CN110904036A - 一种高效分离髓核原代细胞的方法及装置 - Google Patents

一种高效分离髓核原代细胞的方法及装置 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种高效分离髓核原代细胞的方法，该方法包括以下步骤：消化步骤：该步骤采用的消化液的活性成分包括弹性蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶和糖苷酶。与传统的髓核原代细胞分离方法相比，本公开的方法操作过程简单快捷，消化过程温和，所需仪器设备简单，成本较低；所获髓核细胞量大，存活率高，更易于在培养瓶中贴壁，且具有良好的增殖率和细胞形态，细胞活性较强。

Description

一种高效分离髓核原代细胞的方法及装置
技术领域
本公开涉及一种原代髓核细胞的制备方法及装置，尤其涉及一种高效分离髓核原代细胞的方法及组织剪碎装置。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
腰痛是骨科最常见的疾病，它不但给病人造成精神上的痛苦，而且还会造成巨大的经济负担，但目前临床上还缺乏有效的治疗方式。椎间盘是人体最大的无血管器官，研究报道大约40％病人的腰痛是由于椎间盘退变引起的，而髓核组织中存在最明显的改变。目前临床治疗包括非手术疗法(针灸、推拿、牵引以及止痛药物等)和手术治疗，传统治疗方法可能造成椎间不稳、椎体间植骨不融合、医源性脊髓神经根损伤等后果，而且治疗费用对社会造成巨大的经济负担。最新研究发现，组织工程学方法有望用于针对椎间盘退行性变的临床治疗，椎间盘组织工程学日益成为研究热点，目前髓核细胞移入椎间盘是一种有效治疗椎间盘退变的方法，因此大量髓核细胞作为种子细胞是科研及临床的必要条件。
但现阶段多使用脊柱侧凸矫形术中切除的椎间盘，来源有限。腰椎间盘突出症患者虽较为常见，但患者年龄偏大，椎间盘内髓核组织存在老化及髓核细胞数量较少，体外培养困难。而传统髓核细胞原代培养操作繁琐、污染率高，容易失败。且原代髓核细胞在体外培养一般经过3-4次传代扩增后，细胞形态逐渐改变，不利于科研研究需要，为保证实验结果的可靠，通常取传代1-2次的细胞，这就需要大量髓核细胞。
现有技术中关于分离髓核原代细胞的方法，常用的是胰蛋白酶和/或胶原酶消化法，由于细胞膜本身含有蛋白质，越长时间的消化，酶类消化液可以水解这类蛋白质，这些蛋白质被水解之后，髓核原代细胞的细胞膜破裂，严重损伤了髓核原代细胞的完整性，进而影响了分离得到的髓核原代细胞活力和后续髓核原代细胞的增殖培养；而且，随着消化时间的延长，其还会损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢。
因此亟需研发一种高效分离髓核原代细胞的方法，从而在体外通过髓核细胞来进行机制研究。
发明内容
针对以上背景技术，本公开要解决的技术问题是提供一种高效、稳定、便捷分离髓核原代细胞的方法及组织剪碎装置，克服现有技术存在的问题，改进关键的培养步骤，简化传统原代培养方法，降低成本，得到大量的髓核细胞。通过提高髓核细胞原代培养的得率，显著提高临床人体髓核标本的使用效率，并能够后续稳定培养，为椎间盘的研究奠定实验基础，提高科研效率。
为解决上述技术问题，本公开首先提供一种高效分离髓核原代细胞的方法，该方法包括以下步骤：
消化步骤：该步骤采用的消化液的活性成分包括弹性蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶和糖苷酶。
其次，本公开提供一种组织剪碎装置，包括组织剪碎皿，其包括皿体和皿盖，所述皿体为圆锥型漏斗体，下端封底。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
与传统的髓核原代细胞分离方法相比，本公开的方法操作过程简单快捷，消化过程温和，所需仪器设备简单，成本较低；所获髓核细胞量大，存活率高，更易于在培养瓶中贴壁，且具有良好的增殖率和细胞形态，细胞活性较强。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1是本公开实施例1中培养的的髓核原代细胞显微镜照片图。
图2是本公开实施例1和对比例1中培养的髓核原代细胞增殖曲线图。
图3是本公开实施例2中培养的的髓核原代细胞显微镜照片图。
图4是本公开实施例2和对比例2中培养的髓核原代细胞增殖曲线图。
图5是本公开实施例3中培养的的髓核原代细胞显微镜照片图。
图6是本公开实施例3和对比例3中培养的髓核原代细胞增殖曲线图。
图7是本公开的组织剪碎皿的三维图。
图8是本公开的组织剪碎皿的正视图。
图9是本公开的组织剪碎皿的支物架的三维图。
图10是本公开的组织剪碎皿的透视图。
其中，1、皿体，2、皿盖，3、支物架，4、隔板，5、插孔。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
本公开中，所述“髓核原代细胞”是指直接从腰椎间盘突出症患者手术时提取和培养的髓核细胞。
本公开中，0.25％胰蛋白酶溶液是指100mL溶液中含有0.25g胰蛋白酶。
本公开中，0.2％Ⅱ型胶原酶溶液是指100mL溶液中含有0.2gⅡ型胶原酶。
本公开中，所述“含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液”是指90ml的DMEM高糖培养液加10ml的澳洲胎牛血清(FBS)(Gibco)。
正如背景技术所介绍的，目前胰蛋白酶和/或胶原酶消化法对髓核原代细胞的损害较大，为了解决如上的技术问题，在本公开的一个典型的实施方式中，提供一种高效分离髓核原代细胞的方法，该方法包括以下步骤：
冲洗步骤；
剪碎步骤；
消化步骤；
收集步骤；
其中在消化步骤中：采用的消化液的活性成分包括弹性蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶和糖苷酶。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述冲洗步骤的具体方法包括但不限于：
取人体新鲜椎间盘髓核组织，用生理盐水清洗数次，直至残留血液漂洗干净。
手术所取髓核组织应保持新鲜、无菌；组织消化前尽可能将血液清洗干净，以免残留血小板等血细胞影响髓核细胞沉降贴壁。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述剪碎步骤的具体方法包括但不限于：
加入胰蛋白酶，采用无菌剪刀剪碎髓核组织。
无菌手术剪应尽可能将组织剪碎，使组织块尽可能小，利于酶的消化，缩短消化时间，从而避免酶对细胞的损伤。
传统的髓核组织剪碎时，是在平底的培养皿中剪碎，组织剪碎过程中比较分散，效率低，且接触空气面积大，组织容易干；而本发明人采用自制小型的组织剪碎装置，其包括组织剪碎皿，所述组织剪碎皿包括皿体1，其为漏斗形状且下部为封底的结构，组织剪碎过程中比较集中，剪碎效率高，与空气接触面积小，组织不易发干，且漏斗状方便手拿，具体结构示意图如图7、图8和图10所示，进一步的，组织剪碎皿还包括皿盖2，方便实验等待消化时盖上盖子，避免污染；皿盖2直径大于皿体1直径，使得皿盖2具有边沿儿，方便手拿，减少污染率。进一步的，所述装置还包括支物架3，方便组织剪碎皿的放置；所述支物架3包括至少一排隔板4，每排隔板4设置若干个能够放置组织剪碎皿的插孔5，如图9所示，所述支物架3设置有上下两排隔板4，每排隔板4设置6个插孔。
进一步的，当髓核组织的质量为100～2000mg，加入1～2ml 0.25w/w％胰蛋白酶溶液，使髓核组织在切割过程中保持湿润。
进一步的，采用无菌剪刀进行髓核组织剪碎需要15～20min。
进一步的，剪碎后的髓核组织直径不大于1mm。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述消化步骤中，所述消化液的组成为：弹性蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶和糖苷酶；其中，添加量为：1mL剪碎的髓核组织中，弹性蛋白酶0.1～1U，Ⅱ型胶原蛋白酶0.1～1U，糖苷酶0.1～1U。
本公开中的消化液可采用PBS缓冲液进行配制，也可采用PBS缓冲液和含胎牛血清的培养液进行配制，操作简便又可提高细胞成活率。配制的消化液中，每mL含有弹性蛋白酶0.1～1U，Ⅱ型胶原蛋白酶0.1～1U，糖苷酶0.1～1U。此消化液消化作用缓和，各种酶相互配合，使得消化时间短、无需机械振荡和消化效率高。
髓核组织是乳白色半透明胶状体，富有弹性，其中包含蛋白多糖复合体、胶原纤维和纤维软骨等，而蛋白多糖复合体是髓核组织中的主要大分子结构之一，主要由透明质酸、硫酸角质素、硫酸软骨素等组成。针对此，本公开设计以含有糖苷酶和弹性蛋白酶的消化液来消化髓核组织，经过试验验证发现采用含有糖苷酶和弹性蛋白酶的消化液进行消化可以得到大量的高活力髓核原代细胞，消化时间短，细胞存活率高，显著提高了髓核原代细胞的培养效率。
进一步的，所述糖苷酶为内切糖苷酶和外切糖苷酶组成，所述内切糖苷酶为透明质酸酶，所述外切糖苷酶蛋白为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，首先透明质酸酶能水解透明质酸、硫酸软骨素等蛋白多糖中的β-N-乙酰氨基已糖糖苷键，随后再由β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶进一步水解，得到更小分子物质，两种糖苷酶相互配合可快速降解蛋白多糖复合体，使得髓核原代细胞可快速释放出来，提高了消化效率。经过试验验证，选择此种内切糖苷酶和外切糖苷酶，可显著缩短消化时间，提高消化效率。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述消化步骤中，消化温度为室温，消化时间为1～3h；进一步的，消化温度为37℃。
在本公开的一个实施方式中，所述消化步骤的具体方法为：向剪碎的髓核组织中加入消化液，消化结束后，过滤除菌，将收集的滤液离心去上清，剩余组织用D-Hanks平衡盐溶液洗后重悬离心。
在本公开的另外一个实施方式中，所述消化步骤的具体方法为：向剪碎的髓核组织中加入消化液，消化结束后，离心去上清；再次将剩余组织重复消化步骤，过滤除菌，将收集的滤液离心去上清，剩余组织用D-Hanks平衡盐溶液洗后重悬离心。
进一步的，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述消化步骤中，每5～20min摇动或震荡一次，使消化液和髓核组织混合均匀，更有利于消化。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述收集步骤中，将消化步骤中离心后的沉淀去上清，用含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，移入培养瓶中，得到高活力髓核原代细胞。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
实验方法：手术无菌摘取髓核组织，放入直径为10cm的无菌培养皿中，用生理盐水冲洗数次，直至无明显血迹为止，小心分离软骨等组织。加入1ml0.25％胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL髓核组织，用无菌手术剪将髓核组织剪碎约20分钟，剪成直径小于1mm大小。
将剪碎的髓核组织采用3ml无菌巴氏管移入50ml无菌离心管中，再向培养皿中加入消化液，使得弹性蛋白酶0.5U/每mL剪碎的髓核组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.5U/每mL剪碎的髓核组织、透明质酸酶0.2U/每mL剪碎的髓核组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.2U/每mL剪碎的髓核组织，冲洗皿中剩余髓核组织，用巴氏管同样移入50ml无菌离心管中，37℃恒温水浴箱中消化30min，每10min震荡一次。消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后弃上清，再次加入消化液于离心管中，添加量为：弹性蛋白酶0.5U/每mL离心管中剩余组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.5U/每mL离心管中剩余组织、透明质酸酶0.2U/每mL离心管中剩余组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.2U/每mL离心管中剩余组织，置于37℃水浴锅中，消化1h，每10min混匀一次。消化完毕后，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。剩余沉淀组织用0.5倍体积的D′Hanks重悬离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后弃上清。用1ml枪头加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，直到看不到组织团块为止。将重悬的细胞悬液移入培养瓶中，重复加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液冲洗离心管后，同样移入培养瓶中，而后向培养瓶中加入0.6倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次。倒置显微镜下观察细胞形态。分别在接种后的第1、2、3、4、5、6d进行细胞数量(以吸光度值表示)检测，培养7d后，检测细胞数量和细胞活率。
实验结果：按照上述方法可有效去除软骨细胞等非髓核细胞，得到大数量的髓核细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏。
培养第2d，髓核细胞逐渐贴壁生长增殖,并由组织块向四周蔓延；髓核细胞分裂增殖活跃，于培养第5d已形成较大的集落,培养第7d时细胞可达95％。图1为倒置显微镜下本实施例分离培养的原代髓核细胞形态，由图1可知，培养的细胞形态呈短梭形或多边形，胞质内可见散在深色颗粒，细胞核较大形态明显，符合髓核细胞光学显微镜下的形态特征；细胞增殖曲线见图2。
实施例2
实验方法：手术无菌摘取髓核组织置于生理盐水中，冲洗数次，直至无明显血迹为止，小心分离软骨等组织。加入1ml 0.25％胰蛋白酶，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL髓核组织，用无菌手术剪将髓核组织剪碎约20分钟，剪成直径小于1mm大小。
将剪碎的髓核组织采用3ml无菌巴氏管移入50ml无菌离心管中，再向培养皿中加入消化液，使得弹性蛋白酶0.4U/每mL剪碎的髓核组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.4U/每mL剪碎的髓核组织、透明质酸酶0.15U/每mL剪碎的髓核组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.15U/每mL剪碎的髓核组织冲洗皿中剩余髓核组织，用巴氏管同样移入50ml无菌离心管中，37℃恒温水浴箱中消化1h，每10min震荡一次。消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后弃上清，再次加入消化液于离心管中，添加量为：弹性蛋白酶0.4U/每mL离心管中剩余组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.4U/每mL离心管中剩余组织、透明质酸酶0.15U/每mL离心管中剩余组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.15U/每mL离心管中剩余组织，置于37℃水浴锅中，消化0.5h，每10min混匀一次。消化完毕后，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。剩余沉淀组织用0.5倍体积的D′Hanks重悬离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后弃上清。用1ml枪头加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，直到看不到组织团块为止。将重悬的细胞悬液移入培养瓶中，重复加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液冲洗离心管后，同样移入培养瓶中，而后向培养瓶中加入0.6倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次。倒置显微镜下观察细胞形态。分别在接种后的第1、2、3、4、5、6d进行细胞数量(以吸光度值表示)检测，培养7d后，检测细胞数量和细胞活率。
实验结果：按照上述方法可有效去除软骨细胞等非髓核细胞，得到大数量的髓核细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏。
培养第2d，髓核细胞逐渐贴壁生长增殖,并由组织块向四周蔓延；髓核细胞分裂增殖活跃，于培养第5d已形成较大的集落,培养第7d时细胞可达95％。图3为倒置显微镜下本实施例分离培养的原代髓核细胞形态，由图3可知，培养的细胞形态呈短梭形或多边形，胞质内可见散在深色颗粒，细胞核较大形态明显，符合髓核细胞光学显微镜下的形态特征；细胞增殖曲线见图4。
实施例3
实验方法：手术无菌摘取髓核组织置于生理盐水中，冲洗数次，直至无明显血迹为止，小心分离软骨等组织。加入1ml 0.25％胰蛋白酶，使胰蛋白酶的含量为0.1U/每mL组织，用无菌手术剪将髓核组织剪碎约20分钟，剪成直径小于1mm大小。
将剪碎的髓核组织采用3ml无菌巴氏管移入50ml无菌离心管中，再向培养皿中加入消化液，使得弹性蛋白酶0.6U/每mL剪碎的髓核组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.6U/每mL剪碎的髓核组织、透明质酸酶0.3U/每mL剪碎的髓核组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.3U/每mL剪碎的髓核组织冲洗皿中剩余髓核组织，用巴氏管同样移入50ml无菌离心管中，37℃恒温水浴箱中消化1h，每10min震荡一次。消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后弃上清，再次加入消化液于离心管中，添加量为：弹性蛋白酶0.4U/每mL离心管中剩余组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.4U/每mL离心管中剩余组织、透明质酸酶0.2U/每mL离心管中剩余组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.2U/每mL离心管中剩余组织，置于37℃水浴锅中，消化1h，每10min混匀一次。消化完毕后，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。剩余沉淀组织用0.5倍体积的D′Hanks重悬离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后弃上清。用1ml枪头加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，直到看不到组织团块为止。将重悬的细胞悬液移入培养瓶中，重复加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液冲洗离心管后，同样移入培养瓶中，而后向培养瓶中加入0.6倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次。倒置显微镜下观察细胞形态。分别在接种后的第1、2、3、4、5、6d进行细胞数量(以吸光度值表示)检测，培养7d后，检测细胞数量和细胞活率。
实验结果：按照上述方法可有效去除软骨细胞等非髓核细胞，得到大数量的髓核细胞，并可进行细胞传代、冻存、复苏。
培养第2d，髓核细胞逐渐贴壁生长增殖,并由组织块向四周蔓延；髓核细胞分裂增殖活跃，于培养第5d已形成较大的集落,培养第7d时细胞可达95％。图5为倒置显微镜下本实施例分离培养的原代髓核细胞形态，由图2可知，培养的细胞形态呈短梭形或多边形，胞质内可见散在深色颗粒，细胞核较大形态明显，符合髓核细胞光学显微镜下的形态特征；细胞增殖曲线见图6。
对比例1
实验方法：手术无菌摘取髓核组织置于生理盐水中，冲洗数次，直至无明显血迹为止，小心分离软骨等组织。加入1ml 0.25％胰蛋白酶，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL髓核组织，用无菌手术剪将髓核组织剪碎约20分钟，剪成直径小于1mm大小。
将剪碎的髓核组织采用3ml无菌巴氏管移入50ml无菌离心管中，再向培养皿中加入2.5ml 0.25％胰蛋白酶，胰蛋白酶1U/每mL剪碎的髓核组织，冲洗皿中剩余髓核组织，用巴氏管同样移入50ml无菌离心管中。37℃恒温水浴箱中消化20min，每5min震荡一次。消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后弃上清，加入0.2％Ⅱ型胶原酶溶液(Ⅱ型胶原蛋白酶0.8U/每mL离心管中剩余组织)于离心管中，置于37℃水浴锅中，消化3h，每30min混匀一次。消化完毕后，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。剩余沉淀组织用0.2倍体积的D′Hanks重悬离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后弃上清。用1ml枪头加入1ml含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，直到看不到组织团块为止。将重悬的细胞悬液移入培养瓶中，重复加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液冲洗离心管后，同样移入培养瓶中，而后向培养瓶中加入0.6倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次。分别在接种后的第1、2、3、4、5、6d进行细胞数量(以吸光度值表示)检测，培养7d后，检测细胞数量和细胞活率。
对比例2
实验方法：手术无菌摘取髓核组织置于生理盐水中，冲洗数次，直至无明显血迹为止，小心分离软骨等组织。加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL髓核组织，用无菌手术剪将髓核组织剪碎约20分钟，剪成直径小于1mm大小。
将剪碎的髓核组织采用3ml无菌巴氏管移入50ml无菌离心管中，再向培养皿中加入消化液，使得胰蛋白酶0.5U/每mL剪碎的髓核组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.5U/每mL剪碎的髓核组织、透明质酸酶0.2U/每mL剪碎的髓核组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.2U/每mL剪碎的髓核组织，冲洗皿中剩余髓核组织，用巴氏管同样移入50ml无菌离心管中，37℃恒温水浴箱中消化30min，每10min震荡一次。消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后弃上清，再次加入消化液于离心管中，添加量为：胰蛋白酶0.5U/每mL离心管中剩余组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.5U/每mL离心管中剩余组织组织、透明质酸酶0.2U/每mL离心管中剩余组织组织、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶0.2U/每mL离心管中剩余组织组织，置于37℃水浴锅中，消化1h，每10min混匀一次。消化完毕后，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。剩余沉淀组织用0.5倍体积的D′Hanks重悬离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后弃上清。用1ml枪头加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，直到看不到组织团块为止。将重悬的细胞悬液移入培养瓶中，重复加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液冲洗离心管后，同样移入培养瓶中，而后向培养瓶中加入0.6倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次。分别在接种后的第1、2、3、4、5、6d进行细胞数量(以吸光度值表示)检测，培养7d后，检测细胞数量和细胞活率。
对比例3
实验方法：手术无菌摘取髓核组织置于生理盐水中，冲洗数次，直至无明显血迹为止，小心分离软骨等组织。加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶的含量为0.2U/每mL组织，用无菌手术剪将髓核组织剪碎约20分钟，剪成直径小于1mm大小。
将剪碎的髓核组织采用3ml无菌巴氏管移入50ml无菌离心管中，再向培养皿中加入消化液，使得弹性蛋白酶0.5U/每mL剪碎的髓核组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.5U/每mL剪碎的髓核组织，冲洗皿中剩余髓核组织，用巴氏管同样移入50ml无菌离心管中，37℃恒温水浴箱中消化30min，每10min震荡一次。消化结束后，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min。离心后弃上清，再次加入消化液于离心管中，添加量为：弹性蛋白酶0.5U/每mL离心管中剩余组织、Ⅱ型胶原蛋白酶0.5U/每mL离心管中剩余组织，置于37℃水浴锅中，消化1h，每10min混匀一次。消化完毕后，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液，置于离心机中离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后去上清。剩余沉淀组织用0.5倍体积的D′Hanks重悬离心，离心转速为1500rpm，离心时间5min，离心后弃上清。用1ml枪头加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，直到看不到组织团块为止。将重悬的细胞悬液移入培养瓶中，重复加入0.2倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液冲洗离心管后，同样移入培养瓶中，而后向培养瓶中加入0.6倍体积的含10％FBS(Gibco)的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，每3天换液1次。分别在接种后的第1、2、3、4、5、6d进行细胞数量(以吸光度值表示)检测，培养7d后，检测细胞数量和细胞活率。
对比例1为传统分离髓核原代细胞的方法，由表1可得，其细胞增殖数量和细胞活率明显低于实施例1～3；细胞增殖曲线见图2。
对比例2的消化步骤的消化液中，没有采用弹性蛋白，而是采用胰蛋白进行消化，虽然得到的细胞总数比较多，但是细胞活率显著低于实施例1～3，说明采用胰蛋白进行长时间的消化，会损害细胞；细胞增殖曲线见图4。
对比例3的消化步骤的消化液中，没有采用糖苷酶，虽然对细胞活率的影响不是很大，但是增殖的细胞数量明显低于实施例1～3；细胞增殖曲线见图6。
表1细胞增殖数量与细胞活率
培养7d后所得细胞数 细胞活率
实施例1 5.82×10<sup>6</sup> 99.15％
实施例2 5.24×10<sup>6</sup> 98.32％
实施例3 5.45×10<sup>6</sup> 99.04％
对比例1 2.45×10<sup>5</sup> 80.35％
对比例2 1.20×10<sup>6</sup> 75.35％
对比例3 2.10×10<sup>5</sup> 99.05％
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高效分离髓核原代细胞的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
消化步骤：该步骤采用的消化液的活性成分包括弹性蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶和糖苷酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，具体的方法步骤包括：
冲洗步骤；
剪碎步骤；
消化步骤；
收集步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述冲洗步骤的具体方法包括：
取人体新鲜椎间盘髓核组织，用生理盐水清洗数次，直至残留血液漂洗干净。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述剪碎步骤的具体方法包括：
加入胰蛋白酶，采用无菌剪刀剪碎髓核组织；
进一步的，采用无菌剪刀进行髓核组织剪碎需要15～20min；
进一步的，剪碎后的髓核组织直径不大于1mm。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述消化液的组成为：弹性蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白酶和糖苷酶；其中，添加量为：1mL剪碎的髓核组织中，弹性蛋白酶0.1～1U，Ⅱ型胶原蛋白酶0.1～1U，糖苷酶0.1～1U；
进一步的，所述糖苷酶为内切糖苷酶和外切糖苷酶组成，所述内切糖苷酶为透明质酸酶，所述外切糖苷酶为β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述消化步骤中，消化温度为室温，消化时间为1.5～3h；进一步的，消化温度为37℃。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述消化步骤的具体方法为：向剪碎的髓核组织中加入消化液，消化结束后，过滤除菌，将收集的滤液离心去上清，剩余组织用D-Hanks平衡盐溶液洗后重悬离心。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述消化步骤的具体方法为：向剪碎的髓核组织中加入消化液，消化结束后，离心去上清；再次将剩余组织重复消化步骤，过滤除菌，将收集的滤液离心去上清，剩余组织用D-Hanks平衡盐溶液洗后重悬离心；
进一步的，采用70um无菌筛网过滤除菌，收集滤液。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述消化步骤中，每5～20min摇动或震荡一次；
进一步的，所述收集步骤中，将消化步骤中离心后的沉淀去上清，用含胎牛血清的DMEM培养液重悬髓核细胞沉淀，移入培养瓶中，得到高活力髓核原代细胞。
10.一种组织剪碎装置，其特征是，包括组织剪碎皿，其包括皿体和皿盖，所述皿体为圆锥型漏斗体，下端封底。
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CN103215223A (zh) * 2013-03-18 2013-07-24 中国人民解放军第四军医大学 人椎间盘髓核细胞和免疫细胞相互作用的体外模型构建方法
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