나 감소된 양은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내며,
바람직하게는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 발현은 세포 표면상에 각각 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 발현을 나타내는 것이다.
특별한 실시형태에서, 기준 세포는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다고 알려진 세포인 것이며,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화세포에 의해 발현된 CD10의 동일하거나 감소된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다는 것을 나타내거나;
- 본원에서 다른 곳에 기재된 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있지 않다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10의 증가된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내며,
바람직하게는 CD10의 발현은 세포 표면상에 CD10의 발현을 나타내는 것이다.
특별한 실시형태에서, 기준 세포는 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포인 것이며,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10의 감소된 양은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능을 가지고 있지 않다는 것을 나타내거나,
- 본원에서 다른 곳에 기재된 원하는 골형성능을 가지고 있다고 알려진 세포를 대표하는 각각의 컷오프 값과 비교하여 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10의 동일하거나 증가된 양은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내며,
바람직하게는 CD10의 발현은 세포 표면상에 CD10의 발현을 나타내는 것이다.
특정 실시형태에서는
- (b1)의 컷오프 값과 비교하여 (a1)에서 측정된 체외 분화 세포의 동일하거나 증가된 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내며;
- (b2)의 각각의 컷오프 갓과 비교하여 (a2)에서 측정된 CD73, CD44 및/또는 CD10의 동일하거나 증가된 양, 및 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교하여 (a2)에서 측정된 CD105의 동일하거나 감소된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지고 있다는 것을 나타내는 것인, 본원에서 교시된 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 정규화 중간 형광 강도(nMFI), 100의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 40의 CD10에 대한 nMFI이다. 특정 실시형태에서, (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 50의 CD10에 대한 nMFI이다.
특정 실시형태에서, (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 정규화 nMFI, 150의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 40의 CD10에 대한 nMFI이다. 특정 실시형태에서, (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 정규화 nMFI, 150의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 50의 CD10에 대한 nMFI이다.
특정 실시형태에서, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양이 측정된다. 특정 실시형태에서, (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI 및 150의 CD105에 대한 nMFI이다.
특정 실시형태에서, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 및 CD10의 양이 측정된다. 특정 실시형태에서, (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및 40의 CD10에 대한 nMFI이다. 특정 실시형태에서, (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 150의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및 40의 CD10에 대한 nMFI이다. 특정 실시형태에서, (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및 40의 CD10에 대한 nMFI이다. 특정 실시형태에서, (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 150의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및 50의 CD10에 대한 nMFI이다.
특별한 실시형태에서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b1)의 컷오프 값은 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 0%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%; 96%; 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 90%이며, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상의 발현은 세포 표면상에 각각 CD73, CD105, CD10 또는 CD44의 발현을 나타내는 것이다. 따라서, CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b1)의 컷오프 값은 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 체외 분화 세포의 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%; 96%; 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 90%이며, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두의 발현은 세포 표면상에 각각 CD73, CD105, CD10 및 CD44의 발현을 나타내는 것이 본원에서 제공된다. 특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%; 96%; 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 90%, 또는 그 이상이 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상, 바람직하게는 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 경우, 체외 분화 세포는 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가진다. 따라서, 체외 분화 세포의 약 90% 이상이 CD73, CD105, CD10 및 CD44 모두를 발현하는 경우, 체외 분화 세포는 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 것이 또한 본원에서 제공된다.
특별한 실시형태에서, 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 및/또는 CD10 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 또는 900의 nMFICD73, 바람직하게는 500의 nMFICD73, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 또는 350의 nMFICD44, 바람직하게는 100의 nMFICD44, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110 또는 100의 nMFICD105, 바람직하게는 150의 nMFICD105, 및/또는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60의 nMFICD10, 바람직하게는 50의 nMFICD10이며; 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
따라서, 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 또는 900의 nMFICD73, 바람직하게는 500의 nMFICD73, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 또는 350의 nMFICD44, 바람직하게는 100의 nMFICD44 및 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110 또는 100의 nMFICD105, 바람직하게는 150의 nMFICD105이며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이 또한 본원에서 제공된다.
특정 실시형태에서, 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 및 CD10 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 또는 900의 nMFICD73, 바람직하게는 500의 nMFICD73, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 또는 350의 nMFICD44, 바람직하게는 100의 nMFICD44, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110 또는 100의 nMFICD105, 바람직하게는 150의 nMFICD105 및 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60의 nMFICD10, 바람직하게는 50의 nMFICD10이며; 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특별한 실시형태에서, 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 10, 15, 20, 25, 또는 30의 nMFICD10, 바람직하게는 20의 nMFICD10이다. 특별한 실시형태에서, 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD10의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 40, 45, 50, 55, 또는 60의 nMFICD10, 바람직하게는 40의 nMFICD10; 더 바람직하게는 50의 nMFICD10; 더욱더 바람직하게는 60의 nMFICD10이다. 바람직하게는, nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정된다.
본원에서 사용된 설명 "CD73에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD73"은 CD73(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°:560847)에 대해 APC-공액 항체로 표지된 분석된 전체 세포 집단의 MFI 대 APC(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 555751)와 공액된 IgG 대조로 표지된 세포 집단의 MFI의 비율을 나타낸다. 바람직하게는, nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정된다.
본원에서 사용된 설명 "CD44에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD44"는 CD73(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 550989)에 대해 PE-공액 항체로 표지된 분석된 전체 세포 집단의 MFI 대 PE(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 556650)와 공액된 IgG 대조로 표지된 세포 집단의 MFI의 비율을 나타낸다. 바람직하게는, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정된다.
본원에서 사용된 설명 "CD105에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD105"는 CD105(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 562408)에 대해 APC-공액 항체로 표지된 분석된 세포 집단의 MFI 대 APC(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 555751)와 공액된 IgG 대조로 표지된 세포 집단의 MFI의 비율을 나타낸다. 바람직하게는, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정된다.
본원에서 사용된 설명 "CD10에 대한 nMFI" 또는 "nMFICD10"은 CD10(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 555375)에 대해 PE-공액 항체로 표지된 분석된 전체 세포 집단의 MFI 대 PE(예를 들어, BD Biosciences®, Cat N°: 556650)와 공액된 IgG 대조로 표지된 세포 집단의 MFI의 비율을 나타낸다. 바람직하게는, nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정된다.
특별한 실시형태에서, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 또는 900, 바람직하게는 500, 또는 그 이상의 nMFICD73은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가진다는 것을 나타낸다.
특별한 실시형태에서, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300 또는 350, 바람직하게는 100, 또는 그 이상의 nMFICD44는 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가진다는 것을 나타낸다.
특별한 실시형태에서, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110 또는 100 바람직하게는 150 또는 그 이하의 nMFIC105는 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가진다는 것을 나타낸다.
특별한 실시형태에서, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 55, 또는 적어도 60, 바람직하게는 적어도 50의 nMFIC10은 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가진다는 것을 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정된 체외 분화 세포에 의해 발현된 500 이상의 nMFICD73, 100 이상의 nMFICD44, 및 150 이하의 nMFICD105는 체외 분화 세포가 원하는 골형성능, 바람직하게는 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 것을 나타내며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정된다는 것이다.
특별한 실시형태에서, 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 및/또는 CD10 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 500의 nMFICD73, 100의 nMFICD44, 150의 nMFICD105 및/또는 40의 nMFICD10이며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특별한 실시형태에서, 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b1)의 컷오프 값이 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 90%이고/이거나; 세포 표면상에 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105, CD44 및/또는 CD10 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능, 바람직하게는 공지의 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교한 (b2)의 컷오프 값은 500의 nMFICD73, 100의 nMFICD44, 150의 nMFICD105 및/또는 40의 nMFICD10이며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포는 다능성 줄기 세포(PS), 예컨대 포유동물 PS 및 인간 PS, 바람직하게는 인간 PS로부터 얻어지거나 유래한다.
명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "체외 분화 세포"는 세포가 한 세포형에서 또 다른 세포형으로 전이하도록 하는 적합한 조건하에 체외 배양되었던 임의 세포를 나타낸다. 세포의 분화는 원하는 세포형으로 세포의 분화를 유도할 수 있는 조건하에 MSC를 배양하는 것, 더 전형적으로는 원하는 세포형으로 세포의 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 작용제(예를 들어, 성장 인자)를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "줄기 세포"는 일반적으로 자기 재생가능하고, 즉 분화 없이 증식할 수 있으며, 세포가 또는 자손이 적어도 하나의 비교적 더 특수화된 세포형을 생성할 수 있는 미분화(unspecialized) 또는 비교적 덜 특수화되고 증식 적격인 세포를 나타낸다. 용어는 실질적으로 비제한적인 자기 재생가능한, 즉 줄기 세포의 자손 또는 적어도 그 일부가 실질적으로 미분화되거나 비교적 덜 특수화된 표현형, 분화능, 및 모줄기 세포의 증식능을 보유하는 것인 줄기 세포, 및 뿐만 아니라 제한적인 자기 재생을 나타내는, 즉 추가 증식 및/또는 분화를 위한 자손 또는 그의 일부의 능력이 모세포에 비해 확실히 줄어든 것인 줄기 세포를 포함한다. 일예로서 그리고 제한 없이, 줄기 세포는 하나 이상의 계통을 따라 분화하여 점증적으로 비교적 더 특수화된 세포를 생성하거나, 심지어 분열 종료일 수 있는, 최종 분화 세포, 즉 완전히 특수화된 세포를 생성할 수 있는 자손을 생성할 수 있으며, 여기서 이러한 자손 및/또는 점증적으로 비교적 더 특수화된 세포는 자체가 본원에서 정의된 줄기 세포일 수 있다.
mPS 세포의 정의에 제한 없이 다양한 dbgyd의 배아 줄기 세포가 포함되며, 제한 없이 예를 들어 Evans & Kaufman 1981 (Nature 292: 154-6) 및 Martin 1981 (PNAS 78: 7634-8)에 의해 기재된 뮤린 배아 줄기 세포; 예를 들어 Iannaccone et al. 1994 (Dev Biol 163: 288-292)에 의해 기재된 래트 다능성 줄기 세포; 예를 들어 Doetschman et al. 1988 (Dev Biol 127: 224-227)에 의해 기재된 햄스터 배아 줄기 세포; 예를 들어 Graves et al. 1993 (Mol Reprod Dev 36: 424-433)에 의해 기재된 토끼 배아 줄기 세포; 예를 들어 Notarianni et al. 1991 (J Reprod Fertil Suppl 43: 255-60) 및 Wheeler 1994 (Reprod Fertil Dev 6: 563-8)에 의해 기재된 돼지 다능성 줄기 세포; 예를 들어 Notarianni et al. 1991 (상기 참조)에 의해 기재된 양 배아 줄기 세포; 예를 들어 Roach et al. 2006 (Methods Enzymol 418: 21-37)에 의해 기재된 소 배아 줄기 세포; 예를 들어 Thomson et al. 1998 (Science 282: 1145-1147)에 의해 기재된 인간 배아 줄기 (hES) 세포; 예를 들어 Shamblott et al. 1998 (PNAS 95: 13726)에 의해 기재된 인간 배아 생식 (hEG) 세포; 예를 들어 Thomson et al. 1995 (PNAS 92: 7844-7848)에 의해 기재된, 붉은털원숭이(Rhesus) 줄기 세포와 같은 다른 영장류 유래 배아 줄기 세포 또는 예를 들어 Thomson el al. 1996 (Biol Reprod 55: 254-259)에 의해 기재된 마모셋 줄기 세포에 의해 예시된다.
다른 유형의 mPS 세포는 또한 이들이 배아 조직, 태아 조직 또는 다른 공급원에서 유래하였는지에 관계없이 세 배엽 모두의 유도체를 포함하는 자손을 생성할 수 있는 포유동물 기원의 임의 세포가 그렇듯이 용어에 포함된다. mPS 세포는 악성 공급원에서 유래하지 않은 것이 바람직하다. 세포 또는 세포주가 암성이 아니거나, 공지의 암 유전자로 변이되지 않은 일차 조직에서 확립된 경우 이는 "비악성 공급원" 유래이다. mPS가 적합한 조건하의 장기간 배양을 통해 정상 핵형을 유지하는 것이 바람직할 수 있다. mPS가 적합한 체외 조건하에 실질적으로 무한한 자기 재생능을 유지하는 것이 또한 바람직할 수 있지만 항상 필요한 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 수식어구 "다능성"은 유기체의 세 배엽 모두, 즉 중배엽, 내배엽 및 외배엽에서 유래하는 세포형을 생성하며, 전체 유기체로 성장할 수는 없지만 유기체의 임의 및 모든 세포형을 잠재적으로 생성할 수 있는 세포의 능력을 나타낸다.
더 특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포는 간엽 줄기 세포(MSC), 배아 줄기 세포(ESC), 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPS)로부터 얻어지거나 유래한다. 본원에서 교시된 용도 또는 방법의 더 특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포는 MSC로부터 얻어지거나 유래한다.
본원에서 사용된 용어 "간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"는 간엽 계통, 전형적으로 2 이상의 간엽 계통, 더 전형적으로 3 이상의 간엽 계통, 예를 들어, 연골-골아세포계(골 및 연골), 골아세포계(골), 연골아세포계(연골), 근세포계(근육), 건세포계(건), 섬유아세포계(결합 조직), 지방세포계(지방) 및 기질성 계통(stromogenic lineage)(수 기질)의 세포를 생성할 수 있는 성체의 중배엽 유래 줄기 세포를 나타낸다. MSC는 생물학적 샘플, 바람직하게는 인간 피험체의 생물학적 샘플, 예를 들어, 골수, 섬유주골, 혈액, 탯줄, 태반, 태난황낭, 피부(진피), 구체적으로 태아 및 미성년 피부, 골막, 치수, 건 및 지방 조직으로부터 분리될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, 유기체, 예컨대 동물 또는 인간 피험체, 세포 배양, 조직 샘플, 등으로부터 얻어진 샘플을 나타낸다. 동물 또는 인간 피험체의 생물학적 샘플은 동물 또는 인간 피험체로부터 떼 내어 그의 세포를 포함하는 샘플을 나타낸다. 동물 또는 인간 피험체의 생물학적 샘플은 하나 이상의 조직 유형을 포함할 수 있고 하나 이상의 조직 유형의 세포를 포함할 수 있다. 동물 또는 인간 피험체의 생물학적 샘플을 수득하는 방법은 본 기술에 잘 알려졌고, 예를 들어, 조직 생검 또는 채혈이다. 인간 MSC, 이들의 분리, 체외 확장, 및 분화는 미국특허 제5,486,359호; 미국특허 제5,811,094호; 미국특허 제5,736,396호; 미국특허 제5,837,539호; 또는 미국특허 제5,827,740호에 기재된 바 있다. 본 기술에 기재되고 본 기술에 기재된 임의 방법에 의해 분리된 임의의 MSC는 본 발명에 적합할 수 있다. 특히, MSC는 골아세포, 지방세포, 및 연골아세포로 체외 삼계통(trilineage) 간엽 분화를 위한 능력을 나타내는 것으로서 정의될 수 있다((Dominici et al., 2006, vol. 8, 315).
본원에서 사용된 영어 "배아 줄기 세포" 또는 "ESC"는 배아로부터, 예컨대 배반포의 내부 세포량(cell mass)으로부터 유래하며, 표준 기술 허용 시험, 예컨대 특히 SCID 뮤린에서 기형종(teratoma)을 형성하는 능력, 또는 조직 배양에서 세 배엽 모두의 확인가능한 세포를 형성하는 능력에 따라, 세 배엽 모두, 즉 내배엽, 중배엽, 및 외배엽의 유도체인 서로 다른 세포형의 자손을 적합한 조건하에 생성할 수 있는 다능성 줄기 세포를 나타낸다. 용어 "hES 세포"의 범위는 배반포기에, 또는 세포의 세 배엽으로 실질적 분화 전에 인간 배아로부터 유래하는 다능성 줄기 세포를 포함한다. ES 세포, 특히 hES 세포는 전형적으로 배반포의 내부 세포량으로부터 또는 전체 배반포로부터 유래한다. 상실배기로부터 hES 세포주의 유도체화가 자료로 제공된 바 있고 이와 같이 얻어진 ES 세포가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다(Strelchenko et al. 2004. Reproductive BioMedicine Online 9: 623-629). 본원에서 사용된 용어 "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 재프로그램화(reprogramming)에 의해 성체 세포로부터 생성된 다능성 줄기 세포를 나타낸다. iPS 세포는 자기 재생할 수 있고 유기체의 세 배엽 모두, 즉, 중배엽, 내배엽 및 외배엽에서 기원하는 세포형을 생성할 수 있고, 잠재적으로는 전체 유기체로 성장할 수는 없지만, 유기체의 임의 및 모든 세포형을 생성할 수 있다. iPS 세포의 예는 특히 Yamanaka et al. 2006 (Cell 126: 663-676) 및 Yamanaka et al. 2007 (Cell 131: 861-872)에 의해 교시된 것들이다.
용어 "MSC", "ESC" 또는 "iPS"도 동물 또는 인간 피험체의 생물학적 샘플로부터 얻어진, MSC, ESC 또는 iPS 각각의 자손, 예를 들어 MSC, ESC 또는 iPS 각각의 체외 또는 생체외 증식(번식/확장)에 의해 얻어진 자손을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "성체 줄기 세포"는 태아기에 또는 바람직하게는 출생 후(예를 들어, 구체적으로 그러나 인간 유기체에 대해 제한 없이, 출생 후 적어도 1월령, 예를 들어, 출생 후 적어도 2월령, 적어도 3월령, 예를 들어, 적어도 4월령, 적어도 5월령, 예를 들어, 적어도 6월령, 예컨대 예를 들어, 출생 후 1년 이상, 5년 이상, 적어도 10년 이상, 15년 이상, 20년 이상, 또는 25년 이상), 예컨대 예를 들어 성인기를 달성한 후 유기체에 존재하거나 이로부터 얻어진(예컨대 이로부터 분리된) 중기 세포를 나타낸다. 일예로서, 성체 줄기 세포는 다르게는 종래 용어 "유아", "아동", "젊은이", "미성년" 또는 "성인"으로 기재되는 인간 피험체로부터 얻어질 수 있다.
잘 알려졌을 때를 제외하고, "피험체", "공여자" 또는 "환자"는 상호 교환하여 사용되며 동물, 바람직하게는 척추동물, 더 바람직하게는 포유동물을 나타내며, 구체적으로 인간 환자 및 비인간 포유동물을 포함한다. 바람직한 환자는 인간 피험체이다. 동물 피험체는 동물의 출산 전 형태, 예컨대 예를 들어, 태아를 포함한다.
본원에서 교시된 용도 또는 방법의 특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포는 인간 세포이다.
본 방법과 프로토콜은 바람직하게는 "분화되지 않은" 다능성 줄기 세포 집단(예를 들어, mPS 또는 hPS 세포 집단)으로부터 벗어날 수 있으며, 즉 줄기 세포 집단에서 세포의 실질적인 비율(예를 들어, 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 80%, 아직 더 바람직하게는 적어도 약 90% 및 100%까지)이 미분화 mPS 세포의 특성(예를 들어, 형태학적 특징 및/또는 마커)을 나타내는 것이며, 분화를 수행한 세포로부터 이들을 명백히 구분할 수 있다.
미분화 mPS 세포는 일반적으로 통상의 기술자에 의해 쉽게 인식되며, 고 핵/세포질 비율과 현저한 인을 가진 2차원의 현미경 뷰(view)로 나타낼 수 있으며, 예리한 경계를 가진 조밀한 콜로니(colony)로서 성장할 수 있다. 집단 내 미분화 세포의 콜로니는 흔히 더 분화되어 있는 이웃하는 세포에 의해 둘러싸일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 미분화 콜로니는 자체 공지된 적합한 조건 하에 집단이 배양되거나 계대될 때 지속하며, 개별 미분화 세포는 세포 집단의 실질적인 비율을 구성한다. 미분화 mPS 세포는 시기 특이적 배아 항원(SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 TRa-1-81로 지정된 항체를 이용하여 검출 가능한 마커를 발현할 수 있다(Thomson el al. 1998, 상기 참조). 미분화 mPS 세포는 또한 전형적으로 Nanog, Oct-4 및 TERT를 발현할 수 있다. 미분화 mPS 세포는 또한 알칼린 포스파타아제(AP)의 발현을 포함할 수 있다(예를 들어, 적합한 AP 활성 검정에 의해 결정된 바와 같이).
특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포는 연골-골아세포계(골 및 연골), 골아세포계(골), 예컨대 예를 들어, 골연골 전구체 및/또는 골 전구체 및/또는 전골아세포 및/또는 골아세포 및/또는 골세포, 등; 연골아세포계(연골), 예컨대 예를 들어, 골연골 전구체 및/또는 연골 전구체 및/또는 전연골아세포 및/또는 연골아세포 및/또는 연골세포; 지방생성(지방); 근생성(근육); 건생성(건세포) 계통; 섬유아세포계(결합 조직), 예컨대 예를 들어, 섬유아세포, 섬유세포; 또는 활액세포계(활액)로 되어 있다.
체외 분화 세포에 관련하여 본원에서 사용된 용어 "연골-골아세포계"는 골아세포계의 세포, 예컨대 골연골 전구체, 골 전구체 및/또는 전골아세포 및/또는 골아세포 및/또는 골세포 등으로 또는 연골아세포계의 세포, 예컨대 골연골 전구체, 연골 전구체 및/또는 전연골아세포 및/또는 연골아세포 및/또는 연골세포로 분화되는 능력을 가진 세포를 나타낼 수 있다. 통상의 기술자는 세포가 이들이 노출되는 조건, 예컨대 물리적 인자 및/또는 화학적 또는 생물학적 구성 요소, 예컨대 성장 인자에 따라 골아세포계(예를 들어, 전골아세포 또는 골아세포)의 세포로, 또는 연골아세포계(예를 들어, 전연골아세포 또는 연골세포)의 세포로 분화될 것임을 이해할 것이다.
특별한 실시형태에서, 체외 분화 세포는 골아세포계(예를 들어, 골 전구체, 전골아세포, 골아세포, 또는 골세포) 또는 연골아세포계(예를 들어, 연골 전구체 및/또는 전연골아세포 및/또는 연골아세포 및/또는 연골세포)의 세포이다.
연골-골아세포, 골아세포계 또는 연골아세포계의 세포로 MSC의 분화는 연골-골아세포, 골아세포계 또는 연골아세포계의 세포 쪽으로 MSC의 분화를 유도할 수 있는 조건하에 MSC를 배양하는 것, 더 전형적으로는 연골-골아세포, 골아세포계 또는 연골아세포계의 세포 쪽으로 MSC의 분화를 유도할 수 있는 하나 이상의 작용제(예를 들어, 성장 인자)를 포함하는 배지에서 MSC를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 연골-골아세포, 골아세포계 또는 연골아세포계의 세포 쪽으로 MSC의 분화를 위한 프로토콜은 본원에서 다른 곳에 기재된 MSC를 "골형성 세포 B"로 분화하는 공정 및 다음과 같은 MSC를 "세포산물 C" 또는 "골형성 세포 C"로 분화하는 공정을 포함한다: 5% OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 Ul/ml 헤파린 (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix) 및 TGFfL 1 (Humanzyme)을 포함하는 종래의 배양 배지에 골수 백혈구를 50,000 세포/cm2의 밀도에서 파종하고, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양한다. 세포 파종 4일 후에, 비접착 세포를 제거하고 배지를 배양 배지로 바꾼다. 파중 7일 및 11일 후, 배양 배지의 반을 제거하고 새로운 배지로 대체하여 성장 인자를 재생한다. 세포를 14일간 일차 배양 동안 배양한다. 14일째에 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 1: P1). 중간 세포를 동결 보존하고(예를 들어, CryoStor® CS10에서) 액체 질소에 저장한다. 다음에, 중간 세포를 해동하고 이차 배양을 위해 572 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅한다. 세포를 10일간 이차 배양 동안 배양한다. 24일째에, 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 2: P2). 중간 세포를 동결 보존하고(예를 들어, CryoStor® CS10에서) 액체 질소에 저장한다. 이어서, 중간 세포를 해동하고 이차 배양을 위해 572 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅한다. 세포를 10일간 삼차 배양 동안 배양한다. 34일째에, 예를 들어 Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확한다(계대 3: P3). 최종 세포산물을 얻기 위해, 25 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 예를 들어 OctaPlasLG®에 세포를 재현탁한다. 이 세포산물을 본원에서 "세포산물 C-신선"으로 지칭한다. 삼차 배양의 종료시에, 세포를 또한 장기 저장을 위해 동결 보존한다. 거기서, 원하는 농도(25 x 106 세포/ml)에 도달하도록 세포를 동결 건조 배지에 재현탁한다. 그 후 세포 현탁액을 액체 질소에 보관되어 있는 동결 튜브(cryotube)로 옮긴다. 이 세포산물을 본원에서 "세포산물 C-동결"로 지칭한다. 동결 보전 배지는 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions), 또는 50% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc) 및 50% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma), 또는 95% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc) 및 5% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma), 또는 80% (v/v) Hypothermosol® (BioLife Solutions Inc) 10% (v/v) DMSO, 및 10% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma)일 수 있다.
골아세포계 또는 연골아세포계의 세포로 MSC의 분화를 위한 추가 프로토콜은 특히 WO 2009/087213; WO 2007/093431; 및 추가로 REGER, R.L. et al. ‘Differentiation and Characterization of Human MSCs’. In: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), D.J. Prockop et al에 의해 편집. Humana Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107; VERMURI, M.C. et al. (Eds.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 특히 pages 201 to 352)를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "성장 인자"는 다양한 세포형의 증식, 성장, 분화, 생존 및/또는 이동에 영향을 주는 생물학적 활성 물질을 나타내며, 단독으로 또는 다른 물질에 의해 조절될 때 유기체에서 발달적, 형태학적 및 기능적 변화에 영향을 미칠 수 있다. 성장 인자는 전형적으로 성장 인자에 반응하는 세포에 존재한 수용체(예를 들어, 표면 또는 세포 내 수용체)에 리간드로서 결합함으로써 작용할 수 있다. 본원에서 성장 인자는 특히 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질성 실체물(entity)일 수 있다. 일예로서 그리고 제한 없이, 용어 "성장 인자"는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리, 골 형태형성 단백질(BMP) 패밀리, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 패밀리, 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 패밀리, 신경 성장 인자(NGF) 패밀리, 표피 성장 인자(EGF) 패밀리, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 패밀리, 성장 분화 인자(GDF) 패밀리, 간세포 성장 인자(HGF) 패밀리, 조혈 성장 인자(HeGFs), 혈소판 유래 내피세포 성장 인자(PD-ECGF), 안지오포이에틴(angiopoietin), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 패밀리, 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 등의 멤버를 포함한다. 통상의 기술자는 성장 인자 또는 성장 인자들의 조합이 원하는 세포형 쪽으로 MSC의 분화를 유도할 수 있다고 알려진 임의 성장 인자 또는 성장 인자들의 조합일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 통상의 기술자는 원하는 세포형 쪽으로(예를 들어, 골연골아세포계, 골아세포계, 또는 연결아세포계의 세포 쪽으로)MSC의 분화를 유도하는 체외 방법은 원하는 세포형의 실질적으로 순수한(즉, 주로 구성되는) 세포 집단을 얻을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 제한 없이, 이와 같이 유래한 세포 집단은 원하는 세포형의 적어도 90%(숫자로), 예컨대 예를 들어, 원하는 세포형의 ≥91%, ≥92%, ≥93%, ≥94%, ≥95%, ≥96%, ≥97%, ≥98%, ≥99%, 또는 100% 함유할 수 있다.
통상의 기술자는 본원에서 교시된 방법이 체외 분화 세포의 골형성능의 평가에 관한 것이므로, 본원에서 의도된 체외 분화 세포가 전형적으로 연골-골아세포, 골아세포계 또는 연골아세포계의 세포 쪽으로 다능성 세포, 예컨대 MSC의 분화를 유도할 수 있는 조건하에 배양된다는 것을 이해할 것이다. 이에 따라, 본원에서 의도된 체외 분화 세포는 근세포계(근육), 건세포계(건), 섬유아세포계(결합 조직), 지방세포계(지방) 또는 기질성 계통(수 기질)의 세포 쪽으로 다능성 세포, 예컨대 MSC의 분화를 유도할 수 있는 조건하에 배양되지 않는다.
추가 양태는 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어진 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공한다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 단계.
바람직하게는, 추가 양태는 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어진 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공한다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 단계.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 150 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특정 실시형태에서, 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있거나, 기본적으로 이루어질 수 있거나 이루어질 수 있다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100, CD105에 대한 nMFI 많아야 150 또는 CD10에 대한 nMFI 적어도 40, 예를 들어, 적어도 50, 적어도 55 또는 적어도 60 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 단계.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100, CD105에 대한 nMFI 많아야 150 또는 CD10에 대한 nMFI 적어도 50 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특정 실시형태에서, 뵨원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100, CD105에 대한 nMFI 많아야 150 또는 CD10에 대한 nMFI 적어도 40, 예를 들어, 적어도 50, 적어도 55 또는 적어도 60 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특정 실시형태에서, 뵨원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 150, CD105에 대한 nMFI 많아야 150 또는 CD10에 대한 nMFI 적어도 50 중 하나 이상을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며/되거나 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
양태에서, 본 발명은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어진다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD10의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 40, 예를 들어, 적어도 50, 적어도 55 또는 적어도 60을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 단계.
바람직한 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 50을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
양태에서, 본 발명은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어진다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD10의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 40, 예를 들어, 적어도 50, 적어도 55 또는 적어도 60을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 단계.
바람직한 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 50을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어진다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD10의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 40, 예를 들어, 적어도 50, 적어도 55 또는 적어도 60을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
바람직한 특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 50을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
바람직하게는, 추가 양태는 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어진 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법을 제공한다:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 및 CD44의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포의 적어도 90%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가 CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 및 CD105에 대한 nMFI 많아야 150을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가:
- CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상;
- CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 및 CD105에 대한 nMFI 많아야 150;
- 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850 또는 적어도 900의 nMFICD73; 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300 또는 적어도 350의 nMFICD44; 또는 많아야 180, 많아야 170, 많아야 160, 많아야 150, 많아야 140, 많아야 130, 많아야 120, 많아야 110 또는 많아야 100의 nMFICD105 중 하나 이상;
- 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850 또는 적어도 900의 nMFICD73; 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300 또는 적어도 350의 nMFICD44; 및 많아야 180, 많아야 170, 많아야 160, 많아야 150, 많아야 140, 많아야 130, 많아야 120, 많아야 110 또는 많아야 100의 nMFICD105;
- CD73에 대한 nMFI 적어도 700, CD44에 대한 nMFI 적어도 200 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상; 및/또는
- CD73에 대한 nMFI 적어도 700, CD44에 대한 nMFI 적어도 200 및 CD105에 대한 nMFI 많아야 150을 가지는 경우, 체외 분화 세포는 골형성능, 특히 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며,
바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
특정 실시형태에서, 본원에서 교시된 방법은 체외 분화 세포의 적어도 90%, 예컨대 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 경우, 그리고 체외 분화 세포가:
- CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상;
- CD73에 대한 nMFI 적어도 500, CD44에 대한 nMFI 적어도 100 및 CD105에 대한 nMFI 많아야 150;
- 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850 또는 적어도 900의 nMFICD73; 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300 또는 적어도 350의 nMFICD44; 또는 많아야 180, 많아야 170, 많아야 160, 많아야 150, 많아야 140, 많아야 130, 많아야 120, 많아야 110 또는 많아야 100의 nMFICD105 중 하나 이상;
- 적어도 550, 적어도 600, 적어도 650, 적어도 700, 적어도 750, 적어도 800, 적어도 850 또는 적어도 900의 nMFICD73; 적어도 110, 적어도 120, 적어도 130, 적어도 140, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300 또는 적어도 350의 nMFICD44; 및 많아야 180, 많아야 170, 많아야 160, 많아야 150, 많아야 140, 많아야 130, 많아야 120, 많아야 110 또는 많아야 100의 nMFICD105;
- CD73에 대한 nMFI 적어도 700, CD44에 대한 nMFI 적어도 200 또는 CD105에 대한 nMFI 많아야 150 중 하나 이상; 및/또는
- CD73에 대한 nMFI 적어도 700, CD44에 대한 nMFI 적어도 200 및 CD105에 대한 nMFI 많아야 150을 가지는 경우, 체외 분화 세포는 골형성능, 특히 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있으며,
바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것이다.
본 발명자들은 본원에서 교시된 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법이 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 체외 분화 세포일 수 있는 MSC를 포함하는 이들 MSC-공여자를 선택하는데 사용될 수 있다는 사실을 밝혀냈다.
따라서, 추가 양태는 연골-골형성 계통의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 방법을 제공하며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 피험체의 생물학적 샘플로부터 MSC를 회수하는 단계;
- MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하는 단계;
- 본원에서 교시된 방법에 의해 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 경우 연골-골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 단계.
특별한 실시형태에서, 피험체의 생물학적 샘플로부터 MSC를 회수하는 것은 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 특별한 실시형태에서, MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하는 것은 본원에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
특별한 실시형태에서, 피험체는 인간 피험체이다.
통상의 기술자는 본원에서 기재한 정의 및 특별한 실시형태가 본원에서 개시된 모든 방법 및 용도에 적용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 출원은 또한 하기 진술 항목(statement)에서 제시된 양태 및 실시형태를 제공한다:
진술 항목 1. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 용도.
진술 항목 2. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법으로서, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 상기 체외 분화 세포의 양을 측정하고, 상기 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법.
진술 항목 3. 진술 항목 2에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
(a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계;
(b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하는 단계;
(b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
(c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계;
(c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
(d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
진술 항목 4. 진술 항목 3에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값과 단계 (b2)의 상기 각각의 컷오프 값이 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값인 것인 방법.
진술 항목 5. 진술 항목 4에 있어서,
- 단계 (b1)의 컷오프 값과 비교한 단계 (a1)에서 측정된 체외 분화 세포의 감소된 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있지 않은 것을 나타내거나,
- 단계 (b1)의 컷오프 값과 비교한 단계 (a1)에서 측정된 체외 분화 세포의 동일하거나 증가된 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있다는 것을 나타내며;
- 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD73 및 CD44의 어느 하나의 감소된 양, 및/또는 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD105의 증가된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있지 않은 것을 나타내거나,
- 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD73 및 CD44의 동일하거나 증가된 양, 및 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD105의 동일하거나 감소된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
진술 항목 6. 진술 항목 3 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; 단계 (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 정규화 중간 형광 강도(nMFI),100의 CD44에 대한 nMFI 및/또는 150의 CD105에 대한 nMFI이며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고/되거나, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 방법.
진술 항목 7. 진술 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양이 측정되며, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양이 측정되는 것인 방법.
진술 항목 8. 진술 항목 7에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; 단계 (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI 및 150의 CD105에 대한 nMFI이며, 바람직하게는 nMFICD73은 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되며, nMFICD44는 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되고, nMFI105는 APC에 대한 633 nm의 여기 파장 및 660 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 방법.
진술 항목 9. 진술 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 체외 분화 세포는 간엽 줄기 세포(MSC)로부터 수득되는 것인 방법.
진술 항목 10. 진술 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 체외 분화 세포는 인간 세포인 방법.
진술 항목 11. 연골-골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것인 선택 방법:
- 피험체의 생물학적 샘플로부터 MSC를 회수하는 단계;
- MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하는 단계;
- 진술 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 경우 연골-골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 단계.
진술 항목 12. 진술 항목 11에 있어서, 피험체가 인간 피험체인 방법.
진술 항목 13. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105, CD44 및 CD10의 용도.
진술 항목 14. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법으로서, CD73, CD105, CD44 및 CD10을 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계, 및 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법.
진술 항목 15. 진술 항목 14에 있어서, 상기 방법이 하기 단계를 포함하는 방법:
(a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
(a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계;
(b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값과 비교하는 단계;
(b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
(c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계;
(c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
(d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
진술 항목 16. 진술 항목 15에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값 및 단계 (b2)의 상기 각각의 컷오프 값은 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값인 방법.
진술 항목 17. 진술 항목 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상의 양이 측정되는 것인 방법.
진술 항목 18. 진술 항목 16 또는 17에 있어서,
- 단계 (b1)의 컷오프 값과 비교한 단계 (a1)에서 측정된 체외 분화 세포의 동일하거나 증가된 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있다는 것을 나타내며;
- 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD44및/또는 CD10의 동일하거나 증가된 양, 및 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD105의 동일하거나 감소된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
진술 항목 19. 진술 항목 15 내지 18에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; 단계 (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 정규화 중간 형광 강도(nMFI), 100의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 40의 CD10에 대한 nMFI인 방법.
진술 항목 20. 진술 항목 15 내지 18에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값은 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; 단계 (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 정규화 중간 형광 강도(nMFI), 150의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 40의 CD10에 대한 nMFI인 방법.
진술 항목 21. 진술 항목 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양이 측정되는 것인 방법.
진술 항목 22. 진술 항목 21에 있어서, 단계 (b2)의 상기 컷오프 값은 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI 및 150의 CD105에 대한 nMFI인 방법.
진술 항목 23. 진술 항목 13에 있어서 또는 진술 항목 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 체외 분화 세포는 간엽 줄기 세포(MSC)로부터 수득되는 것인 용도 또는 방법.
진술 항목 24. 진술 항목 13에 있어서 또는 진술 항목 14 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 체외 분화 세포는 인간 세포인 용도 또는 방법.
진술 항목 25. 연골-골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
- 피험체의 생물학적 샘플로부터 MSC를 회수하는 단계;
- MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하는 단계;
- 진술 항목 14 내지 24 중 어느 하나에 정의된 방법에 의해 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 경우 연골-골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 단계.
진술 항목 26. 진술 항목 25에 있어서, 피험체가 인간 피험체인 방법.
진술 항목 27. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하거나, 기본적으로 이루어지거나 이루어지는 판정 방법:
- 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD10의 양을 측정하는 단계; 및
- 체외 분화 세포가 CD10에 대한 nMFI 적어도 40을 가지는 경우 체외 분화 세포는 골형성능을 가지고 있다는 것으로 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 것인 단계.
본 발명이 그의 구체적인 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 상기 설명에 비추어 많은 대안, 수정, 및 변경이 통상의 기술자에게 명백할 것임이 분명하다. 따라서, 첨부 청구범위의 정신 및 넓은 범위에서 다음과 같이 이러한 대안, 수정 및 변형 모두를 포함하도록 의도된다.
본원에서 개시된 본 발명의 양태와 실시형태는 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 뒷받침된다.
실시예
실시예 1: 간엽 줄기 세포(MSC)와 MSC 유래 세포의 수득 방법
간엽 줄기 세포
건강한 자원 공여자의 장골능에서 인간 척수(BM) 흡인물을 수득함으로써 미분화 MSC를 준비하였다. 수확 후, 골수 백혈구를 계산하였고, 배양 배지에 50,000 세포/cm2의 밀도로 파종하였으며, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양하였다. 24h 후, 배양 배지를 제거하였고 세포 신선한 배양 배지를 첨가하였다. 배양 배지를 2-3일마다 교체하였다. 콜로니의 반 이상이 80%의 합류(confluence)에 도달하였을 때 또는 일부 콜로니가 100%의 합류에 도달하였을 때, 세포를 수확하였다(계대 1: P1). 이 제1 계대에서, 세포를 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.)에 직접 동결 보존하였다. 배양 과정을 종료하기 위해, MSC를 해동하였고, 제2 배양을 위해 572 세포/cm2에서 플레이팅하였으며, 증식시켰다(cultivated). 콜로니의 반 이상이 80%의 합류에 도달하였을 때 또는 일부 콜로니가 100%의 합류에 도달하였을 때 세포를 수확하여 계대 2(P2)에서 MSC를 수득하였다. 이 세포산물은 본원에서 "MSC"로 지칭된다.
세포산물 A( 또한 본원에서 골형성 세포 A로서 지칭)
5% 옥타세룸(Octaserum)(50:50 자기 혈청 및 OctaPlasLG® (Octapharma)), FGF-b (CellGenix) 및 TGFβ-1 (Humanzyme)를 포함하는 종래 배양 배지.
10% 옥타세룸(50:50 자기 혈청 및 OctaPlasLG® (Octapharma)) 및 10% DMSO를 포함하는 동결 배지
건강한 자원 공여자의 장골능에서 인간 BM 흡인물을 수득함으로써 본원에서 "세포산물 A"로서 지칭된 체외 분화 MSC 유래 세포를 준비하였다. 수확 후, 골수 백혈구를 계산하였고, 배양 배지에 50,000 세포/cm2의 밀도로 파종하였으며, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양하였다. 세포 파종 4일 후, 비접착 세포를 제거하였고 배지를 배양 배지로 바꾸었다. 파종 7일 및 11일 후, 배양 배지의 반을 제거하였고 새로운 배지로 교체하였다. 14일간 일차 배양 중에 세포를 배양하였다. 14일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 1: P1). 중간 세포를 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.) 또는 동결 배지에 동결 보전하였고 액체 질소에 보관하였다.
이차 배양을 위해, 세포를 해동하였고 1144 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅하였다. 14일간 이차 배양 중에 세포를 배양하였다. 28일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 2: P2). 최종 세포산물을 수득하기 위해, 25 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 OctaPlasLG®에 세포를 재현탁시켰다. 이 세포산물은 본원에서 "세포산물 A"로서 지칭된다.
세포산물 B( 또한 본원에서 골형성 세포 B로서 치칭 )
5% OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 UI/ml 헤파린 (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix) 및 TGFβ-l (Humanzyme)을 포함한 종래 배양 배지.
건강한 자원 공여자의 장골능에서 인간 BM 흡인물을 수득함으로써 체외 분화 MSC 유래 세포를 준비하였다. 수확 후, 골수 백혈구를 계산하였고, 배양 배지에 50,000 세포/cm2의 밀도로 파종하였으며, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양하였다. 세포 파종 4일 후, 비접착 세포를 제거하였고 배지를 배양 배지로 바꾸었다. 파종 7일 및 11일 후, 배양 배지의 반을 제거하였고 새로운 배지로 교체하여 성장 인자를 재생하였다. 14일간 일차 배양 중에 세포를 배양하였다. 14일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 1: P1). 중간 세포를 CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc.)에 동결 보전하였고 액체 질소에 보관하였다.
다음에, 중간 세포를 해동하였고 이차 배양을 위해 286 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅하였다. 14일간 이차 배양 중에 세포를 배양하였다. 28일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 2: P2). 최종 세포산물을 수득하기 위해, 25 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 OctaPlasLG®에 세포를 재현탁시켰다. 이 세포산물은 본원에서 "세포산물 B"로서 지칭된다.
세포산물 C(즉, 세포산물 C 신선 및 세포산물 C 동결; 또한 본원에서 골형성 세포 C로서 지칭)
5% OctaPlasLG® (Octapharma), 0.1 UI/ml 헤파린 (LEO Pharma), FGF-b (CellGenix) 및 TGFβ-l (Humanzyme)을 포함한 종래 배양 배지.
건강한 자원 공여자의 장골능에서 인간 골수(BM) 흡인불 20 내지 60 ml를 수득하였다. 수확 후, 골수 백혈구를 계산하였고, 배양 배지에 50,000 세포/cm2의 밀도로 파종하였으며, 5% CO2를 함유한 가습 배양기에서 37℃에 배양하였다. 세포 파종 4일 후, 비접착 세포를 제거하였고 배지를 배양 배지로 바꾸었다. 파종 7일 및 11일 후, 배양 배지의 반을 제거하였고 새로운 배지로 교체하여 성장 인자를 재생하였다. 14일간 일차 배양 중에 세포를 배양하였다. 14일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 1: P1). 중간 세포를 동결 보전하였고(CryoStor® CS10에서) 액체 질소에 보관하였다. 각 세포 스탁(stack)은 일 공여자로부터 보급되었고, 공여자 사이에 저류(pooling)는 없었다.
다음에, 중간 세포를 해동하였고 이차 배양을 위해 572 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅하였다. 10일간 이차 배양 중에 세포를 배양하였다. 24일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 2: P2). 중간 세포를 동결 보전하였고(CryoStor® CS10에서) 액체 질소에 보관하였다.
이어서, 중간 세포를 해동하였고 삼차 배양을 위해 572 세포/cm2의 밀도에서 다시 플레이팅하였다. 10일간 삼차 배양 중에 세포를 배양하였다. 34일째에, Trypzean (Lonza)로 탈리에 의해, 그리고 스월링 및 상하 피펫팅에 의해 세포를 수확하였다(계대 3: P3). 최종 세포산물을 수득하기 위해, 25 x 106 세포/ml의 최종 농도에서 OctaPlasLG®에 세포를 재현탁시켰다. 이 세포산물은 본원에서 "세포산물 C-신선"로서 지칭된다.
삼차 배양의 종료 시에, 세포를 또한 장기 저장을 위해 동결 보존하였다. 거기서, 세포를 원하는 농도(25 x 106 세포/ml)에 도달하도록 동결 보존 배지에 재현탁시켰다. 그 후 세포 현탁액을 액체 질소에 보관된 동결 튜브에 옮겼다. 이 세포산물은 본원에서 "세포산물 C-동결" 또는 "골형성 세포 C 동결(보존)" 또한 줄여서 "B-F 세포 C"로서 지칭될 것이다. 동결 보존 배지는 다음과 같았다:
- CryoStor® CS10 (BioLife Solutions), 또는
- 50% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc) 및 50% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma), 또는
- 95% (v/v) CryoStor® CS10 (BioLife Solutions Inc) 및 5% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma), 또는
- 80% (v/v) Hypothermosol® (BioLife Solutions Inc) 10% (v/v) DMSO, 및 10% (v/v) 인간 혈청 알부민 (Octapharma)
실시예 2: 연골- 골아세포계의 MSC 유래 세포의 체외 골형성 특성
재료 및 방법
세포 배양
실시예 1에 기재된 바와 같이, MSC, 골형성 세포 A, B 및 C를 준비하였다.
마우스
9-10주 암컷 NMRI-누드(nu/nu) 마우스를 Janvier S.A.S. (프랑스 르 저니스트 성 일레)로부터 구입하였고 사료와 물을 자유재량으로 표준 조건에서 사육하였다. 본 연구를 위해 총 196마리의 마우스를 사용하였다.
두개관 골형성 마우스 모델
12주령 암컷 NMRI-누드(nu/nu) 마우스(n=137)를 이소플루란(IsoFlo®)으로 마취하였고 MSC, 골형성 세포 A(FGF-2 및 TGFβ1로 생성됨), 또는 골형성 세포 B(FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성됨)(마우스당 100 μl 내 2.5 x 106 세포) 또는 부형제(100 μl)의 두개관 골 위 단일 피하 투여를 수행하였다. 시간 경과에 따라 골 신형성을 표지하기 위해, 칼슘 결합 형광 색소를 순차로 마우스에 투여하였다. 알자린 레드(적색), 칼세인(녹색 및 청색) 및 테트라사이클린(황색)(모두 Sigma-Aldrich®로부터)을 각각 세포 투여 3일 전 및 4, 8 및 12일 후에 복강 내 주사하였다. 투여 후 2주간 체중, 일반적인 임상 징후, 및 투여 부위에서 임상 징후에 대해 실험 동물을 모니터하였다. 경추 탈구에 의해 세포 투여 2주 후에 마우스를 안락사시켰고 각 뮤린의 두개관을 채취하여 X-선 영상화, 조직 형태 측정(골형성의 정량화) 및 면역 형광에 의해 골형성 세포의 골형성 특성을 평가하였다.
두개관 골형성 마우스 모델- 세포산물 C 동결
12주령 암컷 NMRI-누드(nu/nu) 마우스를 이소플루란(IsoFlo®)으로 마취하였고 세포산물 C 동결(마우스당 100 μl 내 2.5 x 106 세포) 또는 부형제(100 μl)의 두개관 골 위 단일 피하 투여를 수행하였다. 시간 경과에 따라 골 신형성을 표지하기 위해, 칼슘 결합 형광 색소를 순차로 마우스에 투여하였다. 알자린 레드(적색), 칼세인(녹색 및 청색) 및 테트라사이클린(황색)(모두 Sigma-Aldrich®로부터)을 각각 세포 투여 2 또는 3일 전 및 5, 12 및 19일 후에 복강 내 주사하였다. 투여 후 4주간 체중, 일반적인 임상 징후, 및 투여 부위에서 임상 징후에 대해 실험 동물을 모니터하였다. 경추 탈구에 의해 세포 투여 4주 후에 마우스를 안락사시켰고 각 마우스의 두개관을 채취하여 X-선 영상화, 조직 형태 측정(골형성의 정량화) 및 면역 형광에 의해 골형성 세포의 골형성 특성을 평가하였다.
샘플 포매 (embedding) 및 조직 절편화
조직 형태 측정, ALP, TRAP(주석산염 내성 산 포스파타아제), 마슨 삼색 골드너 염색 및 면역 형광을 위해, 70%, 80% 및 90% 에탄올조에서, 각각 12 시간 동안, 4℃에서 부드럽게 흔들면서 연속 배양과 함께 탈수하였고, 히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA) 플라스틱 수지(HistoResin, Leica®)에 포매하였다. 마이크로톰(microtome)(Leica®, RM2255)을 이용하여 4 μm 두께 및 8 μm 두께 관상 단면을 절단하였다. 사프라닌-오렌지 염색 및 면역 퍼옥시다아제를 위해, 두개관을 3.7% 포름알데히드에서 24 시간 고정하였고, 10% 에틸렌디아민테트라아세트 산(EDTA) pH 7,4에서 3일간 탈회하였고 파라핀에 포매하였다. 마이크로톰(Leica®, RM2255)을 이용하여 74 μm 두께 관상 및 시상 파라핀 단면을 절단하였다.
면역 형광 염색
면역 형광에 의한 인간 및 뮤린 콜라겐 I의 평가는 두개관의 4 μm 두께 관상 조직 절편 상에 수행되었다. 간단하게는, PBS 1X/Triton 0.3%의 용액을 이용하여 실온(RT)에서 30분간 투과화의 단계 후, 조직 절편을 블로킹 용액(즉, PBS/BSA/말 혈청/TritonTM)에서 RT에 1시간 배양하여 비특이 결합 부위를 포화시켰다(sature). 그 후 조직 슬라이드를 마우스 항인간 및 토끼 항뮤린 콜라겐 I 일차 항체(각각 Abeam; #abl38492 및 Abeam; #ab21286)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. RT에서 5분간 PBS 내 헹굼 3 단계 후, RT에서 1시간 블로킹 용액으로 블로킹을 실현하였다. 그 후 블로킹 용액으로 희석된 이차 항체를 빛으로부터 보호된 RT에서 2시간 첨가하였다. 뮤린 콜라겐 I을 녹색으로 인간 콜라겐 I을 적색으로 각각 가시화하는데 이차 항체 Alexa Fluor® 488 당나귀 항토끼 IgG H&L (ThermoFisher, #A21206) 및 Alexa Fluor® Cy3® 염소 항마우스 IgG H&L (Abeam; #ab97035)를 사용하였다. 그 후 슬라이드를 RT에서 5분간 PBS 1X에서 3회 헹구었고 RT에서 1분간 NucBlue® 용액과 함께 배양하여 핵을 염색하였다. 끝으로, 슬라이드를 PBS에서 간단히 1회 헹군 다음 GlycerGel® 시약에서 고정시켰다. 면역 형광의 음성 대조로서, 인접 조직 슬라이드 상에 일차 항체의 생략을 수행하였다.
조직 염색
골아세포 및 파골세포 활성을 각각 ALP 및 TRAP 효소 활성 검출법을 이용하여 각각 두개관 절편에 대해 평가하였다. ALP 염색을 위해, 4 μm 두께 두개관 관상 플라스틱 단면을 패스트 블루(Fast Blue) RR 염 (Sigma-Aldrich®) 및 나프톨(Naphtol) AS-MX 포스페이트 알칼리 (Sigma-Aldrich®)의 용액과 함께 1시간 배양하였다. 제조업자의 사용설명서에 따라 산 포스파타아제, 백혈구 (TRAP) 키트 (Sigma-Aldrich®)를 이용하여 8 μm 두께 두개관 관상 플라스틱 단면에 대해 TRAP 염색을 수행하였다. 신형성된 골의 석화화의 상태를 평가하기 위해, 제조업자의 사용설명서에 따라 키트(Bio-Optica®)를 사용하여 ALP로서 염색된 관상 단면에 대해 마슨 삼색 골드너 염색을 수행하였다. 연골 형성을 입증하기 위해, 7 μm 두께 두개관 시상 파라핀 단면에서 대해 사프라닌-오렌지 염색을 수행하였다. 간단하게는, 탈파라핀화 후, 조직 절편을 연속으로 와이거트의 헤마톡실린(Weigert's Hematoxylin)(Klinipath®)에서 10분간, 0.1% 패스트 그린(Klinipath®)에서 5분간, 1% 아세트산(VWR Chemicals)에서 15초 및 0.1% 사프라닌-오렌지(Fluka® ref : 84120)에서 5분간 배양하였다. 탈수 후, Pertex® (HistoLab®)를 이용하여 글라스 커버슬립으로 슬라이드를 고정시켰다. 광학 현미경(Leica®) 및 Leica® LAS EZ 소프트웨어로 디지털 이미지를 촬영하였다.
면역퍼옥시다아제
탈파라핀화 후, 7 μm 두께 두개관 관상 또는 시상 파라핀 단면을 2.5% 히알루로니다아제(Sigma-Aldrich®)와 함께 37℃에서 30분간 3% H2O2(Sigma- Aldrich®)에 실온에서 30분간, 0.3% Triton X-100(Sigma-Aldrich®)을 함유한 PBS에 실온에서 30분간, 및 블로킹 용액(즉, PBS/BSA/말 혈청/Triton)에 실온에서 1시간 연속으로 배양하였다. 단면을 4℃에서 뮤린 항인간 I형 콜라겐 일차 항체(Abcam, ab0395), 토끼 항뮤린 I형 콜라겐 일차 항체(Abcam, ab1286)와 함께 또는 토끼 항-Ku80 일차 항체(Abcam, ab80592)와 함께 밤새 배양하였다. 제조업자의 사용설명서에 따라 벡타스테인(Vectastain) 키트(Vector Laboratories, PK6200) 및 3,3' 디아미노벤지딘(Vector Laboratories)을 이용하여 염색을 가시화하였다. 단면을 메이어의(Mayer's) 헤마톡실린(Klinipath®)으로 대조 염색하였다. Pertex®을 사용하여 슬라이드를 글라스 커버슬립으로 고정시켰다.
X-선 분석에 의한 골형성의 정량화( 골형성 세포 C)
안락사에서, Faxitron® MX-20 장치를 이용하여 나란히 놓인 각 뮤린의 두개관의 생체 외 X-선 이미지화를 수행하였다. 전압이 35 kV에 설정되고, 노출 시간이 4.8초에 설정되며, 휘도/콘트라스트가 8300/6000에 설정된 수동 모드로 1.5X 배율에서 디지털 아미지를 촬영하였다. 생성된 X-선 이미지는 0(흑색 영역) 내지 255(백색 영역)의 범위인 그레이 강도 값(grey level value)을 가진 그레이 레벨 이미지이며 방사선 비투과성에 정비례하며, 따라서 골 불투과도 또는 골 두께에 정비례한다. 두정골(수동 선택) 상에 골형성(선택에서 폐기된 석회화 결절)의 골유도 부분의 그레이 레벨 강도 값은 AdobePhotoshop® 소프트웨어의 히스토그램 툴(histogram tool)을 이용하여 분석되었다.
또한 X-선 이미지화 및 AdobePhotoshop® 소프트웨어를 사용하여 석회화 결절(수동 선택)의 표면을 정량화하였다.
두개관의 조직 형태 계측에 의한 분석: 골형성의 정량화
골형성(즉, 절대 골형성)의 정량화를 플라스틱 포매 조직에 대해 수행하였다. 석회화 결절이 있고 없는 절대 신형성된 골두께(알리자린 레드에 의해 형광 표지된 기초 석회화 전면에서 칼세인과 테트라사이클린에 의해 형광 표지된 골 신형성까지)의 측정은 ZEN® 이미지 분석 소프트웨어(Zeiss)에 의해 4 μm 두께 관상 단면에 대해 수행되었다(μm로). 각 동물에 대해, 4회 절대 두께 측정을 5개 독립 수준에 대해 수행하였고, 각 수준 사이의 거리는 200 μm이었다. 제1 단계에서, 두께(결절이 있거나 없는)의 평균 ± SD(즉, 5개 수준에 대해 수준당 4회 측정의 평균)를 각 동물에 대해 계산하였다.
조직 이미지상에 신형성된 골의 표면적의 정량화( ImageJ ® 소프트웨어)
골유도 및 골형성 결절의 표면적 분석을 위해, 다중 형광 및 형광 현미경(Zeiss Axioscope Al, Zeiss, Germany)의 명시야 필터의 조합을 이용하여, 관상 봉합 후 2 수준마다 촬영한 6개의 독립 수준의 디지털 이미지를 두개관의 플라스틱 수지 조직 절편(4 μm)에서 취했다. 측정된 각 수준에서, 골유도된 골 신형성의 선택은 ImageJ® 소프트웨어를 사용하여 명시야 스티치(stiches) 이미지에서 손으로 윤곽을 나타냈다(manually defined). 이러한 선택에 대한 석회화 표면적과 전체 표면적을 측정하였다(mm2로). 골형성 결절의 석회화 표면적과 전체 표면적에 대해 동일한 과정을 수행하였다.
그 후 골유도 및 골형성 결절에 대해, 전체 표면적의 평균과 석회화 표면적의 평균을 실험 동물별 및 그룹별로 계산하였다. 골 신형성의 전체 표면적은 골유도 및 골형성 결절 표면적의 합으로서 최종적으로 계산하였다.
통계 분석
결과를 평균 ± 표준 편차(SD)로서 표현하였다. JMP® (SAS Institute Inc.) 또는 GaphPad Prism® 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. p<0.05일 때 그룹 간 차이를 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
결과
골형성 세포 A(FGF-2 및 TGFβ1로 생성됨) 및 골형성 세포 B(FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성됨) 둘 다 투여 2주 후 대조(부형제)보다 현저히 큰 골형성을 나타냈다(도 1-2, 표 1). 더 구체적으로는, 도 3에서는 골형성 세포 B가 골유도 특성(두개관 위 뮤린 유래 균질한(homogenous) 골형성), 및 골형성 특성(인간 및 뮤린 유래 석회화 결절)을 나타냈음을 보여준다.
뮤린 두개관 슬라이스상에 골형성(%)의 정량화. 뮤린 두개관을 부형제(음성 대조), 골형성 세포 A 또는 골형성 세포 B로 처리하였다.
배치 번호 동물 수 골형성 %
평균 ± SD
부형제 - 59 107 ±2
골형성 세포 A 10 39 165 ±19
골형성 세포 B 7 30 158 ±23
약호 : SD: 표준 편차
골유도 특성(즉, 이식 후 새로 형성된 뮤린 골의 양)은 골형성 세포 A 및 B에 대해 동등하였다(도 1 및 2).
매우 흥미롭게도, 본 발명의 골형성 세포 B는 이식 후 새로 형성된 인간 및 뮤린 골의 큰 양에 의해 나타낸 바와 같이 강력한 골형성 특성 및 골유도 특성을 나타냈다(인간 및 뮤린 Coll IF 염색, 도 3).
결절의 존재는 골형성 세포 B에 대해 7/8 공여자 및 80%의 마우스에서 그리고 골형성 세포 A에 대해 4/11 공여자 및 20%의 마우스에서 관찰되었다. MSC 또는 부형제 투여 후에 결절이 관찰되지 않았다. 골유도 활성 외에, 골형성 세포 B는 따라서 80%의 처리 마우스에서 관찰된 큰 석회화 결절의 존재에 의해 강조된 고 골형성 활성을 촉진하는 반면에, 골형성 세포 A는 약한 골형성 활성, 즉 단지 20%의 처리 마우스에서 약간의 결절을 나타낸다(표 2).
두개관 위에 부형제, MSC, 골형성 세포 A 또는 골형성 세포 B의 투여 2주 후에 뮤린 두개관 상에 석회화 결절의 존재에 대한 정량화
골형성 발생 공여자 배치 동물
부형제 NA NA 0/32 (0%)
MSC 0/2 0/2 0/14 (0%)
골형성 세포 A 4/10 (40%) 4/11 (36%) 9/45 (20%)
골형성 세포 B 7/8 (88%) 7/8 (88%) 37/46 (80%)
약호 : MSC : 간엽 줄기 세포 ; NA: 적용 불가
투여 2주 후(부형제만, MSC, 골형성 세포 A(FGF-2 및 TGFβ1로 생성됨; b-f 세포 A) 또는 골형성 세포 B(FGF-2, TGFβ1 및 헤파린으로 생성됨: b-f 세포 B)) 뮤린 골 두개관 관상 단면의 조직 염색에서는 모든 처리 조건(MSC, b-f 세포 A 및 b-f 세포 B)이 골유도에 의해 형성된 골에서 중간 재형성(remodeling) 활성(ALP 및 TRAP 염색과 함께 높은 골유도능이 있음을 나타냈다.
흥미롭게도, 골형성 세포 B로 처리된 마우스에서 관찰된 석회화 결절은 결절이 골형성 과정: 골형성(공여자 골형성) 및 골유도 과정(숙주 골형성) 둘 다에 의해 형성되었음을 보여주는 뮤린(숙주) 및 인간(공여자) 골 조직(인간 뮤린 I형 콜라겐 염색에 의해 입증됨) 둘 다로 구성되었다. 높은 골아세포 및 파골세포 활성(ALP + TRAP 염색)에 더해, 모든 조건에서 관찰된 골유도 과정이 이미 완료되었지만, 결절은 골형성이 투여 2주 후에 여전히 진행하고 있었음을 시사하는 유골 조직(비석회화 조직)을 나타냈다(도 4).
도 4에서는 인간 골형성(즉, 골형성)(항인간 I형 콜라겐 염색으로 관찰됨), 및 높은 골아세포 및 파골세포 활성(각각 ALP + 골드너 염색 및 TRAP 염색으로 관찰됨)이 골형성 세포 B로 투여된 마우스의 결절에서 대부분 관찰되었음을 보여주며, 이로서 완료된 것으로 보였던 MSC 및 골형성 세포 A의 골유도 과정과 다르게 결절에서 골형성 과정이 진행 중이었고 2주에 완료되지 않았음을 보여준다. 모든 처리된 조건(MSC, b-f 세포 A, b-f 세포 B)은 골유도된 골형성에서 보통의 재형성 활성(ALP 및 TRAP 염색)과 함께 높은 골유도능을 가졌다(도 4).
부형제만, MSC, b-f 세포 A 또는 b-f 세포 B로 처리 2주 후에 형광에 의해 골 신형성을 평가하였다(도 5). 이를 위해, 특정 시점에서 골 칼슘 결합 형광 염료(즉, 알리자린 레드, 칼세인 그린 및 블루, 테트라사이클린 옐로우)를 마우스에 투여하여 신형성된 골을 표지하였다. 투여될 최종 형광 색소는 테트라사이클린ㅇ니었고, 세포의 투여 12일 후 투여되었다.
도 5에 도시한 바와 같이, 골형성 세포 B로 투여된 마우스의 결절은 골유도된 골형성에서 관찰된 골유도(알리자린 레드(적색), 칼세인(녹색) 및 칼세인 블루(청색); 이들 염색은 옅은 회색으로 보이며 이중 화살표는 골형성 두께를 나타낸다)과 비교하여 형성 후기를 확인하는 테트라사이클린 형광 색소에 의해 대부분 염색되었다(도 5에서 황색 염색은 점선으로 둘러싸였다).
처리된 마우스의 골 신형성을 조직 이미지(ImageJ® 소프트웨어) 상에 신형성된 골의 표면적의 정량화에 의해 평가하였다. 신형성된 골의 전체 표면적은 분석된 수준별 및 마우스별로 골유도된 표면적 및 골 결절 표면적을 합하여 결정되었다.
결과로서 골형성 세포 B(n=7 마우스, 도 6에서 옅은 회색으로 도시됨)는 세포의 투여 2주 후에 MSC(n=6 마우스, 도 6에서 진한 회색으로 도시됨; 표 3)와 비교하여 약 2배로 골 신형성을 상당히 향상시켰음을 보여준다. 이러한 차이는 골형성 세포 B에 의해 나타난 높은 골형성 특성과 MSC에 대한 이러한 특성의 부재로 인한 것이었다.
골유도 및 골형성을 포함한 전체 골 신형성은 관상 단면상에서 측정된다.
세포형(동일 공여자로부터) 동물 수 골유도 골형성(결절) 전체(골유도+골형성)
석회화 면적(mm2)
(평균±SD)		 전체 면적(mm2)
(평균±SD)		 석회화 면적(mm2)
(평균±SD)		 전체 면적(mm2)
(평균±SD)		 석회화 면적(mm2)
(평균±SD)		 전체 면적(mm2)
(평균±SD)
MSC 6 0.42±0.09 0.57±0.17 0 0 0.42±0.09 0.57±0.17
b-f 세포 B 7 0.43±0.16 0.59±0.25 0.22±0.19 0.57±0.53 0.65±0.30 1.16±0.71
약호 : MSC : 간엽 줄기 세포 ; SD: 표준 편차
또한, 조직 염색을 이용하여 시간 경과에 따라 골 신형성의 평가가 골형성 세포 B로 투여된 마우스의 두개관 상단에서 관찰된 결절이 연골 내 골화 메커니즘을 통해 골화되고 있었음을 밝혔다. 도 7에서, 사프라닌-오렌지 염색은 프로테오글리칸(연골 특이적) 기질(파선으로 둘러싸인 면적); 핵; 골 조직; 및 세포질을 보여준다. 막내 골화에 의해 생성된 골유도 골에 반하여, 골 졀절이 연골 내 골화를 통해 생성되었으며, 연골 기질은 투여 후 1주 및 3주 사이에 발생하였다(도 7).
골형성 세포 B의 투여 4주 후에 수행된, 인간 I형 콜라겐, 뮤린 I형 콜라겐 및 인간 핵(즉, Ku80)을 표적으로 한 면역 조직 화학 염색에서는 결절 내 인간 골의 존재를 확인하였다. 더구나, Ku80 염색은 골형성 세포 B가 골 기질(결절)에 이식되어(engrafted) 체내 투여 후 골세포가 되었음을 밝혔다. 세포산물 C 동결을 투여받은 마우스는 투여 4주 후 대조보다 더 큰 골형성을 나타냈다(도 11 A-C). 골형성 세포 C 동결에 대한 골 불투명도는 부형제에 비해 상당히 컸다(도 11B). 골형성의 표면은 석회화 결절이 관찰되지 않았던 부형제에 비해 상당히 더 넓었다(도 11C). 골형성이 있거나 없는 골유도의 조직 형태 치수(measures)(절대 골형성으로 표시)는 골형성 세포 C 동결에 대해 부형제에 비해 상당히 더 컸다(도 11D 및 11E). 또한, 골유도 활성에 더하여, 골형성 세포 C 동결은 석회화 결절의 존재에 의해 강조된 높은 골형성 활성을 촉진하였다. 이러한 골형성 활성은 4/5 골수 공여자(또는 배치 생산) 및 65%의 마우스에서 관찰되었다(도 11F). 그룹당 한 마리 마우스에서 적어도 하나의 석회화 결절이 관찰되었을 때 한 공여자/배치가 골형성(양성)이 있는 것으로 고려되었다. 부형제 투여 후 결절이 관찰되지 않았다.
더 구체적으로는, 세포산물 C 동결은 골유도 특성(두개관 위 뮤린 유래로부터 균질한 골형성) 및 골형성 특성(인간 및 뮤린 유래로부터 석회화 결절) 둘 다를 나타냈다(도 12).
막내 숙주 골화가 두개관 표면을 따라 유도된다(도 12 및 13). 더 구체적으로는, 골형성 세포 C 동결은 골유도 및 골형성 특성을 나타냈다(도 13, "fluo"). 마우스/인간 I형 콜라겐 이중 면역 표지화(도 13, "인간 I형 콜라겐")는 숙주 및 공여자 유래의 골의 존재(골형성)를 밝혔다. 골아세포(도 13, "ALP+") 및 파골세포(도 13, "TRAP") 활성은 결절에서 골 재형성 과정이 투여 4주 후에도 여전히 진행중이었음을 보여주는 석회화 결절에서 대부분 검출되었다. 이러한 관찰은 결절의 크기에 좌우되었다: 결절이 클수록 투여 4주 후에도 더 많은 ALP 및 TRAP 활성이 여전히 존재한다. 약한 유골(도 13, "골드너의 마슨 삼색 염색")은 골형성 과정이 완료됨을 나타내면서 강조되었다.
이에 따라, 골형성 세포 C 동결보존은 골 신형성을 증가시켰다.
이는 장골뿐만 아니라 편평골에서 골 결손의 치료를 위한, 명세서 및 실시예에 기재된 세포산물 및 세포 조성물의 유용성을 입증한다.
실시예 3: 골형성 세포 A, 결형성 세포 B 및 골형성 세포 C 동결보존에 의해 수복된 체내 마우스 대퇴부 구역 아임계 크기 결함(sub- CSD )
실험 과정
세포 배양
골형성 세포 A, 골형성 세포 B 및 골형성 세포 C 동결보존을 실시예 1에 기재된 바와 같이 준비하였다.
대퇴부 구역 sub- CSD 모델
문헌에 따라 무균 조건하에 수술을 수행하였다(Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19 (4) : 271-80; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116) : 52940). 간단히, 13주령 암컷 NMRI-누드(nu/nu) 마우스(n=73)를 덱스메데토미딘 히드로클로라이드((Dexdomitor®, Orion Pharma, 1 mg/kg 체중) 및 케타민(Nimatek®, Euronet, 150 mg/kg 체중)의 믹스의 복강 내 주사로 마취하였고 가온 플레이트 위 복부 위치로 놓았다. 좌측 대퇴골의 앞쪽에 4 또는 5개 나사로 고정된 6-홀 티타늄 마이크로로킹(micro-locking) 플레이트(RISystem AG®)를 적용한 후, 기글리(Gigli) 톱과 지그(RISystem AG®)를 이용하여 2 mm 길이의 중간 골간 대퇴부 골절술을 수행하였다. 예방 약물로서, 항생제(Baytril®, 10 mg/kg 체중)를 수술 전날에 투여하였고(음용수로) 진통제(부르페노르핀 히드로클로라이드, Temgesic®, Schering-Plough, 0.1 mg/kg 체중)를 수술 전날 및 수술 후 적어도 3일간 12시간 마다 투여하였다. MSC 유래 세포(마우스당 30 μl의 부피로 2.25 x 106 세포)를 50 μl 해밀톤(Hamilton) 주사기를 사용한 피하 주사에 의해 골 결손 부위에 국소로 수술 당일(수술 봉합사로 상처를 폐쇄한 직후)에 투여하였다. 경추 탈구에 의해 세포 또는 부형제 투여 6 또는 10주 후에 마우스를 안락사시켰다. 각 마우스의 좌측 대퇴골을 절개하고, 채취하여 X-선 촬영까지 실온에서 0.9% NaCl에 보관하였다.
X-선 분석에 의한 골 수복의 정량화
플레이트 고정, 구역 대퇴부 결함 크기를 대조하고 기준선을 얻기 위해 Faxitron® MX-20 장치를 사용하여 각 마우스의 좌측 대퇴골의 체내 X-선 촬영을 수술 직후 및 2주 마다 수행하였다. 전압 35 kV, 노출 시간 4.8초, 명도 4,300 및 콘트라스트 7,100으로 설정하여 수동 모드로 5X 배율에서 중외측 뷰 및 전후 뷸로 디지털 이미지를 촬영하였다. 안락사 세포 투여 6주 후에 채취한 좌측 대퇴골에 생체 외 X-선 촬영을 수행하였다. 골형성 세포 A 및 골형성 세포 B 실험을 위해, ImageJ® 소프트웨어를 사용하여 중외측 및 전후 X-선 이미지(총 6회 측정)상에서 3개 위치(결함의 우측, 중간 및 좌측)에 골 결함의 두 가장자리 사이의 거리(μm)를 측정함으로써 각 마우스에 대해 경시적으로 결함 크기를 정량화하였다. 마우스별로 매 시점에 6회 측정의 평균을 계산하였다.
골형성 세포 C 동결보존 실험을 위해, ImageJ® 소프트웨어를 사용하여 중외측 및 전후 X-선 이미지(총 4회 측정)상에서 2개 위치(양쪽 피질)에 골 결함의 두 가장자리 사이의 거리(μm)를 측정함으로써 각 마우스에 대해 경시적으로 결함 크기를 정량화하였다. 마우스별로 매 시점에 4회 측정의 평균을 계산하였다.
SFCSD 모델에 적합한 RUS(방사선 유니온 스코어)는 골 신형성, 가교(bridging) 및 골절선의 존재 또는 부재를 기초로 반정량화 측정이다(전후 및 중외측 방사선 이미지로부터). 점수는 양쪽 뷰 상에 2개 피질 결함 부위에서 결정된 4 스코어의 합에 해당한다(각각 1 내지 4 범위의 4 스코어의 전체). 따라서 점수는 4(치유 징후 무) 내지 16(완전 융합)의 범위이다.
융합 스코어는 대퇴부 결함의 가장자리 사이 융합률을 평가하는 이진 스코어이다. 융합을 정의하는데 사용된 방사선학적 기준은 적어도 3개의 피질에서 결함의 가교의 가시화이다(Cekic E et al., Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48(5), 533-40). 스코어는 0(융합 무) 또는 1(융합)이다. 이 파라미터에 대해, 최종 시점만이 분석되었다(W10, 여기서).
마이크로컴퓨터 단층 촬영(micro-CT) 분석
안락사에서 채취 후, 좌측 대퇴골을 3.7% 포름알데히드로 고정시켜 마이크로 CT 분석을 위해 CMMI(Center For Microscopy and Molecular Imaging, ULB, Gosselies, Belgium)로 이동시켰다. 다중 모드 microPET/CT nanoScan® PET/CT 카메라 (Mediso) 및 Nucline ™ v2.0l 소프트웨어 (Mediso)를 사용하여 샘플을 스캐닝하였다. 반원형 스캔, 최대 줌, 35 kVp의 튜브 텐션(tube tension), 갠트리(gantry) 회전당 720 프로젝션(projection), 프로젝션당 300 ms의 노출 시간, 1 대 1의 검출기 픽셀 비닝(pixel binning)을 이용하여 스캔을 수행하였다. X와 Y 치수의 스캔 길이는 각 획득(acquisition)에 맞게 조정되었다. micro-CT 스캐닝의 전체 기간은 3분 42초이었다. Shepp-Logan 필터 및 8개 정규 샘플의 다중 샘플링 모드를 이용하여 각 micro-CT 스캔을 40 μm 사이드의 입방 복셀(voxel)로 사후 재구성하였다. X와 Y 이미지의 치수는 각 재구성에 맞게 조정되었다. Z 이미지의 크기는 획득에 대해 정의된 스캔 길이에 해당하였다. 골을 Z 축(스캐너 축)과 재배향하고 Z 축상 대퇴부 골에서 한 근위 나사에서 다른 근위 나사로, 그리고 가로(X-Y) 평면에서 가능한 한 좁게 이미지를 절단한(cropping) 후 micro-CT 이미지에 대해 골 수복의 정성적 평가를 수행하였다. 그 후, 3D 최대치 투영법(Maximum Intensity projection, MIP) 렌더링(rendering)이 생성되었다. 골 수복을 정량적으로 평가하기 위해, 직경 2 mm 및 축 길이 2 mm의 가상 실린더를 micro-CT 스캔상의 결함 공간에 놓고 1500 HU 이상의 방사선 강도로 복셀을 역치화(thresholding) 함으로써 이 실린더에서 평균 골 부피를 평가하였다.
결과
골형성 세포 B 및 골형성 세포 C 동결은 마우스 대퇴부 아임계 구역 결함을 개선하였다.
NMRI-누드 마우스의 아임계 크기 구역 결함(CSD) 모델에서, 골형성 세포 B(n-12 마우스, 2 배치)는 투여 2 내지 6주 후 부형제(n=11 마우스)에 비해, 그리고 골형성 세포 A(n=4 마우스)에 비해 골 결함 크기의 현저한 감소로 나타난 바와 같이 골절 수복을 개선하였다(도 8A).
부형제, 골형성 세포 A(도시 안됨) 또는 골형성 세포 B의 투여 후 D0 및 6W에 구역대퇴부 결함의 X-선 이미지에서는 부형제(도 8B) 또는 골형성 세포 A(도시 안됨)로 투여된 마우스와 비교하여 본 발명의 실시형태에 따른 골형성 세포 B로 투여된 마우스에서 골 결함 크기의 감소를 나타냈다.
부형제와 골형성 세포 B의 투여 후 6W에 구역 대퇴부 결함의 골 수복 부피를 마이크로컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)에 의해 정량화하였다. 결과로서 골형성 세포 B는 부형제에 비해 더 큰 골 수복을 유도하였음을 확인하였다(도 8C).
골형성 세포 C 동결보존은 투여 2 내지 10주 후(n=38 마우스(19 처리 및 19 부형제로 대조, 2 배치; p<0.001) 부형제와 비교하여 구역 대퇴부 sub-CSD 모델에서 골절 수복 퍼센트를 상당히 개선하였고 가속하였다(도 14 및 15). 더구나, RUS 스코어는 부형제 그룹에 비해 골형성 세포 C 동결보존 그룹에 대해 상당히 증가하였다(도 16). 끝으로, 융합률 또한 부형제 투여 후 융합 무와 비교하여 골형성 세포 C 동결보존의 투여 10주 후에 마우스의 9/19(47%) 융합으로 개선되었다.
실시예 4: 실시예 2 및 3에서 골형성능을 보여준 MSC 유래 세포의 체외 세포 특성화
재료 및 방법
세포 배양
MSC, 세포산물 A와 세포산물 B, 세포산물 C 신선 및 세포산물 C 동결을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득한다.
유세포 분석
세포 표면 마커의 특성화를 유세포 분석에 의해 수행하였다. PBS-1% BAS 내 1x106 세포/ml의 농도에서 50,000 세포를 어둠에서 5μl의 항체로서 10분간 배양하였다. 이 배양 시간 후, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 세포외 염색에 사용된 상이한 항체들은 다음과 같다: CD105 (BD Biosciences®, Cat N°: 562408) 및 CD73 (BD Biosciences®, Cat N°:560847)에 대해 알로피코시아닌(APC)-공액 항체, 및 CD10 (BD Biosciences®, Cat N°: 555375) 및 CD44 (BD Biosciences®, Cat N°: 550989)에 대해 피코에리트린(PE)-공액 항체. 세포를 FITC, APC 및 PE(모두 각각 BD Biosciences®, Cat N°: 556649; 555751; 556650)와 함께 배양함으로써 비특이 염색을 결정하였다. 분석 전에, 일중항(singulet) 및 관심 집단의 게이팅을 도 9에 기재한 바와 같이 수행하였다. FACSCanto™II (BD Biosciences®) 및 FACSDiva™ 8.0 소프트웨어 (BD Biosciences®)를 사용하여 게이팅된 집단의 10 000 이벤트에 대해 유세포 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 설정 파라미터를 비드(BD CompBeads Plus®, Cat N°560497)로 자동 수행하였다. 각 공액에 대해, 양성 컷오프를 대조 이소형 항체의 양성 1%에 고정하였고 각 마커의 양성을 결정하였다. 분석된 전체 집단의 형광 중앙(MFI)이 또한 결정되었고 상응하는 이소형 대조 항체의 MFI로 나누어 정규화 MFI(nMFI)를 얻었다.
결과
유세포 분석으로 세포산물 A, 세포산물 B(선행 기술에 따른 비교 방법으로 생성됨), 및 최종 동결보전이 있거나 없는 세포산물 C(본 발명에 예시된 방법으로 생성됨)의 세포 표면 마커 발현 프로파일을 기반으로 일반적인 세포 동일성(identity)이 비교할만하였다고 밝혔다.
이들 모두는 간엽 마커 CD73, CD90 및 CD105를 발현하였고 조혈 마커 CD45, CD34 및 CD3을 발현하지 못했다(세포 집단의 5% 미만이 이들 마커를 발현하였다)(표 4). 세포산물 A, 세포산물 B 및 세포산물 C(최종 동결보전이 있거나 없는)는 HLA-DR과 같은 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체를 낮은 수준으로 발현하였다. HLA-DR의 약한 발현으로 대표되는 약한 면역원성은 유리하게는 예를 들어 동종이계(allogeneic) 피험체에 세포 이식을 허용한다(표 4). 또한, 세포산물 A, 세포산물 B, 및 세포산물 C(최종 동결보존이 있거나 없는)는 미분화 MSC와 비교하여 이들의 세포 표면상에 효소 ALP를 고발현하였다(표 4 및 5). ALP의 고발현은 골아세포계 쪽으로 세포산물 A, 세포산물 B, 및 세포산물 C(최종 동결보존이 있거나 없는)의 관여(commitment)를 강조한다. 세포산물 A, 세포산물 B, 및 세포산물 C(최종 동결보존이 있거나 없는)는 또한 미분화 MSC와 비교하여 세포 마커 CD10을 고발현하지 않았다(표 4).
비교 세포산물(즉, MSC, 세포산물 A, 세포산물 B) 및 본 발명을 예시하는 세포산물(즉, 세포산물 C)의 세포 표면 마커 발현 프로파일
마커 발현
( %로 ) 		통계 MSCs 세포산물 A 세포산물 B 세포산물 C 신선 세포산물 C 동결보존
CS10 CS10 희석 HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10%HSA
CD73-APC 평균 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
표준편차 0.0 0.0 0.0 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0
N 6 11 22 15 10 2 3 3
CD90- PE 평균 100.0 99.9 99.9 99.7 99.9 99.5 99.9 99.8
표준편차 0.1 0.2 0.2 0.6 0.2 0.7 0.2 0.4
N 8 12 22 18 10 2 3 3
CD105-APC 평균 100.0 99.8 100.0 99.9 100.0 100.0 100.0 100.0
표준편차 0.0 0.5 0.1 0.3 0.0 0.0 0.0 0.0
N 8 12 20 18 10 2 3 3
CD45- FITC 평균 ND ND ND 1.3 1.0 0.9 0.6 1.0
표준편차 0.7 0.3 0.0 0.3 0.1
N 0 0 0 16 10 2 3 3
CD45-APC 평균 0.4 0.3 1.0 ND ND ND ND ND
표준편차 0.2 0.2 2.9
N 8 12 19 0 0 0 0 0
CD34-APC 평균 0.6 1.0 1.6 2.1 1.6 2.8 3.3 1.5
표준편차 0.4 0.6 1.8 1.6 0.9 2.2 2.2 1.0
N 8 12 22 16 10 2 3 3
CD3- PE 평균 0.2 0.1 0.2 0.0 0.1 0.1 0.0 0.0
표준편차 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 　 0.1 0.1
N 6 10 17 16 10 1 3 3
HLA -DR- PE 평균 0.7 1.0 1.8 1.6 0.9 1.4 1.4 1.4
표준편차 1.2 0.6 2.0 1.8 0.7 0.8 0.8 0.9
N 8 12 22 16 10 2 3 3
HLA -DR/DP/DQ-FITC 평균 1.0 1.6 1.6 2.0 1.5 1.8 1.8 1.6
표준편차 0.4 1.1 1.1 1.6 0.7 0.6 0.8 0.2
N 8 12 22 16 10 2 3 3
ALP- PE 평균 40.7 88.7 94.8 96.2 96.2 97.7 98.7 98.4
표준편차 　 5.6 6.6 4.4 3.6 2.0 0.9 1.7
N 1 5 10 18 10 3 2 3
CD49e - PE 평균 92.7 99.6 99.8 99.9 100.0 99.9 99.8 99.9
표준편차 20.5 1.1 0.5 0.4 0.1 0.2 0.4 0.2
N 8 12 19 18 10 3 2 3
CD44- PE 평균 99.9 99.7 100.0 100.0 100.0 100.0 99.9 100.0
표준편차 0.2 0.5 0.0 0.1 0.0 0.1 0.2 0.1
N 8 12 22 18 10 3 2 3
CD10- PE 평균 19.6 99.6 98.8 99.3 99.5 99.3 99.1 98.9
표준편차 14 0.4 1.5 16 0.5 0.6 0.4 0.7
N 10 12 25 16 10 2 3 3
약호: ALP: 알칼리 포스파타아제; APC: 알로피코시아닌 ; FITC : 플루오레세인 이소티오시아네이트; HLA-DR: 인간 백혈구 항원 - DR 이소형 ; HLA -DR/DP/ DQ : 인간 백혈구 항원 - DR/DP/ DQ 이소형 ; MSC : 간엽 줄기 세포 ; ND: 결정 불가; PE : 피코에리트린; SD: 표준편차
비교 세포산물(즉, MSC, 세포산물 A, 세포산물 B) 및 본 발명을 예시하는 세포산물(즉, 세포산물 C)의 ALP 발현 수준
통계 MSCs 세포산물 A 세포산물 B 세포산물 C 신선 세포산물 C 동결보존
CS10 CS10 희석 HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10%HSA
ALP- PE 집단 양성 ( % ) 평균 40.7 88.7 94.8 96.2 96.2 98.7 97.7 98.4
표준편차 　 5.6 6.6 4.4 3.6 0.9 2.0 1.7
N 1 5 10 18 10 2 3 3
ALP- PE 표면 발현 수준 (nMFI) 평균 2.4 19.8 56.1 60.3 38.0 57.7 42.7 41.2
표준편차 　 10.8 27.4 38.9 24.2 43.1 37.2 31.3
N 1 5 10 18 10 2 3 3
ALP 효소 활성 ( mU /mg 총 단백질) 평균 176.3 671.9 874.7 895.5 801.5 ND 719.9 633.6
표준편차 252.9 305.8 772.9 387.3 351.3 277.0 263.9
N 3 9 26 12 5 0 2 2
약호 : ALP: 알칼리 포스파타아제; ND: 결정 불가; PE : 피코에리트린;
세포 표면 마커 발현 프로파일은 세포 표면상에 마커의 존재(집단 양성 퍼센트) 뿐만 아니라 서로 다른 마커의 세포 표면상에 발현된 마커의 양을 분석하는 것(집단 정규화 중간 형광)을 특징으로 하였다. 이들 분석은 서로 다른 MSC 유래 세포 사이의 일부 차이를 강조하였다.
헤파린의 존재하에 배양된 세포산물 B 및 세포산물 C(최종 동결보존이 있거나 없는)는 MSC보다 더 높은 수준의 ALP를 발현하였고 헤파린 부재하에 배양된 세산물 A(ALP-PE nMFI 결과)는 골형성 세포의 골아세포계 쪽으로 이들의 관여를 강화하였다.
세포 표면상에 간엽 마커 CD73 및 CD105의 발현은 또한 세포형에 좌우되었다. 헤파린의 존재하에 생성된 세포산물(세포산물 B 및 최종 동결보존이 있거나 없는 세포산물 C)은 세포산물 A보다 더 높은 수준의 CD73 및 CD105를 발현하였다. 또한, 특히 세포산물 C가 최종 동결보존을 수행하지 않았을 때 세포산물 C는 세포산물 B보다 더 많은 CD73 및 CD105를 이들의 표면상에 보유하는 것으로 보였다(표 6). 분화 세포산물 A, B 및 C는 미분화 MSC보다 더 많은 양의 세포 마커 CD10을 발현한다. 또한, 세포산물 C는 세포산물 A 및 B보다 더 많은 CD10을 이들의 표면상에 보유한다(표 6).
상기를 고려하여, CD73, CD105, CD10 또는 CD44 중 하나 이상을 발현하는 양; 및/또는 세포 표면상에 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 기준으로 산물 B 및 C가 실시예 2 및 3에서 골유도능 및 높은 골형성능을 나타낸 세포산물 B 및 세포산물 C(최종 동결보존이 있거나 없는)는 산물 A가 실시예 2 및 3에서 골유도능 및 낮은 골형성능을 나타낸 세포산물 A로부터 구분될 수 있는 것으로 보인다.
더 구체적으로는, 표 4 및 6을 기준으로, 세포산물 B 및 세포산물 C의 세포 중 적어도 90%가 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하며(표 4) 세포산물 B 및 세포산물 C의 세포가 적어도 500의 nMFICD73, 적어도 100(또는 적어도 150)의 nMFICD44, 및 많아야 150의 nMFICD105를 갖는(표 6) 것으로 보인다. 한편, 세포산물 A의 세포는 500 미만의 nMFICD73 및 100 미만(또는 150 미만)의 nMFICD44를 가지며; MSC는 500 미만의 nMFICD73 및 150 초과의 nMFICD105를 갖는다(표 6).
따라서, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양과 조합하여 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양은 MSC 또는 세포산물 A의 세포로부터 세포산물 B 및 세포산물 C의 세포를 구분하는데 적합하고 충분하다. 이에 따라, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양과 조합하여 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양은 체외 분화 세포가 골형성능을 가지는지 판정하는데, 및 특히 체외 분화 세포가 높은 골형성능을 가지는지 판정하는데 적합하고 충분하다.
비교 세포산물(즉, MSC, 세포산물 A, 세포산물 B) 및 세포산물 C의 추가 세포 표면 마커 발현 결과
마커 발현 (nMFI로) 통계 MSCs 세포산물 A 세포산물 B 세포산물 C 신선 세포산물 C 동결보존
CS10 CS10 희석 HSA 1:1 CS10 5%HSA HTS 10%DMSO 10%HSA
ALP- PE 평균 2.4 19.8 56.1 60.3 38.0 57.7 42.7 41.2
표준편차 　/ 10.8 27.4 38.9 24.2 43.1 37.2 31.3
N 1 5 10 18 10 2 3 3
CD73-APC 평균 234.8 130.7 646.3 996.9 703.9 777.8 719.2 784.2
표준편차 84.3 80.1 138.8 181.1 150.0 73.3 90.6 47.3
N 6 11 22 15 10 2 3 3
CD105-APC 평균 207.7 26.6 59.1 99.7 70.2 74.6 72.6 67.0
표준편차 67.6 15.2 13.1 27.0 13.1 2.3 4.2 3.9
N 8 12 20 18 10 2 3 3
CD44- PE 평균 139.8 62.0 156.6 362.8 378.4 185.5 227.5 261.3
표준편차 57.5 19.1 40.7 250.4 205.3 19.6 80.1 147.7
N 8 12 22 18 10 2 3 3
CD49e - PE 평균 81.0 22.5 33.5 44.3 39.6 35.7 35.2 36.87
표준편차 51.4 9.9 11.0 8.0 7.4 3.3 3.5 10.0
N 8 12 19 18 10 2 3 3
HLA -ABC-FITC 평균 26.1 21.6 80.2 115.7 104.7 71.5 79.5 70.1
표준편차 　/ 5.2 17.4 22.0 24.9 27.2 22.1 18.0
N 1 4 8 16 10 2 3 3
CD10- PE 평균 0.8 36.2 32.2 64.0 59.3 63.8 64.1 57.9
표준편차 1.1 16.4 16.8 38.5 30.5 45.5 35.4 32.9
N 8 12 22 18 10 2 3 3
약호 : ALP: 알칼리 포스파타아제; APC: 알로피코시아닌 ; FITC : 플루오레세인 이소티오시아네이트; HLA-ABC: 인간 백혈구 항원 ABC; HLA -DR: 인간 백혈구 항원 - DR 이소형; MSC : 간엽 줄기 세포 ; NA: 적용 불가; ND: 결정 불가; PE : 피코에리트린; SD: 표준편차
또한, nMFI 유세포 분석에서는 CD73 및 CD44 단백질 발현이 골형성 세포 B를 포함한 다른 세포형에서보다 골형성 세포 C에서 더 컸다(도 10).

Claims (15)

  1. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하기 위한 CD73, CD105, CD44 및 CD10의 용도.
  2. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법으로서, CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 양을 측정하는 단계, 및 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계를 포함하는 판정 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a1) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 측정하는 단계;
    (a2) 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 측정하는 단계;
    (b1) 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프(cut-off) 값과 비교하는 단계;
    (b2) 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44 중 하나 이상의 양을 공지의 골형성능을 가진 세포를 대표하는 각각의 하나 이상의 컷오프 값과 비교하는 단계;
    (c1) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a1)에서 측정된 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 분율에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계;
    (c2) 상기 컷오프 값으로부터 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD105 또는 CD44의 어느 하나의 양에 대한 편차 또는 무 편차를 찾는 단계; 및
    (d) 상기 편차 또는 무 편차를 체외 분화 세포의 골형성능에 대한 특별한 판정으로 귀착시키는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값과 단계 (b2)의 상기 각각의 컷오프 값은 임상적으로 유용한 골형성능을 가진 세포를 대표하는 컷오프 값인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD73, CD105, CD44 또는 CD10 중 하나 이상의 양이 측정되는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    - 단계 (b1)의 컷오프 값과 비교한 단계 (a1)에서 측정된 체외 분화 세포의 동일하거나 증가된 분율은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있다는 것을 나타내며;
    - 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD73, CD44및/또는 CD10의 동일하거나 증가된 양, 및 단계 (b2)의 각각의 컷오프 값과 비교한 단계 (a2)에서 측정된 CD105의 동일하거나 감소된 양은 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 갖고 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
  7. 제3항 내지 제6항에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값이 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; 단계 (b2)의 상기 컷오프 값이 500의 CD73에 대한 정규화 중간 형광 강도(nMFI), 100의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 40의 CD10에 대한 nMFI인 방법.
  8. 제3항 내지 제6항에 있어서, 단계 (b1)의 상기 컷오프 값이 세포 표면상에 CD73, CD105, CD10 및 CD44를 발현하는 체외 분화 세포의 90%이며; 단계 (b2)의 상기 컷오프 값이 500의 CD73에 대한 정규화 중간 형광 강도(nMFI), 150의 CD44에 대한 nMFI, 150의 CD105에 대한 nMFI 및/또는 40의 CD10에 대한 nMFI인 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 체외 분화 세포에 의해 발현된 CD73, CD105 및 CD44의 양이 측정되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (b2)의 상기 컷오프 값이 500의 CD73에 대한 nMFI, 100의 CD44에 대한 nMFI 및 150의 CD105에 대한 nMFI인 방법.
  11. l제1항에 있어서 또는 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 체외 분화 세포는 간엽 줄기 세포(MSC)로부터 수득되는 것인 용도 또는 방법.
  12. 제1항에 있어서 또는 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 체외 분화 세포는 인간 세포인 용도 또는 방법.
  13. 연골-골아세포계(chrondro-osteoblastic lineage)의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체(subject)를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 선택 방법:
    - 피험체의 생물학적 샘플로부터 MSC를 회수하는 단계;
    - MSC로부터 체외 분화 세포를 수득하는 단계;
    - 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 단계; 및
    - 체외 분화 세포가 임상적으로 유용한 골형성능을 가지는 경우 연골-골아세포계의 체외 분화 세포를 제조하기 위한 피험체를 선택하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 피험체는 인간 피험체인 방법.
  15. 체외 분화 세포의 골형성능을 판정하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 판정 방법;
    - 체외 분화 세포의 세포 표면상에 CD10의 양을 측정하는 단계; 및
    - 체외 분화 세포가 적어도 40의 CD10에 대한 nMFI를 갖는 경우 체외 분화 세포는 골형성능이 있다고 판정하는 단계로서, 바람직하게는 nMFICD10은 PE에 대한 488 nm의 여기 파장 및 580 nm의 방출 파장으로 측정되는 단계.
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