CN108697812A - 用于软骨细胞或软骨类型细胞再生的细胞混合物 - Google Patents

Abstract

本公开至少涉及用于修复和/或再生有需要的个体的椎间盘的方法和组合物。在某些实施方案中，向已知具有或疑似具有退化性椎间盘或有患退化性椎间盘的风险的个体提供治疗有效量的髓核细胞、来自髓核的一种或多种组分、从髓核细胞产生的条件培养基，以及另外地，还可提供例如成纤维细胞、富血小板血浆(PRP)、SOX9(蛋白质或核酸)和/或Tie2+细胞。

Description

用于软骨细胞或软骨类型细胞再生的细胞混合物

本申请要求2016年1月14日提交的美国临时专利申请序列号62/278,635和2016年10月27日提交的美国临时专利申请序列号62/413,587的优先权，这两个临时专利申请序列号均通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及至少医学、外科手术、解剖学、生物学、细胞生物学和/或分子生物学领域。在具体方面，本发明涉及椎间盘修复领域。更具体地，本发明的领域涉及使用细胞疗法来再生软骨细胞或其他软骨类型细胞。

背景

通常，软骨是一旦损坏就不会自然再生的组织。最近，已经努力通过在实验室中再生一部分受损组织来重建受损的生物组织。这种被定义为“组织工程”的方法引起了极大的关注。

组织工程涉及能够与生物组织特异性相互作用以产生功能性组织等同物的生物相容性材料的开发。组织工程具有从个体收集所需组织，从组织样本中分离细胞，增殖细胞，并将这些细胞重新引入同一个体或不同个体的基本概念。在其他方面，利用能够在体内吸引或产生所需细胞的基因疗法。

成纤维细胞已用于软骨细胞或软骨类型细胞的再生。例如成纤维细胞已被证明在机械应激的低氧环境中诱导分化成软骨细胞。然而，目前没有科学证据支持在该混合物中使用其他细胞类型。

椎间盘(disc)退化

每年有超过6500万美国人患有下背部痛。到50岁时，85％的人口会显示椎间盘退化的证据。椎间盘退化(通常被称为退化性椎间盘疾病(DDD)或脊柱骨关节炎)是下脊柱的常见病症。椎间盘退化可导致病症诸如腰椎管狭窄(容纳脊髓和神经根的椎管狭窄)、椎体滑脱(椎间盘和椎骨的向前滑动)和后滑脱(椎间盘和椎骨的向后滑动)。DDD是一种可导致疼痛并极大地影响生活质量的退行性病况。

衰老是椎间盘退化的最常见原因。随着身体衰老，脊柱中的椎间盘会失去使椎间盘活动的重要细胞，脱水或变干，并失去它们在椎骨之间充当减震器的能力。构成脊柱的骨骼和韧带也变得不那么柔韧和变厚。与肌肉不同，对椎间盘的血液供应量极少，因此它们缺乏愈合或修复自身的能力。例如，DDD可导致慢性背痛，该疼痛有时会向臀部辐射，或者在行走时臀部或大腿会出现酸痛。

不清楚为什么一些退化性椎间盘疼痛而一些不疼痛。有些人的神经末梢比其他人的神经末梢更深地穿透至纤维环中或椎间盘的外层中，使椎间盘更容易成为疼痛的来源。沿腿而下辐射的疼痛，称为坐骨神经痛或腰痛，是神经根遇到椎间盘内物质或髓核的结果，髓核是也会对神经施加压力的炎症物质。这些情况可导致症状诸如严重的腿部疼痛，站立和行走困难以及腿部无力或麻木。DDD可导致慢性衰弱病况，并可对人的生活质量产生严重的负面影响。当DDD严重时，常规非手术治疗通常是无效的。

在受损或患病的脊椎盘中恢复完全的组织功能是具有挑战性的。尽管存在常规方法，如人工椎间盘置换或核替代，但仍存在与这些疗法相关的许多缺点。例如，人工椎间盘置换可能易于移位并将机械应力转移到受累区域上方或下方的其他椎骨(称为级联效应)。

例如，本公开涉及成功修复和/或再生脊椎盘的高效且简单的方法和组合物。

发明概述

本公开的实施方案涉及用于例如修复哺乳动物个体(诸如人、狗、猫或马)的关节的方法和组合物。尽管关节可以是任何类型，但在特定实施方案中，关节是椎间盘，尽管可以在哺乳动物个体中在相同或不同时间处理多个脊椎盘。本发明的方法和组合物利用一种或多种髓核组分(诸如脊索细胞、小软骨细胞样细胞、胶原(诸如II型胶原和/或I、V、VI、IX和XII型胶原)原纤维和/或蛋白聚糖(诸如聚集蛋白聚糖))例如修复和/或再生关节中的组织或其他物质。

本公开涉及将同种异体、自体或异种细胞(诸如髓核细胞)和/或源自其的条件培养基治疗性递送(例如，通过注射或经由手术部位的开放性施用)至有此需要的哺乳动物的关节(包脊髓盘)。在一些实施方案中，可将髓核细胞(除了可分化成髓核细胞的细胞之外或作为其替代)与一种或多种其他治疗剂一起提供。尽管一种或多种其他治疗剂可以是任何种类，但在具体实施方案中，所述药剂是细胞、蛋白质、核酸(包括编码序列、miRNA、mRNA、DNA、shRNA、siRNA，其组合等)、小分子或其组合。所述一种或多种其他治疗剂可以是或可以不是来自髓核的组分。

在具体的实施方案中，待提供给关节的治疗剂(除髓核细胞或来自髓核的一种或多种组分外)是小分子、可表达的核酸、肽、蛋白质或其组合。尽管可将多种核酸，肽和/或蛋白质与细胞一起提供，但在具体实施方案中，一种或多种核酸、一种或多种肽或一种或多种蛋白质包括Sox9和/或富血小板血浆(PRP)和/或其他有助于软骨修复和/或再生的核酸、肽或蛋白质。在具体实施方案中，除了NP的一种或多种组分(诸如脊索细胞和/或Tie2+细胞)以外，还提供了髓核细胞和/或可分化成髓核细胞的细胞，包括具有或不具有营养基质或血管。

在某些实施方案中，本公开涉及使用至少一种软骨形成混合物的递送生物修复例如椎间盘中的软骨(诸如在关节中)或其他软骨的方法和组合物。在特定实施方案中，该疗法可用作软骨恢复的体内工作站。在一些情况下，一种或多种细胞和/或其他治疗剂以惰性装置提供。尽管惰性装置可以是任何类型，但在具体实施方案中，惰性装置包含包括两个大致同心的可膨胀膜的结构。可以将或可以不将一种或多种细胞和/或其他治疗剂与支架一起提供给个体。

本公开内容包括通过来自健康的椎间盘的有效量的细胞混合物来改善个体中衰老的椎间盘的病况的方法。还包括了通过提供有效量的可在年轻和更健康的椎间盘中发现的细胞混合物来改善个体中衰老的椎间盘的病况的方法。本公开的方法包括其中通过向具有衰老椎间盘的个体提供有效量的可在无退行性过程发生的人的椎间盘中发现的细胞混合物来改善个体中衰老的椎间盘的病况的那些方法。本公开的一个实施方案包括通过向具有衰老的椎间盘的个体提供有效量的细胞混合物来改善个体中衰老的椎间盘的病况的方法，所述细胞混合物来自无退行性过程发生的一个或多个人的一个或多个椎间盘，或者可发现于所述一个或多个椎间盘中。可在无退行性过程发生的一个或多个人的一个或多个椎间盘中发现的细胞混合物可包括有效量的髓核细胞、软骨细胞、成纤维细胞(至少包括真皮成纤维细胞或来自身体中的结缔组织(包括骨、软骨和/或肌肉)的成纤维细胞、干细胞和/或脂肪细胞。细胞混合物还可包含例如非细胞组分，诸如胶原原纤维、蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖。

如本文所提及的，椎间盘退化的发生可包括疼痛的一种或多种症状，并且在一些情况下源于脊柱中的退化性椎间盘和/或椎间盘退化的辐射性虚弱或麻木可包括一个或多个椎间盘的破裂，所述椎间盘的破裂可包括椎间盘内流体的流失和/或椎间盘外层(环或囊)的微小撕裂或裂缝(以及在某些情况下，椎间盘内的髓核被压出囊中的撕裂处或裂缝，这导致椎间盘凸出、裂开(破裂)或破碎成碎片)。

可用本公开的方法治疗脊柱中的任何椎间盘，但是在特定情况下，椎间盘位于下背部(腰部区域)和/或颈部(颈部区域)。

在特定情况下，所述方法可使用具有一种或多种组合物的支架。用于生物组织再生的支架可以由用作基质以允许细胞附着至材料表面并形成三维组织的材料构成。在具体实施方案中，该材料可以是无毒的，生物相容的和/或可生物降解的。满足上述物理要求的最广泛使用的可生物降解的聚合物包括例如有机聚合物，诸如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚-ε-己内酯(PCL)、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯；天然水凝胶诸如胶原、透明质酸、海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖；合成水凝胶诸如聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(丙烯富马酸酯-共-乙二醇)[P(PF-co-EG)及其共聚物。

在某些方面，例如，通过使用自体或同种异体或异种的髓核细胞(或其混合物)、软骨细胞、成纤维细胞(至少包括真皮成纤维细胞或来自身体中的结缔组织(包括骨、软骨和/或肌肉)的成纤维细胞)、干细胞和/或脂肪细胞，软骨生成可至少部分地在体外开始。然后可以将任何细胞或细胞混合物递送到关节中或关节内或关节附近。在其中成纤维细胞存在于混合物中的实施方案中，在具体实施方案中，成纤维细胞可以将其他未捕获的成纤维细胞吸引到软骨再生过程中。在具体实施方案中，向个体提供细胞或细胞类型的混合物与一种或多种其他治疗剂。递送的细胞组分可以在与递送的非细胞组分相同或不同的时间发生。

在某些实施方案中，可以引入基质，然后在体外或体内用基因疗法和/或成纤维细胞和/或软骨细胞接种，以为软骨再生过程提供结构。

细胞分化成软骨细胞或软骨细胞样细胞可以以任何合适的方式发生，包括a)在将细胞递送到个体之前体外分化细胞；b)在将细胞递送至个体之前体外分化细胞以及在递送之后体内分化细胞；和/或c)细胞递送后的体内分化。递送可包括植入一种或多种细胞组合物。在一些情况下，通过在远端具有长管开口的针状器械将细胞提供给个体。

本公开的实施方案包括为个体产生软骨细胞或软骨细胞样细胞的方法，其包括向个体的退化性椎间盘提供有效量的来自同一个体或来自同一或不同物种的另一个体的髓核(NP)的组分的步骤。在具体的实施方案中，来自NP的组分包括脊索细胞、小软骨细胞样细胞、胶原原纤维、蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖。在一些情况下，还可以向个体的退化性椎间盘提供一种或多种治疗剂，诸如包含核酸、肽、蛋白质、小分子或其组合的一种或多种治疗剂。或者，在将细胞混合物递送至个体之前，将所述一种或多种治疗剂在体外提供给细胞混合物。在某些实施方案中，将本身作为治疗剂的核酸、肽和/或多肽递送至将被提供给个体的细胞中。

在具体的实施方案中，该方法包括向个体提供一种或多种组合物的步骤，所述组合物包含有效量的一种或多种以下物质：a)成纤维细胞；b)脊索细胞；c)Tie2+细胞；d)Tie2基因产物；e)富血小板血浆(PRP)；f)Sox9基因产物；g)转化生长因子β-1(TGFB1)；h)结缔组织生长因子(CTGF)；i)WNT1诱导型信号传导途径蛋白1(WISP1)和/或j)WISP2。在至少某些情况下，在将NP的细胞提供给个体之前对其进行离体修饰。可对本公开中使用的细胞(包括成纤维细胞、脊索细胞和/或Tie2+细胞)进行离体修饰。在一些情况下，将细胞在提供步骤之前暴露于缺氧、机械应变或其组合。

对本公开的某些细胞进行修饰以通过细胞产生特定产物，诸如Tie2基因产物和/或Sox9基因产物。在一个具体的实施方案中，待递送至个体的细胞包含或被修饰而表达选自以下物质的基因产物：COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A4、COL6A5、COL7A1、COL8A1、COL8A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL10A1、COL11A1、COL11A2、COL12A1、COL13A1、COL14A1、COL15A1、COL16A1、COL17A1、COL18A1、COL19A1、COL20A1、COL21A1、COL22A1、COL23A1、COL24A1、COL25A1、COL26A1、COL27A1、COL28A1、Gata4、Mef2C、Tbx5、Sox5、Sox6、Sox9、FGFR2、VEGF、MMP14、分叉头(forkhead)、CD10、MMP13、WNT11、BAPX1、IL-1R1、IGFBP5、MMP16、BMP2、ALK1、BMP5、IGF1、MMP13、ADAMTS5、BCL10、MCOLN2、LRRC8C、PTGFR、RLF、MATN1、PDPN、TNFRSF18、ITGA10、THBS3、SCYL1BP1、KCNT2、244533_at、ARF1、222348_at、SLC4A5、HSPC159、RHOQ、MATN3、SULT1C2、236289_at、BCL2L11、FLJ16008、KLF7、NRP2、SERPINE2、FN1、B3GNT7、ADAMTS9、ANKRD28、GALNTL2、IRAK2、SETD5、FNDC3B、B3GNT5、CYTL1、IBSP、229221_at、PET112L、EDNRA、1563414_at、OSMR、C1QTNF3、ZFYVE16、225611_at、MAST4、EDIL3、230204_at、230895_at、HAPLN1、PDLIM4、cr5q35SQSTM1、SCUBE3、CMAH、236685_at、BMP6、ULBP2、LRP11、SOD2、SYNJ2、WTAP、HIG2、KIAA1718、FAM62B、UBE3C、TNFRSF10D、SLC25A37、ChGn、RB1CC1、C8orf72、EIF2C2、HAS2、TRPS1、WISP1、235821_at、PTK2、ZCCHC7、RPS6、GLIS3、SLC28A3、1555841_at、MGC17337、EDG2、229242_at、ITGB1、C10orf49、YME1L1、AKR1C2、CHST3、LOXL4、SFXN3、228910_at、CD44、FOSL1、RELA、MMP12、MMP13、MMP3、KIAA0999、ASAM、LOC399959、ETNK1、SOX5、CHST11、ATF1、SRGAP1、DSPG3、LOC338758、KIAA0701、SLC41A2、RHOF、FZD10、NUPL1、USP12、UFM1、LECT1、GPC6、ERO1L、BDKRB1、SEMA6D、LACTB、ARIH1、CSPG4、AGC1、LOC283824、VASN、WWP2、NOS2A、LOC201181、MSI2、PITPNC1、TGIF、1552288_at、1552289_a_at、ZNF146、RELB、MIA、ZNF160、SNX5、BMP2、RNF24、HSUP1、MATN4、BIC、RUNX1、LIF、RP4-756G23.1、RPS6KA3、TNMD、RP6-213H19.1及其组合。

本公开的细胞相对于所述个体可以是自体的、同种异体的或异种的。

在一些实施方案中，方法还包括检测退化性椎间盘，诸如通过测量个体中疑似正在退化的椎间盘的NP中的脊索细胞水平。可在结构上或非结构上检测退化性椎间盘(诸如通过监测椎间盘中细胞包括脊索细胞的水平)。非结构检测可包括生物化学或分子手段。在递送至本公开的一种或多种组合物的椎间盘之前，可检测或可以不检测退化性椎间盘的状态或椎间盘的NP中的脊索细胞水平。

在一些实施方案中，存在修复和/或再生有此需要的个体的椎间盘中的软骨的方法，其包括以下步骤：a)向个体的椎间盘提供成纤维细胞、干细胞、脂肪细胞或其组合；b)向个体的椎间盘提供来自髓核(NP)的一种或多种组分；以及c)向个体的椎间盘提供以下物质的一种或多种：1)Tie2+细胞；2)Tie2基因产物；3)富血小板血浆(PRP)；4)PRP+细胞；5)Sox9基因产物；6)Sox9+基因产物；7)TGFB1基因产物；8)TGFB1+细胞；9)CTGF基因产物；10)CTGF+细胞；11)WISP1基因产物；12)WISP1+细胞；13)WISP2基因产物；和/或14)WISP2+细胞。在具体的实施方案中，NP的一种或多种组分包括脊索细胞、小软骨细胞样细胞、胶原原纤维和/或聚集蛋白聚糖。在某些情况下，步骤a)在步骤b)和/或c)之前进行。

在另一个实施方案中，存在修复和/或再生有需要的个体的脊椎盘中的软骨的方法，其包括以下步骤：将a)、b)和/或c)中列出的一种或多种组合物与a)、b)和/或c)中列出的另外一种或多种组合物组合在一起以产生混合物：a)成纤维细胞、干细胞、脂肪细胞或其组合；b)来自髓核(NP)的一种或多种组分；c)以下的一种或多种：1)Tie2+细胞；2)Tie2基因产物；3)富血小板血浆(PRP)；4)PRP+细胞；5)Sox9基因产物；6)Sox9+细胞；7)TGFB1基因产物；8)TGFB1+细胞；9)CTGF基因产物；10)CTGF+细胞；11)WISP1基因产物；12)WISP1+细胞，13)WISP2基因产物和/或14)WISP2+细胞；并向个体提供所述混合物。在具体方面，在体外或体内产生所述混合物。在特定情况下，通过注射或通过开放切口插入向个体递送所述混合物。

在具体的实施方案中，本公开的方法包括将治疗有效量的脊索细胞和/或脊索细胞条件培养基递送至有此需要的个体，所述个体包括例如具有退化性椎间盘的个体。在具体的实施方案中，除了脊索细胞条件培养基或来自其的一种或多种组分外，还向个体提供有效量的脊索细胞、小软骨细胞样细胞、胶原原纤维、蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖。脊索细胞条件培养基再生退化性椎间盘或使其一部分再生或在个体中产生软骨细胞或软骨细胞样细胞。向个体提供脊索细胞条件培养基可以治疗退化性椎间盘、逆转退化性椎间盘，预防退化性椎间盘，或防止退化性椎间盘的进一步恶化。在具体的实施方案中，脊索细胞条件培养基不含血清。在具体的实施方案中，来自脊索细胞和/或脊索细胞条件培养基的一种或多种组分包括转化生长因子β-1(TGFB1)、结缔组织生长因子(CTGF，也称为CCN2)、WNT1-诱导型信号传导途径蛋白1(WISP1)和/或WISP2。在一些情况下，除了向个体递送脊索细胞和/或脊索细胞条件培养基以外或代替向个体递送脊索细胞和/或脊索细胞条件培养基，还可以以蛋白质形式或以核酸形式向个体递送TGFB1、CTGF、WISP1和/或WISP2。在递送脊索细胞和/或脊索细胞条件培养基和/或TGFB1、CTGF、WISP1和/或WISP2后，与在此类递送不存在的情况下脊索细胞和/或干细胞的损失相比，髓核中保留有脊索细胞和/或干细胞。

个体可接受治疗性组合物的多次施用，并且可以在任何时间跨度内诸如在数天、数周、数月和/或数年内递送另一次单独的施用。个体可通过不同途径接受本公开的多种治疗性组合物的施用。在一些情况下，向尚具有退化性椎间盘的一种或多种症状的个体提供一种或多种本公开的治疗性组合物。在某些情况下，从某个年龄(诸如在20岁、25岁、30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁等)开始，向个体提供有效量的一种或多种本公开的治疗性组合物。在特定方面，无论是否已为个体检测到退化性椎间盘的一种或多种症状，向易于产生退化性椎间盘的个体提供有效量的本公开的一种或多种治疗性组合物。容易产生退化性椎间盘的个体包括例如从事重复活动的个体，具有脊柱损伤的个体，参加体育运动(包括高接触性运动)的个体，和/或从事需要繁重抬举的工作的个体。

在一些情况下，将有效量的来自髓核(NP)的一种或多种组分提供给需要接受来自NP的一种或多种组分的个体；在特定情况下，来自NP的所述一种或多种组分包括例如脊索细胞、脊索细胞条件培养基、小软骨细胞样细胞、胶原原纤维、蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖。还可向个体提供治疗剂。在具体的实施方案中，为了专门地将来自NP的所述一种或多种组分提供给个体，向个体提供来自NP的一种或多种组分。在向个体专门地提供来自NP的一种或多种组分之前，可确定个体需要来自NP的所述一种或多种组分。在一些情况下，可向个体专门地提供来自NP的一种或多种组分，但专门地不提供来自NP的一种或多种其他组分。在特定情况下，向个体提供或不提供基本上完整的NP的内容物。在具体的实施方案中，向个体提供有效量的组合物，其包含例如来自NP的一种或多种组分(诸如脊索细胞、脊索细胞条件培养基、小软骨细胞样细胞、胶原纤维、蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖中的一种或多种)，基本上由所述组分组成或由所述组分组成。

前面已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术有利方面，以便可以更好地理解随后的本发明的详细描述。在下文中将描述本发明的附加特征和有利方面，其形成本发明权利要求的主题。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方式可以容易地用作修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到，此类等同结构不脱离所附权利要求中阐述的本发明的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述将更好地理解被认为是关于其组织和操作方法的本发明特征性的新颖性质，以及其他目的和有利方面。然而，应该清楚地理解，提供每个附图仅用于说明和描述的目的，而不旨在作为对本发明的限制的定义。本申请涉及许多参考资料和文献，所有这些参考资料和文献通过引用整体并入本文。

详述

如本说明书中所用，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或多个/种。如本文在权利要求中所用，当与单词“包括”结合使用时，词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可以表示一个/种或不止一个/种。如本文中所用，“另一个/种”可以表示至少第二个/种或更多个/种。在具体的实施方案中，例如，本发明的方面可以“基本上由一个或多个本发明的序列组成”或“由一个或多个本发明的序列组成”。本发明的一些实施方案可由本发明的一种或多种要素、方法步骤和/或方法组成或基本上由其组成。设想了可相对于本文所述的任何其他方法或组合物实施本文所述的任何方法或组合物。

美国专利号7850983、美国专利公开US 2014/0314726、美国专利公开US 2014/0044682、美国专利公开US 2014/0377231以及WO/2015/035395通过引用整体并入本文。

I.定义

如本文所用，术语“软骨细胞样细胞”是指不是原代软骨细胞但衍生自干细胞(诸如间充质干细胞)的细胞或来自其他谱系(诸如成纤维细胞)的细胞。这样的软骨细胞样细胞具有软骨细胞(软骨的细胞)的表型。这意味着它们不仅具有软骨细胞的形状(例如，多边形和/或菱形细胞)，而且它们还能够聚集并产生软骨基质组分，诸如硫酸化蛋白聚糖和II型胶原。因此，软骨细胞样细胞的示例性标志物包括例如聚集蛋白聚糖(其为硫酸软骨素和硫酸角质素蛋白聚糖)、II型胶原、Sox-9蛋白、软骨连接蛋白和基底膜蛋白聚糖(其为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)中的一种或多种。

如本文中所用，术语“缺氧”是指氧的缺乏。在特定方面，其是指小于约20％、15％、10％、5％等的氧张力。

如本文中所用，术语“关节”是指体内两个骨骼连接的区域。

在某些实施方案中，如本文中所用，术语“接种”是指将细胞植入支架中，并且支架可以存在于椎间盘中或可以存在于体外。细胞将附着于支架，然后在支架中生长和分化。在具体的实施方案中，术语“接种”是指通过直接注射、不用支架而将细胞接种到髓核中。这种分化可以在体外和体内发生。

II.一般实施方案

作为快速发展的领域，组织工程在至少一些情况下通过开发仿生组织替代物而为关节软骨修复和再生提供了替代解决方案。在本公开的一些实施方案中，存在与组织包括软骨的修复和/或再生相关的方法和组合物。如本文中所用，术语“修复”表示软骨的正常功能的恢复，而不管填充缺损部位的新组织的组成如何。如本文中所用，“再生”定义为不仅恢复受损或患病的关节软骨的正常功能，而且还导致与天然软骨无法区分或非常相似的新组织形成的过程。

在具体实施方案中，将髓核细胞和/或由其产生的条件培养基提供给有此需要的个体，诸如具有退化性椎间盘病症、具有退化性椎间盘等的个体，并且其可治疗或防止椎间盘脱出，椎间盘凸出、椎间盘滑出、椎间盘破裂等。来自髓核的细胞和/或由其产生的条件培养基可获自被治疗的个体，诸如来自同一个体的健康椎间盘；它们可获自同一物种的另一个人；或者它们可获自例如另一物种的个体。分离髓核细胞的方法是本领域已知的(例如，Gruber等，2006；Feng等，2013；Tang等，2014)。髓核细胞可商购获得。从细胞产生条件培养基的方法是本领域已知的。

可将来自髓核的细胞(和/或任何其他待递送至个体的细胞)在递送至有此需要的个体之前暴露于一种或多种组合物。例如，可以修饰细胞以表达一种或多种有助于细胞健康和/或增殖的组合物和/或可以修饰细胞以表达一种或多种用于软骨修复和/或再生的组合物。在具体的实施方案中，操作细胞以携带表达用于治疗目的的特定核酸(其中核酸本身是治疗性剂或其中核酸表达治疗性基因产物)的载体(病毒性(腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等)或非病毒性(质粒))。在其他实施方案中，操纵细胞或其他载体(诸如脂质体)以提供特定蛋白质或其功能活性肽片段。可将蛋白质作为融合蛋白递送，例如可将目标蛋白质与促进软骨修复和/或再生的另一种蛋白质或蛋白质片段融合，或可将目标蛋白质与另一种蛋白质或蛋白质片段(诸如标志物或标记物)融合。可向个体提供的蛋白质或编码其部分或全部的核酸的实例如下：COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A4、COL6A5、COL7A1、COL8A1、COL8A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL10A1、COL11A1、COL11A2、COL12A1、COL13A1、COL14A1、COL15A1、COL16A1、COL17A1、COL18A1、COL19A1、COL20A1、COL21A1、COL22A1、COL23A1、COL24A1、COL25A1、COL26A1、COL27A1、COL28A1、Gata4、Mef2C、Tbx5、Sox5、Sox6、Sox9、FGFR2、VEGF、MMP14、forkhead、CD10、MMP13、WNT11、BAPX1、IL-1R1、IGFBP5、MMP16、BMP2、ALK1、BMP5、IGF1、MMP13、ADAMTS5、BCL10、MCOLN2、LRRC8C、PTGFR、RLF、MATN1、PDPN、TNFRSF18、ITGA10、THBS3、SCYL1BP1、KCNT2、244533_at、ARF1、222348_at、SLC4A5、HSPC159、RHOQ、MATN3、SULT1C2、236289_at、BCL2L11、FLJ16008、KLF7、NRP2、SERPINE2、FN1、B3GNT7、ADAMTS9、ANKRD28、GALNTL2、IRAK2、SETD5、FNDC3B、B3GNT5、CYTL1、IBSP、229221_at、PET112L、EDNRA、1563414_at、OSMR、C1QTNF3、ZFYVE16、225611_at、MAST4、EDIL3、230204_at、230895_at、HAPLN1、PDLIM4、cr5q35SQSTM1、SCUBE3、CMAH、236685_at、BMP6、ULBP2、LRP11、SOD2、SYNJ2、WTAP、HIG2、KIAA1718、FAM62B、UBE3C、TNFRSF10D、SLC25A37、ChGn、RB1CC1、C8orf72、EIF2C2、HAS2、TRPS1、WISP1、235821_at、PTK2、ZCCHC7、RPS6、GLIS3、SLC28A3、1555841_at、MGC17337、EDG2、229242_at、ITGB1、C10orf49、YME1L1、AKR1C2、CHST3、LOXL4、SFXN3、228910_at、CD44、FOSL1、RELA、MMP12、MMP13、MMP3、KIAA0999、ASAM、LOC399959、ETNK1、SOX5、CHST11、ATF1、SRGAP1、DSPG3、LOC338758、KIAA0701、SLC41A2、RHOF、FZD10、NUPL1、USP12、UFM1、LECT1、GPC6、ERO1L、BDKRB1、SEMA6D、LACTB、ARIH1、CSPG4、AGC1、LOC283824、VASN、WWP2、NOS2A、LOC201181、MSI2、PITPNC1、TGIF、1552288_at、1552289_a_at、ZNF146、RELB、MIA、ZNF160、SNX5、BMP2、RNF24、HSUP1、MATN4、BIC、RUNX1、LIF、RP4-756G23.1、RPS6KA3、TNMD、RP6-213H19.1、渗透敏感性转录因子TonEBP及其组合。可将上述基因产物作为核酸或蛋白质递送。

在其他实施方案中，可将待递送至有此需要的个体的任何细胞暴露于一种或多种条件，所述条件为个体提供、促进或增强治疗，诸如提供、促进或增强软骨再生和/或或修复。在具体的实施方案中，可将本公开的任何细胞在递送至个体之前暴露于缺氧条件(诸如低氧张力，例如5％或更低的O₂)、高渗环境、机械应变或其组合，以及在其他实施方案中，在体内递送后，将细胞可选地或另外地暴露于缺氧条件、机械应变或其组合。机械应变的实例包括间断流体静力压、流体剪切应力、低氧张力、直接压缩或其组合。

在具体的实施方案中，向有此需要的个体提供Tie2+细胞。Tie2也可称为血管生成素-1受体；CD202B；hTIE2；p140TEK；可溶性TIE2变体1；可溶性TIE2变体2；TEK；TEK酪氨酸激酶(内皮)；TIE-2；TIE2；内膜内皮细胞激酶(Tunica interna endothelial cell kinase)；酪氨酸蛋白激酶受体TEK；酪氨酸蛋白激酶受体TIE-2；VMCM和VMCM1。可以产生Tie2+细胞，诸如通过用包含编码部分或全部Tie2蛋白的核酸的载体转化或转染所述细胞。可从被治疗的个体或另一个体(包括同一或不同物种的另一个体)中分离Tie2+细胞。可以例如使用结合Tie2+的实体(诸如Tie2抗体或适体)分离Tie2+细胞，并且这些方法是本领域熟知的。

在某些实施方案中，将来自髓核的细胞和/或由其产生的条件培养基提供给个体，并且此类细胞可包含脊索细胞、小软骨细胞样细胞或其组合。除了细胞递送之外，还可向个体提供来自髓核的其他组分，诸如胶原原纤维和/或聚集蛋白聚糖或任何蛋白聚糖。可以标记用于递送的任何组合物，并且组合物还可包含抗生素、缓冲剂、盐、培养基等。

在特定方面，本公开的方法包括鉴定关节医学病况或病症或缺陷(包括关节为椎间盘)的步骤。确定椎间盘缺损的方法在本领域中是已知的，但在具体的实施方案中，它们包括CT扫描、磁共振成像、椎间盘造影、其组合等。在某些情况下，当确定了椎间盘中脊索细胞减少时，个体可能需要本公开的疗法。

例如，进行治疗的个体可具有原因不明的椎间盘问题，或者个体可以例如达到50岁或50岁以上或为运动员。在具体的实施方案中，个体处于其20-30岁之间、30-40岁之间或40-50岁期间。

在具体的实施方案中，本公开包括通过提供细胞混合物来改善衰老的椎间盘的环境的方法，所述细胞混合物包含一定组成的细胞和一定数量的细胞，所述细胞存在于一个或多个更年轻、更雄健的椎间盘(virile discs)中，或分离自所述椎间盘。包括了用于通过向具有衰老的椎间盘的个体提供有效量的细胞混合物来改善个体中衰老的椎间盘的病况的方法，所述细胞混合物来自无退行性过程发生的人的椎间盘，或可发现于所述无退行性过程发生的人的椎间盘中。在具体的实施方案中，细胞混合物包含成纤维细胞；干细胞；脂肪细胞；脊索细胞；Tie2+细胞；PRP+细胞；Sox9+细胞；TGFB1+细胞；CTGF+细胞；WISP1+细胞；WISP2+细胞；或其组合。在某些情况下，向个体提供以下的一种或多种：Tie2基因产物；富血小板血浆(PRP)；Sox9基因产物；TGFB1基因产物；CTGF基因产物；WISP1基因产物；WISP2基因产物；或其组合。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例1

作为本公开的方法的一个实例，引入同种异体、异种或自体髓核细胞和/或由其产生的条件培养基，和/或Sox9或其他有助于软骨生成的基因和/或脊索细胞和/或Tie2+细胞，和/或富血小板血浆(PRP)。在某些实施方案中，通过递送在健康髓核中大量存在的细胞，这种递送将有益于分化过程。Sox9或其他基因、脊索细胞和/或Tie2+的数量减少在退化性椎间盘疾病的发作中起重要作用。将这些细胞添加回由成纤维细胞分化产生的新核中，将为新分化的细胞产生更强健和更有活力的环境。由于软骨通常具有低血流量和营养物，因此其被认为是体内最难再生的组织。因此，可以向成纤维细胞混合物中添加其他元素，诸如Sox9或其他基因、脊索细胞、Tie2+细胞和/或PRP。目前的研究表明，这些细胞类型的减少实际上可能是退化性椎间盘疾病的催化剂或起源。

参考资料

本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出通过引用并入。

专利和专利申请

美国专利号7850983、美国专利公开US 2014/0314726；美国专利公开US 2014/0044682；美国专利公开US 2014/0377231和WO/2015/035395。

出版物

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尽管已经详细描述了本发明及其有利方面，但是应该理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变、替换和变更。此外，本申请的范围不旨在限于说明书中描述的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法和步骤的特定实施方案。本领域普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，目前存在或以后开发的执行与本文所述的相应实施方案基本相同的功能或实现基本上相同的结果的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤或可以按照本发明来使用。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这样的过程、机器、制造、物质组成、装置、方法或步骤。

Claims (30)

1.一种为个体产生软骨细胞或软骨细胞样细胞的方法，其包括向个体的退化性椎间盘提供有效量的来自同一个体或者同一或不同物种的另一个体的髓核(NP)的一种或多种组分的步骤。

2.权利要求1的方法，其中来自NP的组分包括脊索细胞、脊索细胞条件培养基、小软骨细胞样细胞、胶原原纤维、蛋白聚糖和/或聚集蛋白聚糖。

3.权利要求1或2的方法，其中向所述个体的退化性椎间盘提供一种或多种治疗剂。

4.权利要求1、2或3的方法，其中所述一种或多种治疗剂包含核酸、肽、蛋白质、小分子或其组合。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其包括向所述个体提供一种或多种组合物的步骤，所述组合物包含有效量的一种或多种以下物质：

a)成纤维细胞；

b)脊索细胞；

c)Tie2+细胞；

d)Tie2基因产物；

e)富血小板血浆(PRP)；

f)Sox9基因产物；

g)转化生长因子β-1(TGFB1)；

h)结缔组织生长因子(CTGF)；

i)WNT1诱导型信号传导途径蛋白1(WISP1)；和/或

j)WISP2。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中在将所述NP的细胞提供给所述个体之前离体修饰所述NP的细胞。

7.权利要求5的方法，其中离体修饰所述成纤维细胞、脊索细胞和/或Tie2+细胞。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在提供步骤之前将细胞暴露于缺氧、机械应变或其组合。

9.权利要求8的方法，其中所述机械应变包括间断流体静力压、流体剪切应力、低氧张力、直接压缩或其组合。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述Tie2基因产物由一种或多种所述细胞产生。

11.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述Sox9基因产物由一种或多种细胞产生。

12.权利要求3或4的方法，其中所述试剂包含选自以下物质的基因产物：COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL4A6、COL5A1、COL5A2、COL5A3、COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A4、COL6A5、COL7A1、COL8A1、COL8A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COL10A1、COL11A1、COL11A2、COL12A1、COL13A1、COL14A1、COL15A1、COL16A1、COL17A1、COL18A1、COL19A1、COL20A1、COL21A1、COL22A1、COL23A1、COL24A1、COL25A1、COL26A1、COL27A1、COL28A1、Gata4、Mef2C、Tbx5、Sox5、Sox6、Sox9、FGFR2、VEGF、MMP14、forkhead、CD10、MMP13、WNT11、BAPX1、IL-1R1、IGFBP5、MMP16、BMP2、ALK1、BMP5、IGF1、MMP13、ADAMTS5、BCL10、MCOLN2、LRRC8C、PTGFR、RLF、MATN1、PDPN、TNFRSF18、ITGA10、THBS3、SCYL1BP1、KCNT2、244533_at、ARF1、222348_at、SLC4A5、HSPC159、RHOQ、MATN3、SULT1C2、236289_at、BCL2L11、FLJ16008、KLF7、NRP2、SERPINE2、FN1、B3GNT7、ADAMTS9、ANKRD28、GALNTL2、IRAK2、SETD5、FNDC3B、B3GNT5、CYTL1、IBSP、229221_at、PET112L、EDNRA、1563414_at、OSMR、C1QTNF3、ZFYVE16、225611_at、MAST4、EDIL3、230204_at、230895_at、HAPLN1、PDLIM4、cr5q35SQSTM1、SCUBE3、CMAH、236685_at、BMP6、ULBP2、LRP11、SOD2、SYNJ2、WTAP、HIG2、KIAA1718、FAM62B、UBE3C、TNFRSF10D、SLC25A37、ChGn、RB1CC1、C8orf72、EIF2C2、HAS2、TRPS1、WISP1、235821_at、PTK2、ZCCHC7、RPS6、GLIS3、SLC28A3、1555841_at、MGC17337、EDG2、229242_at、ITGB1、C10orf49、YME1L1、AKR1C2、CHST3、LOXL4、SFXN3、228910_at、CD44、FOSL1、RELA、MMP12、MMP13、MMP3、KIAA0999、ASAM、LOC399959、ETNK1、SOX5、CHST11、ATF1、SRGAP1、DSPG3、LOC338758、KIAA0701、SLC41A2、RHOF、FZD10、NUPL1、USP12、UFM1、LECT1、GPC6、ERO1L、BDKRB1、SEMA6D、LACTB、ARIH1、CSPG4、AGC1、LOC283824、VASN、WWP2、NOS2A、LOC201181、MSI2、PITPNC1、TGIF、1552288_at、1552289_a_at、ZNF146、RELB、MIA、ZNF160、SNX5、BMP2、RNF24、HSUP1、MATN4、BIC、RUNX1、LIF、RP4-756G23.1、RPS6KA3、TNMD、RP6-213H19.1或其组合。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述细胞相对于个体是自体的、同种异体的或异种的。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述方法还包括检测所述退化性椎间盘。

15.权利要求14的方法，其中通过测量个体中疑似正在退化的椎间盘的NP中的脊索细胞水平。

16.根据权利要求14所述的方法，其中在结构上或非结构上检测所述退化性椎间盘。

17.权利要求16所述的方法，其中非结构检测包括通过生物化学或分子手段。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中还向所述个体提供有效量的成纤维细胞、干细胞和/或脂肪细胞。

19.一种在有此需要的个体中修复和/或再生脊椎盘中的软骨的方法，其包括以下步骤：

a)向所述个体的椎间盘提供成纤维细胞、干细胞、脂肪细胞或其组合；

b)向所述个体的椎间盘提供来自所述髓核(NP)的一种或多种组分；以及

c)向所述个体的椎间盘提供以下物质的一项或多项：

1)Tie2+细胞；

2)Tie2基因产物；

3)富血小板血浆(PRP)；

4)PRP+细胞；

5)Sox9基因产物；

6)Sox9+细胞；

7)TGFB1基因产物；

8)TGFB1+细胞；

9)CTGF基因产物；

10)CTGF+细胞；

11)WISP1基因产物；

12)WISP1+细胞，

13)WISP2基因产物；和/或

14)WISP2+细胞。

20.权利要求19的方法，其中所述NP的一种或多种组分包括脊索细胞、小软骨细胞样细胞、胶原原纤维和/或聚集蛋白聚糖。

21.权利要求19或20的方法，其中步骤a)发生在步骤b)和/或c)之前。

22.权利要求19-21中任一项的方法，其中还向所述个体提供有效量的成纤维细胞、干细胞和/或脂肪细胞。

23.一种修复和/或再生有此需要的个体的椎间盘中的软骨的方法，其包括以下步骤：

将a)、b)和/或c)中列出的一种或多种组合物与a)、b)和/或c)中列出的另外一种或多种组合物组合以产生混合物：

a)成纤维细胞、干细胞、脂肪细胞或其组合；

b)来自所述髓核(NP)的一种或多种组分；

c)以下物质的一种或多种：

1)Tie2+细胞；

2)Tie2基因产物；

3)富血小板血浆(PRP)；

4)PRP+细胞；

5)Sox9基因产物；和

6)Sox9+细胞；

7)TGFB1基因产物；

8)TGFB1+细胞；

9)CTGF基因产物；

10)CTGF+细胞；

11)WISP1基因产物；

12)WISP1+细胞，

13)WISP2基因产物；和/或

14)WISP2+细胞；以及

向所述个体提供所述混合物。

24.权利要求23的方法，其中在体外产生所述混合物。

25.权利要求23的方法，其中在体内产生所述混合物。

26.权利要求23-25中任一项的方法，其中通过注射、通过开放切口插入、通过导管或其组合将所述混合物递送至所述个体。

27.权利要求23-26中任一项的方法，其中还向所述个体提供有效量的成纤维细胞、干细胞和/或脂肪细胞。

28.一种改善个体中的衰老的椎间盘的病况的方法，所述方法通过向所述具有衰老的椎间盘的个体提供有效量的细胞混合物，所述细胞混合物来自无退行性过程发生的人的椎间盘，或者可发现于所述无退行性过程发生的人的椎间盘中。

29.权利要求28的方法，其中所述细胞混合物包含成纤维细胞；干细胞；脂肪细胞；脊索细胞；Tie2+细胞；PRP+细胞；Sox9+细胞；TGFB1+细胞；CTGF+细胞；WISP1+细胞，WISP2+细胞或其组合。

30.权利要求28或29的方法，其中向所述个体提供以下物质的一种或多种：Tie2基因产物；富血小板血浆(PRP)；Sox9基因产物；TGFB1基因产物；CTGF基因产物；WISP1基因产物；WISP2基因产物；或其组合。