KR20100069376A

KR20100069376A - 성장 인자를 이용한 지방기원 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 방법

Info

Publication number: KR20100069376A
Application number: KR1020080128043A
Authority: KR
Inventors: 임군일
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2010-06-24

Abstract

본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포로부터 연골세포 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지방기원 중간엽 줄기세포를 TGF-β₂가 단독으로 또는 TGF-β₂와 IGF-1이 혼합되어 첨가된 연골형성 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법으로 분화된 연골세포를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 연골세포로 전분화된 중간엽 줄기세포를 생체 내에 이식하면, 이식된 중간엽 줄기세포가 뼈 등의 다른 세포로 분화할 우려가 적어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다.

지방기원 중간엽 줄기세포, 연골세포, 세포 분화, IGF

Description

성장 인자를 이용한 지방기원 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 방법{Chondrogenic Differentiations of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Using Growth Factors }

본 발명은 조직공학 또는 세포치료제로서 연골을 제작하는 방법에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

관절 연골은 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 연골 총부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성, 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나로 생각되고 있다( Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, Dec, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다.

자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 예측 가능하고, 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력이 바로 연골의 조직공학적 재생이다.(kang et al. Tissue Engineering, 11(3-4), pp.438-447, 2005)

인공연골의 제작에 관한 연구가 이미 외국에서 활발하게 수행 중이며, 유럽에서는 이미 연골세포운반체와 함께 연골세포를 이식하는 치료법이 사용되고 있는 실정이다. (Meyer U et al, Eur Cell Mater, Apr 26(9), pp.39-49, 2005)

줄기세포에서 분화된 연골세포의 조직공학적 관절연골 제작은 중심 요인들인 연골세포화된 줄기세포, 생분해성 지지체가 필수적이고 연골 세포화된 줄기세포는 골수로부터 단일핵 세포를 분리 후 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. 이상적인 연골세포는 증식능력이 좋아야 하며, 연골세포의 특이 표현형인 콜라젠 타입(collagen type) II를 유지하는 세포이다.

한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell:MSC)는 여러종류의 결합조직의 수선세포(repair cell)로 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 중간엽 줄기세포를 관절연골의 손상을 치유하는 데 사용하기 위해서는 생체 내 및 실험실 내에서 줄기세포를 직접적으로 연골세포주로 분화시키는 효율적이면서도 잘 정리된 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이러한 미분화된 중간엽 줄기세포는 복구된 조직의 장기간 동안의 안정성에 대한 정보가 부족하고, 다른 형태의 세포로 분화하는 경향에 의해서 생체 내에서 이형조직이 형성될 위험이 있기 때문에 그 이용이 제한적이다(De Bari, C et al., Arthritis Rheum, 50:142, 2004). 유전적 재조합을 하지 않거나 미분화된 중간엽 줄기세포를 무릎 관절에 직접 주사하였을 때, 분화되어 연골조직을 복원시키지 못하고, 오히려 증식하여 종양을 형성하였다는 보고가 있다(Gilbert, JE et al., Am. J. Knee Surg., 11:42, 1998, Noel, D et al., Stem Cells, 22:74, 2004, Butnariu-Ephrat, Metal., Clin. Orthop. Relat., 330:234, 1996).

한편, 중간엽 줄기세포로는 윤활막(synovium), 제대혈, 골수 또는 지방조직 기원 줄기세포 등의 종류가 있지만, 연골세포로의 분화를 위해서는 주로 골수 기원 중간엽 줄기세포를 이용하여 왔다. 그러나 지방조직 기원 줄기세포는 지방흡입술 등을 통하여 쉽게 또한 많은 양을 한번에 얻을 수 있다는 점에서 유리하기 때문에, 많은 연구자들이 연골세포로의 분화에 이용되는 중간엽 줄기세포로서 이용하려고 시도하여 왔다. 그러나, 2005년 Takeishi등이 지방 기원 중간엽 줄기세포가 연골이나 골조직보다 지방조직을 형성하려는 경향이 강하다는 것을 보고한 바 있고, 골수에 비하여 지방조직 기원 중간엽 줄기세포는 연골세포로의 분화능이 떨어지는 문제를 극복하지 못하는 한계가 있었다.

본 발명은 연골세포에 비하여 원래의 조직을 손상시키지 않고 쉽게 비교적 많은 양이 분리되어 증식되어 연골형성에 유용하게 이용될 수 있는 중간엽 줄기세포 중에서 특히 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 위의 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 포함하는 연골손상 질환 치료용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 위의 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 포함하는 인공관절의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 위의 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 포함하는 인공관절을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 데 있어서, 전환성장인자-베타2(TGF-β₂)가 5 ~ 25ng/ml 첨가된 연골형성 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 데 있어서, 인슐린유사성장인자-1(IGF-1)를 추가로 더 포함한 연골형성 배지에서 배양하 는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포를 상기 연골형성 배지에서 배양하는 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포를 상기 연골형성 배지에서 배양하는 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포를 상기 연골형성 배지에서 배양하는 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 사용하여 제조된 인공관절을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 데에 이용한다.

지방기원 중간엽 줄기세포는 지방흡입술 등을 이용해 얻은 지방조직에서, 지방세포, 적혈구, 세포 파쇄물 등을 세척, 여과 등의 방법을 이용하여 분리한 후, 줄기세포 배양용 배지에서 배양함으로써 얻을 수 있다.

지방기원 중간엽 줄기세포를 분리한 후 2 ~ 5 회, 바람직하게는 3 ~ 4회, 가장 바람직하게는 3 회 계대배양한 것을 연골형성에 사용하는 것이 분화가능한 줄기세포만을 분리한다는 점에서 바람직하다.

본 발명에서 지방기원 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법으로는 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다. 현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3차원 배양방법으로는 펠렛(pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다.

특히, 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이고, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다.

또한, 세포를 알지네이트 비드에 인캡슐레이션(encapsulation)시켜 세포주위에 생리적으로 적합한 환경을 제공하하는 알지네이트를 이용하여 연골화를 유도하는 방법도 이용할 수 있다.

본 발명의 연골형성 배지는 골수 기원 중간엽 줄기세포로부터 연골 형성을 촉진하는 것을 목적으로 사용되는 연골형성 배지를 제한 없이 사용할 수 있고, 본 발명의 목적에 부합되는 것이라면 특별히 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킴에 있어서, 전환성장인자-베타2(transforming growth factor-β_2,이하 TGF-β₂) 가 단독으로 첨가되거나, TGF-β₂및인슐린유사성장인자-1(Insulin-like Growth Factor-1, 이하 IGF-1) 가 모두 첨가된 연골형성 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.

특히 TGF-β₁보다 소량의 약제로 분화를 유도한다는 점에서 TGF-β₂를 선택하였다. 또한, TGF-β₂는 5 ~ 25 ng/㎖를 사용한다. 5 ng/㎖ 미만으로 사용하면 연골 분화에 효과적이지 않은 문제가 있고, 25 ng/㎖ 초과하여 사용하면 비용 의 문제와 연골형성 후 연골 비대화의 촉진이라는 문제가 있다.

또한 IGF-1는 100 ~ 500 ng/㎖ 범위에서 첨가하는 것이 바람직하다. 100ng/㎖ 미만으로 사용하면 연골분화에 효과적이지 않은 문제가 있고, 500 ng/㎖을 초과하여 사용하면 TGF-β₂와 마찬가지로, 비용에 큰 문제가 있으며 오히려 연골형성 후 연골 비대화를 촉진하는 문제가 발생한다.

본 발명의 방법으로 생산되는, 지방기원 중간엽 줄기세포로부터 분화된 연골세포는 연골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 생산된 연골세포를 이용하여 치료할 수 있는 연골손상 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마치스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 연골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며(Kim, G. et al, J. Vet. Med. Sci., 66:263, 2004, Lee,J.W. et al., Yonsei Med. J., 30:41, 2004), 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경료, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 의해 분화된 연골세포를 일정한 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공연골을 얻을 수 있으며, 이를 이용하여, 인공관절 또는 귀나 코의 성형에 사용되는 인공연 골을 제조할 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 방법으로 제조된 분화된 연골세포는 세포나 조직의 이식을 통한 생물학적인 방법으로 골관절염을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 분화된 연골세포는 골세포 등 다른 세포로 분화할 우려가 적어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다.

본 발명자들은 지방기원 중간엽 줄기세포에 성장인자와 신호전달체계의 변화를 유발하여 효과적인 신생 연골형성을 할 수 있는 조건을 제공하기 위해, (i) 지방조직으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하였고, (ii) 각종 조건을 달리하여 연골세포의 형성을 유도하였으며, (iii) 각종 조건에 따른 연골 형성정도, 골 형성정도 및 연골의 비후화 억제 정도를 평가하였다.

이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

제조예 1: 지방기원 중간엽 줄기세포의 분리

지방흡입술을 이용해 45세에서 65세 사이의 환자에게서 지방조직을 얻고, 이 를 PBS 완충액으로 세척한 후, 1.5㎎/㎖ 콜라게나제로 처리하여 눈금 250㎛의 나일론 망으로 걸러냈다. 그 걸러낸 액을 용혈 완충액(0.154M NH₄Cl, 10mM KHCO₃, 0.1mM EDTA)으로 적혈구를 제거하고, 다시 두 번 PBS 완충액으로 세포를 세척하는 과정을 통해 중간엽 줄기세포를 얻었다.

얻어진 지방기원 중간엽 줄기세포를 다시 10% 우태혈청(FCS), 1% 항균제를 함유한 F12/DMEM 배양액에 1 X 10⁶ 개 접종하여 37℃, 5% CO₂ 의 조건에서 배양접시에 배양하였고, 세포들이 바닥의 80%를 덮을 때(80% confluence) 트립신/EDTA를 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였다. 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 수득한 세포는 다시 상기 배지로 현탁하여 동일하게 3회 계대 배양한 후 다음 실험에 사용하였다.

상기 3회 계대 배양된 세포가 중간엽 줄기세포인지를 확인하기 위해서, 조혈모세포의 표지자(CD34), 백혈구의 표지자(CD45), 줄기세포의 표지자(CD73 및 CD166)에 대한 팩스 분석을 실시하여 도 1에 도시하였다. 도 1의 결과 상기 3회 계대 배양된 세포가 지방기원으로서 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.

제조예 2: 연골 분화

제조예 1에서 3회 계대 배양된 분리된 1 X 10⁶ 개의 지방기원 중간엽 줄기세포를 DMEM 배지에 50 nM의 아스코르빈산, 1% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L), 10^-7M 덱사메타손을 첨가한 연골형성 배지(chondrogenic-defined medium) 또는 상기 연골형성 배지에 다양한 성장인자를 첨가한 배지에 접종하여, 펠렛 배양(pellet culture) 형태로 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 4 주간 배양하였다.

상기 배지의 조성에 따라, 연골형성 배지에 성장인자를 첨가하지 않는 것(비교예 1), 연골형성 배지에 TGF-β₂ 5 ng/㎖ 첨가한 것(실시예 1), TGF-β₂5 ng/ml및 IGF-1 100 ng/ml 첨가한 것(실시예 2), TGF-β₂ 15 ng/ml 첨가한 것(실시예 3), TGF-β₂ 15 ng/ml 및 IGF-1 300 ng/ml 첨가한 것(실시예 4), TGF-β₂25 ng/ml 첨가한 것(실시예 5), TGF- β₂25 ng/ml 및 IGF-1 500 ng/ml 첨가한 것(실시예 6)으로 구분하였다.

실험예 1: DNA 함량 측정

게놈 DNA를 정제하여 펠렛 당 총 게놈 DNA의 양을 측정하는 방법으로 세포 증식을 확인하기 위하여 DNA 함량을 측정하였다. 연골형성 배지에서만 배양한 경우(비교예 1)를 1로 하여 상대적인 DNA 함량을 도 2에 도시하였다.

실시예 1 ~ 6 은 성장인자가 포함되지 않은 배지에 비해 DNA 함량이 약 1.4 ~ 3배 증가하였다. 특히 IGF-1 을 첨가한 배지(실시예 2, 4, 6)가 IGF-1을 첨가하지 아니한 배지(실시예 1, 3, 5) 보다 DNA 함량이 증가하였다.

실험예 2: 글루코스아미노글루칸(Glucosaminoglycan : GAG) 측정

제조예 2에서 4 주간 배양한 세포 펠렛을 10 %(W/V) 파파인으로 처리한 후, 시료 100㎕를 1 ml의 블리스칸 염색약(1,9-dimethyl-methylene blue)과 반응시킨 후 656 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 수치를 DNA양으로 나누어서 세포당 글루코스아미노글리칸의 양을 추정하였다.

실시예 1 ~ 6 은 성장인자가 포함되지 않은 배지에 비해 세포당 글루코스아미노글리칸의 양이 약 1.6 ~ 3배 증가하였다. 또한 IGF-1 을 첨가한 배지(실시예 2, 4, 6)가 IGF-1을 첨가하지 아니한 배지(실시예 1, 3, 5) 보다 세포당 글루코스아미노글리칸의 양이 증가하였다.

실험예 3: 조직학적 검사

상기 제조예 2의 배양 4주 후 세포를 고정하여 조직편을 제작하고, 기본적으로 헤마톡실린 에오신(hematoxylin eosin)염색을 실시한 후 연골기질에 대한 사프라닌-O 염색과 Col2A1(콜라겐 타입 2)에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다.

프로테오글리칸의 발현 정도를 사프라닌-O 염색 결과로 나타내어 도 4에 나타내었다. 비교예 1 은 도 4의 A, 실시예 1 ~ 6 은 도 4의 B ~ G 에 해당한다. A에 비해 B ~ G 가 사프라닌-O 에 염색된 기질이 많이 생성되어 있음을 확인할 수 있다.

Col2A1(콜라겐 타입 2)에 대한 면역조직화학 염색 결과는 도 5에 나타내었 다. 비교예 1 은 도 5의 A, 실시예 1 ~ 6 은 도 5의 B ~ G 에 해당한다. Col2A1에 대해나 면역조직화학 염색 역시 도 4와 상응하는 결과를 나타내었다.

염색 결과를 베른 점수(Bern score)를 이용하여 반정량화 하였고, 이를 도 6에 나타내었다. 비교예 1 에 비해 실시예 1 ~ 6 의 면역학적 점수가 약 1.4 ~ 2.8 배 증가하였다.

도 1은 지방조직에서 분리된 중간엽 줄기세포 여부를 확인하기 위해, CD34, CD45, CD73 및 CD166에 대해 팩스 분석을 하여 도시한 것이다.

도 2은 세포 증식을 확인하기 위한 DNA 함량을 측정결과를 그래프로 나타내었다.

도 3는 프로테오글리칸(글루코스아미노글리칸)의 측정결과를 그래프로 나타내었다.

도 4는 사프라닌-O 염색을 통해 프로테오글리칸의 양을 확인한 것으로, 200배 확대한 사진이다.

도 5는 면역분석학적 염색에 의하여 콜라겐 타입 II(Col2A1)의 양을 확인한 것으로, 200배 확대한 사진이다.

도 6은 면역분석학적 점수를 그래프화 한 것이다.

Claims

전환성장인자-베타2(TGF-β2)가 5 ~ 25ng/ml 첨가된 연골형성 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 연골형성 배지에 인슐린유사성장인자-1(IGF-1)를 추가로 포함시키는 것을 특징으로 하는 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
제 2 항에 있어서,

상기 인슐린유사성장인자-1(IGF-1)를 100 ~ 500ng/ml 더 포함시키는 것을 특징으로 하는 지방기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법을 통해 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 연골손상 질환은 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 방법으로 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법.
제 6 항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 인공관절.