CN113260713A - 确定体外分化细胞的成骨潜能的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了CD73、CD105、CD44和/或CD10在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。本申请还提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，包括测量表达CD73、CD105、CD10和/或CD44的体外分化细胞的量，和/或测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105和/或CD44的量。本发明还提供了选择用于制备成软骨‑成骨细胞谱系的体外分化细胞的受试者的方法，该方法包括从受试者的生物样品回收MSC；从MSC获得体外分化细胞；通过本文公开的方法确定体外分化细胞的成骨潜能；以及如果该体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，则选择所述受试者用于制备成软骨‑成骨细胞谱系的体外分化细胞。
Description
发明领域
本发明涉及确定体外分化细胞的成骨潜能的方法和用途。更具体地，本发明涉及包括测量一种或多种细胞标志物的确定体外分化细胞的成骨潜能的方法和用途。
发明背景
能够经历成骨分化的干细胞、定型于成骨分化的细胞或具有骨形成能力的细胞的移植是治疗骨相关疾病的有前途的方法，特别是治疗需要产生新骨组织时。
先前已将间充质干细胞(MSC)用于治疗骨病(Gangji et al.，2005Expert OpinBiol Ther 5:437-42)。然而，尽管可以移植此类相对未分化的干细胞，但它们不定型于成骨细胞谱系并且对骨组织形成的贡献可能主要是由旁分泌效应介导的。此外，从受试者可获得的用于治疗用途的MSC的量常常不令人满意。
已开发了几种体外扩增MSC并从MSC获得骨祖细胞、成骨细胞或成骨表型细胞的方法。通过此类方法获得的细胞在体外和体内可能具有不同程度的成骨潜能。因此，此类细胞移植后在体内产生的新骨组织的量并不总是可预测的，并且在某些情况下对于临床目的不是最佳的。
在体外培养细胞(如，体外分化的MSC衍生细胞)的移植之前，需要确定这些细胞是否具有临床上有用的成骨潜能。
发明概述
如示例本发明某些代表性实施方案的实验部分所证实的，本发明人意识到，可通过确定所述细胞的特异性细胞表面标志物表达谱来评估体外分化细胞(如，间充质干细胞(MSC)衍生细胞)的成骨潜能。更具体地，本发明人发现，通过测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105、CD10和CD44全部)的体外分化细胞的量，并测量由细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105和CD44全部)的量，可确定细胞是否具有成骨潜能，特别是使细胞在临床环境中有用的成骨潜能。此外，本发明人还发现，使用本文公开的确定MSC衍生细胞的成骨潜能的方法，可选择特别适合作为MSC的供体的受试者用于制备成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞。
因此，一方面，本发明提供了CD73、CD105或CD44中任何一种或多种在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
优选地，本发明提供了CD73、CD105、CD44和CD10在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
另一方面，本发明提供了用于确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，所述方法包括测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量，以及测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。
优选地，本发明提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，其包括测量表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量，和/或测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。
另一方面，本发明提供了选择用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞的受试者的方法，所述方法包括：
-从受试者的生物样品回收MSC；
-从MSC获得体外分化细胞；
-通过如本文教导的方法确定体外分化细胞的成骨潜能；以及
-如果体外分化的细胞具有临床上有用的成骨潜能，则选择所述受试者用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞。
在以下各部分和所附权利要求中描述了本发明的这些和其他方面以及优选的实施方案。因此，所附权利要求书的主题特别地并入本说明书。
附图说明
图1示出施用单独的赋形剂(对照条件)、MSC衍生骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)或MSC衍生骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)后2周通过鼠和人的钙结合荧光染料证实在鼠骨颅盖冠状面上的骨新形成。
图2示出施用单独的赋形剂(阴性对照)、MSC衍生骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)或MSC衍生骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)后2周在鼠颅盖冠状面上进行的骨形成定量(％)。
图3示出施用MSC衍生骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)后2周在鼠骨颅盖冠状面上进行的抗鼠和抗人I型胶原双重免疫染色(免疫荧光)。图3a示出抗人和抗鼠I型胶原双重免疫染色(合并)，而图3b和图3c分别示出抗人和抗鼠I型胶原免疫染色。
图4示出施用单独的赋形剂、MSC、用FGF-2和TGFβ1产生的MSC衍生骨形成细胞A(b-f细胞A)或用FGF-2、TGFβ1和肝素产生的MSC衍生骨形成细胞B(b-f细胞B)后2周，鼠骨颅盖冠状面的组织学染色。(A)腹膜内依次注射钙结合荧光染料(茜素-红→钙黄绿素-绿→钙黄绿素-蓝→四环素)以证实骨新形成(箭头)并评估骨形成的动力学；(B)免疫荧光(IF)人+鼠I型胶原；(C)IF鼠I型胶原；(D)IF人I型胶原。进行抗人和抗鼠I型胶原的双重免疫荧光，以允许检测由骨基质分泌的人和鼠I型胶原；(E)ALP+戈德纳(Goldner)染色：ALP：检测成骨细胞活性，以黑色示(实线和区域)，Masson三色戈德纳：检测类骨质(未矿化骨组织)以黑色虚线示，矿化骨以深灰色线示；(F)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)：检测破骨细胞活性，以深灰色/黑色示。
图5表示示出施用单独的赋形剂；MSC；用FGF-2、TGFβ1产生的MSC衍生骨形成细胞A(b-f细胞A)；或用FGF-2、TGFβ1和肝素产生的MSC衍生骨形成细胞B(b-f细胞B)后2周，鼠骨颅盖冠状面上骨新形成的照片。通过荧光(通过不同荧光染料依次整合标记：茜素-红→钙黄绿素-绿→钙黄绿素-蓝→四环素黄)证实骨新形成。红色、绿色和蓝色染色显示为浅灰色，用双箭头指示骨新形成厚度。黄色染色用虚线包围。
图6表示示出施用MSC(深灰色)或骨形成细胞B(浅灰色)后2周在鼠颅盖切面上测量的新形成骨的总表面积的图(平均值±SEM，*p＜0.05)。
图7示出施用骨形成细胞B后一天(D1)和施用后一段时间(D7、D14、D21)直至28天(D28)在鼠骨颅盖矢状面上进行的矿化结节的软骨基质的番红-橙染色(用虚线包围)。
图8示出MSC衍生细胞在节段性股骨亚临界尺寸缺损模型中的作用。(A)代表示出施用单独的赋形剂、骨形成细胞A(b-f细胞A)或骨形成细胞B(b-f细胞B)后，在手术程序/项目施用当天(D0)和一段时间(1、2、3、4、5周)直至6周(6W)的X-射线图像上测量缺损尺寸的图；平均值±SEM，**p＜0.01，***p＜0.001；(B)代表施用单独的赋形剂或骨形成细胞B(b-f细胞B)后D0和6W时节段性股骨缺损的代表性X-射线图像；(C)代表示出施用单独的赋形剂(n＝7)和骨形成细胞B(n＝8)后6W时通过微型计算机断层扫描(Micro-CT)分析的骨修复的体积测量的图；平均值±SEM，*p＜0.05。
图9示出实施例5中使用的流式细胞术门控策略。
图10示出流式细胞术分析MSC、骨形成细胞A、B和C中CD73(上图)和CD44(下图)表达水平。(对于MSC、骨形成细胞A、B和C分别为N＝12,6，22，15(CD73)和N＝22,8,22,18(CD44)，其中N代表单个实验的数量)。
图11示出通过X射线分析评估的骨诱导和骨生成。A：通过测量与骨不透明度直接相关并因而与骨厚度直接相关的灰度强度值来评估骨诱导(A，左图)。通过X射线成像测量显示折射更强的结节表面来评估骨生成(A，右图)。B：与赋形剂相比，冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)的骨不透明度显著更高(n＝20(赋形剂)和n＝34(来自5个不同批次的B-F细胞C))。C：与未观测到矿化结节的赋形剂相比，骨生成的表面显著更高(n＝20(赋形剂)和n＝34(来自5个不同批次的B-F细胞C))。D至E：与赋形剂相比，冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)具有(图8D)或不具有(图8E)骨生成的骨诱导(由绝对骨形成表示)显著更高。曼-惠特尼U检验(Mann Whitney U-test)：***p≤0.001。F：除骨诱导活性外，冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)促进高的成骨活性，其通过4/5个骨髓供体(或批量生产)和65％的小鼠中存在至少一个矿化结节表明(n＝20(赋形剂)和n＝34(来自5个不同批次的B-F细胞C)。
图12示出单次施用冷冻保存的骨形成细胞C或赋形剂后4周的冠状组织切片。冷冻保存的骨形成细胞C通过以下两种机制显示活性：(i)“骨诱导”：通过导致膜内骨化的旁分泌刺激宿主骨形成，以及(ii)“骨生成”：通过软骨内骨化促进(来自供体/人来源的)“直接”骨形成。
图13示出接受单次注射冷冻保存的骨形成细胞C后4周的小鼠颅盖的组织学分析。冷冻保存的骨形成细胞C显示骨诱导和骨生成特性(“荧光(fluo)”)。人骨形成(“人I型胶原”)在矿化结节(骨生成)中突出显示。在矿化结节中大多检测到成骨细胞(“ALP”，第3个图中黑色箭头所示)和破骨细胞(“TRAP”，第4个图中黑色箭头所示)活性，表明施用后4周结节中的骨重塑过程仍在进行。无类骨质(“戈德纳Masson三色染色”)突出显示表明骨形成过程已完成。
图14示出冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)在节段性股骨亚临界尺寸缺损模型中的作用。X射线图像表示施用单独的赋形剂或冷冻保存的骨形成细胞C后第0天直至第10周的节段性股骨缺损。
图15示出冷冻保存的骨形成细胞C在节段性股骨亚临界尺寸缺损模型(sub-CSD模型)中的作用。该图表示手术程序/项目施用当天(“W0”)和施用单独的赋形剂或冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)后一段时间长达10周(“W10”)的X射线图像的骨修复百分比；平均值±SEM，***p<0.001(双向重复测量ANOVA)。
图16示出冷冻保存的骨形成细胞C在节段性股骨亚临界尺寸缺损模型(sub-CSD模型)中的作用。该图表示由手术程序/项目施用当天(“W0”)和施用单独的赋形剂或冷冻保存的骨形成细胞C(“B-F细胞C”)后一段时间长达10周(“W10”)的X射线图像确定的RUS评分；平均值±SEM，**p<0.01，***p≤0.001(双向重复测量ANOVA)。
发明详述
如本文所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括单数和复数指代物，除非上下文另外明确指出。
如本文所用的，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未叙述的成员、元件或方法步骤。该术语还包括“由……组成”和“基本上由……组成”，其享有专利术语中的公认含义。
由端点表述的数值范围的描述包括包含在相应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。
当涉及可测量值如参数、量、持续时间等时，如本文所用的术语“大约”或“约”是指包括指定值的变化和从指定值的变化，如指定值的以及从指定值的+/-10％或更小，优选+/-5％或更小，更优选+/-1％或更小，还更优选+/-0.1％或更小的变化，只要这些变化适于在所公开的发明中实施。应当理解，修饰语“大约”所指的值本身也具体地和优选地被公开。
术语“一个或多个”或“至少一个”，例如一个或多个成员或一组成员中的至少一个成员本身是清楚的，通过进一步的示例，该术语尤其包括对所述成员中的任何一个或对所述成员中的任何两个或更多个的引用，例如所述成员中的任何3或更多、4或更多、5或更多、6或更多或者7或更多等，以及直到所有所述成员。在另一个示例中，“一个或多个”或“至少一个”可以指1、2、3、4、5、6、7或更多。
本文中包括对本发明的背景论述以解释本发明的背景。这不应被认为是承认所引用的任何材料在任何权利要求的优先权日之前在任何国家是公开的、已知的或公知常识的一部分。
贯穿本公开内容，通过识别的引用提及各种出版物、专利和公开的专利说明书。本说明书中引用的所有文献都通过引用整体并入本文。特别地，本文特别提及的这些文献的教导或部分通过引用并入。
除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。当结合本发明的特定方面或本发明的特定实施方案来定义特定术语时，除非另外定义，否则此内涵意欲适用于本说明书全文，即，也适用于本发明的其它方面或实施方案的上下文中。
在以下段落中，更详细地限定本发明的不同方面或实施方案。除非明确地相反指出，如此定义的每个方面或实施方案可以与任何其它方面或实施方案组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何其他被指示为优选或有利的一个或多个特征组合。
在整个说明书中，提及“一个实施方案”意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定全部指代同一实施方案，而是可以指代同一实施方案。此外，如本领域技术人员从本公开中将显而易见的，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。此外，虽然本文描述的一些实施方案包括在其它实施方案中包括的一些而非其它特征，但是不同实施方案的特征的组合意图在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员将理解的。例如，在所附权利要求书中，任何要求保护的实施方案可以以任何组合使用。
本发明人认识到某些细胞表面标志物可用于确定体外分化细胞的成骨潜能。更具体地，发明人发现表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105、CD10和CD44全部)的体外分化细胞的量，以及由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105和CD44全部)的量，可用作确定体外分化细胞的成骨潜能的标志物。
如在整个说明书中所使用的，提及“CD73”、“CD105”，“CD44”或“CD10”表示从上下文显而易见的各个肽、多肽、蛋白或核酸，如在本领域中所述命名下通常已知的那样。该术语涵盖任何生物体，特别是动物，优选恒温动物，更优选脊椎动物，还更优选哺乳动物，包括人类和非人类哺乳动物，更优选人类中发现的此类肽、多肽、蛋白质或核酸。
如在整个说明书中使用的术语“蛋白质”通常涵盖包含一个或多个多肽链的大分子，即通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物链。该术语可涵盖天然、重组、半合成或合成产生的蛋白质。该术语还涵盖携带一个或多个共表达或表达后类型修饰多肽链的蛋白质，例如但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，磺化，甲基化，泛素化，信号肽去除，N端Met去除，酶原或前激素转化为活性形式等。该术语还包括蛋白质变体或突变体，其携带相对于相应天然蛋白质的氨基酸序列变化，如，例如氨基酸缺失、添加和/或取代。该术语涵盖全长蛋白质和蛋白质部分或片段，例如由于加工此类全长蛋白而成的天然存在的蛋白质部分。
如在整个说明书中使用的术语“多肽”通常涵盖通过肽键连接的氨基酸残基的聚合链。因此，就蛋白质仅由单个多肽链组成而言，术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用来表示此类蛋白质。该术语不限于多肽链的任何最小长度。该术语可以涵盖天然，重组，半合成或合成产生的多肽。该术语还涵盖携带一个或多个多肽链的共表达或表达后类型修饰的多肽，例如但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，磺化，甲基化，泛素化，信号肽去除，N端Met去除，酶原或前激素转化为活性形式等。该术语还包括多肽变体或突变体，其携带相对于相应天然多肽的氨基酸序列变化，如，例如氨基酸缺失、添加和/或替换。该术语涵盖全长多肽和多肽部分或片段，例如由于加工此类全长多肽而产生的天然存在的多肽部分。
如在整个说明书中使用的术语“肽”优选是指如本文所用的多肽，其基本上由50个氨基酸或更少，例如45个氨基酸或更少，优选40个氨基酸或更少，例如35个氨基酸或更少，更优选30个氨基酸或更少，例如25个或更少，20个或更少，15个或更少，10个或更少或5个或更少的氨基酸组成。
如在整个说明书中使用的术语“核酸”通常是指基本上由核苷单元组成的任何长度的聚合物(优选线性聚合物)。核苷单元通常包括杂环碱基和糖基。杂环碱基可包括尤其是嘌呤和嘧啶碱基，如广泛存在于天然存在的核酸中的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，其他天然存在的碱基(如，黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰(如，甲基化)，非天然或衍生碱基。示例性修饰的核碱基包括但不限于5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。特别地，已显示5-甲基胞嘧啶取代增加核酸双链体的稳定性，并且在例如反义试剂中可能是优选的碱基取代，甚至更特别是当与2'-O-甲氧乙基糖修饰组合时。糖基团可包括尤其是戊糖(戊呋喃糖)基团，如优选天然存在的核酸中常见的核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖，2-脱氧阿拉伯糖，苏糖或己糖糖基团，以及修饰或取代的糖基团(例如但不限于2'-O-烷基化(如2'-O-甲基化或2'-O-乙基化)的糖，如核糖；2'-O-烷氧基烷基化(如2'-O-甲氧基乙基化)的糖，如核糖；或2'-O、4'-C-亚烷基连接(如2'-O，4'-C-亚甲基连接或2'-O，4'-C-亚乙基连接)的糖，如核糖；2'-氟-阿拉伯糖等)。核苷单元可通过许多已知核苷间连接中的任何一种彼此连接，包括尤其是天然存在的核酸中常见的磷酸二酯连接，以及进一步修饰的基于磷酸酯或膦酸酯的连接，例如硫代磷酸酯，烷基硫代磷酸酯(如硫代磷酸甲酯)，二硫代磷酸酯，烷基膦酸酯(如甲基膦酸酯)，烷基硫代磷酸酯，磷酸三酯(如烷基磷酸三酯)，氨基磷酸酯，磷酸哌嗪酸酯，磷酸吗啉酸酯，桥接的氨基磷酸酯，桥接的亚甲基膦酸酯，桥接的硫代磷酸酯；以及另外的硅氧烷，碳酸酯，氨基磺酸酯，烷氧碳酰，乙酰亚胺酯，氨基甲酸酯(如3'-N-氨基甲酸酯)，吗啉基，硼烷，硫醚，3'-硫缩醛和砜核苷间连接。优选地，核苷间连接可以是基于磷酸酯的连接，包括经修饰的基于磷酸酯的连接，如更优选为磷酸二酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接或其组合。术语“核酸”还涵盖任何其他含核碱基的聚合物，如核酸模拟物，包括但不限于肽核酸(PNA)，具有磷酸基的肽核酸(PHONA)，锁核酸(LNA)，吗啉代二氨基磷酸酯主链核酸(PMO)，环己烯核酸(CeNA)，三环DNA(tcDNA)和具有带有烷基接头或氨基接头的主链部分的核酸(参见，例如Kurreck 2003(Eur JBiochem 270：1628–1644))。如本文所用的“烷基”特别涵盖低级烃部分，例如C1-C4直链或支链的饱和或不饱和烃，例如甲基，乙基，乙烯基，丙基，1-丙烯基，2-丙烯基和异丙基。如本文意图的，核酸可包括天然存在的核苷，修饰的核苷或其混合物。修饰的核苷可包括修饰的杂环碱基，修饰的糖部分，修饰的核苷间连接或其组合。术语“核酸”进一步优选涵盖DNA、RNA和DNA/RNA杂合分子，具体包括hnRNA，前体mRNA，mRNA，cDNA，基因组DNA，扩增产物，寡核苷酸和合成(如化学合成)的DNA，RNA或DNA/RNA杂合体。核酸可以是天然存在的(如存在于自然界中或从自然界分离)，可以是重组的(即通过重组DNA技术产生)，和/或可部分或全部以化学或生物化学方式合成。“核酸”可以是双链的，部分双链的或单链的。在单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。另外，核酸可以是环状或线性的。
通过另外的指导，CD73在本领域中又称为外-5'-核苷酸酶，NT，eN，NT5，NTE，eNT，E5NT和CALJA。CD73是糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的细胞表面酶。举例来说，人CD73基因以NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)基因ID4907注释，人CD73蛋白以Uniprot(www.uniprot.org)登录号P21589.1注释。人CD73的mRNA和蛋白质序列以以下NCBIGenbank登录号注释：CD73 mRNA(NM_002526.3；NM_001204813.1)，CD73蛋白质(NP_002517.1；NP_001191742.1)。
通过另外的指导，CD105在本领域中又称为内皮糖蛋白(ENG)，END，FLJ41744，HHT1，ORW和ORW1。CD105是位于细胞表面的I型膜糖蛋白。举例来说，人CD105基因以NCBIGenbank基因ID 2022注释，人CD105蛋白以Uniprot登录号P17813.2注释。人CD105的mRNA和蛋白质序列以以下NCBI Genbank登录号注释：CD105(NM_001114753.2；NM_000118.3；NM_001278138.1)，CD105蛋白(NP_001108225.1；NP_000109.1；NP_001265067.1)。通过另外的指导，CD44在本领域中又称为归巢细胞粘附分子(HCAM)，Pgp-1(吞噬糖蛋白-1)，Hermes抗原，淋巴细胞归巢受体(LHR)，ECM-III，HUTCH-1，IN，MC56，MDU2，MDU3，MIC4，Pgp1，CDW44，CSPG8，HCELL，HUTCH-I和ECMR-III。CD44是参与细胞间相互作用、细胞粘附和迁移的细胞表面糖蛋白。举例来说，人CD44基因以NCBI Genbank基因ID 960注释，人CD44蛋白以Uniprot登录号P16070.3注释。人CD44的mRNA和蛋白质序列以以下NCBI Genbank登录号注释：CD44mRNA(NM_000610.3，NM_001001389.1，NM_001001390.1，NM_001001391.1，NM_001001392.1，NM_001202555.1，NM_001202556.1，NM_001202557.1)，CD44蛋白(NP_000601.3，NP_001001389.1，NP_001001390.1，NP_001001391.1，NP_001189484.1，NP_001189484.1，NP_001189485.1，NP_001189486.1)。
通过另外的指导，CD10在本领域中又称为膜金属内肽酶(MME)，NEP，SFE，CALLA，CMT2T和SCA43。CD10是II型跨膜糖蛋白。举例来说，人CD10基因以NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)基因ID 4311注释，人CD10蛋白以Uniprot登录号P08473.2注释。人CD10的mRNA和蛋白质序列以以下NCBI Genbank登录号注释：CD10 mRNA(NM_000902.3，NM_007287.2，NM_007288.3，NM_007289.3，NM_001354642.1，NM_001354643.1，NM_001354644.1)，CD10蛋白(NP_000893.2，NP_009218.2，NP_009219.2，NP_009220.2，NP_001341571.1，NP_001341572.1，NP_001341573.1)。提醒读者，Genbank或Uniprot条目提供前体多肽或蛋白质序列的情况下，预期相应的成熟形式(如，例如缺乏信号肽)将存在于细胞的细胞表面上。
术语“CD73”，“CD105”，“CD44”和“CD10”特别涵盖此类具有天然序列的肽、多肽、蛋白质或核酸，即，其主要序列与自然界中存在或从自然界衍生的肽、多肽、蛋白质或核酸的序列相同。技术人员理解，由于不同物种之间的遗传差异，天然序列在此类物种之间可能有所不同。此外，由于给定物种内的正常遗传多样性(变异)，同一物种的不同个体之间或不同个体之内的天然序列可能有所不同。同样，由于体细胞突变或转录后或翻译后修饰，天然序列在同一物种的不同个体之间或甚至不同个体之内可能有所不同。肽、多肽、蛋白质或核酸的任何此类变体或同等型在本文中均是所意图的。因此，认为自然界中存在或从自然界衍生的肽、多肽、蛋白质或核酸的所有序列是“天然的”。当形成活细胞的一部分时，该术语涵盖肽、多肽、蛋白质或核酸。
第一方面提供了CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。因此，还提供了CD73、CD105或CD44中一种在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途；CD73、CD105或CD44中两种在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途；以及CD73、CD105和CD44中全部三种在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
某些实施方案提供了CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
某些实施方案提供了CD44在确定体外分化的细胞的成骨潜能中的用途。某些实施方案提供了CD44与CD73和CD105中任一种或两种在确定体外分化的细胞的成骨潜能中的用途。某些实施方案提供了CD44与CD73、CD105或CD10中任一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)在确定体外分化的细胞的成骨潜能中的用途。
某些实施方案提供了CD10在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。某些实施方案提供了CD10与CD73、CD105或CD44中任一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)在确定体外分化的细胞的成骨潜能中的用途。
如本文所用，术语“成骨潜能”是指体内和任选地体外细胞(转)分化为骨基质分泌细胞的能力或细胞分泌骨基质的能力(即，不需要(转)分化步骤)。该术语涵盖细胞通过膜内骨化或软骨内骨化形成骨组织的能力。细胞通过膜内骨化形成骨组织的能力通常代表细胞不需要钙化软骨基质作为模板而形成骨组织的能力。细胞通过软骨内骨化形成骨组织的能力通常代表细胞通过先形成钙化的软骨基质接着使用所述钙化的软骨基质作为骨组织形成的模板来形成骨组织的能力。该术语不涵盖细胞的骨诱导潜能，其代表细胞吸引其他骨基质分泌细胞和/或诱导其他细胞(转)分化为骨基质分泌细胞的能力。技术人员将理解，尽管本发明的目的是确定体外分化的细胞的成骨潜能，但是除了成骨潜能之外，这些细胞可以但不必具有骨诱导潜能。
在特定实施方案中，成骨潜能是细胞通过软骨内骨化形成骨基质的潜能。
在整个申请中使用的术语“软骨内骨化”是指骨组织形成的过程，其中第一软骨细胞形成软骨细胞外基质，随后成骨细胞将其用作沉积骨基质的模板。在软骨内骨化过程中，一些软骨细胞可转分化为成骨细胞。
在优选实施方案中，CD73、CD105和CD44全部均用于测定体外分化细胞的成骨潜能。
在特定实施方案中，除CD73、CD105和CD44中任何一种或多种，优选除CD73、CD105和CD44全部之外，还使用CD10来确定体外分化细胞的成骨潜能。因此，还提供了CD73、CD105、CD44和CD10在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
另一方面提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括(a1)测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的体外分化细胞的量，和/或(a2)测量体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量。因此，本文还提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括(a1)测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中一种的体外分化细胞的量，优选测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中两种的体外分化细胞的量，更优选测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中三种的体外分化细胞的量，最优选测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中全部四种的体外分化细胞的量；和/或(a2)测量体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中一种的量,优选测量体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中两种的量，最优选测量体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中全部三种的量。因此，本文还提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括(a1)测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中全部四种的体外分化细胞的量，和/或(a2)测量体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中全部三种的量。在具体实施方案中，本文教导的方法不包括测量除CD73、CD105、CD10或CD44之外的其他标志物。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的体外分化细胞的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量表达CD44的体外分化细胞的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量表达CD44与CD73和CD105中任何一种或两种的体外分化细胞的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量表达CD44与CD73、CD105或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的体外分化细胞的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量表达CD10的体外分化细胞的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量表达CD10与CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的体外分化细胞的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD73的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD73与CD105和CD44中任何一种或两种的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD73与CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(如，一种、两种或全部三种)的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD105的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD105与CD73和CD44中任何一种或两种的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD105与CD73、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD44的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD44与CD73和CD105中任何一种或两种的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量由体外分化细胞表达的CD44与CD73、CD105或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量体外分化细胞的细胞表面上或由体外分化细胞表达的CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量体外分化细胞的细胞表面上或由体外分化细胞表达的CD73、CD105、CD44和CD10的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量体外分化细胞表达CD10的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括测量体外分化细胞表达的CD10与CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括(a1)测量表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量，和/或(a2)测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括(a1)测量表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量，和/或(a2)测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的量。
如在整个说明书中使用的术语“表达”通常涵盖由细胞产生任何转录或翻译产物，如RNA、肽、多肽和蛋白质，以及在细胞表面上呈递肽、多肽或蛋白质。
通过另外的指导，当认为细胞对给定的基因、肽、多肽或蛋白质(如，CD73、CD105、CD10或CD44)呈阳性或细胞表达给定的基因、肽、多肽或蛋白质(如，CD73、CD105、CD10或CD44)或包含给定的基因、肽、多肽或蛋白质(如，CD73、CD105、CD10或CD44)的表达时，本领域技术人员实施能够检测或定量细胞内或细胞上基因、肽、多肽或蛋白质的测量时将推断对该基因、肽、多肽或蛋白质的独特信号的存在或证据。适当地，将基于比较针对细胞获得的测量结果与针对阴性对照(例如，已知不表达标志物的细胞)和/或阳性对照(例如，已知表达标志物的细胞)实施的相同测量的结果而推断对该基因、肽、多肽或蛋白质的独特信号的存在或证据。
当在样品中检测或确定分子或分析物(如，肽、多肽、蛋白质或核酸)，或者两种或更多种分子或分析物组(如，两种或更多种肽、多肽、蛋白质或核酸)的存在或不存在和/或量，优选基本排除其他分子和分析物时，在样品中“测量”所述分子或分析物或者所述分子或分析物组。术语“量”，“数量”和“水平”是同义的，并且在本领域中通常是容易理解的。如本文所用的术语可具体指样品中许多细胞、肽、多肽、蛋白质或核酸的绝对定量，或指样品中许多细胞、肽、多肽、蛋白质或核酸的相对量，即相对于另一个值，如相对于如本文所教导的参考值。肽、多肽或蛋白质的量也可由肽、多肽或蛋白质的活性来表示。样品中的肽、多肽或蛋白质的活性还可以以绝对术语(例如以每体积的酶单位)或相对术语表达。
样品中肽、多肽、蛋白质或核酸的绝对量可以有利地表示为重量或摩尔量，或者更通常地表示为浓度，例如重量/体积或摩尔/体积。
样品中肽、多肽、蛋白质或核酸的相对量可有利地表示为相对于所述另一个值(如，相对于如本文其他地方所述的参考值)的增加或减少或倍数增加或倍数减少。在第一参数和第二参数(例如，第一量和第二量)之间进行相对比较可以但不必要求首先确定所述第一参数和第二参数的绝对值。例如，测量方法可为所述第一参数和第二参数产生可量化的读出(如，例如信号强度)，其中所述读出是所述参数的值的函数，并且其中可直接比较所述读出以产生第一参数相比第二参数的相对值，而无需实际要求首先将读出转换为各自参数的绝对值。
细胞的相对量可表示为所分析细胞总数中细胞的百分比(分数)，更具体地，其为确定CD73、CD105、CD10或CD44中一种或多种的表达的细胞总数的百分比。因此，如本文所教导的测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(如，一种、两种、三种或全部四种)的体外分化细胞的量通常可包括(i)确定体外分化细胞表达(即，存在)CD73、CD105、CD10和/或CD44；(ii)计数步骤(i)中确定表达CD73、CD105、CD10和/或CD44的体外分化细胞的数目；以及(iii)计算步骤(i)中确定表达CD73、CD105、CD10和/或CD44的体外分化细胞相对于步骤(i)中检测的体外分化细胞总数目的分数。表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量可通过本领域已知的任何方法来测量。例如，通过流式细胞术。
因此，在特定实施方案中，表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的体外分化细胞的量是确定为表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞相对于所有分析的体外分化细胞的分数。
可通过用于测量细胞或细胞群内或者细胞或细胞群上的肽、多肽、蛋白质或核酸的存在或不存在(例如，存在相比不存在读出；或可检测的量相比不可检测的量)和/或量(例如，读出为绝对或相对量)的任何现有、可用或常规的检测和/或定量方法来进行体外分化细胞的CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的存在的确定和/或量的测量。例如，此类方法可包括生化测定法、免疫测定法、质谱分析法或色谱法或其组合。
在特定实施方案中，测量CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的存在和/或量包括测量CD73、CD105、CD10或CD44肽、多肽或蛋白质或者CD73、CD105、CD10或CD44 mRNA或两者。
在优选实施方案中，测量CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的存在和/或量包括测量CD73、CD105、CD10或CD44肽、多肽或蛋白质。
由于CD73、CD105、CD10和CD44肽、多肽或蛋白质的每一种通常在细胞表面上表达，技术人员将理解，如果提及细胞表面上的CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，意图在于肽、多肽或蛋白质形式，或者如果提及CD73、CD105、CD10或CD44肽、多肽或蛋白质中任何一种或多种，则意图在于细胞表面上的CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种。
在具体的实施方案中，测量CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的存在和/或量包括测量细胞表面上的CD73、CD105、CD10或CD44肽、多肽或蛋白质。
在更具体的实施方案中，测量活细胞的细胞表面上非变性形式的CD73、CD105、CD10或CD44肽、多肽或蛋白质中任何一种或多种的存在和/或量。
在更具体的实施方案中，测量CD73、CD105、CD10或CD44肽、多肽或蛋白质中任何一种或多种的存在和/或量包括使用分别采用能够特异性结合CD73、CD105、CD10或CD44中一种或多种试剂的技术，优选其中一种或多种试剂分别独立地为一种或多种抗体、抗体片段、抗体样蛋白支架或适体。
此类方法可包括基于亲和力的测定方法，其中通过可检测和/或可定量结合剂与i)肽、多肽、蛋白质或核酸之间的特异性结合赋予测定法检测和/或定量肽、多肽、蛋白质或核酸的能力。结合试剂可以是免疫结合试剂(抗体)或非免疫结合试剂。能够结合人CD73的抗体的实例包括但不限于可从以下供应商获得的抗体(“#”代表目录号)：BD Biosciences(别藻蓝蛋白(APC)缀合的小鼠单克隆抗体，#560847；异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的小鼠单克隆抗体，#561254；R-藻红蛋白(PE)缀合的小鼠单克隆抗体#55027)，Abcam(小鼠单克隆抗体，#ab54217；兔单克隆抗体，#ab79423；小鼠单克隆抗体#ab34199)，R&D系统(生物素化多克隆山羊抗体，#BAF1182；单克隆小鼠#MAB1182；PE缀合的多克隆山羊抗体，#FAB8160P)。能够结合人CD105的抗体的实例包括但不限于可从以下供应商获得的那些抗体(“#”代表目录号)：BD Biosciences(APC缀合的小鼠单克隆抗体，#562408；PE标记的小鼠单克隆抗体，#560839)，Abcam(小鼠单克隆，#ab156756；小鼠单克隆，#ab2529；兔单克隆，#ab221675)，R&D系统(Alexa
488缀合的单克隆小鼠，#FAB10971G；Alexa
647缀合的单克隆小鼠，#FAB10971R；山羊多克隆，#AF1097)。能够结合人CD44的抗体的实例包括但不限于可从以下供应商获得的那些抗体(“#”代表目录号)：BD Biosciences(PE缀合的小鼠单克隆抗体，#550989；FITC缀合的小鼠单克隆抗体，#555478)，Abcam(兔多克隆，#ab157107，PE缀合的小鼠单克隆，#ab46793；PE缀合的小鼠单克隆，#ab58754)，R&D系统(Alexa
缀合的大鼠单克隆，#FAB6127 S；PE缀合的小鼠单克隆，#FAB3660P)。能够结合人CD10的抗体的实例包括但不限于可从以下供应商获得的那些抗体(“#”代表目录号)：BD Biosciences(PE缀合的小鼠单克隆抗体，#555375)，Abcam(兔单克隆，#ab79423；兔多克隆，#ab82073；PE缀合的小鼠单克隆，#ab210380)，R&D系统(Alexa
缀合的小鼠单克隆，#FAB1182N；生物素化山羊多克隆，#BAF1182)。基于亲和力的测定方法，如免疫学测定方法包括但不限于免疫组织化学，免疫细胞化学，流式细胞术，质谱流式细胞术(mass cytometry)，荧光激活细胞分选(FACS)，荧光显微镜学，使用微流体系统的基于荧光的细胞分选，基于(免疫)亲和吸附的技术，如亲和色谱、磁激活细胞分选或使用微流体系统基于珠的细胞分选，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于ELISPOT的技术，放射免疫测定(RIA)，Western印迹等。
可以任选地与任何上述分析方法结合使用用于检测和/或定量肽、多肽或蛋白质的其他技术。此类方法包括但不限于质谱(MS)技术，化学提取分配，等电聚焦(IEF)包括毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管电色谱法(CEC)等，一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)，毛细管凝胶电泳(CGE)，毛细管区带电泳(CZE)，胶束电动色谱(MEKC)，自由流动电泳(FFE)等。
可使用本领域已知的标准定量RNA或cDNA测量工具来检测核酸的存在或不存在和/或量，如在RNA水平(例如，hnRNA，前体mRNA，mRNA或cDNA的水平)。非限制性实例包括基于杂交的分析，微阵列表达分析，数字基因表达(DGE)，RNA原位杂交(RISH)，Northern印迹分析等；PCR，RT-PCR，RT-qPCR，终点PCR，数字PCR等；支持寡核苷酸检测，焦磷酸测序，边合成边polony循环测序，同时双向测序，单分子测序，单分子实时测序，真正单分子测序，杂交辅助的纳米孔测序，边合成边测序等。
在进一步的实例中，可使用如本文所讨论的方法的任何组合。
在具体实施方案中，CD73、CD105、CD10或CD44表示肽、多肽或蛋白质，且CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的表达分别表示CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的细胞表面表达。肽、多肽或蛋白质的细胞表面表达优选由流式细胞术确定。
在具体实施方案中，如本文教导的方法包括(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数；和/或(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。因此，本文还提供了如本文教导的方法，其包括(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44中一种的体外分化细胞的分数，优选测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44中两种的体外分化细胞的分数，更优选测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44中三种的体外分化细胞的分数，最优选测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44中全部的体外分化细胞的分数；和/或(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中一种的量，优选测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中两种的量，更优选测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中全部的量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括：
(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量；
(b1)将(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种(例如，一种、两种或全部三种)的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括：
(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的量；
(b1)将(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将(a2)中测量的CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现(a2)中测量的CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
在具体实施方案中，测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；和/或测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量使用选自下组的技术来进行：流式细胞术、质谱流式细胞术、荧光活化细胞分选、荧光显微镜检查、亲和分离、磁性细胞分离、微流控分离以及其组合。
流式细胞术涵盖当细胞群中的单个细胞以窄束流成单行通过激光束时通过其光学特性(如，吸光度、光散射和荧光特性等)来分析细胞群中的单个细胞的方法。流式细胞术方法包括荧光激活细胞分选(FACS)方法，通过该方法可将具有特定光学特性的细胞群与其他细胞分开。
基于元素质谱的流式细胞术或质谱流式细胞术提供了通过用质量标记的结合试剂(即，用具有确定质量的元素或同位素标记)取代荧光染料标记的结合试剂来分析细胞的方法。在这些方法中，将标记的颗粒引入质谱流式细胞仪，在其中它们将得以单独原子化和离子化。然后对单个颗粒进行元素分析，其识别和测量所用质量标签的丰度。接着存储和分析与每个颗粒关联的同位素元素的身份和数量。由于元素分析的分辨率和可使用的元素同位素的数量，可在单个颗粒上同时测量多达100个或更多的参数。
荧光显微镜检查宽泛地涵盖通过其荧光特性对细胞群中的单个细胞进行显微镜分析的方法。荧光显微镜检查方法可以是手动的，或者优选地是半自动化的或自动化的。
亲和分离又称为亲和色谱，其宽泛地涵盖涉及流动相(如，合适的液相，例如水性悬浮液中的细胞群)中存在的细胞与固定相(如，合适的固相)之间存在的特异性相互作用，从而将细胞吸附至固定相；然后将固定相与剩余的流动相分离；以及从固定相回收(例如，洗脱)吸附的细胞。亲和分离可以是柱状的，或者可能需要分批处理，其中通过合适的技术如离心或施加磁场从液相中收集/分离固定相(例如在固定相包含磁性基质的情况下，例如磁性颗粒或磁珠)。因此，本文中还设想了磁性细胞分离。
微流体系统利用各种物理原理允许准确且高通量的细胞检测、定量和/或分选。通过减小必要设备的尺寸，消除潜在的生物危害性气溶胶和简化通常与细胞分选相关的复杂方案，微芯片上的细胞分选提供了许多优势。如在整个说明书中使用的术语“微流体系统”宽泛地是指具有一个或多个流体微通道的系统。微通道表示具有如下横截面尺寸的流体通道，其最大尺寸通常小于1mm，优选小于500μm，更优选小于400μm，更优选小于300μm，更优选小于200μm，例如100μm或更小。此类微流体系统可用于操作流体和/或物体，如液滴、气泡、胶囊、颗粒、细胞等。微流体系统可允许例如基于荧光标记(如，采用荧光团缀合的结合剂，如荧光团缀合的抗体)，基于珠(例如，珠缀合的结合剂，如缀合珠的抗体)或无标记的细胞分选(综述于Shields et al.,Lab Chip.2015,vol.15:1230–1249)。在特定实施方案中，测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数；并使用流式细胞术进行测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。
可使用与用于CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的荧光染料(例如，PE，PE-Cy 7，PE-Cy5，APC，APC-Cy7，Alexa
Alexa
FITC，PacificBlue，Alexa
)缀合的抗体来标记体外分化细胞，所述荧光染料随后被激光以特定波长(荧光染料的激发波长)激发，以发射不同波长(荧光染料的发射波长)的光。例如，体外分化细胞可使用别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD105抗体(BD
目录号：562408)，APC缀合的抗CD73抗体(BD
目录号：560847)，藻红蛋白(PE)缀合的抗CD10抗体(
目录号：555375)和/或PE缀合的抗CD44抗体(
目录号：550989)。技术人员将理解，激光的波长和用于标记抗体的荧光染料的激发波长必须相容。例如，FITC的激发波长为488nm，发射波长为500-560nm；PE的激发波长为488-561nm，发射波长为560-595nm。CD73、CD105、CD10或CD44中超过一种的存在或量可通过使用各自缀合发射不同波长的不同光的不同荧光染料的抗体来测量。
大多数细胞不会自然地发射荧光。因此，如果将与荧光染料缀合的抗体结合至体外分化细胞的细胞表面上的CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，则当该细胞通过流式细胞仪的激光束时会拾取到荧光信号。对于在流式细胞术分析中使用的各个荧光染料缀合的抗体，可设置阳性截止值。例如，可将阳性截止值设置为对照同种型抗体阳性的1％。
体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的量可表示为体外分化细胞发射的荧光信号的平均强度或中值强度。荧光信号的平均强度或中值强度由针对整个分析的细胞群(即，包括不发射荧光信号的细胞)中每个细胞检测到的荧光信号确定。更具体地，体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的量可由标准化中值荧光强度(nMFI)表示。标准化nMFI通常是通过将用一种或多种荧光染料缀合的抗体标记的整个分析细胞群的MFI除以阴性对照(例如，用一种或多种荧光染料缀合的同种型对照抗体标记的细胞，如缀合有FITC、APC和PE的免疫球蛋白G(IgG)对照)的MFI来确定。
如本文所用的“标准化荧光强度中值”或“nMFI”是指用一种或多种荧光染料缀合的抗体标记的整个分析细胞群的MFI(MFI标志物_通道)与用一种或多种荧光染料缀合的同种型对照抗体，如缀合有荧光染料如FITC、APC或PE的免疫球蛋白G(IgG)对照标记的细胞群的MFI(MFI同种型_通道)之比。nMFI结果与存在于感兴趣的群细胞表面的标志物的量成正比。通常将(n)MFI与测量荧光信号发射的波长相关联。例如，FITC的激发波长可以是488nm，PE的激发波长可以是488nm，APC的激发波长可以是633nm。例如，FITC的发射波长可以是530nm，PE的发射波长可以是580nm，APC的发射波长可以是660nm。
流式细胞术可计数通过激光的标记的体外分化细胞的总数目以及发射一定波长的光的标记的体外分化细胞的数目。该信息可用于确定表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量，优选分数，其又称为阳性荧光细胞百分比(PPFC)。
技术人员将理解，在测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的存在或量之前，可例如通过门控策略基于其前向和侧向散射特性将感兴趣的细胞群与其他细胞或碎片区分开。
可对固定数量的检测事件(例如，穿过流式细胞仪的激光的细胞数目)进行流式细胞术数据分析。例如，可对门控细胞群的10000个事件进行流式细胞术数据分析。
可使用本领域已知的任何细胞计数仪来进行流式细胞术。例如，使用FACSCantoII(BD
)。
可使用本领域已知的任何流式细胞术软件来进行流式细胞术数据分析。例如，FACS
8.0软件(BD
)。在特定实施方案中，如本文教导的方法包括(b1)将如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的体外分化细胞的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值进行比较；和(b2)将如本文其他地方所述测量的体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值进行比较。因此，本文还提供了如本文教导的方法，其包括(b1)将如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44全部的体外分化细胞的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值进行比较；和(b2)将如本文其他地方所述测量的体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44中全部的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值进行比较。
在更具体的实施方案中，如本文教导的方法包括(b1)将如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；和/或(b2)将如本文其他地方所述测量的体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较。因此，本文还提供了如本文教导的方法，其包括(b1)将如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44中全部的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；和/或(b2)将如本文其他地方所述测量的体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44中全部的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较。
在更具体的实施方案中，如本文教导的方法包括(b1)将如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；和/或(b2)将如本文其他地方所述测量的体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(例如，一种、两种或全部三种)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较。在某些实施方案中，如本文教导的方法包括(b1)将如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；和/或(b2)将如本文其他地方所述测量的体外分化细胞表达的CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种(例如，一种、两种、三种或全部四种)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较。
具有已知成骨潜能的细胞可以是已知具有一定程度的成骨潜能(例如，无成骨潜能，低成骨潜能，高成骨潜能或所期望程度的成骨潜能)的细胞。
成骨潜能的程度可表示为形成的骨基质的量和/或以体外或体内的骨基质形成的速率表示。骨基质的量和/或骨基质形成的速率可通过本领域已知的任何方法来确定，如骨组织形态计量术，组织学(例如，胶原I，Masson三色戈德纳)和免疫荧光(例如，胶原I，四环素骨标记)。例如，在通过皮下注射向小鼠施用细胞后，可在体内评估新矿化骨的厚度，新形成骨的表面积或至少一个矿化结节的存在。
例如，可通过测量此类细胞的成骨活性来确定细胞的成骨潜能程度。人体外分化细胞的成骨活性可在体内测量，例如在颅盖上经皮下注射向小鼠施用细胞后通过确定(例如，人或人-鼠混合来源的)至少一个矿化结节的存在。可在体内测量人体外分化细胞的成骨活性，例如在颅盖上经皮下注射向小鼠施用细胞后，通过评估(例如，人或人-鼠混合来源的)新矿化结节的厚度，或者通过评估股骨节段性亚临界尺寸缺损(sub-CSD)小鼠模型中骨修复的程度。
例如，可通过在颅骨上进行单次皮下施用，将一定量的人细胞(如，在100μl赋形剂中配制的2.5x106个细胞)施用于裸鼠。为了标记随时间的骨新形成，可在细胞的细胞施用前3天和细胞施用后4、8和12天，以腹膜内注射分别向小鼠依次施用钙结合的荧光染料，如茜素红(红色)，钙黄绿素(绿色)，钙黄绿素(蓝色)和四环素(黄色)。施用细胞后2周，对小鼠实施安乐死，并且收获每只小鼠的颅盖以通过组织计量术(例如，骨形成的定量)来评估骨形成特性。颅盖的初始厚度和最终厚度可用于计算细胞施用后新骨形成的百分比。此外，还可通过免疫荧光来评估骨形成特性(例如，鼠或人来源的骨形成)。可使用ALP酶活性检测方法在颅盖切片上评估成骨细胞活性。可使用TRAP酶活性检测方法在颅盖切片上评估破骨细胞活性。新形成骨的矿化状态可在用ALP染色的颅盖切片上使用Masson三色戈德纳染色来评估，例如使用市售试剂盒(例如，
)。软骨形成可在颅盖矢状面石蜡切片上使用番红-橙染色来评估。
在另一实例中，在对小鼠进行股骨节段性亚临界尺寸损伤后一天，通过经皮注射将人体外分化细胞(如，在50μl赋形剂中配制的1.25x106个细胞)局部施用至小鼠的骨缺损部位。骨修复可通过X射线成像定量。骨缺损尺寸可通过测量骨缺损的两个边缘之间的距离定量。
在特定实施方案中，具有已知成骨潜能的细胞可以是不需要钙化软骨基质作为模板的已知形成骨基质的细胞(例如，已知通过膜内骨化形成骨的细胞)或者已知先形成钙化软骨基质随后使用所述钙化软骨基质作为骨组织形成的模板的细胞(例如，已知通过软骨内骨化形成骨的细胞)。骨形成的类型(例如，软骨内骨化或膜内骨化)可通过本领域已知的任何方法来确定，如骨组织形态计量术，组织学(例如，胶原I，Masson三色戈德纳，番红-橙，SOX9，胶原II型)和免疫荧光(例如，胶原I，四环素骨标记，胶原II型)。例如，如本文其他地方所述通过皮下注射向小鼠施用细胞后，存在至少一个矿化结节可表明骨基质是通过软骨内骨化形成的。
在特定实施方案中，具有已知成骨潜能的细胞是已知通过软骨内骨化形成骨的细胞。例如，具有已知成骨潜能的细胞可以是在通过皮下注射向小鼠施用细胞后在体内形成人来源的至少一个矿化结节的人细胞，优选其中皮下注射是在颅骨上进行。
在特定实施方案中，相对于例如通过皮下注射向小鼠施用对照细胞(例如，没有成骨潜能的细胞或具有低成骨潜能的细胞)或媒介物时观测到的骨形成，具有已知成骨潜能的细胞是在例如通过皮下注射向小鼠施用细胞后显示(例如，人来源的)体内骨形成增加至少约20％(约1.2倍或更多)，或至少约30％(约1.3倍或更多)，或至少约40％(约1.4倍或更多)，或至少约50％(约1.5倍或更多)，或至少约60％(约1.6倍或更多)，或至少约70％(约1.7倍或更多)，或至少约80％(约1.8倍或更多)，或至少约90％(约1.9倍或更多)，或至少约100％(约2倍或更多)的细胞(例如，人细胞)，优选其中皮下注射是在颅骨上进行。例如，可将从与具有已知成骨潜能的细胞同一供体获得的未分化MSC用作对照细胞。
已知具有低成骨潜能的细胞的非限制性实例包括如下获得的体外分化的MSC衍生细胞(在本文中称为“细胞产品A”或“骨形成细胞A”)：将骨髓白细胞以50,000个细胞/cm2的密度接种于培养基中，并在含5％CO2的加湿培养箱中于37℃培养。细胞接种后4天，去除未贴壁细胞，并用补充有5％Octaserum(50:50自体血清和
(Octapharma))，FGF-b(CellGenix)，TGFβ-1(Humanzyme)的常规培养基更新培养基。接种后7天和11天，去除一半培养基，并用新鲜培养基更换。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过例如用Trypzean(Lonza)分离，并通过来回打旋和移液收获细胞(第1代：P1)。将中间细胞冷冻保存在包含培养基，10％Octaserum(50:50自体血清和
(Octapharma))，10％DMSO)的冷冻培养基中，并储存于液氮中。为了进行继代培养，将细胞解冻并以1144个细胞/cm2的密度重新接种。在继代培养期间培养细胞14天。第28天时，通过例如用Trypzean(Lonza)分离，并通过来回打旋和移液收获细胞(第2代：P2)。为了获得最终的细胞产品，将细胞以25×106个细胞/ml的最终浓度重悬于例如
中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品A”或“骨形成细胞A”。
已知具有高成骨潜能的细胞的非限制性实例包括如下获得的体外分化的MSC衍生细胞(在本文中称为“细胞产品B”或“骨形成细胞B”)：将骨髓白细胞以50,000个细胞/cm2的密度接种于包含5％
(Octapharma)，0.1UI/ml肝素(LEO Pharma)，FGF-b(CellGenix)，TGFβ-1(Humanzyme)的常规培养基中，并在含5％CO2的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，去除未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，去除一半培养基，并用新鲜培养基代替以更新生长因子。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用例如Trypzean(Lonza)分离并通过来回打旋和移液收获细胞(第1代：P1)。将中间细胞冷冻保存(例如，于
CS10(BioLife Solutions))并储存于液氮中。接着，将中间细胞解冻并重新接种，以286个细胞/cm2的密度进行继代培养。在继代培养期间培养细胞14天。第28天时，通过例如用Trypzean(Lonza)分离并通过来回打旋和移液收获细胞(第2代：P2)。为了获得最终的细胞产品，将细胞以25×106个细胞/ml的终浓度重悬于例如
中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品B”或“骨形成细胞B”。
在特定实施方案中，具有已知成骨潜能的细胞是具有临床上有用的成骨潜能的细胞。
在某些实施方案中，(b1)的截止值和/或(b2)的所述的各自截止值可以是代表具有临床上有用的成骨潜能的细胞的截止值。
当涉及细胞的成骨潜能使用时，术语“临床上有用的”是指细胞的成骨潜能的程度在细胞移植后，允许细胞在受试者骨基质中以一定量和/或通过某种机制(例如，软骨内骨化或膜内骨化)形成，这对受试者具有治疗意义，如为受试者(如患有肌肉骨骼疾病或骨相关病症的受试者)提供临床相关的益处。
在某些实施方案中，如果在颅盖上经皮下注射向动物(例如小鼠)施用细胞后至少50％的动物(例如小鼠)形成(例如，人或人-鼠混合来源的)矿化结节，则体外分化细胞可具有临床上有用的成骨潜能。在某些实施方案中，如果在颅盖上经皮下注射向动物(例如小鼠)施用细胞后至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90或至少95％的动物(例如小鼠)形成(例如，人或人-鼠混合来源的)矿化结节，则体外分化细胞可具有临床上有用的成骨潜能。
肌肉骨骼疾病的非限制性实例可包括局部或系统性病症，如任何类型的骨质疏松或骨质减少，如原发性、绝经后、老年、肾上腺皮质激素诱导的、双膦酸盐诱导的和放射疗法诱导的；任何继发性、单位点或多位点骨坏死；任何类型的骨折，如不愈合、畸形愈合、延迟愈合骨折或压缩、颌面骨折；需要骨愈合的病症(例如，脊柱愈合和重建)；先天性骨缺损；骨重建，如在外伤或癌症手术后，和颅面骨重建；创伤性关节炎、局灶性软骨和/或关节缺损、局灶性退行性关节炎；骨关节炎、退行性关节炎、膝关节病和髋关节病；成骨不全症；溶骨性骨癌；佩吉特病；内分泌紊乱；低磷酸盐血症；低血钙症；肾性骨营养不良；骨软化症；动力缺失性骨病；甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进；牙周病；Gorham-Stout病和McCune-Albright综合征；类风湿性关节炎；脊椎关节病，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、肠病性关节病、和未分化的脊椎关节炎和反应性关节炎；系统性红斑狼疮和相关综合征；硬皮病和相关病症；干燥综合征；系统性血管炎，包括巨细胞动脉炎(Horton’s病)、Takayasu’s动脉炎、风湿性多肌痛、ANCA-相关的血管炎(例如韦格纳肉芽肿病、显微多血管炎和Churg-Strauss综合征)、Behcet’s综合征和其它多动脉炎和相关病症(例如结节性多动脉炎、Cogan’s综合征和Buerger’s病)；伴随其他系统性炎性疾病的关节炎，包括淀粉样变性和结节病；晶体关节病，包括痛风、焦磷酸钙二水合物疾病、与磷酸钙或草酸钙晶体的关节沉积有关的病症或综合征；软骨软化和神经性关节病；费尔特综合征和赖特综合征；莱姆病和风湿热。
作为示例而非限制，可从具有临床上有用的成骨潜能的细胞移植中受益的骨相关病症可包括局部或系统性病症，如任何类型的骨质疏松或骨质减少，如原发性、绝经后、老年、肾上腺皮质激素诱导的；任何继发性、单位点或多位点骨坏死；任何类型的骨折，如不愈合、畸形愈合、延迟愈合骨折或压缩；需要骨愈合的病症(例如，脊柱愈合和重建)；颌面骨折；骨重建，如在外伤或癌症手术后，和颅面骨重建；成骨不全症；溶骨性骨癌；佩吉特病；内分泌紊乱；低磷酸盐血症；低血钙症；肾性骨营养不良；骨软化症；动力缺失性骨病；类风湿性关节炎；甲状旁腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进；牙周病；Gorham-Stout病和McCune-Albright综合征。
具有已知临床上有用的成骨潜能的细胞的非限制性实例包括如本文其他地方所述获得的“细胞产品B”或“骨形成细胞B”。具有已知临床上有用的成骨潜能的细胞的进一步非限制实例包括如本文其他地方所述获得的“细胞产品C”或“骨形成细胞C”。
在特定实施方案中，具有已知临床上有用的成骨潜能的细胞是如本文其他地方所述获得的“细胞产品B”或“骨形成细胞B”。在特定实施方案中，具有已知临床上有用的成骨潜能的细胞是如本文其他地方所述获得的“细胞产品C”或“骨形成细胞C”，包括“细胞产品C-冷冻”或“骨形成细胞C-冷冻(保存)”。
在特定实施方案中，可通过分别确定参考细胞(例如，已知具有临床上有用的成骨潜能的细胞)中表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量而产生参考值，来确定表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量的参考值。类似地，可通过分别确定参考细胞(例如，已知具有临床上有用的成骨潜能的细胞)中CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量而产生参考值来确定由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量的参考值。
如本领域通常已知的，从一种或多种参考细胞类型获得的一种或多种参考值可用于确定阈值或截止值，以提供一定程度的细胞的成骨潜能，优选提供临床上有用的成骨潜能。
在特定实施方案中，(b1)中与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值进行比较的如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105、CD10和CD44全部)的体外分化细胞的量(或分数)的参考值或截止值；和/或(b2)中与代表具有已知的成骨潜能的细胞的参考值或截止值进行比较的如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105和CD44全部)的量的参考值或截止值，是代表具有临床有用的成骨潜能的细胞的参考值或截止值。
通过大量研究，本发明人发现至少90％的具有成骨潜能的体外分化细胞的细胞群，特别是具有高成骨潜能并通过软骨内骨化形成体内骨基质的体外分化细胞的细胞群表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，优选CD73、CD105、CD10和CD44全部。此外，分别与MSC中CD73、CD44和CD105的量相比，这些体外分化细胞还表达增加量的CD73和/或CD44以及减少量的CD105。
因此，在特定实施方案中，如本文教导的方法包括(c1)发现如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种(优选CD73、CD105、CD10和CD44全部)的体外分化细胞的量(或分数)与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，和/或(c2)发现如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种(优选CD73、CD105和CD44全部)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，以及(d)将(c1)和/或(c2)中发现的偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。因此，本文还提供了如本文教导的方法，其包括(c1)发现如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44全部的体外分化细胞的量(或分数)与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，和/或(c2)发现如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44全部的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，以及(d)将(c1)和/或(c2)中发现的偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括(c1)发现如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量(或分数)与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，和/或(c2)发现如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种(例如，一种、两种或全部三种；优选CD73、CD105和CD44全部)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，以及(d)将(c1)和/或(c2)中发现的偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
在某些实施方案中，如本文教导的方法包括(c1)发现如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量(或分数)与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，和/或(c2)发现如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种(例如，一种、两种、三种或全部四种；优选CD73、CD105、CD44和CD10全部)的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的参考值或截止值的偏差或无偏差，以及(d)将(c1)和/或(c2)中发现的偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
第一值与第二值的“偏差”通常可涵盖改变的任何方向(例如，增加：第一值＞第二值；或减少：第一值＜第二值)和任何程度。
例如，偏差可涵盖第一值相对于与之进行比较的第二值减少(不限于)至少约10％(约0.9倍或更少)，或至少约20％(约0.8倍或更少)，或至少约30％(约0.7倍或更少)，或至少约40％(约0.6倍或更少)，或至少约50％(约0.5倍或更少)，或至少约60％(约0.4倍或更少)，或至少约70％(约0.3倍或更少)，或至少约80％(约0.2倍或更少)，或至少约90％(约0.1倍或更小)。
例如，偏差可涵盖第一值相对于与之进行比较的第二值增加(不限于)至少约10％(约1.1倍或更多)，或至少约20％(约1.2倍或更多)，或至少约30％(约1.3倍或更多)，或至少约40％(约1.4倍或更多)，或至少约50％(约1.5倍或更多)，或至少约60％(约1.6倍或更多)，或至少约70％(约1.7倍或更多)，或至少约80％(约1.8倍或更多)，或至少约90％(约1.9倍或更多)，或至少约100％(约2倍或更多)，或至少约150％(约2.5倍或更多)，或至少约200％(约3倍或更多)，或至少约500％(约6倍或更多)，或至少约700％(约8倍或更多)等。
优选地，偏差可指观测到统计学上显著的变化。例如，偏差可指观测到的变化，该变化落在给定参考细胞的参考值的误差范围之外(如以标准差或标准误差或以其预定倍数表示，如±1xSD或±2xSD或±3xSD，或±1xSE或±2xSE或±3xSE)。偏差还可指落在给定参考细胞的值所定义的参考范围之外的值(例如，在给定参考细胞中包括值的≥40％,≥50％,≥60％,≥70％,≥75％或≥80％或≥85％或≥90％或≥95％或甚至≥100％的范围外)。
在另一实施方案中，如果观测到的变化超出给定阈值或截止值，则可推断出偏差。例如，如果观测到的变化低于、等于或高于给定阈值或截止值，则可以推断出偏差。
在特定实施方案中，如本文教导的方法包括以下，基本上由以下组成或由以下组成：
(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数；
(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量；
(b1)将如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将如(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现如(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
因此，还提供了如本文教导的方法，其包括以下、基本由以下组成或由以下组成：
(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105和CD44的量；
(b1)将如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将如(a2)中测量的CD73、CD105和CD44的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现如(a2)中测量的CD73、CD105和CD44的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
在特定实施方案中，其中参考细胞是已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞，
-与如本文其他地方所述的已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的截止值相比，如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量或分数相同或减少，表明体外分化细胞不具有临床上有用的成骨潜能；或
-与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的截止值相比，如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量或分数增加，表明体外分化的细胞具有临床上有用的成骨潜能，和/或
-与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD44和/或CD10的量相同或减少，并且与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD105的量相同或增加，表明体外分化细胞不具有临床上有用的成骨潜能；或
-与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD44和/或CD10的量增加，和/或与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD105的量减少，表明体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，
优选地，其中CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的表达分别代表CD73、CD105、CD10或CD44在细胞表面上的表达。
在特定实施方案中，其中参考细胞是已知具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能的细胞，
-与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的截止值相比，如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量或分数减少，表明体外分化细胞不具有期望的成骨潜能；或
-与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的截止值相比，如本文其他地方所述测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量或分数相同或增加，表明体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能；和/或
-与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD44和/或CD10的量减少，和/或与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD105的量增加，表明体外分化细胞不具有期望的成骨潜能；或
-与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD73、CD44和/或CD10的量相同或增加，和与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD105的量减少，表明体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能，
优选地，其中CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的表达分别代表CD73、CD105、CD10或CD44在细胞表面上的表达。
在特定实施方案中，其中参考细胞是已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞，
-与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达CD10的量相同或减少，表明体外分化细胞不具有临床上有用的成骨潜能；或
-与如本文其他地方所述的代表已知不具有临床上有用的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD10的量增加，表明体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，
优选地，其中CD10的表达代表CD10在细胞表面上的表达。
在特定实施方案中，其中参考细胞是已知具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能的细胞，
-与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达CD10的量减少，表明体外分化细胞不具有期望的成骨潜能；或
-与如本文其他地方所述的代表已知具有期望的成骨潜能的细胞的各自截止值相比，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的CD10的量相同或增加，表明体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能，
优选地，其中CD10的表达代表CD10在细胞表面上的表达。
某些实施方案提供了如本文教导的方法，其中：
-与(b1)的截止值相比，如(a1)中测量的体外分化细胞的分数相同或增加，表明体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能；和
-与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD73、CD44和/或CD10的量相同或增加，以及与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD105的量相同或减少，表明体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能。
在某些实施方案中，所述(b1)的截止值是90％的在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)为500，CD44的nMFI为100，CD105的nMFI为150和/或CD10的nMFI为40。在某些实施方案中，所述(b1)的截止值是90％的在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100，CD105的nMFI为150和/或CD10的nMFI为50。
在某些实施方案中，所述(b1)的截止值是90％的在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的标准化nMFI为500，CD44的nMFI为150，CD105的nMFI为150和/或CD10的nMFI为40。在某些实施方案中，所述(b1)的截止值是90％的在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的标准化nMFI为500，CD44的nMFI为150，CD105的nMFI为150和/或CD10的nMFI为50。
在某些实施方案中，测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量。在某些实施方案中，所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100和CD105的nMFI为150。
在某些实施方案中，测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105、CD44和CD10的量。在某些实施方案中，所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100，CD105的nMFI为150，CD10的nMFI为40。在某些实施方案中，所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为150，CD105的nMFI为150，CD10的nMFI为40。在某些实施方案中，所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100，CD105的nMFI为150，CD10的nMFI为40。在某些实施方案中，所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为150，CD105的nMFI为150，CD10的nMFI为50。
在特定实施方案中，与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数的(b1)的截止值，是90％，91％，92％，93％，94％，95％；96％；97％，98％或99％，优选90％的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞，优选其中CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的表达代表CD73、CD105、CD10或CD44各自在细胞表面上的表达。因此，本文提供了与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的表达CD73、CD105、CD10和CD44全部的体外分化细胞的分数的(b1)的截止值，是90％，91％，92％，93％，94％，95％；96％；97％，98％或99％，优选90％的表达CD73、CD105、CD10和CD44全部的体外分化细胞，优选其中CD73、CD105、CD10和CD44全部的表达代表CD73、CD105、CD10和CD44各自在细胞表面上的表达。在特定实施方案中，如果约90％，91％，92％，93％，94％，95％；96％；97％，98％或99％，优选90％或更多的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，优选CD73、CD105、CD10或CD44的全部，则体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能。因此，本文还提供了如果约90％或更多的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44的全部，则该体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能。
在特定实施方案中，与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达的CD73、CD105、CD44和/或CD10中任何一种或多种的量的(b2)的截止值为：nMFICD73为500、550、600、650、700、750、800、850或900，优选nMFICD73为500，nMFICD44为100、110、120，130、140、150、200、250、300或350，优选nMFICD44为100，nMFICD105为180、170、160、150、140、130、120、110或100，优选nMFICD105为150，和/或nMFICD10为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60，优选nMFICD10为50；优选地，其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
因此，本文还提供了与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达的CD73、CD105和CD44的量的(b2)的截止值为：nMFICD73为500、550、600、650、700、750、800、850或900，优选nMFICD73为500，nMFICD44为100、110、120、130、140、150，200、250、300或350，优选nMFICD44为100，nMFICD105为180、170、160、150、140、130、120、110或100，优选nMFICD105为150，优选地，其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，以及nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
在某些实施方案中，与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达的CD73、CD105、CD44和CD10中任何一种或多种的量的(b2)的截止值为：nMFICD73为500、550、600、650、700、750、800、850或900，优选nMFICD73为500,nMFICD44为100、110、120、130、140、150、200、250、300或350，优选nMFICD44为100，nMFICD105为180、170、160、150、140、130、120、110或100，优选nMFICD105为150，nMFICD10为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60，优选nMFICD10为50；优选地，其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在特定实施方案中，与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达CD10的量的(b2)的截止值为：nMFICD10为10、15、20、25或30，优选nMFICD10为20。在特定实施方案中，与代表具有临床上有用的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达CD10的量的(b2)的截止值为：nMFICD10为40、45、50、55或60，优选nMFICD10为40；更优选nMFICD10为50；甚至更优选nMFICD10为60。优选地，nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
如本文所用的描述“CD73的nMFI”或“nMFICD73”是指用APC缀合的抗CD73抗体(例如，BD
目录号：560847)标记的整个分析细胞群的MFI与用缀合有APC的IgG对照(例如，BD
目录号：555751)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
如本文所用的描述“CD44的nMFI”或“nMFICD44”是指用PE缀合的抗CD44抗体(例如，BD
目录号：550989)标记的整个分析细胞群的MFI与用缀合有PE的IgG对照(例如，BD
目录号：556650)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
如本文所用的描述“CD105的nMFI”或“nMFICD105”是指用APC缀合的抗CD105抗体(例如，BD
目录号：562408)标记的整个分析细胞群的MFI与用缀合有APC的IgG对照(例如，BD
目录号：555751)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFI105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
如本文所用的描述“CD10的nMFI”或“nMFICD10”是指用PE缀合的抗CD10抗体(例如，BD
目录号：555375)标记的整个分析细胞群的MFI与用缀合有PE的IgG对照(例如，BD
目录号：556650)标记的细胞群的MFI之比。优选地，nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在特定实施方案中，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的nMFICD73为500、550、600、650、700、750、800、850或900，优选为500或更多，表明该体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能。
在特定实施方案中，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的nMFICD44为100、110、120、130、140、150、200、250、300或350，优选为100或更多，表明该体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能。
在特定实施方案中，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的nMFICD105为180、170、160、150、140、130、120、110或100，优选为150或更少，表明该体外分化的细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能。
在特定实施方案中，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的nMFICD10为至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少45，至少50，至少55或至少60，优选为至少50，表明该体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能。
在优选实施方案中，如本文其他地方所述测量的由体外分化细胞表达的nMFICD73为500或更多，nMFICD44为100或更多，nMFICD105为150或更少，表明该体外分化细胞具有期望的成骨潜能，优选临床上有用的成骨潜能，优选地，其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，以及nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
在特定实施方案中，与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达的CD73、CD105、CD44和/或CD10中任何一种或多种的量的(b2)的截止值为：nMFICD73为500，nMFICD44为100，nMFICD105为150和/或nMFICD10为40，优选地，其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在特定实施方案中，与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达的CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的分数的(b1)的截止值为：90％的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞；和/或与代表具有已知成骨潜能(优选已知临床上有用的成骨潜能)的细胞的截止值进行比较的由体外分化细胞在细胞表面上表达的CD73、CD105、CD44和/或CD10的量的(b2)的截止值为：nMFICD73为500，nMFICD44为100，nMFICD105为150和/或nMFICD10为40，优选地，其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在特定实施方案中，体外分化细胞获自或衍生自多能干细胞(PS)，如哺乳动物PS和人PS，优选人PS。
如在整个说明书中使用的术语“体外分化细胞”是指在适当条件下体外培养的任何细胞，其允许细胞从一种细胞类型转变为另一种细胞类型。细胞的分化可包括在能够诱导细胞向期望的细胞类型分化的条件下培养MSC，更通常在包含能够诱导细胞向期望的细胞类型分化的一种或多种试剂(例如，生长因子)的培养基中培养细胞。术语“干细胞”通常指非特化的或相对较不特化的增殖感受态细胞，其能够自我更新，即可以增殖而不分化，并且其或其后代可产生至少一种相对更特化的细胞类型。该术语包括能够基本上无限地自我更新的干细胞，即其中干细胞的后代或其至少部分基本上保留了母干细胞的未特化或相对较不特化的表型、分化潜能和增殖能力，以及显示有限自我更新的干细胞，即其中后代或其部分进一步增殖和/或分化的能力与母细胞相比明显降低。作为示例而非限制，干细胞可以产生能够沿着一个或多个谱系分化以产生越来越多的相对更特化的细胞后代，其中这样的后代和/或越来越多的相对更特化的细胞本身可以是如本文定义的干细胞，或甚至产生可以是有丝分裂后的终末分化的细胞，即完全特化的细胞。
mPS细胞的定义包括但不限于各种类型的胚胎干细胞，例如但不限于鼠胚胎干细胞，例如，如Evans&Kaufman 1981(Nature 292：154-6)和Martin 1981(PNAS 78：7634-8)所述；大鼠多能干细胞，例如，如Iannaccone et al.1994(Dev Biol 163：288-292)所述；仓鼠胚胎干细胞，例如，如Doetschman1988(Dev Biol 127：224-227)所述；兔胚胎干细胞，例如，如Graves et al.1993(Mol Reprod Dev 36：424-433)所述；猪多能干细胞，例如，如Notarianni et al.1991(J Reprod Fertil Suppl 43：255-60)和Wheeler 1994(ReprodFertil Dev 6：563-8)所述；绵羊胚胎干细胞，例如Notarianni et al.1991(同上)所述；牛胚胎干细胞，例如，如Roach et al.2006(Methods Enzymol 418：21-37)所述；人胚胎干(hES)细胞，例如，如Thomson et al.1998(Science 282：1145-1147)所述；人胚胎生殖(hEG)细胞，例如，如Shamblott et al.1998(PNAS 95：13726)所述；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞，如Thomson et al.1995(PNAS 92：7844-7848)所述，或狨猴干细胞，如Thomson et al.1996(Biol Reprod 55：254-259)所述。
该术语还包括其他类型的mPS细胞，以及能够产生后代的哺乳动物来源的任何细胞，包括所有三个胚层的衍生物，无论它们是源自胚胎组织、胎儿组织或其他来源。mPS细胞优选不是源自恶瘤来源。如果细胞或细胞系是从非癌性或未被已知癌基因改变的初生组织建立的，则该细胞或细胞系来自“非恶性来源”。可能期望在适当条件下延长的培养过程中，mPS保持正常的核型。还可能期望但并非必需的是，mPS在适当体外条件下保持基本上无限的自我更新潜能。
如本文所用，限定语“多能”表示细胞产生源自生物体的所有三个胚层(即，中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型的能力，并且潜在地能够产生生物体的任何和所有细胞类型的能力，但是不能生长成整个生物体。
在更具体的实施方案中，体外分化细胞获自或衍生自间充质干细胞(MSC)，胚胎干细胞(ESC)或诱导型多能干细胞(iPS)。在本文教导的用途或方法的更具体的实施方案中，体外分化细胞获自或衍生自MSC。
如本文所用的术语“间充质干细胞”或“MSC”是指成体中胚层来源的干细胞，其能够产生间充质谱系的细胞，通常为两种或更多种间充质谱系，更通常为三种或更多种间充质谱系，例如，成软骨-成骨细胞(软骨和骨)、成骨细胞(骨)、成软骨细胞(软骨)、肌细胞(肌肉)、肌细胞(腱)、成纤维细胞(结缔组织)、脂肪细胞(脂肪)和基质发生(髓基质)谱系。MSC可以从生物样品中分离，优选从人受试者的生物样品中分离，例如骨髓、松质骨、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、皮肤(真皮)，特别是胎儿和青少年皮肤、骨膜、牙髓、腱和脂肪组织。
如本文所用的术语“生物样品”或“样品”是指从生物来源获得的样品，例如从生物体，诸如动物或人受试者、细胞培养物、组织样品等获得的样品。动物或人受试者的生物样品是指从动物或人受试者中取出且包含其细胞的样品。动物或人受试者的生物样品可包含一种或多种组织类型，并且可包含一种或多种组织类型的细胞。获得动物或人受试者的生物样品的方法是本领域熟知的，例如组织活检或抽血。人MSC、其分离、体外扩增和分化已描述于，如美国专利号5,486,359；美国专利号5,811,094；美国专利号5,736,396；美国专利号5,837,539；或美国专利号5,827,740。本领域所述的任何MSC和通过本领域所述的任何方法分离的任何MSC都可适用于本发明的方法。特别地，MSC可被定义为显示体外三系间充质分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的能力(Dominici et al.,2006,vol.8,315)。
如本文所用的术语“胚胎干细胞”或“ESC”是指源自胚胎(例如，源自胚泡的内部细胞团)的多能干细胞，并且根据本领域公认的标准测试，其能够在适当条件下产生所有三个胚层(即，内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的不同细胞类型的后代，例如，尤其是在SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或在组织培养中形成可识别所有三个胚层的细胞的能力。术语“hES细胞”的范围涵盖在胚泡阶段或在将细胞实质分化为三个胚层之前源自人胚胎的多能干细胞。ES细胞，特别是hES细胞，通常源自胚泡的内部细胞团或整个胚泡。已证实来自桑椹胚期衍生的hES细胞系，如此获得的ES细胞也可用于本发明(Strelchenko etal.2004.Reproductive BioMedicine Online 9:623–629)。如本文所用的术语“诱导型多能干细胞”或“iPS细胞”是指通过重编程从成体细胞产生的多能干细胞。iPS细胞可自我更新，并且能产生源自生物体的所有三个胚层(即，中胚层、内胚层和外胚层)的细胞类型，并可能产生生物体的任何和所有细胞类型，但是它们不能生长成整个生物。iPS细胞的实例尤其是如Yamanaka et al.2006(Cell 126:663-676)和Yamanaka et al.2007(Cell 131:861-872)所教导。
术语“MSC”、“ESC”或“iPS”还分别涵盖了MSC、ESC或iPS的后代，例如，通过体外或离体增殖(繁殖/扩增)分别从动物或人受试者的生物样品中获得的MSC、ESC或iPS而获得的后代。
本文所用的术语“成体干细胞”是指存在于处于胎儿阶段或优选地出生后(例如，特别地但不限于人生物体，出生后至少1个月大，如至少2个月，至少3个月，如至少4个月，至少5个月，如出生后至少6个月大，如1年或更大，5年或更大，至少10年或更大，15年或更大，20年或更大，或出生后25年或更大，如成年之后)的生物体或从其获得(例如分离)的干细胞。例如，成体干细胞可从人受试者获得，其另外将以常规术语“婴儿”、“儿童”、“青年”、“青少年”或“成人”描述。
除非指明，“受试者”、“供体”或“患者”可互换使用，并且指动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，尤其包括人患者和非人类哺乳动物。优选的患者是人受试者。动物受试者包括动物的产前形态，如胎儿。
在本文教导的用途和方法的特定实施方案中，体外分化细胞是人细胞。
本发明的方法和方案可优选偏离“未分化”的多能干细胞群(例如，mPS或hPS细胞群)，即干细胞群中的大部分(例如，至少约60％，优选至少约70％，甚至更优选至少约80％，还更优选至少约90％和至多100％)细胞显示未分化的mPS细胞的特征(例如，形态特征和/或标志物)，从而将它们清楚地与经历分化的细胞相区别。
未分化的mPS细胞通常是本领域技术人员容易识别的，并且可出现具有高核/细胞质比和突出核仁的二维微观视图，可以生长为具有清晰边界的紧凑克隆。可以理解，群体中未分化细胞的克隆经常被邻近分化程度更高的细胞包围。然而，当群体在本身已知的适当条件下培养或传代时，未分化的克隆仍然存在，并且单个未分化的细胞占细胞群的很大比例。未分化的mPS细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及使用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体可检测的标志物(Thomson et al.，1998，同上)。未分化的mPS细胞通常还可表达Nanog，Oct-4和TERT。未分化的mPS细胞还可包含碱性磷酸酶(AP)的表达(例如，如通过合适的AP活性测定所确定)。
在特定实施方案中，体外分化细胞是成软骨-成骨细胞谱系(骨和软骨)，成骨细胞谱系(骨)，如，例如骨-软骨祖细胞和/或骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等；成软骨细胞(软骨)谱系，如，例如骨-软骨祖细胞和/或软骨祖细胞和/或前成软骨细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞；生脂细胞(脂肪)；生肌细胞(肌肉)；生腱细胞(腱)谱系；成纤维细胞(结缔组织)谱系，如，例如成纤维细胞、纤维细胞；或滑膜细胞谱系(滑膜液)。
如本文使用的术语“成软骨-成骨细胞谱系”涉及体外分化细胞时，是指具有分化为成骨细胞谱系细胞(例如，骨-软骨祖细胞，骨祖细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等)或成软骨细胞谱系细胞(例如，骨-软骨祖细胞，软骨祖细胞和/或前成软骨细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞)的能力的细胞。技术人员将理解，取决于它们所暴露的条件，如物理因素和/或化学或生物成分如生长因子，细胞将分化为成骨细胞谱系的细胞(例如，前成骨细胞或成骨细胞)，或成软骨细胞谱系的细胞(例如，前成软骨细胞或成软骨细胞)。
在特定实施方案中，体外分化细胞是成骨细胞谱系的细胞(例如，骨祖细胞，前成骨细胞，成骨细胞或骨细胞)或成软骨细胞谱系的细胞(软骨祖细胞和/或前成软骨细胞和/或成软骨细胞和/或软骨细胞)。
将MSC分化为成软骨-成骨细胞，成骨细胞或成软骨细胞谱系的细胞可能涉及在能够诱导MSC分化为成软骨-成骨细胞，成骨细胞或成软骨细胞谱系的细胞的条件下培养MSC，更通常在包含够诱导MSC向成软骨-成骨细胞，成骨细胞或成软骨细胞谱系的细胞分化的一种或多种试剂(例如，生长因子)的培养基中培养MSC。用于将MSC分化为成软骨-成骨细胞，成骨细胞或成软骨细胞谱系的细胞的方案包括如本文其他地方所述的将MSC分化为“骨形成细胞B”的过程以及将MSC分化为“细胞产品C”或“骨形成细胞C”的过程如下：将骨髓白细胞以50,000个细胞/cm2的密度接种在包含5％
(Octapharma)，0.1UI/ml肝素(LEO Pharma)，FGF-b(CellGenix)和TGFβ-1(Humanzyme)的常规培养基中，然后在含5％CO2的加湿培养箱中于37℃培养。细胞接种后4天，除去非贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基代替以更新生长因子。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过如用Trypzean(Lonza)分离，并通过来回打旋和移液收获细胞(第1代：P1)。将中间细胞冷冻保存(例如在
CS10中)并储存于液氮中。接着，将中间细胞解冻并以572个细胞/cm2的密度重新接种进行继代培养。在继代培养期间培养细胞10天。第24天时，通过如用Trypzean(Lonza)分离，并通过来回打旋和移液收获细胞(第2代：P2)。将中间细胞冷冻保存(例如在
CS10中)并储存于液氮中。随后，将中间细胞解冻并以572个细胞/cm2的密度重新接种进行三级培养。在三级培养期间培养细胞10天。第34天时，通过如用Trypzean(Lonza)分离，并来回打旋和移液收获细胞(第3代：P3)。为了获得最终的细胞产品，将细胞以如25×106个细胞/ml的终浓度重悬浮于如
中。该细胞产品在本文中被称为“细胞产品C-新鲜”。在三级培养结束时，细胞也被冷冻保存以长期保存。此外，将细胞重悬于冷冻保存培养基中以达到期望的浓度(25×106个细胞/ml)。然后将细胞悬液转移到冷冻管并储存于液氮中。该细胞产品在本文中将被称为“细胞产品C-冷冻”。冷冻保存培养基可以是：
CS10(BioLife Solutions)，或50％(v/v)
CS10(BioLife Solutions Inc)和50％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma),或95％(v/v)
CS10(BioLife Solutions Inc)和5％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)，或80％(v/v)
(BioLife Solutions Inc)，10％(v/v)DMSO和10％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)。
MSC分化为成骨细胞或成软骨细胞谱系的进一步方案包括，尤其是WO2009/087213；WO 2007/093431；以及进一步地，REGER,R.L.et al.‘Differentiation andCharacterization of Human MSCs’.In:Mesenchymal Stem Cells:Methods andProtocols(Methods in Molecular Biology),D.J.Prockop et al.编，Humana Press,2008,Vol.449,p.93-107；VERMURI,M.C.et al.(编).Mesenchymal Stem Cell Assays andApplications(Methods in Molecular Biology).Humana Press,2011,Vol.698,特别是201至352页)。
本文使用的术语“生长因子”是指单独或当被其它物质调节时影响各种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移，并且可以影响生物体发育、形态和功能变化的生物活性物质。生长因子通常可通过作为配体与细胞中存在的响应生长因子的受体(例如，表面或细胞内受体)结合而起作用。本文的生长因子可以具体是包含一个或多个多肽链的蛋白实体。作为示例而非限制，术语“生长因子”包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族、骨形态发生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、转化生长因子β(TGFβ)家族、神经生长因子(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素样生长因子(IGF)家族、生长分化因子(GDF)家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、造血生长因子(HeGFs)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族、糖皮质激素等的成员。技术人员将理解，生长因子或生长因子组合可以是已知能够诱导MSC向期望的细胞类型分化的任何生长因子或生长因子组合。技术人员将理解，诱导MSC向所期望的细胞类型(例如，向成软骨-成骨细胞谱系的细胞)分化的方法可产生所期望的细胞类型的基本上纯的(即，主要由所期望的细胞类型的细胞组成)的细胞群。非限制性地，如此衍生的细胞群可包含至少90％(按数目计)的期望的细胞类型，例如≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％或100％的期望的细胞类型。
技术人员将理解，如本文教导的方法涉及评估体外分化细胞的成骨潜能,如本文意图的体外分化细胞通常在能够诱导多能细胞如MSC向成软骨-成骨细胞，成骨细胞或成软骨细胞谱系分化的条件下培养。与此一致，如本文意图的体外分化细胞通常不在能够诱导多能细胞如MSC向肌细胞谱系(肌肉)，腱细胞谱系(腱)，成纤维细胞谱系(结缔组织)，脂细胞谱系(脂肪)或基质发生谱系(髓基质)分化的条件下培养。
另一方面提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，其包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数；
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量；和
-如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
优选地，另一方面提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，其包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量；和
-如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少150或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
在某些实施方案中，确定体外分化细胞的成骨潜能的方法可包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种的量；和
-如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，CD105的nMFI为至多150或CD10的nMFI为至少40(例如，至少50，至少55或至少60)中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，CD105的nMFI为至多150，或CD10的nMFI为至少50中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少150，CD105的nMFI为至多150，或CD10的nMFI为至少40(例如，至少50，至少55或至少60)中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少150，CD105的nMFI为至多150，或CD10的nMFI为至少50中的任何一种或多种，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，和/或nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
一方面，本发明提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数；
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD10的量；和
-如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，且如果体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少40，例如至少50，至少55或至少60，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选地nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在某些优选实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，且如果体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少50，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选地nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
一方面，本发明提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD10的量；和
-如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少40，例如至少50，至少55或至少60，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选地nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在某些优选实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少50，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选地nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
另一方面，本发明提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD10的量；和
-如果体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少40，例如至少50，至少55或至少60，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选地nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
在某些优选实施方案中，如本文教导的方法可包括如果体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少50，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选地nMFICD10用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量。
优选地，另一方面提供了确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105和CD44的量；和
-如果至少90％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，CD105的nMFI为至多150，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％，如至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种，且如果体外分化细胞具有：
-CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种；
-CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，和CD105的nMFI为至多150；
-nMFICD73为至少550，至少600，至少650，至少700，至少750，至少800，至少850或至少900；nMFICD44为至少110，至少120，至少130，至少140，至少150，至少200，至少250，至少300或至少350；或nMFICD105为至多180，至多170，至多160，至多150，至多140，至多130，至多120，至多110或至多100中的任何一种或多种；
-nMFICD73为至少550，至少600，至少650，至少700，至少750，至少800，至少850或至少900；nMFICD44为至少110，至少120，至少130，至少140，至少150，至少200，至少250，至少300或至少350；和nMFICD105为至多180，至多170，至多160，至多150，至多140，至多130，至多120，至多110或至多100；
-CD73的nMFI为至少700，CD44的nMFI为至少200，或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种；和/或
-CD73的nMFI为至少700，CD44的nMFI为至少200，和CD105的nMFI为至多150，
则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量,和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
在某些实施方案中，如本文教导的方法可包括如果至少90％，如至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的体外分化细胞表达CD73、CD105、CD10和CD44，且如果体外分化细胞具有：
-CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种；
-CD73的nMFI为至少500，CD44的nMFI为至少100，和CD105的nMFI为至多150；
-nMFICD73为至少550，至少600，至少650，至少700，至少750，至少800，至少850或至少900；nMFICD44为至少110，至少120，至少130，至少140，至少150，至少200，至少250，至少300或至少350；或nMFICD105为至多180，至多170，至多160，至多150，至多140，至多130，至多120，至多110或至多100中的任何一种或多种；
-nMFICD73为至少550，至少600，至少650，至少700，至少750，至少800，至少850或至少900；nMFICD44为至少110，至少120，至少130，至少140，至少150，至少200，至少250，至少300或至少350；和nMFICD105为至多180，至多170，至多160，至多150，至多140，至多130，至多120，至多110或至多100；
-CD73的nMFI为至少700，CD44的nMFI为至少200，或CD105的nMFI为至多150中的任何一种或多种；和/或
-CD73的nMFI为至少700，CD44的nMFI为至少200，和CD105的nMFI为至多150，
则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量,和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
本发明人发现，可将如本文教导的确定体外分化细胞的成骨潜能的方法用于选择MSC-供体，其中MSC-供体包含可在体外分化为具有临床上有用的成骨潜能的细胞的MSC。
因此，另一方面提供了选择用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞的受试者方法，该方法包括:
-从受试者的生物样品中回收MSC；
-从MSC中获得体外分化细胞；
-通过如本文教导的方法确定体外分化细胞的成骨潜能；和
-如果体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，则选择该受试者用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞。
在特定实施方案中，从受试者的生物样品回收MSC可如本文其他地方所述进行。在特定实施方案中，从MSC获得体外分化细胞可如本文其他地方所述进行。
在特定实施方案中，受试者是人受试者。
技术人员将理解，如本文所述的定义和具体实施方案可适用于如本文公开的所有方法和用途。
本申请还提供了以下陈述中示出的方面和实施方案：
陈述1.CD73、CD105或CD44在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
陈述2.确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，其包括测量表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的量，以及测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。
陈述3.根据陈述2的方法，所述方法包括：
(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数；
(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量；
(b1)将如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将如(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现如(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
陈述4.根据陈述3的方法，其中所述(b1)的截止值和所述(b2)的各自截止值是代表具有临床上有用的成骨潜能的细胞的截止值。
陈述5.根据陈述4的方法，其中：
-与(b1)的截止值相比，如(a1)中测量的体外分化细胞的分数减少，表明所述体外分化细胞不具有临床上有用的成骨潜能，或
-与(b1)的截止值相比，如(a1)中测量的体外分化细胞的分数相同或增加，表明所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能；和
-与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD73和CD44的量减少，和/或与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD105的量增加，表明所述体外分化细胞不具有临床上有用的成骨潜能，或
-与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD73和CD44的量相同或增加，以及与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD105的量相同或减少，表明所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能。
陈述6.根据陈述3至5中任一项的方法，其中所述(b1)的截止值为90％的在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)为500，CD44的nMFI为100，和/或CD105的nMFI为150，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，和/或nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
陈述7.根据陈述1至6中任一项的方法，其中测量表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量，并且测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量。
陈述8.根据陈述7的方法，其中所述(b1)的截止值为90％的在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100，和CD105的nMFI为150，优选其中nMFICD73用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量，nMFICD44用488nm的激发波长及580nm的发射波长针对PE来测量，和nMFICD105用633nm的激发波长及660nm的发射波长针对APC来测量。
陈述9.根据陈述1至8中任一项的方法，其中体外分化细胞获自间充质干细胞(MSC)。
陈述10.根据陈述1至9中任一项的方法，其中体外分化细胞是人细胞。
陈述11.选择用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞的受试者的方法，该方法包括：
-从受试者的生物样品回收MSC；
-从MSC获得体外分化细胞；
-通过陈述1至10中任一项定义的方法确定体外分化细胞的成骨潜能；以及
-如果体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，则选择该受试者用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞。
陈述12.根据陈述11的方法，其中所述受试者是人受试者。
陈述13.CD73、CD105、CD44和CD10在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
陈述14.确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，其包括测量表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量，以及测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。
陈述15.根据陈述14的方法，所述方法包括：
(a1)测量在体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数；
(a2)测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量；
(b1)将如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将如(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现如(a1)中测量的表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现如(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
陈述16.根据陈述15的方法，其中所述(b1)的截止值和所述(b2)的各自截止值是代表具有临床上有用的成骨潜能的细胞的截止值。
陈述17.根据陈述14至16中任一项的方法，其中测量体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种的量。
陈述18.根据陈述16或17的方法，其中：
-与(b1)的截止值相比，如(a1)中测量的体外分化细胞的分数相同或增加，表明所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能；和
-与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD73、CD44和/或CD10的量相同或增加，以及与(b2)的各自截止值相比，如(a2)中测量的CD105的量相同或减少，表明所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能。
陈述19.根据陈述15至18的方法，其中所述(b1)的截止值为90％的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)为500，CD44的nMFI为100，CD105的nMFI为150，和/或CD10的nMFI为40。
陈述20.根据陈述15至18的方法，其中所述(b1)的截止值为90％的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中所述(b2)的截止值为：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)为500，CD44的nMFI为150，CD105的nMFI为150，和/或CD10的nMFI为40。
陈述21.根据陈述14至20中任一项的方法，其中测量由体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量。
陈述22.根据陈述21的方法，其中所述(b2)的截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100，和CD105的nMFI为150。
陈述23.根据陈述13的用途或根据陈述14至22中任一项的方法，其中所述体外分化细胞获自间充质干细胞(MSC)。
陈述24.根据陈述13的用途或根据陈述14至23中任一项的方法，其中所述体外分化细胞是人细胞。
陈述25.选择用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞的受试者的方法，所述方法包括：
-从受试者的生物样品回收MSC；
-从MSC获得体外分化细胞；
-通过陈述14至24中任一项定义的方法确定体外分化细胞的成骨潜能；以及
-如果体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，则选择该受试者用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化的细胞。
陈述26.根据陈述25的方法，其中所述受试者是人受试者。
陈述27.确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，该方法包括以下，基本由以下组成或由以下组成：
-测量体外分化细胞的细胞表面上CD10的量；和
-如果体外分化细胞具有至少40的CD10的nMFI，则确定该体外分化细胞具有成骨潜能，优选nMFICD10用488nm的激发波长和580nm的发射波长针对PE来测量。
虽然已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是显然，根据前面的描述，许多替换、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，在所附权利要求的精神和宽范围内，本发明包括所有这些替代、修改和变化。
本文公开的本发明的方面和实施方案进一步由以下非限制性实施例支持。
实施例
实施例1：获得间充质干细胞(MSC)和MSC衍生细胞的方法
间充质干细胞
从健康志愿者供体的髂嵴获得人骨髓(BM)抽吸物来制备未分化的MSC。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm2的密度接种于培养基中，并在含有5％CO2的加湿培养箱中于37℃温育。24小时后，除去培养基并添加细胞新鲜培养基。每2-3天更换一次培养基。当超过一半的集落达到80％汇合或一些集落达到100％汇合时，收获细胞(第1代：P1)。该第一次传代时，细胞直接冷冻保存于
CS10(BioLife Solutions Inc.)中。为完成培养过程，将MSC解冻，以572个细胞/cm2接种并培养，以进行第二次培养。当超过一半的集落达到80％汇合或一些集落达到100％汇合时，收获细胞，以获得第2代(P2)的MSC。该细胞产品在本文称为“MSC”。
细胞产品A(在本文中又称为骨形成细胞A)
常规培养基包含5％Octaserum(50:50自体血清和
(Octapharma))，FGF-b(CellGenIX)和TGFβ-1(Humanzyme)。
冷冻培养基包含10％Octaserum(50:50自体血清和
(Octapharma))，10％DMSO。
通过从健康志愿者供体的髂嵴获得人BM抽吸物来制备本文称为“细胞产品A”的体外分化的MSC衍生细胞。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm2的密度接种于培养基，并在含有5％CO2的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，除去未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基更换。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收集细胞(第1代：P1)。将中间细胞于
CS10(BioLife Solutions Inc.)或冷冻介质中冷冻保存并储存于液氮中。
为进行继代培养，将细胞解冻并以1144个细胞/cm2的密度重新接种。在继代培养期间培养细胞14天。第28天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收获细胞(第2代：P2)。为获得最终细胞产品，将细胞以25×106个细胞/ml的终浓度重悬于
中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品A”。
细胞产品B(在本文中又称为骨形成细胞B)
常规培养基包含5％
(Octapharma)，0.1UI/ml肝素(LEO Pharma)，FGF-b(CellGenIX)和TGFβ-1(Humanzyme)。
通过从健康志愿者供体的髂嵴获得人BM抽吸物来制备体外分化的MSC衍生细胞。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm2的密度接种于培养基，并在含有5％CO2的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，除去未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基更换以更新生长因子。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收获细胞(第1代：P1)。将中间细胞于
CS10(BioLife Solutions)中冷冻保存并储存于液氮中。
接着，将细胞解冻并以286个细胞/cm2的密度重新接种以进行继代培养。在继代培养期间培养细胞14天。第28天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收获细胞(第2代：P2)。为获得最终细胞产品，将细胞以25×106个细胞/ml的终浓度重悬于
中。该细胞产品在本文中称为“细胞产品B”。
细胞产品C(即，细胞产品C-新鲜和细胞产品C-冷冻；在本文中又称为骨形成细胞
C)
常规培养基包含5％
(Octapharma)、0.1UI/ml肝素(LEO Pharma)、FGF-b(CellGenIX)和TGFβ-1(Humanzyme)。
从健康志愿者供体的髂嵴获得20至60ml人骨髓(BM)抽吸物。收获后，对骨髓白细胞进行计数，以50,000个细胞/cm2的密度接种于培养基，并在含有5％CO2的加湿培养箱中于37℃温育。细胞接种后4天，除去未贴壁细胞，并用培养基更新培养基。接种后7天和11天，除去一半培养基，并用新鲜培养基更换以更新生长因子。在原代培养期间培养细胞14天。第14天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收获细胞(第1代：P1)。将中间细胞冷冻保存(于
CS10)并于液氮中储存。每个细胞储备都来自一个供体，并且供体之间没有合并。
接着，将中间细胞解冻并以572个细胞/cm2的密度重新接种进行继代培养。在第二次培养期间培养细胞10天。第24天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收获细胞(第2代：P2)。将中间细胞冷冻保存(于
CS10)并于液氮中储存。
随后，将中间细胞解冻并以572个细胞/cm2的密度重新接种进行三级培养。在三级培养期间培养细胞10天。第34天时，通过用Trypzean(Lonza)分离并来回打旋和移液来收获细胞(第3代：P3)。为获得最终的细胞产品，将细胞以25×106个细胞/ml的终浓度重悬于
该细胞产品在本文中称为“细胞产品C-新鲜”。
三级培养结束时，细胞也被冷冻保存以长期储存。其中，将细胞重悬于冷冻保存培养基中以达到期望的浓度(25×106个细胞/ml)。然后将细胞悬浮液转移到冷冻管并于液氮中储存。该细胞产品在本文中称为“细胞产品C-冷冻”或“骨形成细胞C-冷冻(保存)”，又简称为“B-F细胞C”。冷冻保存培养基为：
-
CS10(BioLife Solutions)，或
-50％(v/v)
CS10(BioLife Solutions)和50％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)，或
-95％(v/v)
CS10(BioLife Solutions)和5％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)，或
-80％(v/v)
(BioLife Solutions)，10％(v/v)DMSO和10％(v/v)人血清白蛋白(Octapharma)。
实施例2：成软骨-成骨细胞谱系的MSC衍生细胞的体内骨形成特性
材料与方法
细胞培养
如实施例1中所述制备MSC，骨形成细胞A、B和C。
小鼠
9-10周龄的雌性NMRI-裸鼠(nu/nu)购自Janvier S.A.S.(Le Genest-St-Isle,France)，并在标准条件下饲养，随意取食和饮水。在本研究中总共使用196只小鼠。
颅骨形成小鼠模型
将12周龄的雌性NMRI-裸鼠(nu/nu)(n＝137)用异氟烷
麻醉，并在颅骨上接受单次皮下施用MSC、骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生)，或骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生)(每只小鼠2.5×106个细胞/100μl)，或赋形剂(100μl)。为标记随时间的骨新形成，将钙结合的荧光染料依次施用于小鼠。分别在细胞施用之前3天和之后4、8和12天腹膜内注射茜素红(红色)，钙黄绿素(绿色和蓝色)和四环素(黄色)(均来自
)。施用后，监测实验动物的体重、整体临床体征和施用部位的临床体征达2周。细胞施用后2周，通过颈脱位法对小鼠实施安乐死，并收获每只小鼠的颅盖，通过X射线成像、组织形态学(骨形成的定量)和免疫荧光法评估骨形成细胞的骨形成特性。
颅骨形成小鼠模型—细胞产品C-冷冻
将12周龄的雌性NMRI-裸鼠(nu/nu)用异氟烷
麻醉，并在颅骨上接受单次皮下施用细胞产品C-冷冻(每只小鼠2.5×106个细胞/100μl)或赋形剂(100μl)。为标记随时间的骨新形成，将钙结合的荧光染料依次施用于小鼠。分别在细胞施用之前2或3天和之后5、12和19天腹膜内注射茜素红(红色)，钙黄绿素(绿色和蓝色)和四环素(黄色)(均来自
)。施用后，监测实验动物的体重、整体临床体征和施用部位的临床体征达4周。在细胞施用后4周，通过颈脱位法对小鼠实施安乐死，并收获每只小鼠的颅盖，通过X射线成像、组织形态学(骨形成的定量)和免疫荧光法评估骨形成细胞的骨形成特性。
样本包埋和组织切片
为进行组织形态计量术，ALP，TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)，Masson三色戈德纳(Trichrome戈德纳)染色和免疫荧光法，将颅盖固定并在70％、80％和90％乙醇浴中于4℃下在轻轻摇动的情况下各自连续温育12小时进行脱水，并包埋在甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)塑料树脂(HistoResin,
)中。使用切片机(
RM2255)切下4μm厚和8μm厚的冠状面。为进行番红-橙染色和免疫过氧化物酶，将颅骨在3.7％甲醛中固定24小时，在10％乙二胺四乙酸(EDTA)pH 7.4中脱钙3天，并包埋在石蜡中。使用切片机(
RM2255)切下7μm厚的冠状面和矢状面石蜡切片。
免疫荧光染色
在4μm厚的颅盖冠状面塑料组织切片上通过免疫荧光评估人和鼠胶原I。简言之，于室温(RT)下使用PBS 1X/Triton 0.3％溶液透化30分钟的步骤后，将组织切片在封闭溶液(即，PBS/BSA/马血清/TritonTM)中于室温下温育1小时，以使非特异性结合位点饱和。然后将组织切片与小鼠抗人和兔抗鼠胶原I一抗(分别为Abcam；#ab138492和Abcam；#ab21286)于4℃温育过夜。在PBS中于室温下进行5分钟的3次漂洗步骤后，于室温下用封闭液实现封闭1小时。然后添加稀释于封闭溶液的二抗，室温避光2小时。将二抗Alexa
488驴抗兔IgG H&L(ThermoFisher，#A21206)和Alexa
山羊抗小鼠IgG H&L(Abcam；#ab97035)分别用于显现小鼠胶原I(绿色)和人胶原I(红色)。然后将载玻片于室温下在PBS 1X中漂洗3次达5分钟，然后于室温下与
溶液一起温育1分钟，以染色细胞核。最后，将载玻片在PBS中短暂漂洗一次，然后在
试剂中封装。作为免疫荧光的阴性对照，在邻近的组织载玻片上省略了一抗。
组织学染色
分别使用ALP和TRAP酶活性检测方法在颅盖切片上评估成骨细胞和破骨细胞的活性。为了进行ALP染色，将4μm厚的颅盖冠状面塑料切片与固蓝RR盐
和萘酚AS-MX碱性磷酸盐
溶液一起温育1小时。根据制造商的说明，使用酸性磷酸酶，白细胞(TRAP)试剂盒
在8μm厚的颅盖冠状面塑料切片上进行TRAP染色。为评估新形成骨的矿化状况，根据制造商的说明，使用试剂盒
对用ALP染色的颅盖切片进行Masson三色戈德纳染色。为证实软骨形成，在7μm厚的颅盖矢状面石蜡切片上进行番红-橙染色。简言之，脱蜡后，将组织切片依次在Weigert’s苏木精
中温育10分钟，0.1％固绿
中温育5分钟，1％醋酸(VWRChemicals)中温育15秒，0.1％番红-橙(
ref:84120)中温育5分钟。脱水后，使用
用玻璃盖玻片封装载玻片。使用光学显微镜
和
LASEZ软件拍摄数字图像。
免疫过氧化物酶
脱石蜡后，将7μm厚的颅盖冠状面或矢状面石蜡切片依次与2.5％透明质酸酶
于37℃温育30分钟，在3％H2O2 
中于室温下温育30分钟，在含0.3％Triton X-100
的PBS中于室温下温育30分钟，以及在封闭溶液(即PBS/BSA/马血清/Triton)中于室温下温育1小时。将切片与小鼠抗人I型胶原一抗(Abcam，ab90395)，兔抗鼠I型胶原一抗(Abcam，ab21286)或兔抗Ku80一抗(Abcam，ab80592)于4℃温育过夜。根据制造商的说明，使用Vectastain试剂盒(Vector Laboratories，PK6200)和3,3'二氨基联苯胺(Vector Laboratories)显现染色。用Mayer’s苏木精
复染切片。使用
用玻璃盖玻片封装载玻片。
通过X射线分析定量骨形成(骨形成细胞C)
安乐死时，使用
MX-20设备对并排放置的每只小鼠的颅盖进行离体X射线成像。在手动模式下以1.5X放大率拍摄数字图像，其中电压设置为35kV，曝光时间为4.8秒，亮度/对比度为8300/6000。生成的X射线图像是灰度图像，其灰度强度值的范围为0(黑色区域)到255(白色区域)，并且与射线不透性成正比，因而与骨不透明度或骨厚度成正比。使用
软件的直方图工具分析顶骨(手动选择)上骨形成的骨诱导部分(从选择中丢弃矿化结节)的灰度强度值。
X射线成像和
软件还用于定量矿化结节的表面(手动选择)。
颅盖的组织形态计量学分析：骨形成的定量
对塑料包埋的组织进行骨形成(即，绝对骨形成)的定量。通过
图像分析软件(Zeiss)，在4μm厚的冠状面上测量有矿化结节和无矿化结节的绝对新形成骨的厚度(从茜素红荧光标记的基底矿化前缘到钙黄绿素和四环素荧光标记的骨新形成)的测量值(以μm计)。对于每只动物，在5个独立水平上进行4次绝对厚度测量，每个水平之间的距离为200μm。第一步，计算每只动物的平均厚度(有结节或无结节)±SD(即，5个水平上每个水平的4个测量值的平均值)。
在组织学图像上定量新形成骨的表面积(
软件)
为了进行骨诱导和成骨结节的表面积分析，使用荧光显微镜(Zeiss AxioscopeA1，Zeiss，Germany)的多个荧光和明视野滤光片的组合，从颅盖的塑料树脂组织切片(4μm)采集冠状缝后每2个水平获取的6个独立水平的数字图像。在每个测量水平上，使用
软件在明视野拼接图像上手动限定骨诱导的骨新形成的选择。测量该选择的矿化表面积和总表面积(以mm2计)。对成骨结节的矿化表面积和总表面积进行相同的程序。
对于骨诱导和成骨结节，接着以每实验动物和每组计算总表面积的平均值和矿化表面积的平均值。最后，将骨新形成的总表面积计算为骨诱导和成骨结节表面积的总和。
统计分析
结果表示为平均值±标准差(SD)。使用
(SAS Institute Inc.)或GraphPad
软件进行统计分析。p＜0.05时，组之间的差异被认为是统计学显著的。
结果
施用后2周，骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1生成)和骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素生成)都显示比对照(赋形剂)显著更高的骨形成(图1-2，表1)。更具体地，图3示出骨形成细胞B显示骨诱导特性(在颅盖上来自鼠来源的均一骨形成)和成骨特性(来自人和鼠来源的矿化结节)。
表1：小鼠颅盖切片上的骨形成的定量(％)。鼠颅盖已经用赋形剂(阴性对照)、骨形成细胞A或骨形成细胞B处理。
缩写：SD：标准差
骨形成细胞A和B的骨诱导特性(即，植入后新形成的鼠骨的量)是相等的(图1-2)。
非常有趣的是，本发明的骨形成细胞B显示有效的成骨特性和骨诱导特性，如由植入后新形成的大量人和鼠骨(人和鼠CoII IF染色，图3)所示。
在7/8个供体和80％骨形成细胞B的小鼠中，以及在4/11个供体和20％骨形成细胞A的小鼠中观测到结节的存在。在施用MSC或赋形剂后没有观测到结节。除了骨诱导活性，骨形成细胞B因此促进了高的成骨活性，这通过在80％的处理小鼠中观测到存在大的矿化结节而突出显示，而骨形成细胞A显示弱的成骨活性，即在仅20％的处理小鼠中观测到小的结节(表2)。
表2：在颅盖上施用赋形剂、MSC、骨形成细胞A或骨形成细胞B后两周，定量鼠颅盖上矿化结节的存在
| 骨生成发生 | 供体 | 批次 | 动物 |
| 赋形剂 | NA | NA | 0/32(0％) |
| MSC | 0/2 | 0/2 | 0/14(0％) |
| 骨形成细胞A | 4/10(40％) | 4/11(36％) | 9/45(20％) |
| 骨形成细胞B | 7/8(88％) | 7/8(88％) | 37/46(80％) |
缩写：MSC：间充质干细胞；NA：不适用
施用(仅赋形剂、MSC、骨形成细胞A(用FGF-2和TGFβ1产生；b-f细胞A)或骨形成细胞B(用FGF-2、TGFβ1和肝素产生；b-f细胞B))后2周，鼠颅盖冠状面的组织学染色显示，所有处理条件(MSC、b-f细胞A和b-f细胞B)都具有高的骨诱导潜能，其中在骨诱导形成的骨中具有中等重塑活性(ALP和TRAP染色)。
有趣的是，在用骨形成细胞B处理的小鼠中观测到的矿化结节由鼠(宿主)和人(供体)骨组织两者构成(通过人和鼠I型胶原染色证明)，表明结节通过两种骨形成过程形成：成骨过程(供体骨形成)和骨诱导过程(宿主骨形成)。除了高的成骨细胞和破骨细胞活性外(ALP+TRAP染色)，结节表现出类骨质组织(非矿化组织)，表明施用后2周骨形成仍在进行，而在所有条件下观测到的骨诱导过程已经完成(图4)。
图4显示在施用骨形成细胞B的小鼠的结节中通常检测到人骨形成(即，骨生成)(用抗人I型胶原染色观测到)和高的成骨细胞和破骨细胞活性(分别用ALP+戈德纳染色和TRAP染色观测到)，从而显示结节中的骨形成过程正在进行并且在2周时未完成，这与MSC和骨形成细胞A似乎完成的骨诱导过程不同。所有处理条件(MSC、b-f细胞A、b-f细胞B)具有高的骨诱导潜能，其中在骨诱导的骨形成中具有中等的重塑活性(ALP和TRAP染色)(图4)。
在仅用赋形剂、MSC、b-f细胞A或b-f细胞B处理后2周，通过荧光评估骨的新形成(图5)。为此，在特定时间点，向小鼠施用骨钙结合荧光染料(即，茜素红、钙黄绿素绿和蓝、四环素黄)以标记新形成的骨。最后施用的荧光染料是在细胞施用后12天施用的四环素。
如图5中所示，施用骨形成细胞B的小鼠的结节大部分被四环素荧光染料染色(图5中黄色染色用虚线包围)，证实了与骨诱导的骨形成中观测到的骨诱导相比稍后阶段的形成(茜素红(红色)、钙黄绿素(绿色)和钙黄绿素(蓝色)：这些染色以浅灰色出现，且双箭头表示骨形成厚度)。
通过在组织学图像(
软件)上对新形成骨的表面积进行定量来评估处理小鼠的骨新形成。通过对每个分析的水平和每只小鼠的骨诱导的表面积和骨结节的表面积求和来确定新形成的骨的总表面积。
结果显示，与MSC(n＝6只小鼠，在图6中以深灰色显示)相比，骨形成细胞B(n＝7只小鼠，在图6中以浅灰色显示)在施用细胞后2周显著增加骨新形成约2倍(表3)。这种差异是由于骨形成细胞B显示的高成骨特性，以及MSC对此类特性的缺乏。
表3：在冠状面上测量总的骨新形成，包括骨诱导和成骨形成
缩写：MSC：间充质干细胞；SD：标准差
此外，使用组织学染色评估随时间的骨新形成，显示在施用骨形成细胞B的小鼠颅盖顶部观测到的结节通过软骨内骨化机制骨化。图7中，番红-橙染色显示蛋白聚糖(对软骨特异的)基质(由虚线包围的区域)；细胞核；骨组织；和细胞质。与通过膜内骨化产生的骨诱导的骨相反，通过软骨内骨化产生骨结节，其中软骨基质在施用后1周至3周之间出现(图7)。
在施用骨形成细胞B后4周进行的靶向人I型胶原、鼠I型胶原和人细胞核(即Ku80)的免疫组织化学染色证实结节中存在人骨。此外，Ku80染色显示骨形成细胞B在体内施用后移入骨基质(结节)中并变为骨细胞。施用细胞产品C-冷冻的小鼠在施用后4周显示比对照更高的骨形成(图11A-C)。与赋形剂相比，骨形成细胞C-冷冻的骨不透明度显著更高(图11B)。与未观测到矿化结节的赋形剂相比，骨生成的表面显著更高(图11C)。与赋形剂相比，骨形成细胞C-冷冻的有或无骨生成的骨诱导的形态计量学测量值(以绝对骨形成表示)显著更高(图11D和11E)。此外，除骨诱导活性外，骨形成细胞C-冷冻还促进了以存在矿化的结节突出显示的高的成骨活性。在4/5个骨髓供体(或批生产)和65％小鼠中观测到这种成骨活性(图11F)。当每组一只小鼠中观测到至少一个矿化结节时，该供体/批次被认为是成骨的(阳性)。赋形剂施用后未观测到结节。
更具体地，细胞产品C-冷冻既显示骨诱导特性(在颅盖上来自鼠来源的均一骨形成)，又显示出成骨特性(来自人和鼠来源的矿化结节)(图12)。
沿颅盖表面诱导了膜内宿主骨化(图12和13)。更具体地，骨形成细胞C-冷冻显示骨诱导和成骨特性(图13，“荧光(fluo)”)。小鼠/人I型胶原双重免疫标记(图13，“人I型胶原”)显示存在宿主和供体来源的骨(骨生成)。在矿化结节中通常检测到成骨细胞(图13，“ALP+”)和破骨细胞(图13，“TRAP”)活性，表明结节中的骨重塑过程在施用后4周仍在进行。该观测结果取决于结节的尺寸：结节越大，施用后4周仍存在的ALP和TRAP活性越多。突出显示弱的类骨质(图13，“戈德纳Masson三色染色”)表明骨形成过程已完成。
因此，冷冻保存的骨形成细胞C增加了骨新形成。
这证明了如说明书和实施例中所述的细胞产品和细胞组合物用于治疗扁平骨和长骨中的骨缺损的有用性。
实施例3：通过骨形成细胞A、骨形成细胞B和冷冻保存的骨形成细胞C修复体内小鼠股骨节段性亚临界尺寸缺损(sub-CSD)
实验程序
细胞培养
如实施例1中所述制备骨形成细胞A、骨形成细胞B和冷冻保存的骨形成细胞C。
股骨节段性sub-CSD模型
根据文献((Manassero et al.,2013,Tissue Engineering,Part C Methods,19(4):271-80；Manassero et al.,2016,Journal of Visualized Experiments；(116):52940)在无菌条件下进行手术程序。简言之，用腹膜内注射盐酸右美托咪定(
Orion Pharma，1mg/kg体重)和氯胺酮(
Euronet，150mg/kg体重)的混合物来麻醉13周龄的NMRI-雌性裸鼠(nu/nu)，并将其腹部位置置于加热板上。在左股骨前侧应用4或5个螺钉固定的6孔钛微锁定板
之后，使用Gigli锯和夹具(RISystem
)进行2mm长的骨干中段股骨截骨术。作为预防性药物，在手术前1天(在饮用水中)施用抗生素(
10mg/kg体重)，并在手术前1天和手术后每隔12个小时至少3天施用镇痛剂(盐酸丁丙诺啡，
Stemring-Plough，0.1mg/kg体重)。手术当天(正好用手术缝合线缝合创伤后)使用50μl-Hamilton注射器通过经皮注射在骨损伤部位局部施用MSC衍生细胞(每只小鼠2.25×106个细胞/30μl体积)或赋形剂(对照组)。在细胞或赋形剂施用后6或10周，通过颈脱位对小鼠实施安乐死。解剖每只小鼠的左股骨，收获，并在X射线成像前于室温保持在0.9％NaCl中。
通过X射线分析定量骨修复
手术后使用
MX-20设备，对每只小鼠的左股骨进行体内X射线成像，以控制板固定，节段性股骨缺损尺寸并获得基线，并且每两周进行一次。在手动模式下以5X放大倍数拍摄中外侧和前后视图的数字图像，电压设置为35kV，曝光时间为4.8秒，亮度为4,300，且对比度为7,100。细胞施用后6周，对安乐死时收获的左股骨进行离体X射线成像。对于骨形成细胞A和骨形成细胞B实验，使用
软件，通过测量中外侧和前后X射线图像上3个位置处(缺损的右侧、中间和左侧)骨缺损的两个边缘之间的距离(μm)，对每只小鼠随时间的缺损尺寸进行定量(总共6次测量)。计算每只小鼠在每个时间点的6次测量值的平均值。
对于冷冻保存的骨形成细胞C实验，使用
软件，通过测量中外侧和前后X射线图像上两个位置(两者均为皮质)处骨缺损的两个边缘之间的距离(μm)，对每只小鼠随时间的缺损尺寸进行定量(总共4次测量)。计算每只小鼠在每个时间点的4次测量值的平均值。
适用于SFCSD模型的RUS(影像学愈合评分(radiographic union score))是基于存在或不存在骨新形成、桥接和骨折线(来自前后和中外侧的影像学图像)的半定量测量。评分对应于两个视图上2个皮质缺损部位处确定的4个评分的总和(共4个评分，每个范围为1-4)。因此，评分的范围为4(无愈合迹象)至16(完全融合)。
融合评分是二元分数，其评估股骨缺损边缘之间的融合率。用于定义融合的放射学标准是可视化至少3个皮质处缺损的桥接(
E et al.,Acta Orthop TraumatolTurc.2014,48(5),533-40)。分数是0(无融合)或1(融合)。对于此参数，仅分析最后一个时间点(此处为W10)。
微型计算机断层扫描(micro-CT)分析
安乐死时收获后，将左股骨用3.7％甲醛固定，并转移至显微镜和分子成像中心(CMMI，ULB，Gosselies，Belgium)进行Micro-CT分析。使用多模式microPET/CT
PET/CT相机(Mediso)和NuclineTM v2.01软件(Mediso)扫描样品。使用半圆形扫描，最大放大，35kVp的管张力，每次机架旋转720次投影，每次投影300ms的曝光时间，1比1的探测器像素合并进行扫描。X和Y维度上的扫描长度适用于每次获取。Micro-CT扫描的总持续时间为3分42秒。使用Shepp-Logan滤波器和8个常规样品的多重采样模式，用40μm侧的立方体素对每个micro-CT扫描进行后重建。X和Y图像的维度适用于每次重建。Z图像的尺寸对应于为获取而定义的扫描长度。在用Z轴(扫描仪轴)重新定向骨并在Z轴上从股骨的一个近端螺钉到另一个近端螺钉修剪图像且在横向(XY)平面上尽可能窄之后，对micro-CT图像进行骨修复的定性评估。然后，生成3D最大强度投影(MIP)绘制。为了定量评估骨修复，在micro-CT扫描中将2mm直径和2mm轴向长度的虚拟圆柱体放置在缺损空间中，并通过放射强度等于或高于1500HU的体素阈值处理来评估该圆柱体中的平均骨体积。
结果
骨形成细胞B和骨形成细胞C-冷冻改善小鼠股骨亚临界节段性缺损的修复
在NMRI裸鼠的亚临界尺寸节段性缺损(CSD)模型中，骨形成细胞B(n＝12只小鼠，2批)施用后2至6周改善了骨折修复，如通过与赋形剂(n＝11只小鼠)和与骨形成细胞A(n＝4只小鼠)相比显著降低骨缺损尺寸所示(图8A)。
赋形剂、骨形成细胞A(未显示)或骨形成细胞B施用后，D0和6W时节段性股骨缺损的X射线图像显示，与施用赋形剂(图8B)或骨形成细胞A(未显示)的小鼠相比，施用根据本发明的实施方案的骨形成细胞B的小鼠中的骨缺损尺寸减小。
在施用赋形剂和骨形成细胞B后6W时，通过显微计算机断层扫描(Micro-CT)分析定量节段性股骨缺损的骨修复体积。结果证实，与赋形剂相比，骨形成细胞B诱导更高的骨修复(图8C)。
施用后2至10周，与赋形剂相比，冷冻保存的骨形成细胞C显著改善和加速节段性股骨sub-CSD模型的骨折修复的百分比(图14和图15)(n＝38只小鼠(19只处理，19只赋形剂对照组，2批；p<0.001)。此外，与赋形剂组相比，冷冻保存的骨形成细胞C组的RUS评分显著提高(图16)。并且最后，与施用赋形剂后无融合相比，施用冷冻保存的骨形成细胞C后10周，融合率得到改善，其中9/19(47％)的小鼠的融合。
实施例4：体外细胞表征实施例2和3中显示成骨潜能的MSC衍生细胞
材料和方法
细胞培养
如实施例1中所述获得MSC、细胞产品A和细胞产品B、细胞产品C-新鲜和细胞产品C-冷冻。
流式细胞术分析
细胞表面标志物的表征通过流式细胞术进行。将50,000个细胞以1×106个细胞/ml的浓度在PBS-1％BSA中与5μl抗体一起在黑暗中温育10分钟。在该温育时间后，细胞用PBS洗涤一次。用于细胞外染色的不同抗体如下：别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD105抗体(BD
目录号：562408)，抗CD73抗体(BD
目录号：560847)，藻红蛋白(PE)缀合的抗CD10抗体(BD
目录号：555375)，抗CD44抗体(BD
目录号：550989)。非特异性染色通过将细胞与缀合有FITC、APC和PE的免疫球蛋白G(IgG)对照(全部为BD
目录号分别为：556649；555751；556650)一起温育来确定。分析之前，对单峰(singulets)和感兴趣的群体进行门控，如图9中所示。使用FACS CantoTMII(BD
)和FACS DivaTM8.0软件(BD
)对门控群体的10 000个事件进行流式细胞术分析。用于分析的设置参数用珠(BD CompBeads
目录号：560497)自动进行。对于每种缀合物，将阳性截止值固定在1％的对照同种型抗体阳性并且确定各标志物的阳性。还测定了整个分析群体的荧光强度中值(MFI)，并除以相应同种型对照抗体的MFI，以获得标准化MFI(nMFI)。
结果
流式细胞术分析显示，基于细胞产品A、细胞产品B(根据现有技术的比较方法产生)和进行或未进行最终冷冻保存的细胞产品C(由本发明示例的方法产生)的细胞表面标志物表达谱的一般细胞身份是可比的。
它们全部表达间充质标志物CD73、CD90和CD105，并且不表达造血标志物CD45、CD34和CD3(少于5％的细胞群表达这些标志物)(表4)。细胞产品A、细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)表达低水平的MHC II类细胞表面受体如HLA-DR。以HLA-DR弱表达所代表的弱免疫原性有利地允许将细胞移植到例如同种异体受试者中(表4)。另外，与未分化的MSC相比，细胞产品A、细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)在其表面上高表达酶ALP(表4和表5)。ALP的高表达突出显示细胞产品A、细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)定型于成骨细胞谱系。与未分化的MSC相比，细胞产品A、细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)还高表达细胞标志物CD10(表4)。
表4：比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A、细胞产品B)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C)的细胞表面标志物表达谱
缩写：ALP:碱性磷酸酶；APC:别藻蓝蛋白；FITC:异硫氰酸荧光素；HLA-DR:人白细胞抗原-DR同种型；HLA-DR/DP/DQ:人白细胞抗原-DR/DP/DQ同种型；MSC:间充质干细胞；ND:未确定；PE：藻红蛋白；SD:标准差
表5：比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A、细胞产品B)和示例本发明的细胞产品(即，细胞产品C)的ALP表达水平
缩写：ALP:碱性磷酸酶；ND:未确定；PE:藻红蛋白
细胞表面标志物表达谱不仅通过细胞表面上标志物的存在(群体阳性百分比)来表征，而且还通过分析不同标志物的细胞表面上表达的标志物的量(群体标准化荧光中值)来表征。这些分析突出显示不同MSC衍生细胞之间的一些差异。
在肝素存在下培养的细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)表达的ALP水平高于在没有肝素的情况下培养的MSC和细胞产品A(ALP-PE nMFI结果)，从而增强了它们定型于骨形成细胞的成骨细胞谱系。
间充质标志物CD73和CD105在细胞表面上的表达还取决于细胞类型。在肝素存在下产生的细胞产品(细胞产品B和进行或未进行最终冷冻保存的细胞产品C)表达的CD73和CD105水平高于细胞产品A。此外，细胞产品C在其表面上似乎比细胞产品B具有更多的CD73和CD105，尤其是当细胞产品C未经过最终的冷冻保存时(表6)。分化的细胞产品A、B和C比未分化的MSC表达更高量的细胞标志物CD10。此外，细胞产品C在其表面上比细胞产品A和B具有更多的CD10(表6)。
鉴于以上，基于表达CD73、CD105、CD10或CD44中任何一种或多种的量；和/或细胞表面上表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量，似乎可将细胞产品B和细胞产品C(进行或未进行最终冷冻保存)与细胞产品A相区分，其中在实施例2和3中产品B和C已显示骨诱导性和高成骨潜能，在实施例2和3中产品A已显示骨诱导性和低成骨潜能。
更具体地，基于表4和表6，似乎细胞产品B和细胞产品C的至少90％的细胞在细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44(表4)，并且细胞产品B和细胞产品C的细胞具有至少500的nMFICD73，至少100(或至少150)的nMFICD44，至多150的nMFICD105(表6)。另一方面，细胞产品A的细胞具有小于500的nMFICD73和小于100(或小于150)的nMFICD44；并且MSC具有小于500的nMFICD73和大于150的nMFICD105(表6)。
因此，表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量与由体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量的组合适合并足以区分细胞产品B和细胞产品C的细胞与MSC或细胞产品A的细胞。与此一致，表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量与体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量组合适合并足以确定体外分化细胞是否具有成骨潜能，尤其是用于确定体外分化细胞是否具有高的成骨潜能。
表6：比较细胞产品(即，MSC、细胞产品A、细胞产品B)和细胞产品C的其他细胞表面标志物表达结果
缩写：ALP:碱性磷酸酶；APC:别藻蓝蛋白；FITC:异硫氰酸荧光素；HLA-ABC:人白细胞抗原ABC；HLA-DR:人白细胞抗原-DR同种型；MSC:间充质干细胞；NA:不可用；ND:未确定；PE:藻红蛋白；SD:标准差
此外，nMFI流式细胞术分析显示，CD73和CD44蛋白表达在骨形成细胞C中比在其他细胞类型(包括骨形成细胞B)中更高(图10)。
Claims (15)
1.CD73、CD105、CD44和CD10在确定体外分化细胞的成骨潜能中的用途。
2.确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，其包括测量表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的量，以及测量由所述体外分化细胞表达的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量。
3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括：
(a1)测量所述体外分化细胞的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的所述体外分化细胞的分数；
(a2)测量所述体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量；
(b1)将(a1)中测量的所述表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与代表具有已知成骨潜能的细胞的截止值进行比较；
(b2)将(a2)中测量的CD73、CD105或CD44中任何一种或多种的量与代表具有已知成骨潜能的细胞的一个或多个各自截止值进行比较；
(c1)发现(a1)中测量的所述表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞的分数与所述截止值的偏差或无偏差；
(c2)发现(a2)中测量的所述CD73、CD105或CD44中任何一种的量与所述截止值的偏差或无偏差；以及
(d)将所述偏差或无偏差归因于所述体外分化细胞的成骨潜能的特定测定。
4.根据权利要求3所述的方法，其中(b1)的所述截止值和(b2)的所述各自截止值是代表具有临床上有用的成骨潜能的细胞的截止值。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中测量所述体外分化细胞的细胞表面上CD73、CD105、CD44或CD10中任何一种或多种的量。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中：
-与(b1)的所述截止值相比，(a1)中测量的所述体外分化细胞的分数相同或增加，表明所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能；和
-与(b2)的所述各自截止值相比，(a2)中测量的CD73、CD44和/或CD10的量相同或增加，以及与(b2)的所述各自截止值相比，(a2)中测量的CD105的量相同或减少，表明所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能。
7.根据权利要求3至6所述的方法，其中(b1)的所述截止值为90％的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中(b2)的所述截止值为：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)为500，CD44的nMFI为100，CD105的nMFI为150，和/或CD10的nMFI为40。
8.根据权利要求3至6所述的方法，其中(b1)的所述截止值为90％的细胞表面上表达CD73、CD105、CD10和CD44的体外分化细胞；并且其中(b2)的所述截止值为：CD73的标准化荧光强度中值(nMFI)为500，CD44的nMFI为150，CD105的nMFI为150，和/或CD10的nMFI为40。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中测量由所述体外分化细胞表达的CD73、CD105和CD44的量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中(b2)的所述截止值为：CD73的nMFI为500，CD44的nMFI为100，和CD105的nMFI为150。
11.根据权利要求1所述的用途或根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述体外分化细胞获自间充质干细胞(MSC)。
12.根据权利要求1所述的用途或根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述体外分化细胞是人细胞。
13.选择用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞的受试者的方法，所述方法包括：
-从受试者的生物样品回收MSC；
-从所述MSC获得体外分化细胞；
-通过权利要求2至12中任一项所定义的方法来确定所述体外分化细胞的成骨潜能；以及
-如果所述体外分化细胞具有临床上有用的成骨潜能，则选择所述受试者用于制备成软骨-成骨细胞谱系的体外分化细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
15.确定体外分化细胞的成骨潜能的方法，所述方法包括：
-测量所述体外分化细胞的细胞表面上CD10的量；和
-如果所述体外分化细胞具有CD10的nMFI为至少40，则确定所述体外分化细胞具有成骨潜能，优选nMFICD10用488nm的激发波长和580nm的发射波长针对PE来测量。
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