CN108883272B

CN108883272B - 利用电刺激促进神经再生的方法

Info

Publication number: CN108883272B
Application number: CN201680074287.XA
Authority: CN
Inventors: 阿尔德希尔·巴亚特; 阿尼尔·塞巴斯蒂安
Original assignee: Oxford Bioelectronics Ltd
Current assignee: Anne Fried Royce
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: ES2925236T3; EP4085969A1; GB201518263D0; EP3362138A1; DK3362138T3; CA3001951A1; AU2016338997B2; WO2017064500A1; EP3362138B1; US20190217089A1; AU2016338997A1; CN108883272A

Abstract

本发明提供了一种促进患者受损神经的再支配的方法，包括在与神经损伤部位不同的位置对患者的皮肤进行电刺激。

Description

利用电刺激促进神经再生的方法

技术领域

本发明涉及利用电刺激促进神经再支配(nerve reinnervation)。

背景技术

皮肤创伤再支配涉及连续的调控事件，包括形态变化和生物化学变化导致神经发生、突触发生以及神经组织的进一步构成 ^1,2 。因此，传入的感觉神经纤维的再支配 ³ 发生在整个皮肤修复中，其特征为功能性神经肽的神经分化和合成 ⁴ 。这些神经肽表现出旁分泌信号转导 ⁵ ，其在一定程度上通过调节细胞增殖、生长因子和细胞因子产生以及新血管形成 ^6,7 ，从而促进愈合过程。神经再支配是维持完整表皮的主要原因 ⁸ 。某些神经纤维自由地终止于真皮中 ⁹ ，而在许多其他情况下，尽管中心主干终止于真皮中，但随后的分支却延伸至整个表皮 ¹⁰ 。然而，表皮组分的神经再支配仍然没有被充分表征。已经提出了几种用于增强神经再支配的涉及细胞因子/神经营养因子相互作用的假说，实际上，它们中的大多数仅考虑了多阶段愈合过程的炎症方面 ⁸ 。另外，在修复期间的神经/神经相关分化蛋白的空间和时间表达的证据不足。

神经分化的特征为早期的神经突生长 ¹¹ ，其促进神经再支配。用于神经分化的生物标志物从有丝分裂纺锤体组件 ¹² 延伸到脂膜结构域 ¹³ 。虽然已将微管蛋白-III类β-微管蛋白(TUBB3)归类为神经特异性分化标志物 ¹⁴ ，并且已将其用于指示组织再生中的神经再支配 ¹⁵ ，但最近已报道其在较小的程度上与多种细胞类型有关 ¹⁶ 。因子诱导的基因4(FIG4)是神经分化期间的另一种介质 ¹⁷，其为质膜中合成磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PI(3,4,5)P₃或PIP₃)的关键组分。有趣的是，还表明诸如神经生长因子(NGF)之类的神经分化启动子可以在表皮黑素细胞 ¹⁸ 和Merkel细胞 ¹⁹ 中调节基因表达。

在基于细胞的修饰 ^20,21 或基于底物的修饰 ^22,23 的帮助下，已表明电刺激(ES)是一种促进神经分化事件的体外模型。在这种情况下，先前的报道已经表明ES和神经分化是神经突生长、神经元微管蛋白诱导、鸡胚胎 ²⁴ 和大鼠 ²⁵ 中的神经丝200和c-fos基因表达的结果，然而，在人的修复过程中很少有信息可用。重要的是，已表明ES可以促进皮肤创伤修复 ^26,27 。最近，我们证实了ES对人体皮肤愈合的促进作用，该愈合伴随增加的血管生成 ²⁸ 和增加的表皮细胞再生速率 ²⁹ 。外源施用ES的基本原理为模拟体内生物电系统，从而增加促进修复的内源性创伤电流。然而，ES对愈合过程和关键靶细胞群的影响机制仍然尚未明确 ¹¹ 。

发明内容

本发明人已经令人惊讶地表明，通过在与神经损伤部位不同的位置对患者的皮肤进行电刺激，可以促进患者受损神经的再支配。特别地，发明人已经令人惊讶地表明，即使在距离损伤部位足够远处施加电刺激，使得电信号或脉冲不会由皮肤传导至损伤部位，也可以促进患者受损神经的再支配。

因此，本发明提供了一种促进患者受损神经的再支配的方法，该方法包括在与神经损伤部位不同的位置对患者的皮肤进行电刺激。

本发明还提供了：

多个电子在促进患者受损神经的再支配的方法中的应用，其中多个电子在与神经损伤部位不同的位置被施用于患者的皮肤；

一种物质或组合物在促进患者受损神经的再支配的方法中的应用，其中所述方法包括将物质或组合物施用于患者，同时在不同于神经损伤部位的位置对患者皮肤进行电刺激；以及

一种套件，其用于促进患者受损神经的再支配，其中所述套件包括(a)能够对患者的皮肤进行电刺激的装置和(b)促进神经再支配的支架、促进神经再支配的移植物、促进神经再支配的细胞群或促进神经再支配的药物。

附图简要说明

图1至13显示了表明在对患者的皮肤进行电刺激之后，创伤中神经再支配的临床结果。

序列表说明

SEQ ID NO：1示出了人网状蛋白-4同工型A的mRNA序列。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/47519458

SEQ ID NO：2示出了人网状蛋白-4同工型A的氨基酸序列。加下划线处为Nogo-66的序列。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/47519458

SEQ ID NO：3示出了人Nogo-66受体-1(NGRH1)的mRNA序列。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF532858.1

SEQ ID NO：4示出了人Nogo-66受体-1(NGRH1)的序列的氨基酸序列。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF532858.1

SEQ ID NO：5示出了人Nogo-66受体-2(NGRH2)的mRNA序列。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF532859.1

SEQ ID NO：6示出了人Nogo-66受体-2(NGRH2)的氨基酸序列。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF532859.1

SEQ ID NO：7至22为实施例中使用的引物。

实施方案详述

应该理解的是，可以根据本领域的特定需求而调整所公开的产品和方法的不同应用。还应该理解的是，本文中使用的术语仅出于描述本发明的具体实施方案的目的，而并非旨在限制本发明。

此外，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，某一名词前所用的“一种(a)”、“一个(the)”、“该”、“所述”或未指明数量的表述包括所指对象多于一个的情况，除非所述内容明确表示为其它含义。因此，(例如)提及“患者”包括两个或更多个这样的患者，提及“部位”包括两个或更多个这样的部位，提及“位置”包括两个或更多个这样的位置，提及“物质”包括两种或更多种这样的物质，提及“组合物”包括两种或更多种这样的组合物等。

将本文引用的所有出版物、专利和专利申请(无论在上文还是在下文中)通过引用全部并入本文。

神经再支配

本发明的方法涉及促进受损神经的再支配。此处，术语神经和神经元可以互换，因此该方法可以涉及促进受损神经元的再支配。可以以任意方式损伤该神经，如由受伤如伤口引起，或由疾病或病症如皮肤疾病或皮肤病症引起。该神经可以受到任意程度的损伤。例如，该神经可以被切断。

该神经可以为有髓鞘的。该神经可以为无髓鞘的。

受损神经可以在患者的任意部位。该神经可以存在于中枢神经系统(CNS)中，即位于中枢或为中枢神经。该神经可以是位于中枢的脑神经或脊神经。CNS神经通常为无髓鞘的。如果受损神经位于CNS中，则根据本发明对皮肤进行电刺激固有地涉及在与神经损伤部位不同的位置进行电刺激。

在一个实施方案中，该神经存在于周围神经系统(PNS)中，即为周围神经。PNS神经可以为有髓鞘的或无髓鞘的。在一个实施方案中，受损神经位于患者的皮肤中。在一个实施方案中，神经损伤部位位于患者的皮肤中。在一个实施方案中，受损神经在受损之前支配患者的皮肤。在这种情况下，该方法涉及在与神经损伤部位不同的位置对患者的皮肤进行电刺激。下文更详细地论述损伤位置和刺激位置之间的合适距离。

皮肤通常包含(a)表皮、(b)真皮和(c)皮下组织。受损神经或损伤部位可以存在于任意的这些部分或它们的任意组合中，如(a)；(b)；(c)；(a)和(b)；(a)和(c)；(b)和(c)；或(a)、(b)和(c)。根据本发明的一个实施方案，通常对表皮进行电刺激。

神经再支配是使已经失去该神经的机体的一部分恢复神经分布。治疗通常使损伤部位受损神经的分布恢复。治疗可有助于治愈损伤，如伤口或由疾病或病症损伤的部位。治疗可以恢复患者皮肤的受损神经的神经支配。

治疗可有助于部分地恢复损伤部位受损神经的分布。治疗可以在部分地恢复患者皮肤的受损神经的神经支配。例如，可以使损伤部位或患者皮肤的受损神经的分布恢复到至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。治疗可以使患者皮肤的受损神经的神经支配完全恢复。治疗可以使患者皮肤的受损神经的神经支配完全恢复。可以使用诸如实施例中所描述的那些技术之类的常规技术来测定神经的神经支配。可以使用III类β-微管蛋白(TUBB3)和因子诱导的基因4(FIG4)在受损神经部位的增加的表达来测定测量神经再支配，这在下文更详细地论述。

患者

根据本发明可以治疗任意患者。患者通常是人。然而，患者可以是另一种哺乳动物，例如商业养殖的动物(如马、牛、羊、鱼、鸡或猪)、实验动物(如小鼠或大鼠)或者宠物(如豚鼠、仓鼠、兔子、猫或狗)。

人类患者可以是任意年龄的人。

患者可以被诊断为神经受损，即已知有受损神经。在一个实施方案中，患者典型地表现出皮肤中神经受损的症状。患者可以疑似具有神经受损。患者可以有损伤，如伤口或者疾病或病症，在一个实施方案中为皮肤疾病或病症。

电刺激

可以以任意方式对患者的皮肤进行电刺激。可以使用AC信号，或者信号可以是脉冲信号。可以通过脉冲波形来调制AC信号。

通常使用一系列信号或脉冲对皮肤进行电刺激。通常使用一系列交流(AC)信号或脉冲对皮肤进行电刺激。通常以特定的波形提供信号或脉冲。在本发明中可以使用任意波形。在一个实施方案中，使用模拟神经冲动波形、非对称波形或双相波形对皮肤进行电刺激。可以使用再生波形对皮肤进行电刺激。在一个实施方案中，使用简并波形对皮肤进行电刺激。这在下文更详细地论述。

在一个实施方案中，使用约0.001毫安(mA)至0.006mA(如约0.002mA至约0.005mA或者约0.003mA至约0.004mA)的电流对患者的皮肤进行电刺激。在一个实施方案中，使用约0.004mA的电流对皮肤进行电刺激。

在一个实施方案中，使用约10伏(V)至约100V(如约15V至约90V或者约20V至约80V)的振幅对患者的皮肤进行电刺激。

在一个实施方案中，使用约15赫兹(Hz)至约351Hz(如50Hz至约300Hz、约80Hz至约250Hz或者约100Hz至约200Hz)的频率对患者的皮肤进行电刺激。在一个实施方案中，使用约120Hz至约180Hz的频率对患者的皮肤进行电刺激。在一个实施方案中，使用以约150Hz为中心的频率对患者的皮肤进行电刺激。

在一个实施方案中，使用约15Hz至约351Hz(或以上公开的任意范围)的波动频率周期对患者的皮肤进行电刺激，其中频率在约1秒至约20秒(如约3秒至约15秒或者约5秒至约10秒)的周期内变化。在一个实施方案中，使用约15Hz至约351Hz(或以上公开的任意范围)的波动频率周期对患者的皮肤进行电刺激，其中频率在约8秒的周期内变化。出于下文所述的原因，在一个实施方案中，在特定治疗周期结束时使用波动频率周期。在一个实施方案中，方法包括在一轮治疗结束时执行一个或多个波动频率周期，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个波动频率周期。

可以以间断的周期对患者的皮肤进行电刺激。在一个实施方案中，间断的周期包括其中振幅在一段时间(如约0.5秒或1秒)内下降到其最小值，并且振幅在不同的时长(通常更长)处于其适当的量(如上述的量)，在一个实施方案中，振幅在两倍的时长(如约1秒或者约2秒)处于其适当的量。

在一个实施方案中，使用一系列信号或脉冲对患者的皮肤进行电刺激，其持续约1微秒(μs)至约800μs，如2μs至约700μs、约5μs至约600μs、约10μs至约500μs、约20μs至约300μs、约30μs至约200μs或者约50μs至约100μs。在一个实施方案中，使用一系列持续约1微秒(μs)至约100μs的信号或脉冲对患者的皮肤进行电刺激。在一个实施方案中，使用一系列持续约60μs的信号或脉冲对患者的皮肤进行电刺激。

电刺激的位置

在本发明的方法中，可以对皮肤的任意部分(或皮肤上的任意位置)进行电刺激，只要在与神经损伤部位不同的位置即可。在一个实施方案中，该不同的位置距离神经损伤部位足够远，使得电信号或脉冲不会由皮肤传导至损伤部位。在一个实施方案中，该不同的位置距离损伤部位至少约1.0mm，如至少约1.5mm、至少约2.0mm、至少约2.5mm、至少约3.0mm、至少约3.5mm、至少约4.0mm、至少约4.5mm、至少约5.0mm、至少约10mm、至少约20mm、至少约30mm、至少约40mm、至少约50mm或至少约100mm。该不同的位置可远离损伤部位，如距离损伤部位至少约15厘米(cm)、至少约20cm、至少约30cm或至少约50cm。在一个实施方案中，将电刺激施加在与神经损伤部位相同的肢体或身体部份上，以便将电刺激施加于接近的区域但又距离损伤部位足够远，使得电信号或脉冲不会由皮肤传导至损伤部位。

如下文更详细地论述的，可以对皮肤的不同位置内的特定部位进行电刺激。

持续时间

可以对患者的皮肤进行任意时间长度的电刺激。在一个实施方案中，时间长度范围为约5秒至约1小时、约10秒至约50分钟、约1分钟至约40分钟或者约15分钟至约30分钟。如下文更详细地论述的，对皮肤的电刺激可以涉及测量皮肤阻抗的变化率。可以进行治疗直到患者皮肤的阻抗变化率为零。

治疗次数

患者可以接受任意次数的不同轮次的治疗(即不同轮次的电刺激)，如约5轮、约10轮、约12轮、约15轮或者约20轮治疗。患者可以在前两周内接受约1轮至约10轮的治疗。

对于(a)所使用的电刺激、(b)治疗的部位和/或位置以及(c)治疗的持续时间，不同轮次的治疗可以是相同的，或者可以基于(a)至(c)中的一项或多项而不同，如(a)；(b)；(c)；(a)和(b)；(a)和(c)；(b)和(c)；或(a)、(b)和(c)。

不同轮次的治疗可以延续任意时间长度，如约一周、约一个月或者约一年。患者的治疗可以持续进行，直到受损部位有任意数量的神经分布恢复。患者的治疗可以持续进行，直到受损神经成功地神经再支配。

简并波形

在一个实施方案中，使用简并波形对患者的皮肤进行电刺激。这样的波形可以为双相的和非对称的。在一个实施方案中，可以通过由锯齿波形调制的AC正弦波形来表示合适的波形，从而提供衰减的AC信号的脉冲。在WO2015/118061的图8至13中示出了这样的波形。

可以通过检测皮肤的电阻抗并相应地自动调节电刺激来对皮肤进行电刺激。如下文更详细地论述的，在一个实施方案中，电刺激涉及测量皮肤的阻抗和/或皮肤阻抗的变化率。皮肤的凹痕可以在用于电刺激的装置的电极之间形成桥接，并由此形成“开路”电路的最终部分，使得皮肤电特性的变化改变输出电路中的流量。

在一个实施方案中，本发明的方法包括，在治疗之前，对患者皮肤上的特定位置的若干个部位进行电刺激，并且测量在各部位处的皮肤的阻抗和/或皮肤的阻抗变化率。根据本发明的一个实施方案，之后可以进一步对阻抗最高(或最大)的和/或阻抗变化率最大的皮肤的部位进行电刺激，例如使用如上文描述的一个或多个波动频率周期。用于监视皮肤阻抗变化的电刺激可以为上述任意电刺激。

本发明的一个实施方案的方法包括，在治疗之前，对患者皮肤上的特定位置的若干个部位进行电刺激，并且监视以下方面中的任何变化：(i)皮肤的摩擦、(ii)患者的感觉、(iii)皮肤的颜色或(iv)它们的任意组合，如(i)；(ii)；(iii)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(ii)和(iii)；或(i)、(ii)和(iii)。根据本发明的一个实施方案，之后进一步对(i)至(iv)中显示出任何变化的或(i)至(iv)中变化最显著的皮肤的部位进行电刺激，例如使用如上文描述的一个或多个波动频率周期。用于监视(i)至(iv)中的变化的电刺激可以为上述任意电刺激。

各部位可以为任意形状，如圆形、正方形或矩形，也可能为其他形状。各部位可以为任意尺寸，如约1cm²至约20cm²、约2cm²至约15cm²或者约5cm²至约10cm²。

电生物反馈(EBF)或神经生物反馈(NBF)

皮肤的电刺激通常导致患者身体自身的自我修复系统的刺激调节。身体自身的自我修复系统的刺激调节用于使受损神经进行神经再支配。换句话说，皮肤的电刺激可以刺激患者自身使受损神经进行神经再支配。这可以被称为电生物反馈(EBF)或神经生物反馈(NBF)。

不希望受任何理论的束缚，假定EBF/NBF通过神经纤维，尤其是无髓鞘的c-纤维，在皮肤细胞和中枢神经系统之间进行“对话”，这很可能是由于皮肤细胞和神经细胞具有共同祖先，它们在胚胎学上均来源于神经外胚层。可以假定，可以将皮肤看作是“外周脑”受体和发射器，通过它可以发起并显示与中枢神经系统的对话。身体内的变化(如病理变化)，可能导致皮肤阻抗改变，其可能发生在(例如)患病器官的部位上，或者可能甚至本身表现在皮肤的明显不相关的区域。因此，可以通过皮肤的电刺激(如下文更详细地论述的，例如使用作为“药理物质”的多个电子)来处理中枢神经系统中的特定中枢，例如脊柱。基本上使身体“发起”，以进行自我修复和愈合的过程，并且当电刺激施加到正确的部位时，启动身体的自我修复系统。在这种情况下，应该指出的是，对于身体的自我修复系统(可以说是身体的“工作部门”)，炎症(伴随着疼痛)是身体的“寻求关注者(attention seeker)”之一。启动皮肤细胞与CNS之间的对话可能会导致CNS的警惕，继而导致身体自我修复系统的资源分配。电刺激可以确保以正确的(即，合适的)方式进行这种资源分配，从而使得炎症减轻，同时伴随着这种修复的启动和成功完成。

同样地，不希望受任何理论的束缚，据认为当电刺激施用于皮肤时，由电刺激提供的药理效果潜在的生理过程如下。如上所述，电刺激可以经由基于对皮肤阻抗的反应的生物反馈系统而起作用。信号或脉冲通常持续时间短(典型地，为约1μs至约100μs，在一个实施方案中为约60μs)并且振幅比较高(为约10V至约100V，在一个实施方案中为约80V)。使用设备屏幕上示出的系列(series)或脉冲的特定测量参数、通过仔细观察来严格控制其影响。由于脉冲持续时间短，该信号的能量极小，并且几乎不可能产生有害作用。

下文更详细地论述适用于本发明的实施方案的方法的设备。所述设备通常能够检测(两个电极之间，(例如)同心矩形电极之间)“可能区”中的最低皮肤阻抗区域，并且由数值读出来指示它们。通常通过皮肤的低阻抗点来发起对话，其中的生物反馈相对更活跃(因而更加有效)，尤其是通过受过训练的医师对此对话的观察来引导该对话。如本文所用，术语“生物反馈”通常是指皮肤对电刺激的施加的响应度，例如通过皮肤阻抗的变化率所测量的响应度。“生物反馈”在皮肤阻抗变化率高于相邻部位的那些部位中是“活跃的”。“生物反馈”的其他指标包括患者的皮肤发红、皮肤摩擦、皮肤感觉以及如上所述的其他可检测的参数。

经由神经末梢，来自电刺激的传入脉冲在脊髓前角进入中枢神经系统(CNS)。利用该脉冲来刺激有髓鞘神经和无髓鞘神经这二者。由于数量优势，大多数对话通过c-纤维发生。脉冲通常沿着背面和腹面脊髓丘脑束、背面和腹面脊髓小脑束和脊髓顶盖束而传导。存在通过网状小脑纤维和脑桥被盖作出的贡献。据认为，电刺激系统的一些促进作用是由网状结构的这部分来转达。Anohin证实了网状结构通信超出脑干而继续进行到皮层，并且对皮层响应产生相关联的影响。传出信号通常经由脊髓皮质束而下行。通常，一个以上的节段层级(segmental level)同时受到影响。这可能导致在治疗明显无关的现病史时，“意外地”从旧病理中恢复。

该影响经由不同的神经递质，而改变涉及反射弧和自主调节的显性病灶的信号，并伴随末端影响以及自主系统和外周系统的传出冲动的改变。这些响应的程度反过来由较高的皮质和脑桥的对下部脊柱系统不稳定性的影响来调整。可以通过电刺激对由于未解决或未完全解决的病理问题而可能存在多年的脊髓病灶进行重新刺激，从而“正常的”通路可以使“停滞的”的解决过程重新开始。这些病灶的“显性层级”在脊髓中占优势。这种层级结构可能与特定疾病的相对生存优势或历史性病理症状有关。Fushpan和Potter(在20世纪50年代)证明了在化学刺激中占优势的突触和在电刺激中占优势的突触之间的突触响应的可变性。许多病症涉及突触传递的扰乱化学作用。其中一些作用成为长期存在的“锁定”过程(例如帕金森病)。电刺激活动可以帮助打破慢性周期，从而允许重新建立先前“健康”的突触活动模式。

电刺激影响可能以分子极化和局部血管舒缩作用的形式产生小的局部效应(即对受损神经的作用)；伴随对局部的梯度电势的一些可能的影响。通过释放神经肽来转达局部的影响。

电刺激的大多数有益影响是通过来自CNS的传出神经进行的。在节段层级上，有时也存在通过递质在进入侧面脊髓丘脑束入口部位的饱和而对疼痛传导通路的影响，尤其是存在明显的A纤维介入的时候。

电刺激信号作用于两个局部反射弧(也影响交感链)，同时伴随有它们对内脏、血管和肌肉的作用；以及经由用于更高连接的上行束而进入CNS，这将导致通常的神经肽释放(带有所产生的对通常的内环境稳定的作用)、内分泌物释放、副交感的影响以及沿着皮质脊髓束下行至相关层级的传出信号。以这种形式的电刺激进行疾病控制和疼痛的过程主要经由CNS中的下行冲动而转达至用于后续外围“局部”神经肽释放的适当层级。通过自主神经系统、经由局部效应和普通生理机能两者来影响进一步的转达。

在一轮治疗结束时，可以选择“频率调制”方案。上文按照波动频率周期来论述这一点。在这个过程中，可以要求设备输出信号在如上所述的频率范围内循环，如在约8秒周期中从约15Hz至约351Hz。据认为，这个过程的主要价值基于以下事实：在皮肤上的特定点处的生物反馈治疗的“结束”导致作为特定通信环路的一部分的波浪脉冲经由反射弧或者脊髓-大脑路径延伸。这种“占优势的”通信是愈合刺激的更重要的部分。但仍有其他相关的通信途径，它们是病灶进程的附属，或者与先前的病理有关联，这些病理受占优势的过程的影响。这些附属途径可能在不同的频率下起作用，并且在生物反馈过程中，不能同时通过主要波形对它们进行处理。同样，不希望受到任何理论的束缚，据认为通过贯穿频率范围的循环，到达了这些其他的附属网络。

本发明的一个实施方案还提供了一种通过患者皮肤促进患者的受损神经的再支配的方法，包括以下步骤：(a)在与神经损伤部位不同的位置对患者的皮肤进行电刺激；(b)检测皮肤阻抗的变化并产生代表皮肤阻抗的输出信号；(c)监测皮肤的响应度；和(d)首先指示何时达到预定水平的响应度，其次指示何时已施用预定治疗。

本发明的一个实施方案还提供了一种通过患者皮肤促进患者的受损神经的再支配的方法，包括以下步骤：(a)放置一对电极，使其在与神经损伤部位不同的位置与皮肤相接触；(b)通过电极对患者的皮肤进行电刺激；(c)检测皮肤阻抗的变化并产生代表皮肤阻抗的输出信号；(d)监测皮肤的响应度；和(e)首先指示何时到达预定响应度水平，其次指示何时执行了预定治疗。

在如上所述的可替代的方法中，在指定的位置(即部位)按顺序对皮肤进行电刺激。例如通过测量皮肤阻抗和它的变化率，来测量并记录皮肤生物反馈。对于多个相邻的部位进行该测量，通过电刺激以相同的初始持续时间和相同的初始振幅对这样的部位进行约30秒至约5分钟的确定时间段的进一步治疗，并且任选地直至皮肤阻抗不再变化，所述部位为生物反馈最强(如皮肤阻抗变化率最大)的部位或皮肤阻抗的局部差异最大的部位或皮肤阻抗变化率高于相邻部位的部位。这有时也被称为“数值技术”，而不是这个术语必然意味着采取了严格的定量方法。例如，所使用的设备的用户界面不必是字面意义上的数字；如果这样的用户界面能够定性地比较不同部位的皮肤阻抗或皮肤阻抗变化率，就足够了。

设备

通常使用具有电极的设备对皮肤进行电刺激。可以使用本领域已知的任意设备。在一个实施方案中，设备为低强度设备。在一个实施方案中，设备产生一系列交流(AC)信号或脉冲。通常以特定的波形产生信号或脉冲。在本发明中可以使用任意波形。在一个实施方案中，设备产生模拟神经冲动波形、非对称波形或双相波形。在一个实施方案中，设备产生简并波形。在一个实施方案中，设备检测皮肤的电阻抗并相应地自动调整其输出。

作为局部状态和一般性状态二者的结果而发生的皮肤阻抗变化可以(例如)在设备上用数值示出，并且影响来自该设备的下一个输出信号。或者，也可以由设备通过可听的或其他可检测的信号，或者可听的和可视的信号这两者，来表示皮肤阻抗变化。此外，可以在设备的屏幕上用数值示出皮肤和设备之间的信号交换的若干其他方面(振幅、速率、梯度、速度等)，或者可以由可听的或其他可检测的信号来表示。这些数字中的一些使用数学算法以便能够产生对电刺激对话的最佳可能的使用。医师可以将这些数值或其他表示用于通过多种方案来指导治疗过程。其目的是将锁定或被扰乱的CNS病灶引导到恢复状态；由此引发或重新激发正常的修复过程；在中枢和在局部均可。由于交换过程的强CNS(相对于局部)成分，因此可以同时影响源自先前病理状态的“旧”病灶，从而导致意外地最终解决过去的疾病状态。

例如，在WO 2005/118061中已经描述了适合用于本发明的实施方案中的设备，将WO 2005/118061的公开内容通过引用全部并入本文。这种设备包括(例如)一对电极，用于与皮肤相接触；波形发生器，用于重复产生AC波形，以便通过电极向皮肤施加电脉冲；检测器，用于检测皮肤阻抗的改变，并用于产生表示皮肤阻抗的输出信号；响应来自检测器的输出信号以便监测皮肤的响应度的部件；以及指示器部件，用于在达到预定响应度水平时产生第一指示，而在执行了预定治疗时产生第二指示。在该设备中，作为局部状态和一般性状态二者的结果而发生的皮肤阻抗变化在设备的屏幕上用数值示出，并且影响来自该设备的下一个输出信号。此外，可以在屏幕上用数值示出皮肤和治疗设备之间的信号交换的若干其他方面，如振幅、速率、梯度、速度等。这些数字中的一些使用数学算法以便能够产生对电刺激对话的最佳可能的使用。然后，医师可以将这些数值表示用于通过多种方案来指导治疗过程。其目的是将中枢神经系统中的锁定或被扰乱的中枢(这些中枢在本文中有时也被称为CNS病灶)引导到恢复状态，由此在中枢和在局部引发或重新激发正常的修复过程。由于对话交换过程的强CNS(相对于局部)成分，因此可以同时影响源自先前病理状态的“旧”病灶，从而还导致意外地解决过去的疾病状态。设备可以以手持式电池供电设备的形式体现。

在一个实施方案中，检测器部件以脉冲的形式产生输出信号，其持续时间表示皮肤阻抗；监视器部件测量各脉冲的持续时间t；并且指示部件被配置为当t满足t的预定函数时产生各指示。在一个实施方案中，指示部件被配置为当t₂＝4.087t₁ ^0.7131时产生第一指示，并且当dZ/bT＝0时产生第二指示，其中Z＝皮肤阻抗。如上所述，由手持式设备产生的电脉冲通常初始振幅高并且持续时间短。由此得到的治疗是非侵入性的，并且不会产生有害的副作用。

设备可以以手持式电池供电设备的形式体现。

可以使用任意设备对皮肤进行电刺激，其中输出信号取决于使电路完整的皮肤的电特性，无论施用的部位是由医师手动找到的，还是依靠电极阵列自动“发现”的，在电极阵列中，使用电子编程以评价电极对之间的对话，使得治疗的焦点可以以那些显示最佳响应的周围为目标。设备甚至可以为可穿戴设备。

可以以上文所述的任意方式使用设备。

联合治疗

可以将皮肤的电刺激与旨在使受损神经进行再支配的一种或多种其他疗法联合施用。联合意味着可以同时对患者进行多种治疗。作为相同治疗方案的一部分，可以将这些治疗分别地或按顺序(以两种顺序的任一者)施用于患者。例如，电刺激可以与旨在使受损神经进行再支配的另一种疗法联合使用。该另一种疗法可以为旨在治疗或改善患者状况的一般疗法。例如，可以将使用甲氨蝶呤、糖皮质激素、水杨酸盐、非甾体抗炎药(NSAID)、镇痛药、其他DMARDs、氨基水杨酸盐、皮质类固醇和/或免疫调节剂(例如，6-巯嘌呤和硫唑嘌呤)的治疗与电刺激联合。该另一种治疗可以为针对患者所遭受的损害或针对伤者的具体症状的特定治疗。在一个实施方案中，与电刺激联合使用的物质和组合物包含促进神经再支配的支架、促进神经再支配的移植物、促进神经再支配的细胞群或促进神经再支配的药物。这些在下文更详细地论述。在一个实施方案中，药物为Nogo-66信号转导抑制剂。

多个电子

本发明的一个实施方案还提供了多个电子，其用于促进患者的受损神经的再支配的方法，其中多个电子在与损伤部位不同的位置被施用于患者的皮肤。可以以上文所述的任意形式施用多个电子，例如，如上所述一系列信号或脉冲或波形。可以在上文所述的任意部位或位置施用多个电子。可以以上文所述的任意方式施用多个电子。

临床结果

使用如WO2005/118061中描述的用于将电刺激施加到患者手臂上的设备，在患者手臂的创伤处得到以下临床结果。将简并波形用于电刺激。

图1：与正常愈合的创伤相比，经ES治疗的创伤中神经再支配和神经肽合成更高。(a)在经ES治疗的创伤中，PGP9.5的qRT-PCR在第14天显示出上调。(b)正常皮肤(NS；第0天)、C14(自发愈合第14天)创伤和ES14(经电刺激的愈合第14天)创伤中的PGP9.5表达的IHC分析。(c)IHC显示，与C14创伤相比，在ES14创伤中PGP9.5⁺细胞增加约44％。(d)在ES14创伤中，PGP9.5的蛋白质印迹显示出上调。(e)正常皮肤中的物质P(SP)表达和第14天的SP表达的代表性图像。虚线将表皮与真皮分开。(f)IHC显示，与C14创伤相比，在ES14创伤中SP⁺细胞增加约34％。这也支持了通过ES使皮肤的神经再支配增强。(g)经ES之后，SP的蛋白质印迹也显示出上调。

正常愈合(对照)的创伤，

经ES治疗的创伤。比例尺为100μm。

表明统计显著性。

图2：在体内，经ES之后的愈合人体皮肤内的TUBB3表达增加。(a)ES14和正常的健康皮肤的微阵列分析显示TUBB3的上调。ES D14和正常D0分别为用ES治疗后第14天的创伤和正常的健康皮肤。(b)与正常愈合相比，经ES治疗的创伤在第10天和第14天分别显示TUBB3的qRT-PCR增加约70％和28％。(c)正常皮肤中的TUBB3蛋白表达。(d)创伤中心的TUBB3表达(第14天的愈合的代表性图像)。(e)C14创伤和(f)ES14创伤中的TUBB3表达。(g)与相应的正常愈合的创伤(C10和C14)相比，定量免疫组织化学分析显示ES10创伤和ES14创伤中的TUBB3⁺细胞分别多约67％和34％。(h)创伤的真皮层的TUBB3表达，尤其是染色新毛细血管(第14天的愈合的代表性图像)。(i)在第10天和第14天，TUBB3的蛋白质印迹。(j)TUBB3的蛋白质印迹的条带强度分析。EP为表皮，DER为真皮，DL为分化的表皮层，SB为基底层，NS为正常的健康皮肤(第0天)，

正常愈合(对照)的创伤，

经ES治疗的创伤。比例尺为100μm。

表明统计显著性。

图3：ES增加急性皮肤创伤中的FIG4表达。(a)与第14天的正常愈合相比，经ES治疗的创伤中FIG4的qRT-PCR显示增加约70％。(b)正常皮肤、C14创伤和ES14创伤中的FIG4蛋白的表达。(c)定量免疫组织化学分析显示，与相应的正常愈合的创伤(C10和C14)相比，ES10创伤和ES14创伤中的FIG4⁺细胞分别多约40％。(d)在第10天和第14天，FIG4的蛋白质印迹。(e)FIG4的蛋白质印迹的条带强度分析显示，与相应的正常愈合的创伤(C7和C14)相比，ES7和ES14分别增加约110％和约50％。NS为正常的健康皮肤(第0天)，

正常愈合(对照)的创伤，

经ES治疗的创伤。比例尺为100μm。

表明统计显著性。

图4：在体内，ES使愈合人体皮肤内的黑素细胞库扩大，并促进黑素生成。(a)愈合人体皮肤中gp100⁺细胞的定量分析。(b)TUBB3/gp100(合并的图像)的共表达显示出经ES14治疗的创伤的表皮中TUBB3⁺/gp100⁺细胞的上调。虚线将表皮与真皮分开。(c)愈合创伤中TUBB3⁺/gp100⁺细胞的定量结果。(d)主要在人体表皮的基底层细胞中观察到由Masson-Fontana组织化学法分析的黑素生成，在经ES治疗的创伤中，黑素生成上调。(e)通过Masson-Fontana组织化学法对黑素生成的定量分析。NS为正常的健康皮肤(第0天)，

正常愈合(对照)的创伤，

经ES治疗的创伤。比例尺为100μm。

表明统计显著性。

图5：在体内，ES上调愈合人体皮肤内的Merkel细胞中的TUBB3和PGP9.5的表达。(a)愈合人体皮肤中CK20⁺细胞的定量分析。(b)TUBB3/CK20(合并的图像)的共表达显示出ES14创伤的表皮中的TUBB3⁺/CK20⁺细胞的上调。(c)愈合创伤中TUBB3⁺/CK20⁺细胞的定量结果。(d)与PGP9.5/CK20(合并的图像)的共表达一同显示的神经再支配。(e)PGP9.5⁺/CK20⁺细胞的定量结果。ES14创伤显示出显著多于C14创伤的PGP9.5⁺/CK20⁺细胞的数量。NS为正常的健康皮肤(第0天)，

正常愈合(对照)的创伤，

经ES治疗的创伤。比例尺为100μm。虚线将表皮与真皮分开。

表明统计显著性。

图6：通过ES，黑素细胞和Merkel细胞的增殖未改变，并且NGF的表达上调。(a)与正常愈合的创伤相比，经ES治疗的创伤在第10天和第14天分别显示NGF的qRT-PCR增加约1.46倍和1.91倍。(b)正常皮肤、C14创伤和ES14创伤中的NGF蛋白质表达。(c)IHC的定量分析显示，与C10创伤和C14创伤相比，ES10创伤和ES14创伤中的NGF分别增加1.25和1.39倍。(d)正常皮肤和创伤愈合伤口中的NGF的蛋白质印迹分析。(e)蛋白质印迹的定量分析显示，与C14创伤相比，ES14创伤中的NGF上调。(f)经ES治疗的创伤和正常愈合的创伤中的上游神经再支配事件的示意图。经ES治疗的创伤中的神经营养因子(NGF)上调导致更高的趋化性以及神经/神经相关的细胞分化，这导致组织神经再支配的更高量级。NS为正常的健康皮肤(第0天)，

正常愈合(对照)的创伤，

经ES治疗的创伤。比例尺为100μm。

表明统计显著性。

图7：ES的施用增强人SHSY5Y成神经细胞瘤细胞的分化。(a)通过“视黄酸(RA)和脑源性神经营养因子(BDNF)”处理使成神经细胞瘤细胞分化，并且分化的细胞显示NeuN表达上调。NeuN是一种多磷酸化抗原，其核内浓度与染色质(DNA)成反比。(b)经RA+BDNF处理之后，FIG4也上调。(c)与经RA+BDNF处理相比，qRT-PCR在经RA+BDNF+ES处理之后显示FIG4表达上调。虚线代表未分化的SHSY5Y成神经细胞瘤细胞。(d)PIP₃合成途径的蛋白质印迹分析。(e)WB条带的定量结果表明经ES之后PI3KII和FIG4蛋白表达的显著增加。UDN为未分化的神经元，DN为分化的神经元。比例尺为50μm。

经RA+BDNF处理10天的细胞。

经RA+BDNF+ES处理6天的细胞。

经RA+BDNF+ES处理8天的细胞。

经RA+BDNF+ES处理10天的细胞。

未分化的神经元，

经RA+BDNF+ES处理的细胞，

经RA+BDNF处理的细胞。

表明统计显著性。

图8：ES增强经FIG4-siRNA处理之后的人SHSY5Y成神经细胞瘤细胞的分化。(a)在缺乏FIG4处理和经FIG4处理之后的情况下，LAMP2的表达指示在成神经细胞瘤细胞中的晚期胞内体的形成。LAMP2是晚期胞内涵体阶段的标志物，进一步导致液泡的形成。(b)与未暴露于ES的对照细胞相比，经FIG4 siRNA处理之后进行RA+BDNF+ES的细胞具有更多的NeuN表达。(c)与对照细胞相比，经ES处理之后，FIG4也上调。(d)与未暴露于ES的对照细胞相比，ES的细胞中LAMP2减少。(e)与未暴露于ES的细胞相比，在经FIG4 siRNA处理之后的RA+BDNF+ES中，mRNA表达显示更高的FIG4水平。虚线表示经FIG4 siRNA处理之后的未分化的SHSY5Y成神经细胞瘤细胞。(f)经FIG4 siRNA处理之后的PIP₃合成途径的蛋白质印迹分析。(g)与未暴露于ES的对照细胞相比，WB条带的定量结果表明经RA+BDNF+ES处理之后FIG4蛋白的表达显著增加。比例尺为50μm。

经FIG4 siRNA处理之后经RA+BDNF处理的细胞。

经FIG4 siRNA处理之后经RA+BDNF+ES处理的细胞。

经FIG4 siRNA处理的细胞，

经FIG4 siRNA处理之后经RA+BDNF+ES处理的细胞。

经FIG4 siRNA处理之后经RA+BDNF处理的细胞。

表明统计显著性。

图9：人体皮肤创伤中的PGP9.5(神经再支配分析)。(a)PGP9.5表达的IHC。在表皮中，最初在愈合第3天检测到较弱的PGP9.5信号，该信号在第14天变得更强。“C”表示自发愈合创伤，“ES”表示经电刺激愈合创伤。(b)PGP9.5的蛋白质印迹条带强度的定量结果显示，与C14创伤相比，ES14创伤中的蛋白质表达更高。“ES”表示电刺激愈合伤口。(b)PGP9.5的蛋白质印迹条带强度的定量结果显示，与C14创伤相比，ES14创伤中的蛋白质表达更高。关键之处如图1所示。

图10：人体皮肤创伤中的物质P(神经肽表达)。(a)SP表达的IHC。与PGP9.5表达类似，在愈合创伤的表皮中SP的表达直到第10天还很少。(b)SP的蛋白质印迹条带强度的定量结果显示，与C14创伤相比，ES14创伤中的蛋白质表达更高。关键之处如图1所示。

图11：愈合创伤中TUBB3表达的IHC图像。与正常的自发愈合相比，在经ES治疗的皮肤创伤中观察到TUBB3表达上调。在所有图像中，虚线将表皮与真皮分开。

图12：愈合创伤中FIG4表达的IHC图像。与正常的自发愈合相比，在经ES治疗的皮肤创伤中观察到TUBB3表达上调。在所有图像中，虚线将表皮与真皮分开。

图13：ES上调TUBB3表达并提高人体皮肤愈合中的黑素生成。(a)TUBB3/gp100的共表达显示出ES14创伤的表皮中TUBB3₊/gp100⁺细胞的上调。(b)由Masson-Fontana组织化学法分析的黑素生成显示出经ES之后愈合人体表皮的基底层细胞的上调。NS为正常皮肤(第0天)。比例尺为100μm。关键之处如图1所示。

图14：在人体皮肤创伤中经ES治疗之后的Merkel细胞中TUBB3和PGP9.5的表达上调。(a)在经过ES治疗的人体皮肤愈合中和正常愈合的创伤中TUBB3/CK20的共表达的IHC。(b)经ES治疗的创伤和正常愈合的创伤的PGP9.5/CK20共表达图像。NS为正常皮肤(第0天)。比例尺为100μm。

图15：人体皮肤愈合的正常愈合的创伤中的黑素细胞和Merkel细胞的增殖分析。(a)Ki67/gp100和(b)Ki67/CK20共表达分析显示经ES治疗的创伤与正常愈合的创伤之间的细胞增殖没有显著差异。NS为正常皮肤。比例尺为100μm。

图16：与人体皮肤中的正常愈合的创伤相比，在经ES治疗的创伤中NGF的表达上调。在愈合第10天和第14天的创伤中的NGF的IHC。在观察和进一步定量的所有其他愈合日(在10之前)中，NGF表达水平显著降低。比例尺为100μm。

图17：(a)PIP3合成途径。(b)用SIVA1 siRNA(5nM和10nM)转染SHSY5Y成神经细胞瘤细胞。转染后96小时，提取蛋白质并进行蛋白质印迹分析。在转染siRNA的浓度为10nM时实现成功的敲除。(c)SIVA1基因敲除之后的mRNA表达。(d)经FIG4siRNA处理后，未分化的SHSY5Y细胞中的液泡形成。比例尺是10微米。

尽管这些临床结果显示出创伤中神经损伤的治疗功效，但本发明的电刺激方法不限于创伤中受损神经的再支配。该方法适用于任意形式的神经损伤。

物质或组合物

本发明的一个实施方案还提供了一种物质或组合物，其用于促进患者受损神经的再支配的方法，其中该方法包括向患者施用所述物质或组合物，联合在与神经损伤部位不同的位置处对患者进行电刺激。上文定义了患者皮肤的电刺激，并且上文所述的任意方式都是适用的。上文还定义了组合治疗。

在一个实施方案中，物质或组合物是促进神经再支配的支架、促进神经再支配的移植物、促进神经再支配的细胞群或促进神经再支配的药物。

可以使用任意的促进神经再支配的支架。支架可以包含一种或多种生物相容性纤维。当与受损组织相接触时，如果纤维不会引起任何不良反应或副作用，则该纤维具有生物相容性。可以存在任意数量的生物相容性纤维，如多于一根纤维，如至少2根、至少5根、至少10根、至少20根、至少30根、至少40根、至少50根、至少100根、至少200根、至少500根纤维、至少1000根纤维或甚至更多根纤维。

合适的生物相容性纤维为本领域已知的。所述一种或多种生物相容性纤维可以是天然的或合成的。生物相容性纤维可以包括但不限于纤维素纤维、胶原纤维、胶原-糖胺聚糖纤维、明胶纤维、丝素蛋白纤维、一种或多种纤维蛋白纤维、壳聚糖纤维、淀粉纤维、藻酸盐纤维、透明质酸纤维、泊洛沙姆(poloaxmer)纤维或它们的组合。在一个实施方案中，糖胺聚糖为软骨素。在一个实施方案中，纤维素为羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或甲基纤维素。在一个实施方案中，泊洛沙姆为普朗尼克酸(pluronic acid)，任选地为Pluronic F-127。

如果组合物中存在不止一种纤维，则纤维束可以是均质的。换句话说，束中的所有纤维可以是相同类型的纤维，例如纤维素纤维。或者，纤维束可以是非均质的。换句话说，纤维束可以包含不同类型的纤维，如纤维素纤维和胶原纤维。

所述一根或多根纤维可以为任意长度。在一个实施方案中，一根或多根纤维的长度与将要使用组合物治疗的损伤的深度大致相同。在一个实施方案中，一根或多根纤维的长度被设计成使得组合物可以穿过受损组织至指定的深度。所述一根或多根纤维可以为任意长度。一根或多根纤维的长度的下限通常由一个或多个治疗性细胞的直径所决定。合适的长度包括但不限于至少1μm长、至少10μm长、至少100μm长、至少500μm长、至少1mm长、至少10mm(1cm)长、至少100mm(10cm)长、至少500mm(50cm)长或至少1000mm(100cm或1m)长。一根或多根纤维可以更长。例如，一根或多根纤维的长度可以长达5m或10m，例如如果用于修复沿着人体肠道的损伤的话，或者如果用于诸如马之类的更大的动物中则甚至更长。所述一根或多根纤维的长度通常由它们的预期应用和/或它们的被操纵能力来确定，例如由外科医生、由机器人或通过一些其他手段如磁力来操纵。

支架可以包含生物相容性粘合剂，其使一个或多个治疗性细胞附着到一根或多根纤维上。生物相容性粘合剂可以使一个或多个治疗性细胞附着到(a)一根或多根纤维的表面上、(b)一根或多根纤维内或(c)一根或多根纤维的表面上和一根或多根纤维内两者。

生物相容性粘合剂可以为天然的或合成的。合适的生物相容性粘合剂为本领域已知的。合适的粘合剂包括但不限于纤维蛋白、纤维蛋白凝胶、整联蛋白、整联蛋白凝胶、钙粘蛋白和钙粘蛋白凝胶。

支架可以包含生物相容性凝胶。合适的生物相容性凝胶为本领域已知的。生物相容性凝胶可以为天然的或合成的。生物相容性凝胶可以包括但不限于纤维素凝胶、胶原凝胶、明胶凝胶、纤维蛋白凝胶、壳聚糖凝胶、淀粉凝胶、藻酸盐凝胶、透明质酸凝胶、琼脂糖凝胶、泊洛沙姆凝胶或它们的组合。可以由上文所述的任意纤维素形成纤维素凝胶。在一个实施方案中，纤维素聚合物的浓度为约1.5％(w/w)至约4.0％(w/w)，如约2.0％(w/w)至约3.0％(w/w)。在一个实施方案中，纤维素聚合物的分子量为约450,000至约4,000,000，如约500,000至约3,500,000、约500,000至约3,000,000或者约750,000至约2,500,000或者约1,000,000至约2,000,000。

在一个实施方案中，泊洛沙姆凝胶为普朗尼克酸凝胶，任选地为Pluronic F-127凝胶。在一个实施方案中，粘合剂和/或凝胶在室温下的粘度范围为1000mPa·s(cps)至500,000mPa·s(cps)，例如在室温下为约1500mPa·s至约450,000mPa·s、在室温下为约2000mPa·s至约400,000mPa·s、在室温下为约2500mPa·s至约350,000mPa·s、在室温下为约5000mPa·s至约300,000mPa·s、在室温下为约10,000mPa·s至约250,000mPa·s、在室温下为约50,000mPa·s至约200,000m Pa·s或在室温下为约50,000mPa·s至约150,000mPa·s。

粘度为粘合剂和/或凝胶因剪切应力或拉伸应力而变形的阻力的量度。可以使用本领域已知的任意方法来测量粘度。合适的方法包括但不限于使用粘度计或流变仪。

室温通常为约18℃至约25℃，如约19℃至约24℃或者约20℃至约23℃或者约21℃至约22℃。在一个实施方案中，室温为18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃和25℃中的任一者。可以在25℃下测量粘度。

在上文所述的任意实施方案中，在一个实施方案中，生物相容性粘合剂和/或生物相容性凝胶包含血小板裂解物。例如，粘合剂和/或凝胶可以为血小板裂解物凝胶。血小板裂解物是指通过裂解这些血小板而释放的血小板中所含的天然生长因子的组合物。可以通过化学手段(即CaCl₂)、渗透手段(使用蒸馏水)或通过冻/融程序来完成裂解。如美国专利No.5,198,357中所述，血小板裂解物可以来源于全血。在一个实施方案中，如PCT/GB12/052911(公开为WO 2013/076507)中所述制备血小板裂解物。例如，可以通过对血小板群进行至少一个冻融循环来制备，其中每个循环的冷冻部分在低于或等于-78℃的温度下进行。在一个实施方案中，血小板裂解物为人血小板裂解物。下文更详细地论述血小板裂解物。

在一个实施方案中，移植物为神经移植物、静脉移植物或同种异体神经移植物。合适的移植技术为本领域已知的。移植物可以为自体移植物、同种异体移植物或异种移植物。合适的同种异体移植物包括但不限于胶原管、硅管、聚乙醇酸管(如

)、纤丝和神经束膜管。

在一个实施方案中，细胞群是治疗性细胞群。治疗性细胞为能够具有治疗作用的细胞。治疗性细胞通常为活细胞。治疗性细胞通常为能够修复诸如神经之类的受损组织的细胞。在一个实施方案中，治疗性细胞为自体的。换句话说，在一个实施方案中，细胞来源于将要施用该细胞的患者。或者，在一个实施方案中，细胞为同种异体的。换句话说，在一个实施方案中，细胞来源于这样的患者，其与将要施用该细胞的患者是免疫相容的。细胞可以为半同种异体的。半同种异体细胞群通常由两个或两个以上的患者产生，所述患者与将要施用该细胞的患者是免疫相容的。换句话说，在一个实施方案中，细胞与将要施用该细胞的患者在基因上相同，或者在基因上足够地相同，以致该细胞与将要施用该细胞的患者免疫相容。

可以施用任意数量的细胞。群体通常包含至少约2个、至少约5个、至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约100个、至少约200个、至少约500个、至少约1000个、至少约2000个、至少约5000个、至少约10000个、至少约50000个、至少约100000个、至少约5×10⁵个、至少约1×10⁶个、至少约2×10⁶个、至少约5×10⁶个、至少约1×10⁷个、至少约2×10⁷个、至少约5×10⁷个、至少约1×10⁸个或至少约2×10⁸个细胞。在一些情况下，可以施用至少约1.0×10⁷个、至少约1.0×10⁸个、至少约1.0×10⁹个、至少约1.0×10¹⁰个、至少约1.0×10¹¹个或至少约1.0×10¹²个细胞或甚至更多细胞。

细胞群可以为同质的。换句话说，群体中的所有细胞可以为相同类型的细胞，例如间充质干细胞(MSC)。或者，细胞群可以为异质的。换句话说，细胞群可以含有不同类型的细胞，如MSCs和中胚层谱系祖细胞(PML)。

细胞可以为PCT/GB2012/051600(公开为WO 2013/005053)中公开的中胚层谱系祖细胞(PML)。

细胞可以为间充质干细胞(MSC)。合适的MSC为本领域已知的。合适的MSC可以购于

Ltd、Osiris

Inc.或者

在一个实施方案中，从

获得人MSC。

细胞可以为间充质前体细胞(MPC)。细胞可以为人间充质前体细胞(MPC)。

细胞可以为树突细胞、血小板、成纤维细胞或肌成纤维细胞。

细胞可以为胚胎干(ES)细胞(如人(ES)细胞)或诱导的多能干细胞(iPS细胞)(如人iPS细胞)。获得这样的细胞的技术为本领域已知的。

在一个实施方案中，细胞为人类细胞。

在施用前，通常将细胞在体外培养。培养细胞的技术为本领域技术人员熟知的。可以在37℃、5％CO₂的标准条件下，在不含血清的培养基中培养细胞。

可以使用任意的已知技术对细胞进行离体修饰。例如，可以用治疗剂或诊断剂对群体进行转染或负载。

在一个实施方案中，药物包含小分子、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。如下文定义的，在一个实施方案中，药物为包含可药用的载体或稀释剂的药物组合物的一部分。

在一个实施方案中，药物为神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)或N-乙酰半胱氨酸。可以施用这些药物的任意组合。

神经突生长抑制剂-66(Nogo-66)抑制剂

在一个实施方案中，药物为Nogo-66信号转导抑制剂。在一个实施方案中，该物质为Nogo-66信号转导抑制剂，而受损神经位于中枢神经系统(CNS)中。Nogo-66为Nogo中的66个氨基酸结构域(也称为网状蛋白-4)，其抑制中枢神经系统中的神经突生长。

Nogo-66信号转导抑制剂为降低或减少Nogo-66信号转导的任意分子。该抑制剂可以减少任意量的Nogo-66信号转导。例如，可以使信号转导降低至少10％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。抑制剂可以消除Nogo-66信号转导(即，使功能降低100％)。可以使用已知技术来测量Nogo-66信号转导。可以通过在存在和缺乏抑制剂的情况下测量细胞(如少突胶质细胞)中的信号转导，来确定抑制剂对Nogo-66影响的程度。可以通过这样的方法来测量抑制剂的活性，即用已知的测定方法来测定抑制剂对于Nogo-66受体的配体激活任意的Nogo-66受体信号转导通路的能力的影响。还可以使用已知的血管生成的测定方法来检测抑制剂。

抑制剂可以以任意方式影响Nogo-66信号转导。例如，抑制剂可以(例如)通过降低Nogo-66受体的表达或增加Nogo-66受体的降解来减少Nogo-66受体的量。抑制剂可以(例如)通过与Nogo-66受体结合或与激活Nogo-66受体的分子结合，从而降低Nogo-66受体的活性。抑制剂可以降低Nogo-66的量和/或活性。

抑制剂可以为竞争性抑制剂(该竞争性抑制剂与其结合的分子的活性位点结合)或变构抑制剂(该变构抑制剂不与其结合的分子的活性位点结合)。抑制剂可以为可逆的。抑制剂可以为不可逆的。Nogo-66受体的抑制剂

在一个实施方案中，抑制剂为Nogo-66受体的抑制剂。抑制剂可以降低Nogo-66受体的产生或表达。抑制剂可以降低Nogo-66受体的转录。抑制剂可以(例如)通过使用诸如锌指核酸酶之类的位点特异性诱变方法来破坏Nogo-66受体的DNA。抑制剂可以(例如)通过反义RNA或RNA干扰来降低Nogo-66受体的mRNA水平或干扰Nogo-66受体mRNA的加工。这在下文更详细地论述。

抑制剂可以增加Nogo-66受体的蛋白质降解。抑制剂可以增加Nogo-66受体的天然抑制剂的水平。抑制剂可以通过抑制性磷酸化、泛素化、类泛素化等来降低Nogo-66受体的功能。

在一个实施方案中，Nogo-66受体的抑制剂为小分子抑制剂、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。

Nogo-66受体的抑制剂可以为蛋白质。在一个实施方案中，抑制剂为Nogo-66受体的功能减弱形式。功能减弱形式的功能可以以任意量减弱/降低。例如，与野生型Nogo-66受体相比，功能可以减弱/降低至少10％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。抑制剂可以为Nogo-66受体的非功能形式。Nogo-66受体的功能减弱形式或非功能形式将与天然(即野生型)Nogo-66受体竞争并减少Nogo-66信号转导。

NGRH1和NGRH2介导对Nogo-66的细胞应答。人NGRH1和NGRH2的氨基酸序列示于SEQID NO：4和6中。在一个实施方案中，抑制剂为SEQ ID NO：4或6的功能减弱的变体或非功能性变体。功能减弱的变体为这样的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列，并且形成功能性Nogo-66受体或激活信号转导途径的能力减弱/降低。如上所述，功能可以以任意量减弱/降低。非功能性变体为这样的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列，并且不具有形成功能性Nogo-66受体或激活信号转导途径的能力。例如，非功能性变体可以在形成二聚体受体的位点或与信号转导途径相互作用的位点具有一个或多个突变。非功能性变体也可以为截断Nogo-66或其他Nogo-66受体配体的截短形式。非功能性变体还可以为截断Nogo-66或其他Nogo-66受体配体的可溶形式的受体。可以使用本领域已知的任意方法来测定变体作为Nogo-66受体发挥作用的能力。通常与诸如SEQ ID NO：4或6之类的野生型Nogo-66受体相比来测量功能减弱的变体和非功能性变体的相对功能性。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列的整个长度上，功能减弱的变体或非功能性变体基于氨基酸同一性至少50％同源于该序列，即在整个序列上的氨基酸同一性至少为50％。在一个实施方案中，基于与整个序列上的SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列的氨基酸同一性(或相同性)，功能减弱的变体或非功能性变体的同源性可以为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一个实施方案中为至少95％、97％或99％。在一段100或更多，例如200或300或更多的连续氨基酸上的氨基酸同一性(“硬同源性”)可以为至少80％，例如至少85％、90％或95％。

可以使用本领域的标准方法来确定同源性。例如，UWGCG软件包提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性，例如使用其默认设置(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research12，第387-395页)。PILEUP和BLAST算法可用于计算同源性或对其序列(如鉴定等效残基或相应序列(通常在其默认设置下))，例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300；Altschul,S.F等(1990)J Mol Biol 215:403-10中所述。可以通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得进行BLAST分析的软件。

可以对SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如多达1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个、50个、100个或200个置换。保守性置换用化学结构相似、化学性质相似或侧链体积相似的其他氨基酸来取代氨基酸。引入的氨基酸可以具有与它们所取代的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，保守性置换可以在预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸的位置引入另一种芳香族或脂肪族氨基酸。保守性氨基酸变化为本领域公知的，并且可以根据下表中定义的20种主要氨基酸的特性进行选择。如果氨基酸的极性相似，则也可以通过参考以下第二个表中的氨基酸侧链的亲水性标度来确定。

表-氨基酸的化学性质

Ala	脂肪族、疏水、中性	Met	疏水、中性
				Cys	极性、疏水、中性	Asn	极性、亲水、中性
Asp	极性、亲水、带电(-)	Pro	疏水、中性
				Glu	极性、亲水、带电(-)	Gln	极性、亲水、中性
Phe	芳香族、疏水、中性	Arg	极性、亲水、带电(+)
				Gly	芳香族、中性	Ser	极性、亲水、中性
His	芳香族、极性、亲水、带电(+)	Thr	极性、亲水、中性
				Ile	脂肪族、疏水、中性	Val	脂肪族、疏水、中性
Lys	极性、亲水、带电(+)	Trp	芳香族、疏水、中性
				Leu	脂肪族、疏水、中性	Tyr	芳香族、极性、疏水

表-亲水性标度

另外，可以使上述多肽缺失SEQ ID NO：4或6的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基。可以缺失多达1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个或50个或更多个残基。

功能减弱的变体或非功能性变体可以包括SEQ ID NO：4或6的片段。此类片段通常保留SEQ ID NO：4或6的结构域，其结合Nogo-66或Nogo-66受体的其他配体，但是功能减弱或无功能。片段的长度可以为至少200个、300个、400个或500个氨基酸。可以将一种或多种氨基酸替代地或另外地添加至上述多肽。

或者，抑制剂可以为编码Nogo-66受体的功能减弱的变体或非功能性变体的多核苷酸。功能减弱的变体或非功能性变体可以为上述任意变体。

多核苷酸(如核酸)为包含两个或更多个核苷酸的聚合物。核苷酸可以为天然存在的或人工的。核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个连接基团，如磷酸酯、2'O-甲基、2'甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯基团。核碱基通常为杂环的。核碱基包括但不限于嘌呤和嘧啶，并且更具体而言为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸酯可以连接在核苷酸的5'端或3'端。

核苷酸包括但不限于单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、单磷酸5-甲基胞苷、二磷酸5-甲基胞苷、三磷酸5-甲基胞苷、单磷酸5-羟甲基胞苷、二磷酸5-羟甲基胞苷、三磷酸5-羟甲基胞苷、单磷酸环腺苷(cAMP)、单磷酸环鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、单磷酸5-甲基-2'-脱氧胞苷、二磷酸5-甲基-2'-脱氧胞苷、三磷酸5-甲基-2'-脱氧胞苷、单磷酸5-羟甲基-2'-脱氧胞苷、二磷酸5-羟甲基-2'-脱氧胞苷和三磷酸5-羟甲基-2'-脱氧胞苷。在一个实施方案中，核苷酸选自AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。

核苷酸可能含有另外的修饰。具体而言，合适的经修饰的核苷酸包括但不限于2'氨基嘧啶(如2'-氨基胞苷和2'-氨基尿苷)、2'-羟基嘌呤(如2'-氟嘧啶(如2'-氟胞苷和2'-氟尿苷)、羟基嘧啶(如5'-α-P-硼烷尿苷)、2'-O-甲基核苷酸(如2'-O-甲基腺苷、2'-O-甲基鸟苷、2'-O-甲基胞苷和2'-O-甲基尿苷)、4'-硫代嘧啶(如4'-硫代尿苷和4'-硫代胞苷)和经核碱基(如5-戊炔基-2'-脱氧尿苷、5-(3-氨基丙基)-尿苷和1,6-二氨基己基-N-5-氨基甲酰基甲基尿苷)修饰的核苷酸。

多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被损坏。例如，多核苷酸可以包含嘧啶二聚体。这种二聚体通常与由紫外光损坏有关。

多核苷酸中的核苷酸可以以任意方式相互连接。核苷酸可以通过磷酸酯、2'O-甲基、2'甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯连接基来连接。如在核酸中那样，核苷酸通常由它们的糖和磷酸酯基团来连接。如在嘧啶二聚体中那样，核苷酸可以由它们的核碱基连接。

多核苷酸可以为核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以为本领域已知的任何合成核酸，如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、吗啉代核酸或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物。多核苷酸可以为单链或双链的。

在一个实施方案中，多核苷酸序列编码如上所述的SEQ ID NO：4或6的功能减弱的变体或非功能性变体。在一个实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或5的变体，基于在整个序列上的核苷酸同一性(即在整个序列上的核苷酸同一性)，该变体的同源性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。在一段300或更多，例如400、500、600、700、800或900或更多的连续核苷酸上的核苷酸同一性(“硬同源性”)可以为至少80％，例如至少85％、90％或95％。如上所述，可以计算同源性。

可以使用本领域的标准方法，例如使用涉及特异性引物的PCR，来衍生和复制多核苷酸序列。使用这样的标准技术可以直接生成多核苷酸序列。

可以将扩增的序列并入诸如克隆载体之类的重组的可复制载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中复制多核苷酸。因此，可以通过将多核苷酸引入可复制的载体中，将该载体引入相容的宿主细胞中，并在可引发该载体复制的条件下培养宿主细胞，从而制备多核苷酸序列。可以从宿主细胞中回收载体。用于克隆多核苷酸的合适的宿主细胞为本领域已知的，并且在下文更详细地描述。

可以将多核苷酸序列克隆到任意的合适的表达载体中。在表达载体中，编码构建体的多核苷酸序列通常有效连接至控制序列，该控制序列能够提供由宿主细胞表达的编码序列。这种表达载体可以用于表达构建体。

术语“有效连接”是指并置(juxtaposition)，其中组件处于允许以它们的预期方式发挥功能的关系。“有效连接”至编码序列的控制序列以这样的方式连接，即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。可以将相同或不同多核苷酸的多个复制体引入载体中。

然后，可以将表达载体引入合适的宿主细胞中。因此，可以通过将编码构建体的多核苷酸序列插入到表达载体中，将该载体引入相容的细菌宿主细胞中，并在可引发多核苷酸序列表达的条件下培养宿主细胞，从而产生构建体。载体可以为(例如)具有复制起点的质粒、病毒或噬菌体载体，任选地为用于表达所述多核苷酸序列的启动子，并且任选地为启动子的调节子。载体可以含有一个或多个可选择标记基因，例如氨苄青霉素抗性基因。可以将启动子和其他表达调节信号选择成与为其将要用作表达载体的宿主细胞相容。通常使用T7、trc、lac、ara或λ_L启动子。

宿主细胞通常以高水平表达构建体。用多核苷酸序列编码构建体来转化的宿主细胞将被选择成与用于转化细胞的表达载体相容。宿主细胞通常为细菌性，并且在一个实施方案中为大肠杆菌。具有λDE3溶原菌的任意细胞(例如C41(DE3)、BL21(DE3)、JM109(DE3)、B834(DE3)、TUNER、Origami和Origami B)可以表达包含T7启动子的载体。

Nogo-66受体的抑制剂还可以(例如)通过抑制(knocking down)Nogo-66受体的表达，来降低患者或CNS中存在的Nogo-66受体的量。用于抑制蛋白质表达的反义和RNA干扰(RNAi)技术为本领域公知的，并且可以采用标准方法来抑制Nogo-66受体的表达。

反义和siRNA技术两者都会干扰mRNA。反义寡核苷酸通过与mRNA的一部分结合(杂交)来干扰mRNA。因此，将反义寡核苷酸设计成与mRNA互补的(尽管如下所述，寡核苷酸不必是100％互补的)。换句话说，反义寡核苷酸可以为cDNA的一部分。此外，寡核苷酸序列可以不与cDNA序列100％相同。这也在下文论述。

RNAi涉及双链RNA的应用，可以使这种小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)结合至mRNA并抑制蛋白质表达。

因此，在一个实施方案中，抑制剂包含与Nogo-66受体mRNA的一部分特异性杂交的寡核苷酸。在一个实施方案中，抑制剂包含与SEQ ID NO：3或5(人NGRH1或NGRH2mRNA)的一部分特异性杂交的寡核苷酸。寡核苷酸为短核苷酸聚合物，其通常具有50个或更少核苷酸，例如40个或更少、30个或更少、22个或更少、21个或更少、20个或更少、10个或更少或者5个或更少核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所使用的寡核苷酸的长度为20个至25个核苷酸，在一个实施方案中，长度为21个或22个核苷酸。核苷酸可以为天然存在的或人工的。核苷酸可以为上述任意核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸与SEQ ID NO：3或5的一部分(以下称为靶序列)特异性杂交。靶序列的长度通常相当于寡核苷酸的长度。例如，21个或22个核苷酸的寡核苷酸通常与21个或22个核苷酸的靶序列特异性杂交。因此，靶序列可以为参照寡核苷酸的长度的上述任意长度。靶序列通常为靶多核苷酸内的连续核苷酸。

在一个实施方案中，如果寡核苷酸与靶序列杂交或与靶序列以高亲和力杂交，但与其他序列基本上不杂交、不杂交或仅以低亲和力杂交，则该寡核苷酸与靶序列“特异性杂交”。

如果寡核苷酸与这样的靶序列杂交，则为“特异性杂交”，即靶序列的解链温度(T_m)比其他序列的T_m高至少2℃，如至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃或至少10℃。在一个实施方案中，寡核苷酸与靶序列杂交，该靶序列的T_m比其他核酸的T_m高至少2℃，如至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少20℃、至少30℃或至少40℃。在一个实施方案中，该部分与靶序列杂交，该靶序列的T_m比有一个或多个核苷酸(如1个、2个、3个、4个或5个或更多核苷酸)与靶序列不同的序列的T_m高至少2℃，如至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少6℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少20℃、至少30℃或至少40℃。该部分通常与T_m为至少90℃(如至少92℃或至少95℃)的靶序列杂交。可以使用已知技术通过实验来测量T_m，包括使用DNA微阵列，或者可以使用可公开获得的T_m计算器(如可通过互联网获得的T_m计算器)来计算T_m。

允许杂交的条件为本领域公知的(例如，Sambrook等,2001,Molecular Cloning:alaboratory manual,第三版,Cold Spring Harbour Laboratory Press；and CurrentProtocols in Molecular Biology,第2章,Ausubel等,Eds.,Greene Publishing andWiley-lnterscience,New York(1995))。可以在低严格条件下进行杂交，例如在37℃下，在存在30％至35％的甲酰胺、1M的NaCl和1％的SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中进行，随后在50℃下在1X(0.1650M Na⁺)至2X(0.33M Na⁺)SSC(标准柠檬酸钠)中冲洗20次。可以在中等严格条件下进行杂交，例如在37℃下，在存在40％至45％的甲酰胺、1M的NaCl和1％的SDS的缓冲溶液中进行，随后在55℃下在0.5X(0.0825M Na⁺)至1X(0.1650M Na⁺)SSC中冲洗。可以在高严格条件下进行杂交，例如在37℃下，在存在50％的甲酰胺、1M的NaCl、1％的SDS的缓冲溶液中进行，随后在60℃下在0.1X(0.0165M Na⁺)SSC中冲洗。

寡核苷酸可以包含与靶序列基本上互补的序列。通常，寡核苷酸为100％互补的。然而，也可以接受较低水平的互补性，如95％、90％、85％甚至80％。可以接受低于100％的互补性，只要寡核苷酸与靶序列特异性杂交即可。因此，寡核苷酸可以在横跨5个、10个、15个、20个、21个、22个、30个、40个或50个核苷酸的区域内具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个错配。

或者，在一个实施方案中，抑制剂包含寡核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：3或5的反向互补序列的50个或更少的连续核苷酸。寡核苷酸可以为上述任意长度。在一个实施方案中，长度为21个或22个核苷酸。寡核苷酸可以包含上述任意核苷酸，包括经修饰的核苷酸。

寡核苷酸可以为核酸，如上述的任意核酸。在一个实施方案中，寡核苷酸为RNA。

寡核苷酸可以为单链的。寡核苷酸可以为双链的。寡核苷酸可以包含发夹结构。

可以使用本领域已知的标准技术来合成寡核苷酸。或者，可以购买寡核苷酸。

在一个实施方案中，抑制剂为特异性结合Nogo-66受体的抗体。在一个实施方案中，抗体结合SEQ ID NO：4或6所示的序列。

如果抗体优先或以高亲和力与某蛋白质结合，但与其他蛋白质基本上不结合、不结合或以低亲和力结合，则该抗体与该蛋白质“特异性结合”。例如，如果抗体优先或以高亲和力与SEQ ID NO：31结合，但与其他人类蛋白质基本上不结合、不结合或仅以低亲和力结合，则该抗体与SEQ ID NO：31“特异性结合”。

如果抗体结合的Kd为1×10^-7M或更小，则该抗体优先或以高亲和力结合，在一个实施方案中，Kd为5×10^-8M或更小，在一个实施方案中，Kd为1×10^-8M或更小或者在一个实施方案中，Kd为5×10^-9M或更小。如果抗体结合的Kd为1×10^-6M或更大，则该抗体以低亲和力结合，在一个实施方案中，Kd为1×10^-5M或更大，在一个实施方案中，Kd为1×10^-4M或更大，在一个实施方案中，Kd为1×10^-3M或更大，在一个实施方案中，Kd为1×10^-2M或更大。竞争性结合或免疫放射测定的多种方案为本领域公知的，它们用于确定诸如抗体或抗体构建体之类的化合物和寡核苷酸的特异性结合能力(参见例如Maddox等，J.Exp.Med.158,1211-1226,1993)。

抗体可以为(例如)单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、CDR移植抗体或人源化抗体。抗体可以为完整的免疫球蛋白分子或其片段，如Fab、F(ab’)₂或Fv片段。

Nogo-66的抑制剂

在一个实施方案中，抑制剂为Nogo-66的抑制剂。抑制剂可以降低Nogo-66或Nogo-66A的产生或表达。抑制剂可以降低Nogo-66的转录。抑制剂可以(例如)通过使用诸如锌指核酸酶之类的位点特异性诱变方法来破坏Nogo-66的DNA。抑制剂可以(例如)通过反义RNA或RNA干扰来降低Nogo-66的mRNA水平或干扰Nogo-66mRNA的加工。这在下文更详细地论述。

抑制剂可以增加Nogo-66的蛋白质降解。抑制剂可以增加Nogo-66的天然抑制剂的水平。抑制剂可以通过抑制性磷酸化、泛素化、类泛素化等来降低Nogo-66的功能。

在一个实施方案中，Nogo-66的抑制剂为小分子抑制剂、蛋白质、抗体、多核苷酸、寡核苷酸、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。

Nogo-66的抑制剂可以为蛋白质。在一个实施方案中，抑制剂为Nogo-66的功能减弱形式。功能减弱形式的功能可以以任意量减弱/降低。例如，与野生型Nogo-66相比，功能可以减弱/降低至少10％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。抑制剂可以为Nogo-66的非功能形式。Nogo-66的功能减弱形式或非功能形式将与天然(即野生型)Nogo-66竞争并减少Nogo-66信号转导。

人Nogo-66的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2的残基1055至1120中。抑制剂可以基于SEQ ID NO：2本身或者仅仅基于SEQ ID NO：2的残基1055至1120。在一个实施方案中，抑制剂为SEQ ID NO：2的或SEQ ID NO：2的残基1055至1120的功能减弱的变体(如非功能性变体)。功能减弱的变体为这样的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：2的或SEQID NO：2的残基1055至1120的氨基酸序列，其具有结合Nogo-66受体(如Nogo-66R2)的能力，并且具有减弱/降低的激活或激动Nogo-66受体的能力。如上所述，功能可以以任意量减弱/降低。非功能性变体为这样的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列不同于SEQ ID NO：2的或SEQID NO：2的残基1055至1120的氨基酸序列，其具有结合Nogo-66受体(如Nogo-66R2)的能力，并且不具有激活或激动Nogo-66受体的能力。

通常与野生型Nogo-66(如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的残基1055至1120)相比，来测量功能减弱的变体和非功能性变体的相对结合能力。可以使用已知技术来测量结合性。

功能减弱的变体可以通过与天然配体竞争而结合Nogo-66受体但激活受体的程度较低，从而降低Nogo-66信号转导。非功能性变体可以通过与天然配体竞争而结合Nogo-66受体但不激活该受体，从而降低Nogo-66信号转导。可以使用本领域已知的任意方法来测定变体结合并激活或激动Nogo-66受体的能力。

在一个实施方案中，在SEQ ID NO：2的或SEQ ID NO：2的残基1055至1120的氨基酸序列的整个长度上，功能减弱的变体或非功能性变体基于氨基酸同一性与该序列具有至少50％的同源性，即在整个序列上的氨基酸同一性至少为50％。在一个实施方案中，基于与整个序列上的SEQ ID NO：2的或SEQ ID NO：2的残基1055至1120的氨基酸序列的氨基酸同一性(或相同性)，功能减弱的变体或非功能性变体的同源性可以为至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一个实施方案中为至少95％、97％或99％。在一段100或更多，例如200或300或更多的连续氨基酸上的氨基酸同一性(“硬同源性”)可以为至少80％，例如至少85％、90％或95％。

可以对SEQ ID NO：2的或SEQ ID NO：2的残基1055至1120的氨基酸序列进行氨基酸置换，例如多达1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个、50个或100个置换。可以进行如上所述的保守性置换。

另外，可以使上述多肽缺失SEQ ID NO：2的或SEQ ID NO：2的残基1055至1120的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基。可以缺失多达1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个、30个或50个或更多个残基。

功能减弱的变体或非功能性变体可包括SEQ ID NO：2的或SEQ ID NO：2的残基1055至1120的片段。此类片段通常保留结合Nogo-66受体的结构域，但缺乏激活受体的结构域。片段的长度可以为至少20个、30个、40个、50个、100个、200个、300个、400个或500个氨基酸。可以将一种或多种氨基酸替代地或另外地添加至上述多肽。

在一个实施方案中，用于本发明的抑制剂为由包含SEQ ID NO：2的残基1055至1094的Nogo-66(1 40)拮抗肽(NEP1 40)(GrandPré T1,Li S,Strittmatter SM,Nature.2002年5月30日；417(6888):547-51)。

或者，抑制剂可以为编码Nogo-66的功能减弱的变体或非功能性变体的多核苷酸。功能减弱的变体或非功能性变体可以为上述任意变体。上文定义了多核苷酸。

Nogo-66的抑制剂还可以(例如)通过抑制Nogo-66的表达，来降低患者或CNS中存在的Nogo-66的量。用于抑制蛋白质表达的反义和RNA干扰(RNAi)技术为本领域公知的，并且可以采用标准方法来抑制Nogo-66的表达。

反义和siRNA技术两者都会干扰mRNA。反义寡核苷酸通过与mRNA的一部分结合(杂交)来干扰mRNA。因此将反义寡核苷酸设计成与mRNA互补的(尽管如下所述，寡核苷酸不必是100％互补的)。换句话说，反义寡核苷酸可以为cDNA的一部分。此外，寡核苷酸序列可以不与cDNA序列100％相同。这也在下文论述。

因此，在一个实施方案中，抑制剂包含与Nogo-66mRNA的一部分特异性杂交的寡核苷酸。在一个实施方案中，抑制剂包含与SEQ ID NO：1(人网状蛋白-4mRNA)的一部分特异性杂交的寡核苷酸。

寡核苷酸为短核苷酸聚合物，其通常具有50个或更少核苷酸，例如40个或更少、30个或更少、22个或更少、21个或更少、20个或更少、10个或更少或者5个或更少核苷酸。在一个实施方案中，所使用的寡核苷酸的长度为20个至25个核苷酸，或者在一个实施方案中，长度为21个或22个核苷酸。核苷酸可以为天然存在的或人工的。核苷酸可以为上述任意核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸与SEQ ID NO：1的一部分(以下称为靶序列)特异性杂交。靶序列的长度通常相当于寡核苷酸的长度。例如，21个或22个核苷酸的寡核苷酸通常与21个或22个核苷酸的靶序列特异性杂交。因此，靶序列可以为参照寡核苷酸的长度的上述任意长度。靶序列通常为靶多核苷酸内的连续核苷酸。在一个实施方案中，靶序列在SEQID NO：1的核苷酸3461至3658内。

如上文所定义的，寡核苷酸与靶序列“特异性杂交”。

或者，在一个实施方案中，抑制剂包含寡核苷酸，其包含来自SEQ ID NO：1的反向互补序列的50个或更少的连续核苷酸。寡核苷酸可以为上述任意长度。在一个实施方案中，长度为21个或22个核苷酸。寡核苷酸可以包含上述任意核苷酸，包括经修饰的核苷酸。寡核苷酸可以为上述任意类型。

在一个实施方案中，抑制剂为特异性结合Nogo-66的抗体。在一个实施方案中，抗体结合SEQ ID NO：2的残基1055至1120所示的序列。特异性结合如上文所述进行了限定。抗体可以为上述任意类型。

其他抑制剂

对CNS中其他分子的抑制可以促进神经进行神经再支配。在一个实施方案中，药物为NI-35的抑制剂、硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的抑制剂、糖胺聚糖的抑制剂或硫酸角质素蛋白多糖(KSPG)抑制剂，在一个实施方案中，当受损神经位于CNS中时，药物为髓磷脂相关糖蛋白(MAG)的抑制剂、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(OMgp)的抑制剂、肝配蛋白B3的抑制剂、semaphoring 4D(Sema 4D)的抑制剂或Sema 3A的抑制剂。在一个实施方案中，CSPGs为CS-E、聚集蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、神经蛋白聚糖或NG-2。对于Nogo-66的抑制剂的任意定义同样适用于这些抑制剂。

施用

在本发明的方法中，将物质、组合物或抑制剂施用于患者。可以以任意适当的方式将物质、组合物或抑制剂施用于患者。在本发明中，可以以各种剂型施用物质、组合物或抑制剂。因此，可以经口施用，例如作为片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂。还可以通过肠内或肠胃外途径施用，如通过口腔、肛门、肺、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、关节内、局部或其他适当的施应用径。可以将物质、组合物或抑制剂直接施用于待治疗的眼中。在一个实施方案中，施应用径为静脉内。医师将能够确定各具体患者所需的施应用径。

物质、组合物或抑制剂的配制将取决于诸如确切的物质、组合物或抑制剂的性质等因素。可以将物质、组合物或抑制剂配制成与其他治疗或与电刺激同时使用、分别使用或连续使用。

通常将物质、组合物或抑制剂配制成与可药用的载体或稀释剂一同施用。药物的载体或稀释剂可以为(例如)等渗溶液。例如，固体口服形式可以含有与活性物质一起的稀释剂，例如乳糖、葡聚糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、海藻酸、藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨酯、十二烷基硫酸盐；以及(一般而言)药物制剂中使用的无毒和药理学非活性物质。可以以已知的方式制造这样的药物制剂，例如借助于混合、制粒、制片、包糖衣或包膜工艺。

用于经口施用的液体分散体可以为糖浆剂、乳剂或混悬剂。糖浆剂可以含有作为载体的(例如)蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。

混悬剂和乳剂可以含有作为载体的(例如)天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。用于肌内注射的混悬剂或溶液剂可以含有与活性物质一起的可药用的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(例如丙二醇)以及(如果需要)适量的盐酸利多卡因。

用于静脉内施用或输注的溶液剂可以含有作为载体的(例如)无菌水，或者在一个实施方案中它们可以为无菌、水性、等渗盐水溶液的形式。

对于栓剂，传统的粘合剂和载体可以包括(例如)聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以由含有0.5％至10％(一个实施方案为1％至2％)范围内的活性成分的混合物形成。

口服制剂包括这样的通常使用的赋形剂，如(例如)药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末的形式，并含有10％至95％(一个实施方案为25％至70％)的活性成分。在将药物组合物冻干的情况下，冻干材料可以在施用前重构成(例如)混悬液。在一个实施方案中，重构在缓冲液中进行。

可以向个体提供用于口服施用的肠溶包衣胶囊、片剂和丸剂，所述肠溶衣包含(例如)Eudragit“S”、Eudragit“L”、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。

多核苷酸或寡核苷酸可以为裸露的核苷酸序列或与阳离子脂质、聚合物或靶向系统结合。可以通过任意已有的技术来递送多核苷酸或寡核苷酸。例如，可以通过针头注射(一个实施方案为皮内、皮下或肌内内注射)引入多核苷酸或寡核苷酸。或者，可使用诸如颗粒介导的基因递送之类的递送装置将多核苷酸或寡核苷酸直接穿过皮肤递送。可以将多核苷酸或寡核苷酸局部地施用于皮肤，或施用于粘膜表面，例如通过鼻内、口腔或直肠内施用。

可以通过几种已知的转染技术(例如包括使用转染剂的技术)来增强多核苷酸或寡核苷酸构建体的摄取。转染剂的实例包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和脂质转染剂(例如lipofectam和transfectam)。可以改变待施用的多核苷酸或寡核苷酸的剂量。

通常对患者施用治疗有效量的物质、组合物或抑制剂。治疗有效量为有效促进神经进行再支配或有效改善神经损伤的一种或多种症状的量。在一个实施方案中，治疗有效量为有效消除神经损伤的一种或多种症状的量，或者在一个实施方案中，治疗有效量为有效消除神经损伤的所有症状的量。

可以根据各种参数，特别是根据所使用的物质；待治疗患者的年龄、体重和情况；施应用径；以及所需的方案来确定剂量。此外，医师将能够确定任意具体患者所需的施应用径和剂量。根据特定的物质、组合物或抑制剂的活性、待治疗患者的年龄、体重和情况以及施用频率和途径，典型的日剂量为每公斤体重约0.1mg至50mg。剂量可以以单剂量提供，或者可以以多剂量提供，例如以规律的时间间隔施用，例如每小时施用2个、3个或4个剂量。在一个实施方案中，剂量水平为5mg至2g。

典型地，多核苷酸或寡核苷酸的施用范围为1pg至1mg，在一个实施方案中，用于颗粒介导的递送为1pg至10μg核酸，而用于其他途径为10μg至1mg。

套件

本发明还提供用于促进患者受损神经的再支配的套件。套件包含能够对患者皮肤进行电刺激的设备。上文公开了合适的设备。套件还包含促进神经再支配的支架、促进神经再支配的移植物、促进神经再支配的细胞群或促进神经再支配的药物。套件可以包含上述任意支架、移植物、细胞或药物。

此外，套件还可以包含一种或多种使本发明的方法能够实施的其他试剂或仪器。这样的试剂包括用于从患者取样或向患者施用物质或组合物的部件，以及合适的缓冲液。套件可以任选地包含说明书，从而使套件能够用于本发明的方法或了解关于可以对其施用方法的患者的详情。

实施例

在我们关于ES的体内应用对人体皮肤愈合(n＝20)的近期的报道中 ²⁸ ，我们局限于受创伤后(第14天)的单个时间点分析。然而，在本研究中(n＝40)，我们已经包括了中间时间点，如第3天、第7天和第10天，从而明确地了解修复过程中神经网络的形成。ES之后增强的神经再支配通过以下方面得到了进一步证实：1)创伤肉芽组织中的TUBB3和FIG4表达分析、神经再支配、神经肽合成和神经相关细胞分化，特别是在黑素细胞和Merkel细胞中，2)黑素生成动力学，3)细胞增殖和神经生长因子分析，以及4)神经分化中ES的体外作用。

材料和方法

患者选择和募集

本研究按照优良临床实践(Good Clinical Practice)和赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的道德原则进行。本研究获得了地方研究委员会(英国曼彻斯特)的伦理许可，并且所有受试者(n＝40；下表)均给出了完整的书面知情同意书。

SHSY5Y细胞培养和分化

使人成神经细胞瘤SHSY5Y细胞(ATCC、CRL-2266)在含有营养混合物F12的Dulbecco’s改良eagle培养基(DMEM-F12；cat.11320-074；Life Technologies,英国佩斯利)中生长，该培养基中补充有10％胎牛血清(FCS)、4×10^-3M谷氨酰胺、10U/ml青霉素和10mg/ml链霉素。将细胞在37℃、5％(v/v)CO₂的潮湿气氛下培养。在6孔板中的22mm圆盖玻片(BD Biosciences,英国牛津)上(以3×10⁴个细胞/cm²的密度)接种细胞。24小时后，在补充有2％FCS的培养基中，利用视黄酸(RA；10^-5M；cat.R2625,Sigma Aldrich,英国多塞特)诱导神经分化6天。如先前报道的，在补充有0.5％FCS的培养基中，再添加脑衍生的神经营养因子(BDNF；50ng/ml；cat.B3795,Sigma Aldrich,英国)4天 ⁴⁰ 。

体外电刺激

以100mV/mm(60Hz)使SHSY5Y细胞经受DW(简并双相正弦波)ES波形 ²¹ 。

用于人类志愿者的电刺激设备

用于体内经ES治疗的创伤的电刺激设备为在食品和药物管理局(FDA)510(k)注册的并且经Conformite Europenne(CE)许可的Fenzian系统(Fenzian Ltd，英国亨格福德) ²⁹ 。这是经皮低强度设备，其检测皮肤阻抗的变化并产生调节“简并电波形”，其中各脉冲取决于皮肤在其电特性改变时的电特性(即，使用电生物反馈)。该设备提供0.004毫安、20V至80V，默认频率为60Hz，脉冲宽度为约1μs至100μs。

用于伤口愈合研究的人体穿刺活组织检查采集

我们先前的研究中提到了我们所采用的用于体内ES研究的方案 ²⁹ 。我们将志愿者分成2组(每一组中n＝20)；第一组(组A)在第3天和第7天提供正常的和经ES治疗的创伤愈合的穿刺活组织检查，而第二组(组B)在第10天和第14天提供正常和经ES治疗的创伤愈合。除了指定穿刺活组织检查采集的日子之外，对两组采用的方法学是相同的。将在第3天、第7天、第10天和第14天采集的正常(对照)创伤愈合活组织检查分别标记为C3、C7、C10和C14。类似地，将在第3天、第7天、第10天和第14天采集的经ES治疗的愈合活组织检查分别标记为ES3、ES7、ES10和ES14。

组A

在第0天，在充当对照臂以监测正常的创伤愈合的参与者的上臂内侧，对参与者的两块5mm直径的全厚度皮肤进行活组织检查。在第3天，对一块直径为7mm的皮肤进行活组织检查，该皮肤包含先前的创伤部位(C3)的一者。在第7天，对另一块直径为7mm的皮肤进行活组织检查，以切除第二个先前的创伤部位(C7)。在第7天本身，在对侧上臂内测的相同解剖位置处建立2×5mm的活组织检查，并进行ES治疗的干预阶段⁵⁸。从该日起(第7天)，用ES治疗志愿者直到第14天。类似于正常愈合的第3天(C3)和第7天(C7)那样，在第10天(ES3)和第14天(ES7)由经ES治疗的志愿者得到中间活组织检查。

组B

在该组中，在第10天(C10)和第14天(C14)采集活组织检查，从而得到第10天和第14天的正常愈合样本。然而，在第14天在对侧手臂上进行另外2个活组织检查。从第14天起，用ES对志愿者进行治疗，并在第24天(ES10)和第28天(ES14)对创伤进行再次活组织检查。

制备用于石蜡包埋、切片、组织学染色和半定量的组织

将用于石蜡包埋的组织在4℃下在10％中性缓冲的福尔马林(cat.F5304；Sigma-Aldrich,英国多塞特)中固定，并如前所述进行处理 ²⁸ 。微阵列分析

在微阵列(n＝4)中，将第3天、第7天、第10天和第14天的正常创伤愈合样本与ES样本进行比较。本研究遵循制造商的方案-基于单色微阵列的基因表达分析(低输入QuickAmp标记试剂盒)而使用Agilent全人类基因组(SurePrint G3 Hmn GE 8x60K V2)Oligo微阵列试剂盒(Agilent Technologies) ⁵⁹ 。用Qlucore Omics Explorer(Qlucore AB,瑞典隆德)分析数据 ⁶⁰ 。由同一软件还产生统计学显著性(P<0.05)。

RNA分离、cDNA合成和定量的实时聚合酶链式反应

如先前所解释的，对于在愈合的不同日子得到的体内活组织检查，进行RNA分离、cDNA合成和qRT-PCR ²⁸ 。使用RPL32 ²⁸ 作为内部对照，并使用ΔΔC_T方法计算基因表达的倍数变化。所用的引物详见下表。

免疫组织化学和免疫细胞化学

如我们先前的报道所详述的进行免疫组织化学染色 ²⁸ 。用于蛋白质检测的阳性对照均为实验室标准化组织，并且将无第一抗体的切片作为阴性对照。由两个独立的观察者用相差显微镜(Olympus IX51显微镜；英国奥林巴斯)分析所有组织学载玻片。

如前所述，对于组织免疫荧光实验，进行脱蜡和抗原修复。而且，用含0.2％TritonX-100的PBS透化组织30分钟，然后用含5％牛血清白蛋白的PBS使组织封闭。随后用合适的第一抗体和第二抗体将它们染色，并用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；cat.H-1200,Vector Laboratories,美国加州伯林盖姆)共染色。

对于免疫细胞化学实验，将细胞用4％的多聚甲醛固定20分钟，用含0.2％TritonX-100的PBS透化30分钟。用含5％牛血清白蛋白的PBS将它们封闭1小时。然后用合适的第一抗体和第二抗体将细胞染色，并用DAPI共染色。

使用Definiens软件进行免疫组织化学图像分析

使用Definiens tissue studio 3.51版(Definiens AK,德国慕尼黑)来对IHC结果定量 ²⁹ 。扫描载玻片并将图像上传到Definiens IHC软件，从而进一步对结果定量。本文中，最初在细胞分析模块中，在组织样本中选择12个子集(subsets)进行位点识别。还在子集上进行细胞核检测、核区检测和核分类。对于IHC-过氧化物酶染色，调节苏木素阈值以进行细胞检测。以20×放大倍率进行分析。

蛋白质印迹法

对于细胞：根据我们先前的方案进行蛋白质印迹法 ²⁹ 。使用1步氮蓝四唑/S-溴-4-氯吲哚基磷酸盐(NBT/BCIP,cat.34042；Thermo Scientific)来显影印迹。

对于组织：将组织在RIPA缓冲液中裂解并在组织裂解器(Qiagen)中匀浆。将它们以10,000g离心20分钟并收集上清液。如对于细胞研究所说明的，进行进一步的蛋白质分离和印迹。

使用Image J软件进行蛋白质印迹条带分析

通过Image J(Fiji,1.47t,NIH,USA)分析来计算条带强度的百分比²⁹。在软件中通过评价条带的轮廓图，然后分析并标记所生成的峰，从而计算条带强度。然后对条带强度以相应的β-肌动蛋白条带进行归一化。然后(对于特定蛋白质)基于使归一化的个体条带的强度与特定行中其余条带的总强度相比来计算百分比，这是相应地计算。Masson-Fontana组织化学法

简言之，从石蜡包埋的组织块切下4-μm厚的切片。将它们在一系列二甲苯和乙醇中脱蜡。用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)在60℃下进行抗原修复1小时。在56℃下，用氨银溶液(逐滴添加10％硝酸银(cat.209139；Sigma-Aldrich)+浓氢氧化铵(cat.320145；Sigma-Aldrich)直至其变澄清，在室温下避光放置24小时)对组织避光处理40分钟。在蒸馏水中洗涤后，将切片用5％的硫代硫酸钠(cat.72049；Sigma-Aldrich)水溶液处理1分钟。然后将切片用水龙头流水冲洗3分钟，并用苏木素复染3分钟。在蒸馏水中洗涤后，使切片脱水并加盖盖玻片。

FIG4 siRNA转染

在6孔板中，将SHSY5Y细胞(4×10⁵个细胞/孔)在胶原覆盖的22mm盖玻片上一式三份地培养，并在悬浊液中使用siRNA复合物进行转染，其中根据制造商的方案用siPORT TMNeoFXTM转染试剂(Ambion)制备siRNA复合物。使用siRNA(Ambion)的杂乱变型(scrambledversion)作为对照。然后将细胞在转染培养基中温育96小时。

显微镜和神经纤维厚度

使用具有20X NA目镜的倒置Olympus IX71显微镜(Olympus,英国滨海绍森德)进行活细胞成像。使用具有100X油浸物镜的竖式Olympus IX51显微镜(Olympus,英国)拍摄荧光图像。通过从纤维网络中随机取12个测量值/样品，并在NIH Image J软件中分析来确定平均纤维厚度。

统计分析

将数据表示为来自三次一式三份地(n＝3)进行的独立实验的平均+/-标准偏差。使用单向ANOVA来计算统计分析，以图基事后检验法(Turkey post hoc test)用于三组之间的比较，并以student’s t检验用于两组之间的比较。在整个分析中选择置信区间为95％并且相应的P值为0.05。

结果

在经ES治疗的创伤中使神经再支配和神经肽合成上调

接着先前发表的实验设计 ²⁹ (材料和方法)，在第3天、第7天、第10天和第14天从40名健康的志愿者的上臂内侧得到经过正常自发愈合和ES治疗的短暂穿刺活组织检查。创伤愈合第14天的初始分析显示，与对照愈合创伤(C14-自发创伤愈合第14天；P<0.05；ES14/C14＝1.45；图1a)相比，经ES治疗的创伤(ES14-经电刺激的创伤愈合第14天)中的蛋白质基因产物9.5(PGP9.5)转录物显著上调。而且，在经ES治疗的创伤中，受伤的人皮肤中PGP9.5⁺神经纤维或P⁺物质(SP)细胞(分别为图1b-d和1e-g；分别为图9a-b和9a-b)的数量显著增加(P<0.05；PGP9.5⁺和SP⁺的ES14/C14分别＝1.44和1.34)。在正常的健康皮肤(第0天)中，细无髓神经纤维分布在整个表皮中，但在颗粒层上疏松地分散。然而，在愈合创伤中，我们从第3天开始在真皮中的少数细胞中观察到了PGP9.5表达，这在比先前看到的时间点更早 ³⁰ 。在愈合第14天的创伤(经ES治疗的和未治疗的)的表皮中，在基底层中的纤维状神经网络显著高于健康皮肤(第0天)。在本文中，经ES治疗的创伤表现出比正常愈合的创伤更多的分支。此外，ES14创伤中的表皮神经纤维厚度比C14创伤高约6％(P>0.05；ES14和C14的神经纤维的平均厚度分别为1.02±0.17μm和0.96±0.17μm，正常的皮肤为1.08±0.15μm)。从蛋白质印迹中还观察到经ES治疗的创伤中上调的PGP9.5和SP表达的确证结果(图1d和g分别对应于PGP9.5和SP)。

在经ES治疗的创伤中使TUBB3和FIG4上调

为了确定ES在神经再支配中的靶标，我们使用微阵列对1)正常的健康皮肤(N0)，2)自发愈合创伤和3)经ES治疗的愈合创伤(2和3两者在创伤愈合第3天、第7天、第10天和第14天)进行全基因组转录谱分析。数据显示，神经分化以及黑素细胞相关基因III型β-微管蛋白(TUBB3) ^31,32 在ES14创伤中高度地上调(P＝6.19×10^-5，ES14/N0＝5.87；P＝4.5×10^-3，C14/N0＝4.4；P>0.05，ES14/C14＝1.33；图2a；补充数据集S1)。随后的qRT-PCR结果显示，分别与C10和C14相比，ES10和ES14中的皮内的TUBB3转录确实上调(P<0.05)(图2b)。通过定量免疫组织化学法(IHC；利用针对TUBB3的特异性单克隆TUJ-1抗体 ³¹ )和蛋白质印迹法对此进行进一步研究。

在正常的健康皮肤中，除了很少的皮内细胞之外，在沿基底层散布的分离细胞中可见TUBB3样免疫反应性(图2c)。在愈合创伤的中心，在正常愈合的创伤和经ES治疗的创伤两者中均在分化的表皮层中看到TUBB3(图2d)。然而，在创伤边缘和临近创伤中心，TUBB3偶然地(haphazardly)散布在基底层细胞中，其以TUBB3⁺树突样结构向表皮的上层分支，到达颗粒层(图2e和2f分别为正常愈合的创伤和经ES治疗的创伤；图11)。IHC结果证实，与正常愈合的创伤相比，经ES治疗的创伤中TUBB3表达的显著上调(P<0.05)(图2g)。在创伤肉芽组织中，TUBB3表达主要受限于创伤肉芽区域的星形和纺锤形细胞(成纤维细胞/肌成纤维细胞)以及衬在新生毛细血管中的极少的细胞(图2h)。用蛋白质印迹的结果证实了，与正常愈合的创伤相比，经ES治疗的治疗创伤中TUBB3蛋白总量上调(图2i和j)。

在微阵列分析中，与C14创伤相比，ES14中的FIG4(神经分化相关标志物¹⁷)显著上调(P<0.05，ES14/C14＝1.12；P>0.05，C14/N0＝0.86；P>0.05，ES14/N0＝1.18；补充数据集S1)。这一点通过qRT-PCR(图3a)、IHC(图3b和c)和蛋白质印迹(图3d和e)分析得到了进一步的证实。在健康皮肤中，FIG4在分化的角质细胞和真皮中极少的分散细胞中表达。然而，在第14天的创伤中，FIG4大量存在于表皮和真皮两者中。在整个修复过程中，FIG4⁺细胞存在于肉芽组织和新生表皮中(图12)。总之，来自TUBB3和FIG4两者表达的定量数据表明ES使细胞分化上调。

ES扩大黑素细胞库，上调黑素细胞中TUBB3的表达并促进皮肤愈合中的黑素生成

为了进一步表征TUBB3，我们检测了黑素细胞中的TUBB3表达(如外周神经元，黑素细胞来源于神经嵴)，因为TUBB3与黑素细胞发育谱系相关 ³³ 。尚未报道过ES对黑素细胞相关基因和基因产物的影响。在本文中，我们采用gp100抗体(区别分化的、黑色素活性黑素细胞、无色素黑素细胞和成黑素细胞 ³⁴ )和Fontana-Masson组织化学法作为黑素细胞/黑素生成读出参数 ³⁵ 。在经ES治疗的创伤中，Gp100上调(P<0.05，ES14/C14＝1.26；所有其他愈合日P>0.05；图4a和图13a)，并且存在于愈合创伤的表皮和真皮两者中(图13a)。然而，与少数未经治疗的创伤相比，主要的gp100⁺细胞群位于经ES治疗的创伤的表皮中。TUBB3与gp100共免疫染色显示，ES上调了表皮内TUBB3/gp100双阳性细胞的数量(P<0.05；ES14/C14＝1.32；4b和c，图13a)。如通过对黑色素的定量Masson-Fontana组织化学法观察到的(图4d和e；图13b)，ES还刺激了表皮内黑素生成(P<0.05)。这些结果表明，ES在促进发育的神经系统外的TUBB3表达、补充黑素细胞以及确定愈合人皮肤中再着色的扩展性中具有潜力。ES上调皮肤肉芽组织中Merkel细胞中的TUBB3和PGP9.5的表达

TUBB3⁺细胞在愈合期间的空间分布提高了这种蛋白质也可以在Merkel细胞中表达的可能性，即，可以连接到感觉神经纤维的机械感觉上皮细胞和神经分泌上皮细胞 ³⁶ 。此外，在正常/再生人皮肤中，尚未引证过Merkel细胞中的TUBB3表达的支持性证据。在本文中，我们采用Merkel细胞选择性细胞角蛋白-CK20作为细胞检测标标志物 ³⁷ 。结果显示，在表皮和真皮区域两者CK20⁺Merkel细胞均随着渐进的愈合天数而增加，尤其是在与对照相比的经ES治疗的创伤中(P>0.05；图5a，图14a和b)。从共表达结果看，极少的CK20⁺细胞也表达TUBB3，并且在表皮和真皮两者中都观察到TUBB3⁺/CK20⁺细胞(图5b和c；图14a)。然而，这部分细胞在表皮中随着随后的伤口愈合天数的增加而增加。有趣的是，与相应的正常愈合创伤相比，ES在愈合第10天和第14天显著地增加TUBB3⁺/CK20⁺细胞(P<0.05，ES10/C10和ES14/C14分别为1.44和1.50；所有其他愈合日P>0.05)。此外，如由CK20/PGP9.5双免疫染色所评价的，ES显著增强Merkel细胞的神经支配(ES14/C14＝1.48，P<0.05；图5d和e，图14b)。在创伤愈合后期，大多数的CK20⁺/PGP9.5⁺细胞集中在真皮中。综上所述，这些数据表明了在ES之后Merkel细胞的不同亚群(TUBB3⁺和PGP9.5⁺)的增加。

在愈合创伤中缺乏增殖黑素细胞和Merkel细胞以及在经ES治疗的创伤中上调的神经生长因子表达

为了更好地理解在施用ES之后如何使黑素细胞和Merkel细胞增加(分别为P<0.05和P>0.05)，进行Ki67/gp100和Ki67/CK20双重免疫染色，从而理解修复过程中细胞增殖的作用。令人惊讶的是，结果显示在愈合创伤适当的位置中黑素细胞和Merkel细胞不存在任何增殖(即Ki67⁺)(图15a和b)。这一发现还在发育生物学角度提出了一个问题，关于Merkel细胞的起源，要么来自基底层细胞的不对称分裂，要么来自神经嵴 ³⁸ 。我们的研究结果表明，ES之后观察到的两种细胞类型的数量增加可能主要是由于增强的驻留前体细胞(如成黑素细胞和Merkel细胞祖细胞)的皮肤内分化和迁移所致。

表皮NGF(神经营养蛋白)在体外与黑素细胞的特异性分化过程(更高的趋化性和树突形成 ¹⁸ )以及不同组织中更高的神经支配密度在一定程度上相关。因此，我们检测了NGF的表达，作为增强神经再支配以及Merkel细胞和黑素细胞数量的合理解释。在本文中，结果显示了ES之后NGF mRNA(P<0.05；ES14/C14＝1.91；图6a)和蛋白质表达(P<0.05；由IHC和蛋白质印迹分析分别为ES14/C14＝1.39和1.52；图6b-e，图16)的显著上调。然而，在修复过程中，仅从第10天起才检测到NGF的皮肤表达。虽然经ES治疗的和未经治疗的创伤的真皮区域中的NGF表达没有显著差异，但在第14天，经ES治疗的创伤的表皮区域的NGF明显较高。这些结果表明了ES介导的NGF的差异调节，这也可以在一定程度上促进由ES加速的愈合(图6f)。

ES上调FIG4表达并增强人成神经细胞瘤细胞的分化

我们观察到严重的创伤中增强的神经再支配之后，进一步研究了ES在体外条件下是否能促进神经分化。由于FIG4在微阵列分析中差异地表达，我们检测了它在神经分化中的作用。在本文中，我们培养SHSY5Y人成神经细胞瘤细胞，并使用视黄酸(RA)和脑源性神经营养因子(BDNF) ⁴⁰ 使其分化(图7a；最初6天RA处理，接着由BDNF处理4天)。NeuN为一种主要的有丝分裂期后的神经核标志物，其在分化的细胞中表现出上调。在本文中，我们观察到分化过程中FIG4表达的增加(图7b)。然而，为了确定ES在神经分化中的作用，除了用RA+BDNF处理细胞之外，还对细胞进行了10天1小时/天的ES。所施加的电场为100mV/mm，因为这个值对应于皮肤创伤愈合中的肉芽组织起始、纤维增生、伤口收缩和新血管形成期间普遍存在的内源性“损伤电流” ^41,42 。与RA+BDNF处理相比，在RA+BDNF+ES处理的第10天，qRT-PCR显示出FIG4的显著增加(P<0.05，增加约1.5倍；图7c)。此外，成神经细胞瘤细胞的蛋白质印迹分析显示II类磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3KII)和FIG4在RA+BDNF+ES处理之后显著上调(P<0.05，分别增加约77％和约43％；图7d和e)。

接着，为了理解在细胞分化过程中FIG4在PIP₃途径(图17a)中的显著性，在成神经细胞瘤细胞中通过siRNA转染抑制FIG4(图17b和c)。在本文中，观察到转染3天后细胞内的液泡生成(图17d)。用通常体现晚期核内体(图8a)的特异性溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)标志物对这些液泡进行免疫组化染色。

随后，我们研究了经siRNA转染的细胞是否进一步能够神经分化，以及ES是否可以影响该过程。为此，我们使经siRNA转染的细胞通过1)RA+BDNF和2)RA+BDNF+ES处理而进行分化。有趣的是，相比于未经ES处理的细胞，经ES处理的细胞显示出更好的分化，伴随更高的细胞核NeuN、FIG4和TUBB3的表达(图8b和8c)。此外，ES之后也使LAMP2表达降低(图8d)。qRT-PCR分析显示，ES后，FIG4mRNA表达增加了2倍(图8e)，这由蛋白质印迹数据得到证实(图8f和8g)。值得注意的是，在mRNA分析和蛋白质分析两者中，FIG4是唯一被ES上调的蛋白质。另外，为了评价细胞分化后的细胞完整性，在最后一天(第10天)将ES施用于经RA+BDNF处理的细胞1小时。令人惊讶的是，在ES处理35分钟内使所有细胞裂解(补充视频S1)，而常规暴露于ES处理的细胞(RA+BDNF+ES)存活(补充视频S2)。这表明了ES在液泡形成之后和进一步分化过程中使神经细胞的完整性恢复的可能性。因此，总的来说，我们的研究表明，ES在人类皮肤修复期间通过靶向诸如TUBB3和FIG4之类的特定蛋白质，从而增强了神经再支配和神经分化。

讨论

据我们所知，这是定量地研究人类皮肤愈合中的神经再支配期间，神经分化生物标志物的表达的第一篇报道。值得注意的是，ES强烈地上调了1)在皮肤创伤中的TUBB3和FIG4表达，2)在创伤黑素细胞和Merkel细胞中的TUBB3表达，2)黑素细胞计数和黑素生成，3)Merkel细胞中的神经再支配，4)创伤肉芽组织中的NGF表达和5)在成神经细胞瘤细胞中液泡生成之后的神经分化以及细胞完整性。综上所述，本研究提供的证据表明，ES可以调节黑素细胞中的色素细胞生物学和正常人皮肤的神经解剖学，刺激驻留的成生黑素细胞和Merkel细胞祖细胞的分化，并有助于公认的皮肤创伤愈合的增强 ^28,43 。

经ES治疗的创伤中，TUBB3的上调以真皮和表皮中外周神经元(细胞体位于别处)的树突过程的增加为特征。有趣的是，Shibazaki等人已注意到TUBB3表达为细胞周期依赖性的，并且由RE-1-沉默转录因子-REST与RE-1元件的结合介导，RE-1元件存在于TUBB3基因的第一个内含子中 ³² 。在这种情况下，可能的是REST-TUBB3轴的调节异常可以引起TUBB3的差异表达。除了TUBB3存在于角质细胞 ¹² 和成纤维细胞 ⁴⁴ 的微管中之外，尚未归因于特定的细胞功能。然而，对成熟黑素细胞中TUBB3的进一步研究表明，它是运输黑素体的驱动蛋白和动力蛋白的微管轨道的活性成分 ³³ 。尚未阐明在修复过程中TUBB3在表皮神经纤维网络中的表达的生理学意义 ⁴⁵ 。

像外周神经元一样，黑素细胞也来源于神经嵴，具有多个树突状突起、相似的受体(如p75^NTR和c-Kit)，并对相同的神经营养因子响应 ⁴⁶ 。NGF与神经/神经细胞相关表面受体-原肌球蛋白受体激酶A结合并启动细胞内的信号转导途径，如促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应、AKT的磷脂酰肌醇-3-激酶刺激以及肌醇三磷酸和甘油二酯的磷脂酶Cγ依赖性生成导致Ca²⁺储存的调动和活化 ¹¹ 。此外，MAPK激酶磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(MAPK家族成员)，导致细胞分化的基因激活。ES增强创伤中的NGF表达，这可以解释黑素细胞的更高趋化性形成邻近的健康的滤泡间表皮 ⁴⁷ 。随后的黑素生成增强是黑素细胞增加或单个细胞中黑素生成加速的二次效应，为再生表皮提供足够的黑色素 ⁴⁸ 。此外，黑素细胞中上调的TUBB3表达也是分化程度较高的指征，其特征为增多的树突形成 ¹⁸ 。

有趣的是，各种药理学治疗已显示通过神经营养因子的过表达来诱导神经突向外生长 ^49,50 。已报道了NGF与ES结合以诱导体外的神经突向外生长 ¹¹ ，其在一定程度上与增强的细胞分化过程相关。在这种情况下，我们观察到ES后，与Merkel细胞的神经末梢相关的与随后的TUBB3表达相似的作用，其可能导致分化的谱系 ⁵¹ 。这些数据提供了对于ES的可能的应用的进一步见解，以增强在毛囊凸起区域内神经支配与未分化/未成熟的Merkel细胞之间的联系。有趣的是，仅在真皮中发现大多数的与PGP9.5⁺细胞接触的CK20⁺细胞。然而，在最终愈合阶段期间，在表皮和真皮两者中均观察到TUBB3⁺/CK20⁺细胞，并且其在表皮中的数量增加。这就引出了这样一个问题，即，在创伤愈合期间，Merkel细胞是否迁移至分化开始后的表皮，或矛盾的是，Merkel细胞必须与神经元接触导向以进行分化吗？

在创伤愈合期间，黑素细胞祖细胞从表皮到确定的滤泡间凸起区域的连续迁移被逆转 ⁴⁸ 。另外，祖细胞离开它们的适当的位置并迁移到创伤部位而没有增殖，例如，黑素细胞干细胞 ⁴⁷ 。与我们在gp100⁺/CK20⁺细胞上的定量IHC结果和使用Ki67抗体的增殖相关联，可以得出结论的是，可以由ES来决定祖细胞迁移和细胞的进一步命运。

在细胞分化期间作为信号转导分子而起作用的磷酸化磷酸肌醇脂质 ⁵² 的合成和更新的调解异常可能导致表型的改变。类似地，FIG4基因中的突变导致神经变性病症，包括Charcot-Marie-Tooth(CMT)疾病和粘多糖症 ⁵³ 。我们关于FIG4抑制的结果与Chow等人一致，其涉及FIG4和PI(5)激酶(Pikfyve)的失活，从而导致磷脂酰肌醇3,5-二磷酸(PI(3,5)P₂)合成的取消而导致晚期胞内体的积累 ⁵³ 。此外，缺乏PI(3,5)P₂导致生理性胞内液泡生成，这是由于由晚期胞内体引起的膜信号转导缺陷所致 ⁵⁴ 。由于尚未对PIP₃途径中的中间体磷酸肌醇进行分析，因而极有可能的是，由缺乏FIG4的液泡生成明显可知，在成神经细胞瘤细胞中发生了PI(3,5)P₂合成的消耗。在我们的研究结果中，液泡具有晚期胞内体生物标记物，这与Zhang等人的研究结果一致。由于在FIG4 siRNA之后的RA+BDNF+ES处理期间未观察到PI3KII的上调(如在未经FIG4 siRNA处理时所观察到的)，因而PI3KII在ES和神经分化中的作用是值得商榷的。

在细胞分化期间质膜中的脂质更新过程中(图17a)，由磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)合成PI(3,5)P₂需要Pikfyve ⁵⁵ 。逆向反应需要PI(3,5)P₂5-磷酸酶FIG4 ⁵⁶ ，而有趣的是，前向和后向反应两者的蛋白质共存于同一蛋白质复合体中 ⁵⁷ 。然而，需要进一步研究ES在这个多重复合体中仅对FIG4的特异性。

最后，肉芽组织中神经肽的明显上调以及经ES治疗的创伤的表皮中神经纤维的时间和空间的进展表明，尽管研究继续进行以检测ES的主要目标，但ES的作用更接近感觉神经。在这种情况下，除了我们的数据显示ES之后增加的细胞生存之外，ES的促进神经/神经相关细胞分化的非侵入性方法表明了ES在组织修复中的新前景和分子靶标。总之，我们的研究结果提供了ES的施用深入地影响黑素细胞、Merkel细胞以及在体内人皮肤创伤的神经再支配的证据。

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序列表

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

MEDLDQSPLVSSSDSPPRPQPAFKYQFVREPEDEEEEEEEEEEDEDEDLEELEVLERKPAAGLSAAPVPTAPAAGAPLMDFGNDFVPPAPRGPLPAAPPVAPERQPSWDPSPVSSTVPAPSPLSAAAVSPSKLPEDDEPPARPPPPPPASVSPQAEPVWTPPAPAPAAPPSTPAAPKRRGSSGSVDETLFALPAASEPVIRSSAENMDLKEQPGNTISAGQEDFPSVLLETAASLPSLSPLSAASFKEHEYLGNLSTVLPTEGTLQENVSEASKEVSEKAKTLLIDRDLTEFSELEYSEMGSSFSVSPKAESAVIVANPREEIIVKNKDEEEKLVSNNILHNQQELPTALTKLVKEDEVVSSEKAKDSFNEKRVAVEAPMREEYADFKPFERVWEVKDSKEDSDMLAAGGKIESNLESKVDKKCFADSLEQTNHEKDSESSNDDTSFPSTPEGIKDRSGAYITCAPFNPAATESIATNIFPLLGDPTSENKTDEKKIEEKKAQIVTEKNTSTKTSNPFLVAAQDSETDYVTTDNLTKVTEEVVANMPEGLTPDLVQEACESELNEVTGTKIAYETKMDLVQTSEVMQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKEKLSALPPEGGKPYLESFKLSLDNTKDTLLPDEVSTLSKKEKIPLQMEELSTAVYSNDDLFISKEAQIRETETFSDSSPIEIIDEFPTLISSKTDSFSKLAREYTDLEVSHKSEIANAPDGAGSLPCTELPHDLSLKNIQPKVEEKISFSDDFSKNGSATSKVLLLPPDVSALATQAEIESIVKPKVLVKEAEKKLPSDTEKEDRSPSAIFSAELSKTSVVDLLYWRDIKKTGVVFGASLFLLLSLTVFSIVSVTAYIALALLSVTISFRIYKGVIQAIQKSDEG HPFRAYLESEVAISEELVQKYSNSALGHVNCTIKELRRLFLVDDLVDSLKFAVLMWVFTYVGALFNGLTLLILALISLFSVPVIYERHQAQIDHYLGLANKNVKDAMAKIQAKIPGLKRKAE

SEQ ID NO:3

SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

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Claims

1.一种促进患者受损神经的再支配的套件，其中所述套件包含(a)能够在与神经损伤部位不同的位置上对患者的皮肤进行电刺激以使得电信号或脉冲不由所述皮肤传导至所述神经损伤部位的装置和(b)促进神经再支配的支架、促进神经再支配的移植物、促进神经再支配的细胞群或促进神经再支配的药物，

其中所述装置对患者的皮肤进行电刺激被配置为使用15Hz至351Hz的波动频率周期对所述患者的所述皮肤进行电刺激，并且其中所述频率在1秒至20秒的周期内的频率范围的上限和下限之间变化。

2.根据权利要求1所述的套件，其中所述不同的位置距所述损伤部位至少1毫米(mm)。

3.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述装置使用一系列(a)信号或脉冲或者(b)交流电(AC)信号或脉冲，以模拟神经冲动波形、非对称波形或双相波形对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

4.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述装置使用0.001毫安(mA)至0.006mA的电流对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

5.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述装置使用10伏特(V)至100V的振幅对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

6.根据前述权利要求1或2所述的套件，其中所述装置使用120赫兹(Hz)至180Hz的频率对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

7.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述装置以断续的周期对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

8.根据权利要求1所述的套件，其中所述装置在一轮治疗结束时进行一个或多个波动频率周期。

9.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述装置使用一系列持续1微秒(μs)至100μs的信号或脉冲对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

10.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述装置使用简并波形对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

11.根据权利要求8所述的套件，其中所述装置通过探测所述皮肤的电阻抗并相应地自动调节电刺激来对所述患者的所述皮肤进行电刺激。

12.根据权利要求1或2所述的套件，其中在治疗之前，所述装置对所述患者的所述皮肤上的特定位置的若干个部位进行电刺激，并且测量在各所述部位处的所述皮肤的阻抗和/或所述皮肤的阻抗变化率，并且其中所述装置通过对阻抗最高的部位和/或阻抗变化率最大的部位进行电刺激来促进神经再支配。

13.根据权利要求1或2所述的套件，在治疗之前，所述装置对所述患者的所述皮肤上的特定位置的若干个部位进行电刺激，并且监视以下方面中的任何变化：(i)所述皮肤的摩擦、(ii)所述患者的感觉、(iii)所述皮肤的颜色或(iv)它们的任意组合，并且其中所述装置通过对(i)至(iv)中有任何变化的部位或(i)至(iv)中变化最显著的部位进行电刺激来促进神经再支配。

14.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述神经为有髓鞘的。

15.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述神经为无髓鞘的。

16.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述电刺激提高所述受损神经的部位处的III类β微管蛋白(TUBB3)和因子诱导的基因4(FIG4)的量。

17.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述移植物为神经移植物、静脉移植物或同种异体神经移植物。

18.根据权利要求1或2所述的套件，其中所述药物为Nogo-66信号转导抑制剂。