ES2962596T3

ES2962596T3 - Matriz de células notocordales como lubricante bioactivo para la articulación osteoartrítica

Info

Publication number: ES2962596T3
Application number: ES19703043T
Authority: ES
Inventors: Keita Ito; Vries Stefan Antonius Henricus De
Original assignee: Eindhoven Technical University
Current assignee: Eindhoven Technical University
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2024-03-20
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: EP3746093B1; US20210113626A1; EP3746093A1; JP7341504B2; WO2019149787A1; JP2021511355A; US11779609B2

Abstract

La presente invención se refiere al uso de una solución de matriz celular notocordal como lubricante bioactivo en el tratamiento de la osteoartritis, más específicamente para su uso como lubricante bioactivo en viscosuplementación. La solución de matriz de células notocordales es capaz de reducir el dolor en las articulaciones osteoartríticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Matriz de células notocordales como lubricante bioactivo para la articulación osteoartrítica

Campo de la invención

Esta invención se refiere a usos de una matriz de células notocordales como lubricante bioactivo en el tratamiento de la osteoartritis.

Sumario de la invención

En el campo de la regeneración del disco intervertebral (IVD), las células notocordales (NC) han recibido una considerable atención. Producen factores solubles capaces de estimular la producción y proliferación de la matriz de las células del núcleo pulposo (NPC)12-15 así como la diferenciación de células madre derivadas de médula ósea (BMSC) a un fenotipo condrogénico16,17 Una alternativa a los factores secretados por NC es el uso directo de matriz de NC porcina (NCM) liofilizada y pulverizada. Este material se aplicó en un cultivoin vitrode NPC bovinos (de Vries, Stefan; van D, MeijBjorn; Tryfonidou, Marianna; Ito, Keita. Notochordal Cell Matrix As a Therapeutic Agent for Intervertebral Disc Regeneration. Tissue Engineering Part A. June 2018:ten.tea.2018.0026.), donde ejerció un efecto anabólico aún más fuerte en comparación con los factores solubles secretados por NC. Asimismo, la inyección intradiscal de NCM en un estudio caninoin vivotuvo efectos anabólicos y antiinflamatorios y aumentó la hidratación del IVD (Bach FC, Tellegen AR, Beukers M,et al.Biologic canine and human intervertebral disc repair by notochordal cellderived matrix: from bench towards bedside. Oncotarget. 2018;9(41):26507-26526). Dado que los NPC se parecen mucho a los condrocitos articulares, la NCM también puede tener el potencial de estimular estas células. Asimismo, cuando se disuelve a baja concentración en medios acuosos, la NCM forma un fluido viscoso que puede tener propiedades lubricantes, similares a las del HA.

La matriz de células notocordales (NCM) tiene potencial regenerativo en las células del núcleo pulposo del disco intervertebralin vitroein vivo.También se ha demostrado que las NC secretan factores con potencial anabólico y antiinflamatorio en los condrocitos humanos. Asimismo, cuando se disuelve en una concentración baja, la NCM forma un fluido viscoso que puede tener propiedades lubricantes. Por tanto, esta invención describe un enfoque novedoso para utilizar NCM como lubricante regenerativo para su aplicación en la articulación osteoartrítica (OA). Se cultivaron microesferas de alginato sembradas con condrocitos bovinos en medio suplementado con NCM para probar el potencial regenerativo de la NCM. Adicionalmente, también se cultivaron microesferas de alginato en NCM estimuladas con IL-1p, para investigar los efectos de la NCM en un entorno inflamatorio. Finalmente, se realizaron pruebas de fricción por deslizamiento recíproco de cartílago sobre vidrio para probar las propiedades lubricantes de NCM en relación con el ácido hialurónico (HA) y en combinación con el mismo. La NCM aumentó la deposición de GAG y la proliferación celular, así como la proporción de GAG por ADN y el contenido de hidroxiprolina. Estos efectos se mantuvieron en presencia de IL-1p. La N<c>M también mitigó la expresión inducida por IL-1p de IL-6, IL-8, ADAMTS-5 y MMP-13. Además, la NCM indujo una reducción dependiente de la dosis del coeficiente de fricción (CoF) similar a la del HA a una velocidad de prueba de 6, así como de 60 mm/s. Los resultados de esta invención indican que la NCM tiene efectos anabólicos y antiinflamatorios sobre los condrocitos, así como propiedades lubricantes favorables. Por tanto, la inyección intraarticular de NCM puede tener potencial como tratamiento para minimizar el dolor mientras se restaura el tejido del cartílago afectado en la articulación OA, y esto justifica una investigación adicional.

Descripción detallada de la invención

El cartílago articular (AC) es una capa de tejido suave e hidratado que cubre las superficies articulares de los huesos en las articulaciones sinoviales llenas de líquido. Junto con el líquido sinovial, proporciona baja fricción en estas articulaciones durante el movimiento. La osteoartritis (OA), una enfermedad degenerativa de las articulaciones, afecta al AC, así como a la membrana sinovial y al hueso subcondral, lo que lleva a una disfunción dolorosa de la articulación. La OA de rodilla es una de las principales causas de dolor y discapacidad en todo el mundo, sugiriendo las estimaciones 9,3 millones de personas afectadas solo en los Estados Unidosl.

La OA se trata inicialmente de forma conservadora, con ejercicio y medicación analgésica. En fases posteriores, se prescriben medicamentos antiinflamatorios no esteroideos o inyecciones intraarticulares de esteroides (2). Otra opción de tratamiento es la viscosuplementación (3), es decir, la inyección intraarticular de ácido hialurónico (HA), un polisacárido grande que se encuentra de manera natural en el líquido sinovial (4). El HA aumenta la viscosidad (5) del líquido sinovial además de proporcionar viscoelasticidad, contribuyendo así a la lubricación hidrodinámica de la articulación (6,7). Además, debido a las interacciones moleculares en la superficie del cartílago, también contribuye a la lubricación límite (8). Con la OA, el HA se degrada dando como resultado una disminución de la concentración y fragmentos de bajo peso molecular, lo que afecta las propiedades lubricantes del líquido sinovial (9). La inyección de HA en la articulación tiene como objetivo aumentar la viscosidad del líquido sinovial y minimizar el dolor para posponer el reemplazo total de rodilla. Aunque los metaanálisis proporcionan resultados contradictorios con respecto a la eficacia de la viscosuplementación con<h>A (10), generalmente se considera un tratamiento seguro y eficaz para la OA dolorosa de rodilla(11). A pesar de los efectos positivos del HA, únicamente proporciona un alivio sintomático y no restaura el cartílago afectado a un estado sano. Por tanto, se deben explorar otras opciones. Un objeto de la presente invención es proporcionar una solución con propiedades lubricantes que pueda utilizarse en la viscosuplementación, un tratamiento para aumentar las propiedades lubricantes del líquido sinovial en las articulaciones artríticas de pacientes que padecen OA.

Se encontró que la solución de NCM tiene propiedades lubricantes similares a la solución de HA y es capaz de reducir el coeficiente de fricción (CoF). La reducción de CoF contribuirá a una reducción del dolor en la articulación, minimizando así el dolor y proporcionando alivio al paciente que padece OA.

La presente invención proporciona de este modo el uso de una solución de NCM en el tratamiento de la osteoartritis (OA), más particularmente para su uso en la viscosuplementación en el tratamiento de la OA. Se entiende por viscosuplementación en el sentido de esta invención el tratamiento de la OA mediante inyección intraarticular de un lubricante directamente en la articulación. Preferentemente, la invención proporciona el uso de una solución de NCM en el tratamiento del dolor en las articulaciones osteoartríticas de un paciente que padece OA. Más preferentemente, la solución de NCM se utiliza como lubricante en el tratamiento de la OA, más específicamente en el tratamiento del dolor en las articulaciones artríticas de un paciente que padece OA. La solución de NCM se puede utilizar como lubricante en la viscosuplementación bioactiva en el tratamiento de la OA.

Como el tejido del NP no tiene función lubricante, no se esperaba que la NMC, que se compone simplemente de componentes de la matriz de NP, actuara como lubricante límite o hidrodinámico. Adicionalmente, debido a que la lubricina (PRG4), una glicoproteína importante unida a la superficie articular del cartílago articular, no estaba presente en el contenido de proteínas del medio rico en NC, la presencia de PRG4 no pudo contribuir a las propiedades lubricantes. Por lo tanto, fue aún más sorprendente que una solución de NCM pudiera dar lugar a una lubricación límite e hidrodinámica.

La presente invención proporciona el uso de una solución de NCM en un método para tratar la osteoartritis (OA), preferentemente en un método para tratar el dolor en las articulaciones afectadas por OA. La solución de NCM se administra como un lubricante en la articulación de un sujeto que padece OA para reducir el dolor en dicha articulación. La solución de NCM se administra preferentemente mediante inyección intraarticular directamente en la articulación. La solución de NCM se administra en una cantidad eficaz para lograr una reducción en el coeficiente de fricción (CoF) del cartílago en la articulación artrítica afectada en comparación con el CoF en la articulación artrítica no tratada. Al reducir el CoF se reducirá el dolor en la articulación artrítica afectada, proporcionando así alivio del dolor en el paciente que padece OA. La cantidad eficaz de solución de NCM puede variar según la concentración de NCM y otros factores tales como el estadio de la enfermedad, la edad y el peso del paciente.

Las soluciones de NCM que son adecuadas para su uso como lubricante se pueden obtener utilizando métodos generales de preparación que son comunes en la técnica, tal como se describe en el documento WO 2017/121736, de Vries, Stefanet al.(June 2018),supra;Bach FC,etal.(2018),supra;Vries SAH, Doeselaar M, Kaper HJ, Sharma PK, Ito K. Notochordal cell matrix as a bioactive lubricant for the osteoarthritic joint. Sci Rep. 2018;8(1):1-11.; Notochordal cell matrix: An inhibitor of neurite and blood vessel growth? J Orthop Res. 2018;36(12):3188-3195. Un método adecuado para preparar la solución de NCM comprende las etapas de:

recolección de tejido de núcleo pulposo (NP) rico en células notocordales (NC) de un disco intervertebral de un animal donante;

liofilización del tejido de NP rico en NC para destruir las células dentro del tejido, obteniendo de esta manera una matriz de NC seca y quebradiza;

pulverización de la matriz seca y quebradiza para obtener un polvo de la matriz de NC seca y quebradiza; y

disolución del polvo de la matriz de NC en un disolvente para obtener una solución de NCM.

Un animal donante según la invención puede ser cualquier animal que conserve sus células notocordales (NC) y, por lo tanto, no desarrolle una enfermedad degenerativa del disco. Por tanto, estos animales conservan sus células notocordales en el tejido de NP del disco intervertebral durante muchos años, incluso durante toda su vida adulta. Los animales donantes adecuados según la invención son cánidos, félidos, suidos y similares, no condrodistróficos. Preferentemente, el animal donante es una especie porcina y el disco intervertebral es un disco intervertebral porcino.

La liofilización se puede llevar a cabo usando métodos estándar conocidos en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición. Ed David B Troy. Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, 2006. La liofilización se lleva a cabo para destruir y fragmentar las células dentro del tejido de NP. Se obtiene una matriz seca y quebradiza, que posteriormente se pulveriza para formar un polvo de la matriz de NC seca y quebradiza.

La pulverización de la matriz de NC seca y quebradiza se puede llevar a cabo utilizando métodos estándar conocidos en la técnica y utilizando equipos estándar bien conocidos en la técnica. Se describen métodos y equipos adecuados para la pulverización de material biológico, por ejemplo, en de Vries, Stefanet al.(June 2018),supra.

El polvo de la matriz de NC seca y quebradiza se disuelve en un disolvente para obtener la solución de NCM de la invención. Preferentemente, el disolvente es un disolvente acuoso, más preferentemente un disolvente acuoso tamponado. Un disolvente acuoso adecuado puede ser cualquier solución acuosa estándar que sea bien conocida como disolvente portador acuoso farmacéuticamente aceptable, tal como agua, solución tampón de PBS, solución salina normal y similares.

Además de la etapa de liofilización y pulverización, el tejido puede someterse a una etapa de descelularización para eliminar restos celulares y de ácidos nucleicos. El animal que dona su disco intervertebral puede albergar en su genoma virus endógenos tales como retrovirus, que podrían infectar a las células humanas. Al someter la matriz de NC a una etapa de descelularización para eliminar el contenido de ácido nucleico, se puede prevenir la infección por el ácido nucleico viral. La descelularización se puede llevar a cabo utilizando métodos de descelularización estándar bien conocidos en la técnica. Se han descrito métodos de descelularización adecuados, p. ej., en los documentos WO 2015/048317 y WO 2017/121736. Antes de la descelularización, la matriz de NC seca y quebradiza obtenida en la etapa de liofilización se rehidrata en un disolvente, preferentemente una solución acuosa fisiológica tal como solución salina normal, solución de PBS y similares. Preferentemente, la descelularización se lleva a cabo tratando el tejido de la matriz de NC rehidratada con una nucleasa o detergente o una combinación de ambos. Dicho tratamiento da como resultado la eliminación sustancial del contenido de ácido nucleico de la matriz de NC mientras se mantiene la mayor cantidad posible de contenido de proteína, en comparación con la matriz de NC no descelularizada. El tratamiento con nucleasa o detergente o una combinación de ambos da como resultado la eliminación de al menos el 80 % de los ácidos nucleicos del tejido de la matriz de NC, en comparación con el tejido de NP que no se ha tratado. En consecuencia, el contenido residual de ácido nucleico es inferior al 20 % en la matriz de NC tratada, en comparación con matriz no tratada.

Son nucleasas adecuadas ADNasa, ARNasa, Bensonase® y similares. Son detergentes adecuados Triton-X® tales como Triton-X® 100 y similares. Preferentemente, la descelularización se lleva a cabo mediante tratamiento con Benzonase, más preferentemente una combinación de Benzonase® y Triton-X®-100. La nucleasa y el detergente eliminan el ácido nucleico de una forma dependiente de la dosis. El tratamiento con nucleasa y detergente son técnicas bien conocidas y el experto podrá determinar la dosis y el tiempo necesarios utilizando habilidades de rutina y su conocimiento general. Dependiendo de la dosis y del tiempo de reacción, se puede lograr cualquier nivel de eliminación de ácidos nucleicos entre el 80 % y el 99 %. Después del tratamiento con la nucleasa y/o detergente, el tejido de matriz de NC descelularizado se somete a varias etapas de lavado para eliminar los restos de ácido nucleico. El tejido de matriz de NC descelularizado se liofiliza nuevamente para obtener un polvo de matriz de NC seca y quebradiza, que puede pulverizarse y disolverse para obtener una solución de NCM según la invención.

De este modo, en un aspecto particular, las soluciones de NCM de la invención se pueden preparar mediante un método que comprende las etapas de:

recolección de tejido notocordal pulposo (NP) rico en células notocordales (NC) de un disco intervertebral de un animal donante;

liofilización del tejido de NP rico en NC para destruir las células dentro del tejido, obteniendo de esta manera una primera matriz seca y quebradiza;

rehidratación de la matriz seca y quebradiza en un disolvente y posterior descelularización de la matriz rehidratada para eliminar restos celulares y de ácidos nucleicos;

liofilización de la matriz descelularizada para obtener una segunda matriz seca y quebradiza;

pulverización de la segunda matriz seca y quebradiza para obtener un polvo de la matriz de NC seca y quebradiza; y

disolución del polvo de la matriz de NC en una solución acuosa para obtener una solución de NCM.

El animal donante puede ser cualquier animal como se ha mencionado anteriormente. Las etapas de liofilización, pulverización, descelularización y disolución se llevan a cabo como se ha mencionado anteriormente.

La solución de NCM puede comprender componentes adicionales tales como antibióticos, BSA, ácido hialurónico (HA) o incluso un hidrogel de liberación sostenida.

Las soluciones de NCM de la presente invención tienen preferentemente una concentración de polvo de matriz de NC en el intervalo de 1-200 mg/ml, preferentemente de 1-100 mg/ml, más preferentemente de 1-50 mg/ml.

Las soluciones de NCM se pueden utilizar como lubricante bioactivo en el tratamiento de la OA, preferentemente en el tratamiento del dolor en articulaciones artríticas en pacientes que padecen OA, más preferentemente en el tratamiento de la OA mediante viscosuplementación, para minimizar el dolor en las articulaciones artríticas. Las articulaciones que se pueden tratar son las articulaciones de la rodilla, codo, tobillo, dedo, cadera y todas las demás articulaciones sinoviales que pueden verse afectadas por la OA.

En un aspecto adicional, la solución de NCM se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de: método para preparar una matriz de células notocordales como lubricante bioactivo para una articulación osteoartrítica, que comprende:

liofilizar tejido de núcleo pulposo porcino que contiene células notocordales para destruir las células dentro del tejido y producir un tejido seco y quebradizo;

tratar el tejido seco y quebradizo para eliminar restos de células y ácidos nucleicos, en donde el tratamiento da como resultado la eliminación de al menos el 80 % de los ácidos nucleicos porcinos del tejido del núcleo pulposo porcino mientras se mantiene sustancialmente el contenido de proteína porcina dentro del tejido del núcleo pulposo porcino;

liofilizar adicionalmente el material tratado y pulverizar el material tratado en un polvo de matriz de células notocordales; y

solubilizar el polvo de matriz de células notocordales disolviendo el polvo de matriz de células notocordales en una solución o gel.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una solución de NCM para su uso como lubricante bioactivo. Preferentemente, el lubricante bioactivo que comprende la solución de NCM se obtiene con cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Más preferentemente, el lubricante bioactivo que comprende la solución de NCM se obtiene a partir de un disco intervertebral porcino utilizando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

En un aspecto, la invención proporciona un lubricante bioactivo para su uso en el tratamiento de la OA, en donde el lubricante comprende un polvo de matriz de células notocordales solubilizado. Preferentemente, el polvo de matriz de células notocordales se origina a partir de tejido de núcleo pulposo porcino liofilizado y tratado que contiene células notocordales, en donde el polvo contiene menos del 20 % de ácidos nucleicos porcinos, en donde el polvo contiene una cantidad sustancialmente inalterada de contenido de proteína porcina en comparación con el tejido del núcleo pulposo porcino de origen, y en donde el polvo de matriz de células notocordales solubilizada se disuelve en un disolvente portador o se conforma como un gel.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, sin limitarse a los mismos o por los mismos.

Leyendas de las figuras

Figura 1:la matriz de NP rica en NC porcinas (NCM) indujo una respuesta anabólica de condrocitos bovinos (a) glucosaminoglucano (GAG) y (b) contenido de ADN por microesfera de alginato con condrocitos bovinos sembrados, (c) GAG por ADN y (d) contenido de hidroxiprolina por microesfera. Los valores representan medias desviaciones típicas, n = 5 por grupo. * indica p < 0,05 en comparación con todos los demás grupos, # indica p < 0. 05 en comparación con el medio base (BM). (e) La tinción con azul alcián confirma una mayor deposición de GAG con NCM y BM suplementados con l0 ng/ml de TGF-p1 (TGF) en comparación con BM. La inmunohistoquímica del colágeno muestra un aumento del colágeno tipo II en el borde de la microesfera y un depósito más difuso de colágeno tipo II con TGF. La intensidad de la tinción de colágeno tipo I parece aumentar con la NCM.

Figura 2:la matriz del núcleo pulposo rica en NC (NCM) tiene distintos efectos anabólicos en las microesferas de alginato con condrocitos sembrados.ACAN:agrecano;COL-2:colágeno tipo II alfa 1;COL-1:colágeno tipo I alfa 1. Los niveles de expresión son relativos a la proteína ribosomal 60S L13(RPL13).Los valores son medias desviaciones típicas, n = 5 por grupo. * indica p < 0,05 en comparación con todos los demás grupos en el mismo momento, # indica p < 0,05 en comparación con el medio base (BM).

Figura 3:la adición de un estímulo inflamatorio no afectó el potencial regenerativo de NCM (a) Glucosaminoglicano (GAG) y (b) contenido de ADN por microesfera de alginato con condrocitos bovinos sembrados, (c) GAG por ADN y (d) contenido de hidroxiprolina por microesfera. Los valores representan medias desviaciones típicas, n = 5 por grupo. # indica p <0,05 de ambos grupos de medio base (BM). (e) La tinción con azul alcián confirma una mayor deposición de GAG en los dos grupos de NCM en comparación con los dos grupos de BM. La tinción de colágeno tipo II fue menos intensa con la adición de IL-1p a b M en comparación con BM solo, lo cual, aunque en menor medida, también se observa con la adición de IL-1p a NCM. La deposición de colágeno tipo I parecía aumentar con la adición de IL-1p a BM, aunque esto no se observa con la adición de IL-1p a NCM.

Figura 4:la matriz de núcleo pulposo rica en NC (NCM) puede tener potencial antiinflamatorio y catabólico.IL-1p/6/8:interleucina-1p/6/8;TNFa:factor de necrosis tumorala; ADAMTS-5:una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 5;MMP-13:metaloproteinasa de matriz 13;ACAN:agrecano;COL-2:colágeno tipo II alfa 1.COL-1:colágeno tipo I alfa 1. Los niveles de expresión son relativos a la proteína ribosomal 60S L13(RPL13).Los valores son medias desviaciones típicas, n = 4-5 por grupo. * indica p < 0,05 en comparación con todos los demás grupos desde el mismo momento, $ indica p < 0,05 en comparación con el medio base (BM), # indica p <0,05 en comparación con BM+IL-1p.

Figura 5:la matriz de núcleo pulposo rica en NC (NCM) tiene potencial en la lubricación del cartílago. Coeficientes de fricción (COF) en el ciclo 20 en los diferentes lubricantes normalizados a COF en el ciclo 20 en PBS sola a (a) 6 mm/s y (b) 60 mm/s. BSA: 5 mg/ml de albúmina sérica bovina, HA: 4 mg/ml de ácido hialurónico, NCMl: 4 mg/ml de NCM, NCMh: 10 mg/ml de NCM. Los valores son medias error típico, n = 5 para mediciones de 6 mm/s, n = 3 para mediciones de 60 mm/s. * indica p < 0,05 en comparación con BSA, # indica p <0,05 en comparación con<b>S<a>+ HA, $ indica p < 0,05 en comparación con BSA NCMl.

Figura 6:Las rondas repetidas de deslizamiento recíproco de cartílago contra vidrio en PBS no afectan a los coeficientes de fricción (CoF). CoF para cada ciclo de 4 rondas consecutivas (PBS1 - PBS4, n = 4) de deslizamiento de cartílago sobre vidrio a (a) 6 mm/s y (b) 60 mm/s. Se observaron diferencias significativas entre múltiples rondas de deslizamiento a cualquiera de las velocidades de prueba para mediciones individuales.

Ejemplos

El objetivo del presente estudio fue investigar si es factible utilizar NCM como biomaterial con propiedades lubricantes, que podría estimular simultáneamente los condrocitos para restaurar el cartílago afectado dentro de la articulación Oa . En primer lugar, se investigó el potencial regenerativo de la NCM en condrocitos bovinos en un cultivo de microesferas de alginatoin vitro.En segundo lugar, se investigó si la NCM también podía estimular los condrocitos en presencia de un estímulo inflamatorio. Finalmente, se realizaron pruebas de fricción por deslizamiento recíproco de cartílago sobre vidrio para probar las propiedades lubricantes de NCM en relación con el ácido hialurónico (HA) y en combinación con el mismo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Producción de NCM porcina

Se recogió tejido de NP rico en NC de los DIV de donantes porcinos (n = 5, ~3 meses de edad). El tejido se liofilizó (Labconco, Kansas City, MO, Estados Unidos) durante la noche, dando como resultado una matriz seca y quebradiza, que posteriormente se pulverizó utilizando un microdesmembrador (Sartorius, Goetingen, Alemania). El polvo de NCM se distribuyó en alícuotas y se conservó a -80 °C hasta su uso posterior.

Aislamiento de condrocitos y producción de microesferas de alginato

Se recogieron cortes completos de cartílago articular de las articulaciones metacarpiano-falángicas de donantes bovinos (n = 5, ~3 años de edad) y se recolectaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con penicilinaestreptomicina al 15 % (P/S). Posteriormente, las escamas de cartílago se incubaron durante 20 minutos a 37 °C y con un 5% de CO2 en presencia de 0,1 % de anfotericina B. Posteriormente, se aspiró la mezcla de PBS-P/S-anfotericina y las escamas de cartílago se digirieron durante la noche en medio de digestión (hgDMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, P/S al 1 %, Anfotericina B al 0,1 % y colagenasa tipo II al 0,5 %) a 37 °C y con un 5 % de CO2. Al día siguiente, la suspensión de células se tamizó usando un tamiz de células de 70 um y los condrocitos se lavaron dos veces en hgDMEM fresco. Los condrocitos se resuspendieron en alginato al 1,2 % (Sigma, 180947, Zwijndrecht, Países Bajos) a 10 millones de células/ml, y se produjeron microesferas de alginato según un protocolo previo (Guoet al.,1989). En resumen, se mezclaron 10 millones de células con 1 ml de alginato usando una aguja mezcladora de 18G, después de lo cual se aspiró la suspensión con una jeringa. Se produjeron microesferas de alginato dejando caer la suspensión de células en una solución de cloruro de calcio 102 mM (Merck, 102378). Posteriormente, las microesferas se lavaron 3 veces con una solución de cloruro de sodio al 0,9 % (Merck, 106404) antes de transferirlas al medio de cultivo.

Cultivo de microesferas de alginato

Para probar el efecto anabólico de la NCM, se cultivaron microesferas de alginato con condrocitos sembrados en medio base (BM: hgDMEM suplementado con P/S al 1 %, ITS-1+ al 1 % (Corning, 354352, Lasne, Bélgica), 50 mg/ml de ácido-2-fosfato ascórbico (Sigma, A8960), 1,25 mg/ml de albúmina sérica bovina (Roche, 10735078001) y 40 mg/ml de L-prolina (Sigma, P5607)), NCM (2 mg/ml de NCM añadida al BM) o con la adición de 10 ng/ml de TGF-p1 como control positivo. Además, para probar si la NCM tiene un efecto regenerativo en un entorno inflamatorio, también se cultivaron microesferas de alginato en BM y NCM en presencia de 5 ng/ml de IL-1p. Las microesferas de alginato se cultivaron durante 3 semanas a 37 °C y con un 5 % de CO2 con cambios de medio dos veces por semana. Se añadieron NMC, TGF-p1 e IL-1p con cada cambio de medio. Después del cultivo, las microesferas de alginato se conservaron a -80 °C para ensayos bioquímicos (días 0 y 21) o análisis de expresión génica (días 3 y 21) o se incluyeron en parafina para tinción (inmuno)histoquímica (día 28).

Contenido bioquímico y tinción (inmuno)histoquímica

Para determinar el contenido bioquímico, las microesferas de alginato se digirieron durante la noche a 60 °C en tampón de digestión de papaína (tampón fosfato 100 mM (Sigma, P5244), 1-cisteína 5 mM (Sigma, 200-157-7), ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (Sigma, 03620) y papaína 140 mg/ml (Sigma, P4762). Se determinó el contenido de GAG de las muestras digeridas con el ensayo de azul de dimetilmetileno (DMMB), modificado a partir de un protocolo anterior18 donde se utilizó como referencia el sulfato de condroitina de cartílago de tiburón (Sigma, C4384). El contenido de hidroxiprolina se midió utilizando el ensayo de cloramina-T19 con una referencia de trans-4-hidroxiprolina (Sigma, H54409). El contenido de ADN se midió utilizando la plataforma de cuantificación Qubit (Invitrogen).

Se seccionaron microesferas de alginato incluidas en parafina y se tiñeron con azul alcián y hematoxilina para visualizar la deposición de proteoglicanos y los núcleos celulares. Para la inmunotinción de colágeno, las secciones se desparafinaron primero usando xileno y una serie de concentraciones decrecientes de etanol. Las secciones se lavaron en PBS durante 5 minutos y la recuperación del antígeno se realizó con tampón citrato durante 20 minutos a 96 °C para la tinción de colágeno tipo I, y con pepsina al 0,05 % en HCl 10 mM durante 5 minutos a 37 °C para el colágeno tipo II. Las muestras se lavaron nuevamente dos veces con PBS con tween al 0,1 % y posteriormente se bloquearon con suero normal de cabra al 10 % durante 30 minutos. Después, las muestras se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario en NGS al 1 % en PBS (Abcam, Ab34710, dilución 1:200 para colágeno tipo I y Abcam, Ab180697, dilución 1:200 para colágeno tipo II). Al día siguiente, las muestras se lavaron dos veces durante 5 minutos en PBS con tween al 0,1 %, seguido de incubación con el anticuerpo secundario (anti-IgG de conejo de Molecular Probes, A21428, dilución 1:200 para colágeno tipo I y anti-IgG2a de ratón de Molecular Probes, A21137, dilución 1:300 para colágeno tipo II) y DAPI (1:500 en PBS). Después de eso, las muestras se lavaron de nuevo dos veces en tween al 0,1 % en PBS y se incluyeron con mowiol. Se tomaron fotografías utilizando un microscopio fluorescente (Zeiss Axiovert 200M, Zeiss, Sliedrecht, Países Bajos). Se incluyeron muestras de control positivo (tendón bovino para colágeno tipo I y cartílago articular para colágeno tipo II), así como controles negativos para cada muestra (es decir, omisión del anticuerpo primario). Los controles negativos no mostraron tinción positiva no específica.

Expresión génica

El análisis de la expresión génica se realizó en 3 microesferas de alginato reunidas por grupo. Las microesferas de alginato se disolvieron en tampón de citrato de sodio (citrato-2-hidrato de trisodio 55 mM (Merck, 1064480500), cloruro de sodio 0,15 M, HEPES 25 mM (Sigma, H3375) en agua libre de ARNasa, pH ajustado a 7,4) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, el sedimento celular se lisó en 300 pl de tampón RLT (Qiagen, 74104, Venlo, Países Bajos) con p-mercaptoetanol al 1 %. El ARN se extrajo y se purificó utilizando el minikit Qiagen (Qiagen, 74104) con una etapa de digestión con ADNasa en columna. Para probar la cantidad y pureza del ARN aislado se utilizó un espectrofotómetro (ND-1000, isógeno, de Meern, Países Bajos). La ausencia de ADN genómico se verificó con una reacción de RT negativa (iCycler; Bio-Rad, Veenendaal, Países Bajos). El ADNc se sintetizó utilizando el kit VILO (Invitrogen, 11754050). Los genes probados y sus pares de cebadores correspondientes se presentan en la Tabla 1. Como gen de referencia se seleccionó la proteína ribosomal L-13 (RPL-13) ya que su expresión fue más estable en todas las condiciones de cultivo. La expresión génica se investigó mediante qPCR en tiempo real (CFX384, Bio-Rad) y la expresión se notifica según el método 2-Ct. Para poder hacer comparaciones estadísticas, Los valores de Ct se establecieron en 40 para las muestras de las que no se obtenía señal.

continuación

Tabla 1:Secuencias de cebadores para genes diana y de referencia utilizados en ensayos de RT-qPCR.RPL13:Proteína Ribosomal 60S L13;IL-1/3/6/8:interleucina-1p/6/8;TNFa:factor de necrosis tumoral a;a Da MTS-5:una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 5;MMP-13:metaloproteinasa de matriz 13;ACAN:agrecano;COL2AI:colágeno tipo II alfa 1. La temperatura de hibridación de todos los pares de cebadores fue de 60 °C.

Preparación de tapones osteocondrales bovinos

Se adquirieron articulaciones de rodilla de bovinos (n = 4, 2 años, toros) de Kroon Vlees b.v., Groninga, Países Bajos. Se eliminó el exceso de piel y se abrió la articulación, con cuidado de no dañar la superficie del cartílago. Se perforaron un total de 14 tapones osteocondrales con un diámetro de 12 mm desde los cóndilos femorales utilizando una broca hueca. Durante la perforación, el cartílago se humedeció de manera continua con PBS para evitar el sobrecalentamiento de las muestras. Después de retirar los tapones osteocondrales de la articulación, se mantuvieron en PBS en hielo hasta su uso para pruebas tribológicas, en menos de 2 horas.

Pruebas tribológicas

Se realizaron pruebas tribológicas en deslizamiento recíproco utilizando UMT-3 (Universal Mechanical Tester, Bruker Corporation, Estados Unidos). Se fijó una superficie de vidrio en un recipiente calentado (33 °C, la temperatura de la articulación de la rodilla) para permitir que una película de líquidos/lubricantes cubriera la superficie. Se montaron tapones osteocondrales en una celda de carga y se deslizaron contra la superficie de vidrio en una configuración recíproca. Para estas pruebas, los tapones osteocondrales se dividieron en tres grupos. Para el grupo 1 (n = 5), primero se sumergió la superficie de vidrio en PBS, después de lo cual se presionó el tapón contra el vidrio hasta que se midió una carga normal de 4 N, lo que dará como resultado una presión de contacto baja de < 0,25 MPa como se utiliza en estudios recientes20. Después se realizó deslizamiento recíproco durante 20 ciclos (55 mm en un sentido) a 6 mm/s bajo una carga normal constante, seguido directamente de 20 ciclos a 60 mm/s. Posteriormente se descargó el tapón y se aspiró PBS y se reemplazó por PBS con 5 mg/ml de albúmina sérica bovina (PBS+BSA) y se repitió la prueba. Después de eso, este procedimiento también se repitió con PBS+BSA con 4 mg/ml de ácido hialurónico (PBS+BSA+HA) y con PBS+BSA+HA con 4 mg/ml de NCM (PBS+BSA+HA+NCM). Para el grupo 2 (n = 5) se realizó la misma prueba con diferentes grupos de medios: PBS, PBS+BSA, PBS+BSA con 4 mg/ml de NCM (PBS+BSA+NCMl) y PBS+BSA con 10 mg/ml de NCM (PBS+BSA+NCMh). Durante las pruebas, se supervisaron las fuerzas normales y las fuerzas de fricción, y se usó un script Matlab personalizado para filtrar los datos e incorporar solo los puntos de datos donde la velocidad de prueba estaba cerca de la velocidad establecida (se permitió un error del 10 %) y para calcular el coeficiente de fricción (CoF). Los CoF obtenidos en el ciclo 20 para cada medición se normalizaron a su medición respectiva en PBS sola, para corregir las diferencias en el área de contacto. Para los tapones osteocondrales del grupo 3 (n = 4) se realizó el mismo procedimiento, pero cada ronda en PBS fresca para verificar que el deslizamiento repetido a dos velocidades no afectaba a la superficie del cartílago y, por lo tanto, a los valores medidos de CoF.

Estadística

La estadística se realizó con el Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS, versión 22; IBM, Armonk, NY). La normalidad se comprobó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Para los datos bioquímicos y de expresión génica, se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de pruebas t independientes post hoc con correcciones de Bonferroni. Para los datos de expresión génica, en cada punto de tiempo se realizó un ANOVA unidireccional en lugar de bidireccional, ya que sólo interesaban las diferencias entre grupos medianos y no el factor tiempo. Para los datos tribológicos, se compararon los valores de CoF normalizados de diferentes grupos de lubricantes con pruebas t pareadas (para comparaciones dentro de los tapones) o no pareadas (para comparaciones entre tapones), de forma post-hoc con correcciones de Bonferroni. Para las mediciones de control de PBS, se utilizaron ANOVA de medidas repetidas para comparar los valores de CoF de 4 pruebas secuenciales que consisten cada una en 20 ciclos a 6 y 60 mm/s.

RESULTADO

Potencial regenerativo de la NCM

Tanto la adición de NCM como la de TGF dieron como resultado un mayor contenido de GAG en comparación con el BM (Fig. 1a). Además, El contenido de GAG con la NCM fue significativamente mayor en comparación con el TGF. Se observa un patrón similar con el contenido de ADN, que aumentó con el TGF en comparación con el BM, pero aumentó aún más con la NCM (Fig. 1b). Estos datos conducen a un aumento similar de la proporción de GAG por ADN para la NCM y el TGF en comparación con el BM (Fig. 1c). Igualmente, la hidroxiprolina, como medida del contenido de colágeno, aumentó tanto con la NCM como con el TGF en relación con el b M (Fig. 1d). La tinción con azul alcián confirmó el aumento del contenido de GAG con la NCM y el TGF (Fig. 1e). A partir de inmunotinciones de colágeno, la deposición de colágeno tipo II parecía estimularse con la NCM principalmente en el borde de la microesfera, pero especialmente con el TGF en comparación con el BM. La deposición de colágeno tipo I no parecía verse afectada por el TGF, mientras que las microesferas cultivadas en la NCM se teñían más intensamente.

Para determinar el efecto anabólico de la NCM a nivel génico, se realizó un análisis de expresión génica de ACAN, COL-2 y COL-1 (Fig. 2). El día 3 no se observaron diferencias en la expresión de ACAN entre los grupos de cultivo. Sin embargo, el día 21, la expresión de ACAN aumentó tanto con la NCM como con el TGF en comparación con el BM, y con el TGF en comparación con la NCM. La expresión de COL-2 no fue significativamente diferente con la NCM en comparación con el b M los días 3 y 21, pero fue significativamente mayor con el TGF en comparación con la NCM el día 3, y en comparación con el BM y la NCM el día 21. El día 3 no se observaron diferencias significativas en la expresión de COL-1 entre los grupos de cultivo, sin embargo, la expresión de COL-1 fue significativamente mayor en la NCM en comparación con el<b>M y el TGF el día 21.

Potencial de la NCM en un entorno inflamatorio

Para determinar si la NCM también tiene potencial regenerativo en presencia de un estímulo inflamatorio, se cultivaron microesferas de alginato con condrocitos sembrados en BM y NCM con y sin adición de IL-1p. Sin embargo, la adición de IL-1p a BM y NCM no afectaba al contenido de GAG, ADN, GAG por ADN y hidroxiprolina en comparación con sus homólogos sin IL-1p (Fig. 3a-d). La tinción con azul alcián verificó el aumento del contenido de GAG con NCM con y sin IL-1p en comparación con BM con y sin IL-1p (Fig. 3e). Curiosamente, la inmunotinción indicó que el colágeno tipo II disminuye con la adición de IL-1p al BM, mientras que esto no se observó tan claramente con la adición de IL-1p a la NCM. Además, la adición de IL-1p parecía aumentar la producción de colágeno tipo I en el BM, pero no en la NCM.

No se observaron diferencias en la expresión de IL-1p entre los grupos de cultivo el día 3, mientras que el día 21 la expresión de IL-1p fue significativamente menor en los dos grupos de NCM en comparación con los dos grupos de BM (Fig. 4). Además, la adición de IL-1p no aumentó la expresión de IL-1p ni en BM ni en NCM en relación con su control no tratado. La expresión de IL-6 fue significativamente mayor en la NCM con IL-1p en comparación con todos los demás grupos el día 3. Sin embargo, el día 21 su expresión fue significativamente mayor en el BM con IL-1p en comparación con el BM solo y en los dos grupos de NCM. No se observaron diferencias en la expresión de IL-8 el día 3, mientras que su expresión fue significativamente mayor en el BM con IL-1p en comparación con todos los demás grupos de cultivo. No se observaron diferencias significativas entre los grupos de cultivo para TNFa ni el día 3 ni el día 21. El día 3, no se observaron diferencias significativas en la expresión de MMP-13, pero su expresión el día 21 fue significativamente mayor en el BM con IL-1p en comparación con el BM solo y en los grupos de NCM. La expresión de ADAMTS-5 el día 3 fue significativamente mayor en la NCM con y sin IL-1p en comparación con los dos grupos de BM. Sin embargo, el día 21 su expresión fue significativamente mayor en el BM con IL-1p en comparación con los otros grupos. No se observaron diferencias en la expresión de ACAN el día 3. Sin embargo, el día 21, la expresión de ACAN en NCM fue significativamente mayor en comparación con el BM solo, y en NCM con IL-1p fue significativamente mayor en comparación con los dos grupos de BM. El día 3, la adición de IL-1p disminuyó significativamente la expresión de COL-2 en comparación con el BM solo, mientras que no se observaron diferencias significativas el día 21. No se observaron diferencias para la expresión de COL-1 el día 3, pero el día 21 su expresión en NCM con IL-1p fue significativamente mayor en comparación con todos los demás grupos de cultivo.

Lubricación con NCM

Tanto a 6 como a 60 mm/s (Fig. 5a, b), la adición de BSA a PBS no produjo ninguna diferencia o provocó un ligero aumento en el CoF. A 6 mm/s, la adición de HA y cantidades más bajas de NCM (NCMl) dio como resultado una disminución significativa (en ~ 27 %) en el CoF después de 20 ciclos de deslizamiento, en comparación con la PBS con BSA (Fig. 5a). La adición combinada de NCMl y HA tuvo como resultado una reducción más fuerte (45 %) en CoF, que fue significativamente menor en comparación con BSA sola y BSA con HA, pero no en comparación con BSA con NCMl. La reducción más fuerte (53 %) en el CoF se observó con la adición de NCMh, donde el CoF fue significativamente menor en comparación con la BSA, así como con la BSA con HA y la BSA con NCMl.

A 60 mm/s, la adición de HA tuvo como resultado una disminución del 92 % en el CoF después de 20 ciclos de deslizamiento, en comparación con la PBS con BSA, y la adición de HA y NCMl también mostraron una disminución similar. La adición de NCMl y NCMh respectivamente provocó una disminución significativa del 55 y el 70 % en comparación con la PBS con BSA (Fig. 5b). Para verificar que el deslizamiento repetido del mismo tapón no afectaba a las mediciones de CoF, se deslizaron tapones osteocondrales contra la superficie de vidrio durante 4 rondas de 20 ciclos, cada ronda en PBS fresca. Los CoF no cambiaron significativamente ni a 6 (Fig. 6a) ni a 60 mm/s (Fig. 6b) como resultado de múltiples rondas de deslizamiento. Por tanto, no se aplicaron correcciones a los datos presentados en las Fig. 5a y b.

ANÁLISIS

Los factores secretados por las NC, aplicados en forma de medio acondicionado, han mostrado potencial anabólico, proliferativo y condrogénico en NPC y BMSC12-17. Debido a las similitudes entre las NPC y los condrocitos, parece lógico un traslado de los factores secretados por NC desde las aplicaciones de DIV al campo de los condrocitos/cartílago. Efectivamente, el medio acondicionado de NC también ha demostrado recientemente efectos anabólicos y antiinflamatorios sobre los condrocitos OA humanos. Dado que la aplicación directa de NCM tuvo efectos anabólicos aún más fuertes en las NPC en comparación con el medio acondicionado de NC (de Vries, presentado), parecía plausible que la NCM tuviera también efectos estimuladores sobre los condrocitos. Por tanto, este estudio probó la viabilidad de un nuevo enfoque de la NCM como lubricante de viscosuplementación bioactivo, para minimizar el dolor articular tras la inyección en la articulación OA, al mismo tiempo que proporciona un estímulo regenerativo a los condrocitos residentes.

La NCM ejerce fuertes efectos anabólicos sobre los condrocitos bovinos

Los hallazgos anteriores sobre el medio acondicionado de NC y la NCM están en línea con los resultados actuales, ya que la NCM ejerció fuertes efectos anabólicos sobre los condrocitos bovinos como lo demuestra el aumento del contenido de GAG, ADN, GAG por ADN e hidroxiprolina con NCM en comparación con BM. La NCM dio como resultado un contenido de GAG y ADN por microesfera aún mayor en comparación con la adición de 10 ng/ml de TGF-p1. Sin embargo, la inmunohistoquímica del colágeno reveló una mayor deposición de colágeno tipo I con n Cm en comparación con BM y TGF, lo cual está en línea con el aumento de la expresión de COL-1 con NCM el día 21. Las diferencias en la deposición de colágeno tipo II entre los grupos de cultivos fueron menos discernibles, aunque el colágeno tipo II estuvo presente consistentemente principalmente en los bordes de las microesferas con NCM, mientras que se depositó en toda la microesfera con la adición de TGF-p1. Esto puede indicar que TGF-p1 es más pequeño que el o los componentes activos de la NCM y puede difundirse dentro de la microesfera más fácilmente. Por tanto, ejercería sus efectos sobre un mayor número de células, lo que explicaría los mayores niveles de expresión génica de ACAN y COL-2 observados con TGF-p1 en comparación con NCM. En línea con esto, en un estudio anterior en el que se probó el potencial regenerativo de NCM en microesferas de alginato con NPC sembradas, la NCM parecía mejorar la deposición de colágeno tipo II en todas las microesferas de alginato, en lugar de colágeno tipo I (De Vries, Stefanet al.(June 2018),supra).En dicho estudio, las NPC se sembraron a una densidad de 3 millones de células/ml, mientras que en este estudio los condrocitos se sembraron a razón de 10 millones de células/ml, lo que indica que la difusión limitada de los factores bioactivos de la NCM puede desempeñar un papel más importante en el estudio actual. Como alternativa, es posible que las NPC y los condrocitos, a pesar de sus similitudes, respondan de manera diferente a la estimulación de NCM en términos de deposición de colágeno, o que las NPC utilizadas en el estudio anterior estuvieran en un estado más sano en comparación con los condrocitos del estudio actual. No obstante, a pesar de que la NCM estimula el colágeno tipo I más que el colágeno tipo II, presenta fuertes efectos anabólicos de matriz y se requieren más estudios para una caracterización más profunda de estos efectos en condiciones de enfermedad.

La NCM tiene potencial regenerativo en presencia de un estímulo inflamatorio

Las citocinas inflamatorias, que a su vez estimulan la liberación de factores catabólicos tales como MMP y ADAMTS, desempeñan un papel central en la aparición y la progresión de la OA. Por tanto, este estudio probó si la n Cm también puede provocar una respuesta regenerativa de los condrocitos en presencia de un estímulo inflamatorio. Los resultados de la expresión génica, principalmente del día 21, sugieren que la adición de IL-1p a BM efectivamente tuvo como resultado un entorno inflamatorio, como se muestra por el aumento de los niveles de expresión de IL-6 e IL-8. Asimismo, IL-1p indujo catabolismo a nivel génico como se muestra por el aumento de los niveles de expresión de MMP-13 y A<d>A<m>TS-5 el día 21 en BM. Sin embargo, el tratamiento del grupo de NCM con IL-1p no tuvo como resultado mayores niveles de expresión de estos genes en relación con el BM o la NCM solos, lo que sugiere que la NCM tiene potencial antiinflamatorio y catabólico, como también se observó en estudios anterioresin vitroein vivoque prueban los efectos de la NCM sobre las NPC (de Vries, Stefan et al (junio de 2018), supra; Bach FCetal.,(2018), supra.). Curiosamente, IL-1p y TNFa no respondieron a la adición de IL-1p ni a BM ni a NCM, lo cual no está en línea con los hallazgos anteriores(21). Esto puede deberse a diferencias de especie y/o edad, ya que el experimento anterior utilizó condrocitos obtenidos de donantes humanos de edad relativamente avanzada, que probablemente sean más sensibles a un estímulo inflamatorio. No obstante, la expresión del gen de IL-1p fue significativamente menor en los dos grupos de NCM en relación con los dos grupos de BM, lo que subraya el potencial antiinflamatorio de la NCM.

El estímulo inflamatorio aplicado durante el cultivo no afectó significativamente al contenido de GAG, ADN e hidroxiprolina, lo que indica que los efectos anabólicos y proliferativos de la NCM se mantienen en un entorno inflamatorio. Esto también se verifica mediante los niveles de expresión génica de ACAN, que no fueron significativamente diferentes en la NCM tratada con IL-1p en comparación con la NCM sola. Sin embargo, la NCM en combinación con IL-1p parecía inducir aún más la producción de colágeno desfavorable, como se observa por la disminución de la intensidad de la tinción de colágeno tipo II y la expresión del gen COL-2 el día 3, y el aumento de la expresión del gen COL-1 el día 21 para la NCM tratada con IL-1p. Sin embargo, el día 21, no se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión de COL-2, lo que sugiere que la producción de colágeno tipo II se ha recuperado durante el tiempo de cultivo, a pesar de la presencia continua de IL-1p. Además, se aplicó una concentración suprafisiológica de IL-1p y el potencial de la NCM en un entorno inflamatorio debe investigarse más a fondo en un entorno más fisiológico, p. ej.,in vivo.

La NCM tiene propiedades lubricantes del cartílago

Además de sus efectos regenerativos sobre los condrocitos, este estudio muestra que bajas concentraciones (4 y 10 mg/ml) de soluciones de NCM fueron capaces de reducir el CoF del cartílago. Por tanto, la NCM se puede aplicar como lubricante para articulaciones OA con o sin HA.

Las mediciones de control tribológico (es decir, 4 rondas repetidas de deslizamiento recíproco del mismo tapón osteocondral, cada vez en PBS fresca) demostró que no hubo diferencias significativas entre los ensayos y, por lo tanto, no se aplicaron correcciones a los otros experimentos. Esta estrategia de utilizar el mismo tapón repetidamente tiene éxito a la hora de evitar diferencias en el área de contacto debido a variaciones biológicas entre articulaciones en las propiedades del cartílago.

Tanto a 6 como a 60 mm/s, la adición de BSA a PBS no produjo ninguna diferencia o provocó un ligero aumento en el CoF. Esto no fue inesperado. La BSA es una proteína globular no glicosilada y no se esperaba que proporcionara lubricación límite o hidrodinámica. Asimismo, la albúmina se ha implicado en la interferencia con la adsorción de lubricina (PRG4) en las superficies naturales del cartílago(22) y de los biomateriales(23). La BSA es una proteína abundante del líquido sinovial, por lo que fue necesario controlar su efecto en las mediciones de los presentes solicitantes (todas las soluciones lubricantes contenían 5 mg/ml de BSA excepto los controles de PBS).

A bajas velocidades, p. ej. 6 mm/s, no se espera que se apliquen ni los mecanismos hidrodinámicos(6,7) ni los de tribohidratación20 de lubricación del cartílago. A esta velocidad en el cartílago natural, las moléculas adsorbidas en la superficie del cartílago proporcionan lubricación límite. La lubricina (PRG4) es una glicoproteína importante unida a la superficie articular del AC, es decir, la lámina splendens. Está anclada en forma de bucle o de un extremo libre, proporcionando lubricación límite. Además de la PRG4, los fosfolípidos tensioactivos (SAPL) pertenecen a los lubricantes límite más investigados24-26. Como el tejido NP no tiene función lubricante, no se esperaba que la NMC, que se compone simplemente de componentes de la matriz de NP, actuara como lubricante límite. En un estudio previo que investigó el contenido proteómico del medio acondicionado con NC porcinas, no se demostró que estuviera presente27 PRG4. También se especula que las vacuolas de las células notocordales contienen lípidos28, pero nunca se ha informado de su actividad en la superficie. Finalmente, los mucopolisacáridos presentes en la matriz NC también pueden ser tensioactivos y dar lugar a una lubricación límite. Sin embargo, los estudios anteriores informaron que eran necesarias concentraciones tan altas como 100 mg/ml de sulfato de condroitina para disminuir el coeficiente de fricción29, mientras que en este estudio la concentración de NCM utilizada habría dado como resultado únicamente 1,5 y 4 mg/ml de GAG. De este modo, fue sorprendente que la lubricación límite fuera el modo de acción más fuerte de NCM, es decir, más que a velocidades más altas, y algún componente distinto de PRG4 proporcionaría lubricación límite al cartílago a estas velocidades más bajas. El hecho de que la adición de NCM indujera una disminución de CoF dependiente de la dosis sería coherente con su mecanismo de lubricación límite. A 4 mg/ml, este efecto fue similar al HA en una concentración similar a la utilizada clínicamente para la viscosuplementación. Finalmente, cuando se añadió a HA, disminuyó aún más el CoF, lo que indica la ausencia de cualquier interacción antagónica entre el HA y la NCM y quizás un modo de acción diferente.

A velocidades más altas, p. ej., 60 mm/s, interviene la lubricación hidrodinámica, donde se crea una cuña de líquido cuando las superficies de cartílago opuestas se deslizan entre sí6,7,30 y, además, se activará la tribohidratación(20). Este tipo de lubricación depende, entre otras cosas, de la viscosidad del fluido atrapado. Como la NCM es rica en mucopolisacáridos27, se podría esperar que tuviera algunos efectos lubricantes. Sin embargo, durante los experimentos, se observó visualmente que una solución de 4 mg/ml de HA era más viscosa en comparación con las soluciones de NCMl (4 mg/ml) e incluso de NCMh (10 mg/ml), y era dudoso que la NCM fuera eficaz. Sin embargo, la NCM tuvo un efecto lubricante a esta velocidad de prueba, ya que redujo el CoF un 55 % a 4 mg/ml y un 70 % a 10 mg/ml en relación con PBS+BSA, a pesar de que hubo una disminución menor en el CoF que con HA. Esto podría sugerir que el mecanismo de lubricación de la NCM a velocidades más altas puede no deberse únicamente a su viscosidad, sino también a otros efectos desconocidos. De nuevo, a esta velocidad, la combinación de NCMl con HA indujo una reducción similar en CoF a la del HA solo, lo que indica que no hay antagonismo y que esta combinación puede, en última instancia, aplicarse clínicamente para maximizar las propiedades lubricantes y al mismo tiempo beneficiarse del potencial regenerativo de la NCM.

CONCLUSIONES

En conclusión, este estudio demuestra que la NCM ejerce efectos regenerativos sobre los condrocitos bovinos y tiene fuertes propiedades lubricantes sobre el cartílago articular. Por tanto, la NCM es prometedora como terapia para la OA, donde se puede aplicar para minimizar el dolor directamente tras la inyección en la articulación, al mismo tiempo que induce un estímulo regenerativo a los condrocitos residentes, que pueden restaurar el tejido de cartílago afectado hacia un estado sano. Otros estudios deberían centrarse en los efectos regenerativos de la NCM en un modelo más fisiológico y en los métodos de procesamiento para la aplicación clínica de la NCM.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una solución de matriz de células notocordales (NCM) para usar en el tratamiento de la osteoartritis (OA).

2. La solución de NCM para su uso según la reivindicación 1, en donde la solución de NCM se usa para tratar el dolor en las articulaciones artríticas de un paciente que padece OA.

3. La solución de NCM para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde las articulaciones artríticas que se pueden tratar son la rodilla, codo, tobillo, dedo y/o cadera de un paciente que padece OA.

4. La solución de NCM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la solución de NCM se usa como lubricante.

5. La solución de NCM para su uso según la reivindicación 4, en donde la solución de NCM se administra mediante inyección intraarticular directamente en la articulación.

6. La solución de NCM para su uso según la reivindicación 4 o 5, en donde la solución de NCM tiene una concentración de polvo de matriz de NC en el intervalo de 1-100 mg/ml, más preferentemente de 1-50 mg/ml.

7. La solución de NCM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de NCM comprende además ácido hialurónico.

8. La solución de NCM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución es una solución acuosa.

9. La solución de NCM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de NCM se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de:

- recolección de tejido de núcleo pulposo (NP) rico en células notocordales (NC) de un disco intervertebral de un animal donante;

- liofilización del tejido de NP rico en NC para destruir las células dentro del tejido, obteniendo de esta manera una matriz seca y quebradiza;

- pulverización de la matriz seca y quebradiza para obtener un polvo de la matriz de NC seca y quebradiza; y - disolución del polvo de la matriz de NC en una solución acuosa para obtener una solución de NCM.

10. La solución de NCM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la NCM se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de:

- liofilización del tejido de NP rico en NC para destruir las células dentro del tejido, obteniendo de esta manera una primera matriz seca y quebradiza;

- rehidratación de la matriz seca y quebradiza en un disolvente y descelularización de la matriz rehidratada para eliminar restos celulares y de ácidos nucleicos;

- liofilización de la matriz descelularizada para obtener una segunda matriz seca y quebradiza;

- pulverización de la segunda matriz seca y quebradiza para obtener un polvo de la matriz de NC seca y quebradiza; y

- disolución del polvo de la matriz de NC en una solución acuosa para obtener una solución de NCM.

11. La solución de NCM para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de NCM se obtiene del disco intervertebral de un suido.