ES2925236T3 - Kit para promover la regeneración nerviosa usando estimulación eléctrica - Google Patents

Abstract

Un método para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente que comprende estimular eléctricamente la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del nervio dañado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Kit para promover la regeneración nerviosa usando estimulación eléctrica

Campo de la invención

La invención se refiere a la promoción de la reinervación nerviosa mediante estimulación eléctrica.

Antecedentes de la invención

La reinervación de heridas cutáneas implica eventos regulados secuencialmente que incluyen cambios morfológicos y bioquímicos que conducen a la neurogénesis, la sinaptogénesis y una mayor organización del tejido nervioso12. Por lo tanto, la reinervación de las fibras nerviosas sensoriales aferentes3, caracterizada por la diferenciación neuronal y la síntesis de neuropéptidos funcionales4, tiene lugar a lo largo de la reparación cutánea. Estos neuropéptidos exhiben una señalización paracrina5, que aumenta el proceso de cicatrización en parte al regular la proliferación celular, la producción de factores de crecimiento y citoquinas, y la neovascularización67. La reinervación es la principal responsable del mantenimiento de una epidermis intacta8. Ciertas fibras nerviosas terminan libremente en la dermis9 mientras que en muchas otras, aunque el tronco central termina en la dermis, la ramificación posterior se extiende por toda la epidermis10. Sin embargo, la reinervación del componente epidérmico sigue estando mal caracterizada. Se han propuesto varias hipótesis que involucran interacciones de citoquinas/neurotrofinas para mejorar la reinervación; de hecho, la mayoría de ellas han considerado solo el aspecto inflamatorio del proceso de cicatrización de múltiples etapas8. Además, hay una falta de evidencia sobre la expresión espacial y temporal de las proteínas de diferenciación neurales/relacionadas con los nervios durante la reparación.

La diferenciación neural se caracteriza por el crecimiento temprano de neuritas11 que aumenta la reinervación. Los biomarcadores para la diferenciación neuronal se extienden desde los componentes del huso mitótico12 hasta los dominios de la membrana lipídica13. Aunque una proteína de los microtúbulos, la p-tubulina de clase III (TUBB3), se ha clasificado como marcador específico de la diferenciación neural14 y se ha utilizado para indicar la reinervación en la regeneración de tejidos15, recientemente se ha informado que está asociado en menor medida con múltiples tipos de células16. El Gen 4 inducido por factor (FIG4), que es un componente clave en la síntesis de (3,4,5)-trifosfato de fosfatidilinositol ((PI(3,4,5)P3 o PIP³) en la membrana plasmática, es otro mediador durante la diferenciación neural17. Curiosamente, los promotores de la diferenciación neuronal, como el factor de crecimiento nervioso (NGF), también han demostrado modular la expresión génica en los melanocitos epidérmicos18 y las células de Merkel19.

Se ha demostrado que la estimulación eléctrica (ES) es un modelo in vitro para mejorar los eventos de diferenciación neuronal, facilitados por células2021 o por modificaciones basadas en el sustrato2223. En este contexto, los informes previos han mostrado la ES y la diferenciación neural como resultado del crecimiento de neuritas, la inducción de la tubulina neuronal, el neurofilamento 200 y la expresión génica de c-fos en embriones de pollo24 y ratas25. Sin embargo, hay poca información disponible durante el proceso de reparación en humanos. Es importante destacar que se ha demostrado que ES promueve la reparación de heridas cutáneas2627. Recientemente, se demostró la aceleración en la cicatrización de la piel humana mediante ES con una angiogénesis mejorada28 y mayor tasa de reepitelización29. La justificación para la aplicación exógena de ES es imitar el sistema bioeléctrico in vivo para aumentar la corriente endógena de la herida, que promueve la reparación. Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales la ES impacta en el proceso de cicatrización y las poblaciones de células diana clave siguen siendo desconocidos11.

El documento US2002/0120309 describe un método para estimular la recuperación de daños en los nervios periféricos mediante la aplicación de señales eléctricas a lo largo de un nervio dañado para provocar un potencial de acción en uno o más axones motores. El documento US2013/0178785 describe un sistema para curar heridas/daño de un organismo de sangre caliente utilizando agentes terapéuticos, teniendo el sistema un mecanismo de succión colocado en comunicación fluida con un compartimento, y una fuente de alimentación colocada en comunicación eléctrica con el electrodo.

Sumario de la invención

La invención se define en la reivindicación 1. Otros aspectos y realizaciones preferidas se definen en las reivindicaciones adjuntas. Los aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente descripción que no se hallan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan meramente con fines ilustrativos. Además, los métodos presentados en la presente descripción se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no forman parte de la presente invención.

Los inventores han demostrado sorprendentemente que es posible promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente estimulando eléctricamente la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del nervio dañado. En particular, los inventores han demostrado sorprendentemente que es posible promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente, incluso si la estimulación eléctrica se aplica lo suficientemente lejos del sitio del daño, de forma que las señales o impulsos eléctricos no sean conducidos por la piel al sitio del daño.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1 a 13 ilustran los resultados clínicos que ilustran la reinervación nerviosa en heridas después de la estimulación eléctrica de la piel de un paciente.

Descripción del listado de secuencias

SEQ ID N°: 1 muestra la secuencia de ARNm de la isoforma A de reticulón-4 humano. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/47519458

SEQ ID N°: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la isoforma A de reticulón-4 humano. La secuencia de Nogo-66 está subrayada. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/47519458

SEQ ID N°: 3 muestra la secuencia de ARNm del receptor 1 de Nogo-66 humano (NGRH1). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/AF532858.1

SEQ ID N°: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia del receptor 1 de Nogo-66 humano (NGRH1). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/AF532858.1

SEQ ID N°: 5 muestra la secuencia de ARNm del receptor 2 de Nogo-66 humano (NGRH2). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/AF532859.1

SEQ ID N°: 6 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor 2 de Nogo-66 humano (NGRH2). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/AF532859.1

SEQ ID N°: 7 a 18 son los cebadores directo e inverso usados en los Ejemplos y enumerados en la Tabla 4.

Descripción detallada de las realizaciones

Reinervación

El método se refiere a promover la reinervación de un nervio dañado. Los términos nervio y neurona son intercambiables aquí, por lo que el método puede tratar de promover la reinervación de una neurona dañada. El nervio puede dañarse de cualquier forma, como por una lesión, como una herida, o por una enfermedad o trastorno, como una enfermedad de la piel o un trastorno de la piel. El nervio puede dañarse en cualquier medida. Por ejemplo, el nervio puede estar cortado.

El nervio puede estar mielinizado. El nervio puede ser amielínico.

El nervio dañado puede estar en cualquier parte del paciente. El nervio puede estar presente en el sistema nervioso central (SNC), es decir, está ubicado centralmente o es un nervio central. El nervio puede ser craneal o espinal ubicado centralmente. Los nervios del SNC normalmente son amielínicos. Si el nervio dañado está en el SNC, la estimulación eléctrica de la piel implica inherentemente la estimulación eléctrica en un lugar diferente del sitio del nervio dañado.

El nervio está presente en una realización en el sistema nervioso periférico (SNP), es decir, es un nervio periférico. Los nervios del SNP pueden estar mielinizados o ser amielínicos. El nervio dañado está en una realización en la piel del paciente. El sitio de daño del nervio está en una realización en la piel del paciente. El nervio dañado en una realización inervaba la piel del paciente antes de que se dañara. En tales casos, el método implica estimular eléctricamente la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del daño del nervio en la piel. Las distancias adecuadas entre la ubicación del daño y la ubicación de la estimulación se analizan con más detalle a continuación.

La piel normalmente comprende (a) una epidermis, (b) una dermis y (c) una hipodermis. El nervio dañado o el sitio del daño pueden estar presentes en cualquiera de estos o en cualquier combinación de los mismos, como (a); (b); (C); (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); o (a), (b) y (c). La epidermis normalmente se estimula eléctricamente de acuerdo con un ejemplo.

La reinervación es la restauración del suministro de nervios a una parte del cuerpo en la que se ha perdido. El tratamiento generalmente restaura el suministro del nervio dañado en el sitio del daño. El tratamiento puede ayudar a curar una lesión, como una herida, o un sitio dañado por una enfermedad o trastorno. El tratamiento puede restaurar la inervación del nervio dañado de la piel del paciente.

El tratamiento puede ayudar a restaurar parcialmente el suministro del nervio dañado en el sitio del daño. El tratamiento puede restaurar parcialmente la inervación del nervio dañado de la piel del paciente. Por ejemplo, el suministro del nervio dañado en el sitio del daño o en la piel del paciente puede restaurarse en al menos alrededor del 10 %, al menos alrededor del 20 %, al menos alrededor del 30 %, al menos alrededor del40 %, al menos alrededor del 50%, al menos alrededor del 60%, al menos alrededor del 70%, al menos alrededor del 80% o al menos alrededor del 90%. El tratamiento puede restaurar completamente la inervación del nervio dañado de la piel del paciente. El tratamiento puede restaurar completamente la inervación del nervio dañado de la piel del paciente. La inervación nerviosa puede medirse usando técnicas rutinarias, como las descritas en los Ejemplos. La reinervación se puede medir mediante el aumento de la expresión de p-tubulina de clase III (TUBB3) y Gen 4 inducido por factor (FIG4) en el sitio del nervio dañado. Esto se analiza con más detalle a continuación.

Paciente

Cualquier paciente puede ser tratado. El paciente es típicamente humano. Sin embargo, el paciente puede ser otro animal mamífero, como un animal de granja comercial, como un caballo, una vaca, una oveja, un pez, un pollo o un cerdo, un animal de laboratorio, como un ratón o una rata, o una mascota, como un conejillo de Indias, un hámster, un conejo, un gato o un perro.

El paciente humano puede tener cualquier edad.

Al paciente se le puede haber diagnosticado un nervio dañado, es decir, se sabe que tiene un nervio dañado. El paciente muestra típicamente los síntomas de un nervio dañado, en una realización en la piel. Se puede sospechar que el paciente tiene un nervio dañado. El paciente puede tener una lesión, tal como una herida, o una enfermedad o trastorno, en una realización, una enfermedad o trastorno de la piel.

Estimulación eléctrica

La piel del paciente se puede estimular eléctricamente de cualquier forma. Se pueden usar señales de CA, o las señales se pueden pulsar. Las señales de CA pueden modularse mediante una forma de onda pulsada.

La piel normalmente se estimula eléctricamente con una serie de señales o impulsos. La piel normalmente se estimula eléctricamente con una serie de señales o impulsos de corriente alterna (CA). Las señales o impulsos normalmente se proporcionan en una forma de onda particular. Se puede utilizar cualquier forma de onda. En una realización, la piel se estimula eléctricamente con una forma de onda de impulso nervioso análoga, una forma de onda asimétrica o una forma de onda bifásica. La piel puede estimularse eléctricamente con una forma de onda regenerada. En una realización, la piel se estimula eléctricamente con una forma de onda degenerada. Esto se discute con más detalle más adelante.

La piel del paciente se estimula eléctricamente en una realización con una corriente de aproximadamente 0,001 miliamperios (mA) a 0,006 mA, tal como de aproximadamente 0,002 mA a aproximadamente 0,005 mA o de aproximadamente 0,003 mA a aproximadamente 0,004 mA. En una realización, la piel se estimula eléctricamente con una corriente de aproximadamente 0,004 mA.

En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con una amplitud de aproximadamente 10 voltios (V) a aproximadamente 100 V, tal como de aproximadamente 15 V a aproximadamente 90 V o de aproximadamente 20 V a aproximadamente 80 V.

En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con una frecuencia de aproximadamente 15 hercios (Hz) a aproximadamente 351 Hz, tal como de 50 Hz a aproximadamente 300 Hz, de aproximadamente 80 Hz a aproximadamente 250 Hz o de aproximadamente 100 Hz a aproximadamente 200 Hz. La piel del paciente se estimula eléctricamente en una realización con una frecuencia de aproximadamente 120 Hz a aproximadamente 180 Hz. La piel del paciente se estimula eléctricamente en una realización con una frecuencia centrada a aproximadamente 150 Hz.

En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con un ciclo de frecuencia fluctuante de aproximadamente 15 Hz a aproximadamente 351 Hz (o cualquiera de los rangos descritos anteriormente), en el que la frecuencia cambia dentro de un ciclo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 segundos, tal como de aproximadamente 3 segundos hasta aproximadamente 15 segundos o desde aproximadamente 5 segundos hasta aproximadamente 10 segundos. En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con un ciclo de frecuencia fluctuante de aproximadamente 15 a aproximadamente 351 Hz (o cualquiera de los rangos descritos anteriormente), donde la frecuencia cambia dentro de un ciclo de aproximadamente 8 segundos. En una realización, el ciclo de frecuencia fluctuante se usa al final de una ronda de tratamiento particular por las razones que se analizan a continuación. El método en una realización comprende realizar uno o más, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, ciclos de frecuencia fluctuante al final de una ronda de tratamiento.

La piel del paciente se puede estimular eléctricamente con ciclos interrumpidos. En una realización, los ciclos interrumpidos incluyen cuando la amplitud cae a su mínimo durante una cierta cantidad de tiempo, como alrededor de 0,5 segundos o 1 segundo, y la amplitud está en su cantidad apropiada (como los discutidos anteriormente) por un tiempo diferente, típicamente más largo, y en una realización el doble de la cantidad de tiempo, tal como aproximadamente 1 segundo o aproximadamente 2 segundos.

En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con una serie de señales o impulsos que duran desde aproximadamente 1 microsegundo (gs) hasta aproximadamente 800 gs, como de 2 gs a aproximadamente 700 gs, de aproximadamente 5 gs a aproximadamente 600 gs, desde aproximadamente 10 gs hasta aproximadamente 500 gs, desde aproximadamente 20 gs hasta aproximadamente 300 gs, desde aproximadamente 30 gs hasta aproximadamente 200 gs, o desde aproximadamente 50 gs hasta aproximadamente 100 gs. En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con una serie de señales o impulsos que duran desde aproximadamente 1 microsegundo (gs) hasta aproximadamente 100 gs. En una realización, la piel del paciente se estimula eléctricamente con una serie de señales o impulsos que duran aproximadamente 60 gs.

Ubicación de la estimulación eléctrica

Cualquier parte de la piel (o ubicación en la piel) puede estimularse eléctricamente siempre que se encuentre en un lugar diferente del sitio del daño del nervio. La ubicación diferente está en una realización lo suficientemente lejos del sitio del daño de modo que las señales o impulsos eléctricos no sean conducidos por la piel al sitio del daño. La ubicación diferente es en una realización de al menos aproximadamente 1,0 mm desde el sitio del daño, tal como al menos aproximadamente 1,5 mm, al menos aproximadamente 2,0 mm, al menos aproximadamente 2,5 mm, al menos aproximadamente 3,0 mm, al menos aproximadamente 3,5 mm, al menos aproximadamente 4,0 mm, al menos aproximadamente 4,5 mm, al menos aproximadamente 5,0 mm, al menos aproximadamente 10 mm, al menos aproximadamente 20 mm, al menos aproximadamente 30 mm, al menos aproximadamente 40 mm, al menos aproximadamente 50 mm o al menos aproximadamente 100 mm desde el sitio del daño. La ubicación diferente puede estar más alejada del sitio del daño, tal como al menos aproximadamente 15 centímetros (cm), al menos aproximadamente 20 cm, al menos aproximadamente 30 cm o al menos aproximadamente 50 cm del sitio del daño. En una realización, la estimulación eléctrica se aplica en la misma extremidad o parte del cuerpo que el sitio del daño del nervio para aplicar la estimulación eléctrica en una región cercana pero lo suficientemente lejos del sitio del daño, de modo que las señales eléctricas o los impulsos no se conduzcan por la piel al sitio del daño

Los sitios específicos dentro de las diferentes ubicaciones de la piel pueden estimularse eléctricamente como se describe con más detalle a continuación.

Duración

La piel del paciente se puede estimular eléctricamente durante cualquier período de tiempo. En una realización, los períodos de tiempo oscilan de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente una hora, de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 50 minutos, de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 40 minutos o de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 30 minutos. Como se analiza con más detalle a continuación, en una realización, la estimulación eléctrica de la piel puede implicar la medición de la velocidad de cambio de la impedancia de la piel. En una realización, el tratamiento puede llevarse a cabo hasta que la tasa de cambio de la impedancia de la piel del paciente sea cero.

Número de tratamientos

El paciente puede recibir cualquier número de diferentes rondas de tratamiento (es decir, diferentes rondas de estimulación eléctrica), como alrededor de 5, alrededor de 10, alrededor de 12, alrededor de 15 o alrededor de 20 tratamientos. El paciente puede recibir de alrededor de 1 a alrededor de 10 rondas de tratamiento en las dos primeras semanas.

Las diferentes rondas de tratamientos pueden ser iguales en términos de (a) estimulación eléctrica utilizada, (b) sitios y/o ubicación del tratamiento y (c) duración del tratamiento, o pueden ser diferentes en base a uno o más de (a) a (c), tales como (a); (b); (c); (a) y (b); (a) y (c); (b) y (c); o (a), (b) y (c).

Las diferentes rondas de tratamientos se pueden repartir a lo largo de cualquier período de tiempo, como alrededor de una semana, alrededor de un mes o alrededor de un año. El tratamiento del paciente puede continuar hasta que haya alguna cantidad de restauración del suministro nervioso al sitio dañado. El tratamiento del paciente puede continuar hasta que el nervio dañado se reinerve con éxito.

Formas de ondas degeneradas

La piel del paciente se estimula eléctricamente en una realización con una forma de onda degenerada. Tal forma de onda puede ser bifásica y asimétrica. En una realización, una forma de onda adecuada puede representarse mediante una forma de onda sinusoidal de CA modulada por una forma de onda de diente de sierra para proporcionar pulsos de señales de CA decrecientes. Tal forma de onda se ilustra en las figuras 8 a 13 del documento WO2015/118061.

La piel puede estimularse eléctricamente detectando la impedancia eléctrica de la piel y ajustando automáticamente la estimulación eléctrica en consecuencia. Como se analiza con más detalle a continuación, la estimulación eléctrica en una realización implica medir la impedancia de la piel y/o la velocidad de cambio de la impedancia de la piel. El pliegue de la piel puede formar un puente entre los electrodos del dispositivo utilizado para la estimulación eléctrica y formar así la parte final de un circuito "abierto", de forma que los cambios en el comportamiento eléctrico de la piel alteran el flujo en el circuito de salida.

Antes del tratamiento, el método en un ejemplo comprende estimular eléctricamente varios sitios en un lugar particular de la piel del paciente y medir la impedancia de la piel y/o la velocidad de cambio de la impedancia de la piel en cada sitio. El sitio de la piel con la impedancia más alta (o máxima) y/o que tiene la tasa más alta de cambio de impedancia puede estimularse eléctricamente, por ejemplo, usando uno o más ciclos de frecuencia fluctuante como se describe anteriormente. La estimulación eléctrica utilizada para controlar los cambios en la impedancia de la piel puede ser cualquiera de las discutidas anteriormente.

Antes del tratamiento, el método de un ejemplo comprende estimular eléctricamente varios sitios en un lugar particular de la piel del paciente y controlar cualquier cambio en (i) la fricción de la piel, (ii) la sensación del paciente, (iii) el color de la piel o (iv) cualquier combinación de los mismos, como (i); (ii); (iii); (i) y (ii); (i) y (iii); (ii) y (iii); o (i), (ii) y (iii). El sitio de la piel que muestra cualquier cambio en (i) a (iv) o los cambios más significativos en (i) a (iv) puede estimularse eléctricamente, por ejemplo, usando uno o más ciclos de frecuencia fluctuante como se describe anteriormente. La estimulación eléctrica utilizada para controlar los cambios en (i) a (iv) puede ser cualquiera de las discutidas anteriormente.

Cada sitio puede tener cualquier forma, como un círculo, un cuadrado o un rectángulo. También son posibles otras formas. Cada sitio puede ser de cualquier tamaño, como de aproximadamente 1 cm2 a aproximadamente 20 cm2, de aproximadamente 2 cm2 a aproximadamente 15 cm2 o de aproximadamente 5 cm2 a aproximadamente 10 cm2.

Electrobiorretroalimentación (EBF) o neurobiorretroalimentación (NBF)

La estimulación eléctrica de la piel normalmente da como resultado un ajuste estimulante del propio sistema de autorreparación del cuerpo en el paciente. El ajuste estimulante del propio sistema de autorreparación del cuerpo se utiliza para reinervar el nervio dañado. En otras palabras, la estimulación eléctrica de la piel puede estimular el propio cuerpo del paciente para reinervar el nervio dañado. Esto puede conocerse como electrobiorretroalimentación (EBF) o neurobiorretroalimentación (NBF).

Sin desear limitarse a ninguna teoría, EBF/NBF asume una especie de "diálogo" entre las células de la piel y el sistema nervioso central a través de las fibras nerviosas, en particular las fibras C amielínicas, muy probablemente debido a la ascendencia común de las células de la piel y las células del sistema nervioso central, ambas derivadas embriológicamente del neuroectodermo. Se puede suponer que la piel se puede considerar como un receptor y transmisor del "cerebro periférico" a través del cual se puede iniciar y manifestar un diálogo con el sistema nervioso central. Los cambios dentro del cuerpo, como una patología, pueden dar como resultado una impedancia alterada de la piel que puede ocurrir, por ejemplo, sobre el sitio del órgano enfermo, o incluso puede manifestarse en un área aparentemente no relacionada de la piel. Por lo tanto, los centros específicos del sistema nervioso central, por ejemplo la columna vertebral, pueden abordarse a través de la estimulación eléctrica de la piel (por ejemplo, utilizando una pluralidad de electrones como "sustancia farmacológica" como se analiza con más detalle a continuación). El cuerpo es esencialmente "iniciado" para someterse a un proceso de auto-reparación y cicatrización, y la estimulación eléctrica cuando se aplica en el sitio correcto inicia el sistema de auto-reparación del cuerpo. En este contexto, cabe señalar que la inflamación (junto con el dolor) es uno de los "buscadores de atención" del cuerpo para los sistemas de autoreparación del cuerpo (los "departamentos de trabajo" del cuerpo, por así decirlo). Iniciar un diálogo entre las células de la piel y el SNC puede dar lugar a una alerta del SNC, lo que, a su vez, provoca una asignación de recursos del sistema de auto-reparación del cuerpo. La electroestimulación puede garantizar que esta asignación de recursos se realice de la manera correcta, es decir, apropiada, lo que conduce a una reducción de la inflamación, concomitantemente con el inicio y la finalización exitosa de dicha reparación.

De nuevo, sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que los procesos fisiológicos subyacentes al efecto farmacológico proporcionado por la estimulación eléctrica cuando se aplica a la piel son los siguientes. Como se describió anteriormente, la estimulación eléctrica puede actuar a través de un sistema de biorretroalimentación basado en la reacción a la impedancia de la piel. Las señales o impulsos son típicamente de corta duración (típicamente de alrededor de 1 ps a alrededor de 100 ps, en una realización alrededor de 60 ps) y de amplitud relativamente alta (de alrededor de 10 V a alrededor de 100 V, en una realización alrededor de 80 V). La influencia se controla críticamente mediante una observación cuidadosa utilizando parámetros medidos específicos de la serie de impulsos representados en la pantalla del dispositivo. Debido a la corta duración del impulso, la energía de la señal es extremadamente pequeña y los efectos nocivos son muy poco probables.

Los dispositivos adecuados para el método se describen con más detalle a continuación. El dispositivo normalmente puede detectar las áreas de menor impedancia de la piel en un "área de posibilidad" (entre dos electrodos, por ejemplo, electrodos rectangulares concéntricos) que denota mediante una lectura numérica. El diálogo normalmente se inicia a través de puntos de la piel que tienen baja impedancia, donde la biorretroalimentación es relativamente más activa (y, por lo tanto, más eficaz), especialmente cuando está guiada por la observación de este diálogo por parte de un profesional capacitado. El término "biorretroalimentación", tal como se utiliza aquí, generalmente se refiere a la capacidad de respuesta de la piel frente a la aplicación de la estimulación eléctrica, medida, por ejemplo, por la velocidad de cambio de la impedancia de la piel. La "biorretroalimentación" es "activa" en aquellos sitios donde la velocidad de cambio de la impedancia de la piel es mayor en comparación con los sitios adyacentes. Otros indicadores de "biorretroalimentación" incluyen el enrojecimiento de la piel, la fricción de la piel, la sensación en la piel del paciente y otros parámetros detectables como se ha comentado anteriormente.

A través de las terminaciones nerviosas, los impulsos aferentes de la estimulación eléctrica ingresan en el sistema nervioso central (SNC) en las astas anteriores de la médula espinal. Tanto los nervios mielinizados como los amielínicos son estimulados por los impulsos. Por supremacía numérica, la mayor parte del diálogo tiene lugar a través de las fibras c. Los impulsos típicamente se conducen hacia arriba por los tractos espinotalámicos dorsal y ventral, los tractos espinocerebelosos dorsal y ventral y los tractos espinotectales. También puede haber una contribución a través de las fibras retículo-cerebrales y el tegmento pontino. Se cree que algunos de los efectos facilitadores del sistema electroestimulador están mediados por esta parte de la formación reticular. Anohin demostró la continuación de las comunicaciones de formación reticular más allá del tronco encefálico hacia la corteza con una influencia asociada en las respuestas corticales. Las señales eferentes suelen descender a través de los tractos corticoespinales. Con frecuencia, se influye simultáneamente en más de un nivel segmentario. Esto puede resultar en una recuperación "inesperada" de una patología antigua mientras se trata un síntoma de presentación aparentemente inconexo.

A través de diversos neurotransmisores, las influencias alteran las señales en los focos de dominancia relacionados con los arcos reflejos y la regulación autónoma con la consiguiente influencia distal y la alteración de los impulsos eferentes en los sistemas autónomo y periférico. El grado en que se ven afectadas estas respuestas se ajusta a su vez por el impacto pontino y cortical superior sobre la labilidad del sistema espinal inferior. Los focos en la médula espinal, posiblemente presentes durante muchos años como resultado de una patología no resuelta o resuelta de manera incompleta, pueden ser reestimulados por la electroestimulación para que las vías "normales" puedan reanudar el proceso de resolución "estancado". En la médula espinal prevalece una "jerarquía de dominio" de estos focos. Esta jerarquía puede relacionarse con la ventaja de supervivencia relativa de una dolencia particular o con la adquisición histórica de la patología. Fushpan y Potter (en la década de 1950) demostraron la variabilidad de la respuesta sináptica entre las sinapsis que predominan en la estimulación química y las que predominan en la estimulación eléctrica. Muchos trastornos se relacionan con la química alterada de la transmisión sináptica. Algunos de estos efectos se convierten en procesos "bloqueados" de larga duración (p. ej., Parkinson). La actividad electroestimuladora puede ayudar a romper ciclos crónicos para permitir que se restablezcan patrones de actividad sináptica previamente "saludables".

Las influencias electroestimuladoras pueden tener pequeños efectos locales (es decir, efectos en el nervio dañado) en forma de polarización de moléculas y efectos vasomotores locales; con alguna posible influencia sobre los potenciales graduados localmente. La mediación de las influencias locales se realiza a través de la liberación de neuropéptidos.

La mayor parte de la influencia beneficiosa de la estimulación eléctrica se produce a través de los nervios eferentes del SNC. A nivel segmentario, a veces también hay influencia en las vías del dolor a través de la saturación del transmisor en el sitio de entrada al tracto espinotalámico lateral, particularmente si existe una afectación marcada de la fibra A.

Las señales de electroestimulación actúan sobre ambos arcos reflejos locales (influyendo también en la cadena simpática) con sus efectos concomitantes sobre los órganos internos, vasos y músculos; además de ingresar al SNC a través de los tractos ascendentes para conexiones superiores que conducirán a la liberación general de neuropéptidos (con el efecto resultante sobre la homeostasis general), liberación endocrina, influencia parasimpática y señales eferentes por los tractos corticoespinales a los niveles relevantes. Los procesos de control de la enfermedad y el dolor con esta forma de electroestimulación están mediados principalmente a través de los impulsos descendentes en el SNC a un nivel apropiado para la liberación subsiguiente de neuropéptidos "locales" periféricos. La mediación adicional está influenciada a través del sistema nervioso autónomo tanto a través de los efectos locales como de la fisiología general.

Al final de una ronda de tratamiento, se puede seleccionar un protocolo de "modulación de frecuencia". Esto se discutió anteriormente en términos de un ciclo de frecuencia fluctuante. En este proceso, se le puede pedir a la señal de salida del dispositivo que pase por un rango de frecuencias como se describió anteriormente, como desde alrededor de 15 a alrededor de 351 Hz en un ciclo de alrededor de 8 segundos. Se cree que el valor principal de este proceso se basa en el hecho de que el "final" de un tratamiento de biorretroalimentación en un punto específico de la piel conduce a una prolongación del pulso de onda como parte de un ciclo de comunicación específico a través de un arco reflejo o una vía espino-cerebral. Esta comunicación "dominante" es la parte más significativa del estímulo curativo. Pero existen otras vías de comunicación asociadas, que son accesorias al proceso focal, o están vinculadas a una patología previa, que se ven afectadas por el proceso dominante. Estas vías accesorias pueden funcionar a diferentes frecuencias y no pueden ser abordadas simultáneamente por la forma de onda principal durante el proceso de biorretroalimentación. Nuevamente, sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que ciclando a través del rango de frecuencias se alcanzan estas otras redes accesorias.

Un método para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente a través de la piel del paciente comprende las etapas de (a) estimular eléctricamente la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del nervio dañado; (b) detectar cambios en la impedancia de la piel y generar señales de salida que representen la impedancia de la piel; (c) controlar la capacidad de respuesta de la piel; y (d) indicar en primer lugar cuando se alcanza un nivel predeterminado de respuesta y en segundo lugar cuando se ha administrado un tratamiento predeterminado.

Un método para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente a través de la piel del paciente comprende las etapas de: (a) colocar un par de electrodos en contacto con la piel en un lugar diferente del sitio del nervio dañado; (b) estimular eléctricamente la piel del paciente a través de los electrodos; (c) detectar cambios en la impedancia de la piel y generar señales de salida que representen la impedancia de la piel; (d) controlar la capacidad de respuesta de la piel; y (e) indicar en primer lugar cuándo se alcanza un nivel predeterminado de respuesta y en segundo lugar cuándo se ha administrado un tratamiento predeterminado.

En un método alternativo como se discutió anteriormente, la piel se estimula eléctricamente en las posiciones indicadas (es decir, sitios) secuencialmente. La biorretroalimentación de la piel se mide y registra, por ejemplo, midiendo la impedancia de la piel y su velocidad de cambio. Esto se realiza para una serie de sitios adyacentes, y el sitio que tiene la biorretroalimentación más fuerte, como la tasa más alta de cambio de impedancia de la piel o el sitio que tiene la mayor diferencia local de impedancia de la piel o el sitio que tiene una tasa de cambio de impedancia de la piel superior a los sitios adyacentes, se trata adicionalmente mediante estimulación eléctrica con la misma duración inicial y la misma amplitud inicial, durante un período definido de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 5 minutos y, opcionalmente, hasta que la impedancia de la piel ya no cambie. Esto también se denomina a veces "técnica numérica", sin que dicho término implique necesariamente que se adopte un enfoque estrictamente cuantitativo. Por ejemplo, la interfaz de usuario del dispositivo utilizado no tiene que ser numérica en sentido literal; es suficiente si dicha interfaz de usuario permite una comparación cualitativa de las impedancias de la piel o de las tasas de cambio de la impedancia de la piel en diferentes sitios.

Dispositivo

La piel normalmente se estimula eléctricamente usando un dispositivo que tiene electrodos. Puede usarse cualquier dispositivo conocido en la técnica. El dispositivo es en una realización un dispositivo de baja intensidad. El dispositivo en una realización produce una serie de señales o impulsos de corriente alterna (CA). Las señales o impulsos se producen típicamente en una forma de onda particular. Puede utilizarse cualquier forma de onda en las realizaciones de la invención. El dispositivo en una realización produce una forma de onda de impulso nervioso análoga, una forma de onda asimétrica o una forma de onda bifásica. El dispositivo en una realización produce una forma de onda degenerada. El dispositivo en una realización detecta la impedancia eléctrica de la piel y ajusta automáticamente su salida en consecuencia.

Las alteraciones de la impedancia de la piel, que se producen como resultado tanto del estado local como general, pueden, por ejemplo, representarse numéricamente en el dispositivo e influir en la siguiente señal de salida del dispositivo. Alternativamente, las alteraciones de la impedancia de la piel también pueden ser representadas por el dispositivo a través de señales audibles o detectables de otro modo, o señales tanto audibles como visuales. Además, varios otros aspectos del intercambio de señales entre la piel y el dispositivo pueden representarse numéricamente en la pantalla del dispositivo (amplitud, tasa, gradiente, velocidad, etc.) o pueden representarse mediante señales audibles u otras señales detectables. Algunos de estos números utilizan algoritmos matemáticos para poder generar el mejor uso posible del diálogo electroestimulador. El médico utiliza las representaciones numéricas o de otro tipo para guiar los procesos de tratamiento, a través de una serie de protocolos. La intención es guiar los focos del SNC bloqueados o alterados hacia un estado de restauración; iniciando o reestimulando así los procesos normales de reparación; tanto a nivel central como local. Debido al fuerte componente del SNC (frente al local) del proceso de intercambio, los focos "antiguos" de los estados patológicos previos pueden ser influenciados simultáneamente, lo que lleva a una resolución final inesperada de estados patológicos pasados.

Un dispositivo adecuado para ser utilizado en las realizaciones de la invención se ha descrito, por ejemplo, en el documento WO 2005/118061. Tal dispositivo comprende, por ejemplo, un par de electrodos para el contacto con la piel; un generador de formas de ondas para generar repetidamente una forma de onda de CA para aplicar impulsos eléctricos a través de los electrodos a la piel; un detector para detectar cambios en la impedancia de la piel y para generar señales de salida que representan una impedancia de la piel; medios sensibles a las señales de salida del detector para monitorizar la capacidad de respuesta de la piel; y medios indicadores para generar una primera indicación cuando se alcanza un nivel predeterminado de respuesta y una segunda indicación cuando se ha administrado un tratamiento predeterminado. En este dispositivo, las alteraciones de la impedancia de la piel que se producen como resultado de cambios tanto en el estado local como general se representan numéricamente en una pantalla del dispositivo e influyen en la siguiente señal de salida del dispositivo. Además, varios otros aspectos del intercambio de señales entre la piel y el dispositivo de tratamiento pueden representarse numéricamente en la pantalla, como la amplitud, la frecuencia, el gradiente, la velocidad, etc. Algunos de estos números usan algoritmos matemáticos para poder generar el mejor aprovechamiento posible del diálogo electroestimulador. Las representaciones numéricas pueden luego ser utilizadas por el médico para guiar los procesos de tratamiento a través de una serie de protocolos. La intención es guiar los centros bloqueados o perturbados dentro del sistema nervioso central, que en la presente memoria también se denominan focos del SNC hasta un estado restaurador, iniciando o reestimulando así los procesos normales de reparación, tanto a nivel central como local. Debido al fuerte componente del SNC (frente al local) del proceso de intercambio de diálogo, los focos "antiguos" de los estados patológicos previos pueden verse influenciados simultáneamente, lo que también conduce a resoluciones inesperadas de estados de enfermedad pasados. El dispositivo se puede realizar en forma de un dispositivo portátil alimentado por batería.

En una realización, los medios de detección generan señales de salida en forma de pulsos cuya duración representa la impedancia de la piel; los medios de monitorización miden la duración t de cada pulso; y el medio indicador está dispuesto para generar cada indicación cuando t satisface una función predeterminada oft. El medio indicador está dispuesto en una realización para generar la primera indicación cuando t² = 4,087 t¹07131 y generar la segunda indicación cuando dZ/bT = 0, en la que Z = impedancia de la piel. Los impulsos eléctricos generados por el dispositivo portátil suelen tener una amplitud inicial alta y una duración breve, como se ha descrito anteriormente. El tratamiento resultante no es invasivo y no genera efectos secundarios nocivos.

El dispositivo se puede realizar en forma de un dispositivo portátil alimentado por una batería.

La piel puede estimularse eléctricamente utilizando cualquier dispositivo en el que la señal de salida dependa de las propiedades eléctricas de la piel que completan el circuito, ya sea que un médico encuentre el sitio de aplicación manualmente o lo "encuentre" automáticamente por medio de una serie de electrodos donde se usa una programación electrónica para evaluar el diálogo entre pares de electrodos de modo que el enfoque del tratamiento pueda enfocarse alrededor de aquellos que muestran la mejor respuesta. El dispositivo puede incluso ser un dispositivo portátil.

El dispositivo se puede usar de cualquiera de las maneras discutidas anteriormente.

Terapia de combinación

La estimulación eléctrica de la piel puede administrarse en combinación con una o más terapias destinadas a reinervar el nervio dañado. Una combinación significa que las terapias pueden administrarse simultáneamente al paciente. Las terapias pueden administrarse por separado o secuencialmente, en cualquier orden, a un paciente como parte del mismo régimen terapéutico. Por ejemplo, la estimulación eléctrica puede usarse en combinación con otra terapia destinada a reinervar el nervio dañado. La otra terapia puede ser una terapia general destinada a tratar o mejorar el estado del paciente. Por ejemplo, el tratamiento con metotrexato, glucocorticoides, salicilatos, medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), analgésicos, otros FARME, aminosalicilatos, corticosteroides y/o agentes inmunomoduladores (p. ej., 6-mercaptopurina y azatioprina) pueden combinarse con la estimulación eléctrica. La otra terapia puede ser un tratamiento específico dirigido al daño sufrido por el paciente, o dirigido a un síntoma particular del daño. En una realización, las sustancias y composiciones para usar en combinación con la estimulación eléctrica comprenden un armazón que promueve la reinervación, un injerto que promueve la reinervación, una población de células que promueve la reinervación o un fármaco que promueve la reinervación. Estos se discuten con más detalle a continuación. El producto farmacéutico es en una realización un inhibidor de la señalización de Nogo-66.

Pluralidad de electrones

Una realización de la invención también proporciona una pluralidad de electrones para su uso en un método para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente, en el que la pluralidad de electrones se administra a la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del daño del nervio. La pluralidad de electrones puede administrarse en cualquiera de las formas descritas anteriormente, como una serie de señales o impulsos o una forma de onda, como se describió anteriormente. La pluralidad de electrones puede administrarse en cualquiera de los sitios o ubicaciones discutidos anteriormente. La pluralidad de electrones puede administrarse de cualquiera de las maneras discutidas anteriormente.

Resultados clínicos

Los siguientes resultados clínicos se obtuvieron en heridas en el brazo de pacientes con el dispositivo como se describe en el documento WO2005/118061 utilizado para aplicar la estimulación eléctrica en el brazo de los pacientes. Se utilizó una forma de onda degenerativa para la estimulación eléctrica.

Figura 1: Mayor reinervación y síntesis de neuropéptidos en heridas tratadas con ES en comparación con heridas en cicatrización normal, (a) La qRT-PCR de PGP9.5 mostró una estimulación en heridas tratadas con ES el día 14. (b) Análisis IHC de la expresión de PGP9.5 en piel normal (NS; día 0), heridas C14 (cicatrización espontánea el día 14) y ES14 (cicatrización estimulada eléctricamente el día 14). (c) La IHC mostró un aumento del ~ 44% en células PGP9.5+ en ES14 en comparación con las heridas C14. (d) La transferencia de Western de PGP9.5 mostró una regulación positiva en las heridas ES14. (e) Expresión de la sustancia P (SP) en piel normal y una imagen representativa de la expresión de SP en el día 14. Las líneas punteadas separan la epidermis de la dermis. (f) La IHC mostró ~ 34% de aumento en células SP+ en ES14 en comparación con las heridas C14. Esto también apoya la mejora de la reinervación cutánea mediante ES. (g) La transferencia de Western también mostró una estimulación de la SP post-ES.

Heridas en cicatrización normal (control),

Heridas tratadas con ES. La barra de escala es de 100 pm.

* Indica significación estadística.

Figura 2: Aumento de la expresión de TUBB3 post-ES en la cicatrización de la piel humana in vivo. (a) El análisis de micromatrices de ES14 y la piel sana normal muestra una estimulación de TUBB3. ES D14 y Normal D0 son heridas tratadas con ES hasta el día 14 y piel sana normal, respectivamente, (b) La qRT-PCR de TUBB3 mostró un aumento del ~ 70 y 28 % en heridas tratadas con ES en comparación con la cicatrización normal, en los días 10 y 14 respectivamente. (c) Expresión de la proteína TUBB3 en piel normal. (d) Expresión de TUBB3 en el centro de la herida (una imagen representativa de la cicatrización en el día 14). (e) Expresión de TUBB3 en heridas C14 y (f) ES14. (g) El análisis inmunohistoquímico cuantitativo mostró que ~ 67% y 34% más células eran TUBB3+ en ES10 y ES14 respectivamente, en comparación con las correspondientes heridas normales en cicatrización (C10 y C14). (h) Expresión de TUBB3 en el compartimento dérmico de la herida, especialmente tinción de neocapilares (una imagen representativa de la cicatrización en el día 14). (i) Transferencia de Western de TUBB3 en los días 10 y 14. (j) Análisis de la intensidad de la banda de la transferencia de Western de TUBB3. EP es la epidermis, DER es la dermis, DL es

la diferenciación de las capas epidérmicas, SB es el estrato basal, NS es la piel sana normal (Día 0), G 3 heridas en cicatrización normal (control),

heridas tratadas con ES. La barra de escala es de 100 pm.

Indica significación estadística.

Figura 3: ES mejora la expresión de FIG4 en heridas cutáneas agudas. (a) La qRT-PCR de FIG4 mostró un aumento del ~ 70 % en las heridas tratadas con ES en comparación con la cicatrización normal en el día 14. (b) Expresión de la proteína FIG4 en piel normal, heridas C14 y heridas ES14. (c) El análisis inmunohistoquímico cuantitativo mostró que un ~ 40% más de células eran FIG4+ en ES10 y ES14 respectivamente, en comparación con las correspondientes heridas normales en cicatrización (C10 y C14). (d) Transferencia de Western de FIG4 en los días 10 y 14. (e) El análisis de las intensidades de las bandas de la transferencia de Western de FIG4 mostró un aumento del ~ 110 % y ~ 50 % en ES7 y ES14 respectivamente, en comparación con las heridas de cicatrización normal correspondientes (C7 y

C14). NS es piel sana normal (Día 0),

heridas en cicatrización normal (control),

heridas tratadas con ES. La barra de escala es de 100 pm.

Indica significación estadística.

Figura 4: ES amplía el grupo de melanocitos y promueve la melanogénesis en la cicatrización de la piel humana in vivo. (a) Análisis cuantitativo de células gp100+ en la cicatrización de la piel humana. (b) La coexpresión de TUBB3 / gp100 (imágenes combinadas) mostró una estimulación de las células TUBB3+/gp100+ en la epidermis de heridas tratadas con ES14. Las líneas punteadas separan la epidermis de la dermis. (c) Cuantificación de células TUBB3+/gp100+ en la cicatrización de heridas, (d) El análisis de la melanogénesis mediante histoquímica de Masson-Fontana se observó principalmente en las células de la capa basal de la epidermis humana y se estimuló en heridas tratadas con ES. (e) Análisis cuantitativo de melanogénesis mediante histoquímica de Masson-Fontana. NS es piel

sana normal (

es de 100 pm.

Indica significación estadística.

Figura 5: La ES estimula las expresiones de TUBB3 y PGP9.5 en las células de Merkel en la cicatrización de piel humana in vivo. (a) Análisis cuantitativo de células CK20+ en la cicatrización de piel humana. (b) La coexpresión de TUBB3/CK20 (imágenes combinadas) mostró la estimulación de las células TUBB3+/CK20+ en la epidermis de heridas ES14. (c) Cuantificación de células TUBB3+/CK20+ en la cicatrización de heridas. (d) Reinervación como se muestra con la coexpresión de PGP9.5/CK20 (imágenes combinadas), (e) Cuantificación de células PGP9.5+/CK20+. Las heridas ES14 mostraron un número significativamente mayor de células PGP9.5+/CK20+ que las heridas C14. NS es

piel sana normal (Día 0), heridas en cicatrización normal (control), heridas tratadas con ES. La barra de escala es de 100 pm. Las líneas punteadas separan la epidermis de la dermis.

Indica significación estadística.

Figura 6: Proliferación inalterada de melanocitos y células de Merkel, y expresión de NGF regulada positivamente por ES. (a) La qRT-PCR de NGF mostró un aumento de ~ 1,46 y 1,91 veces en las heridas tratadas con ES en comparación con las heridas en cicatrización normal, en los días 10 y 14 respectivamente. (b) Expresión de la proteína NGF en piel normal, heridas C14 y ES14. (c) El análisis cuantitativo de IHC mostró un aumento de 1,25 y 1,39 veces en las heridas ES10 y ES14, en comparación con las heridas C10 y C14, respectivamente. (d) Análisis mediante transferencia Western de NGF en piel normal y heridas en cicatrización. (e) El análisis cuantitativo de la transferencia de Western mostró una estimulación de NGF en las heridas ES14 en comparación con las heridas C14. (f) Representación esquemática de los eventos de reinervación previos en heridas tratadas con ES y heridas en proceso de cicatrización normal. La estimulación de neurotrofina (NGF) en las heridas tratadas con ES conduce a una mayor quimiotaxia, así como a una diferenciación celular neural/relacionada con los nervios, lo que da como resultado una mayor magnitud

de reinervación del tejido. NS es piel sana normal (Día 0), heridas en cicatrización normal (control), heridas tratadas con ES. La barra de escala es de 100 pm.

Indica significación estadística.

Figura 7: La aplicación de ES mejora la diferenciación de células de neuroblastoma SHSY5Y humano. (a) Las células de neuroblastoma se diferenciaron mediante el tratamiento con "ácido retinoico (RA) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)", y las células diferenciadas mostraron una expresión estimulada de NeuN. NeuN es un antígeno fosforilado múltiple, cuya concentración en los núcleos es inversamente proporcional a la cromatina (ADN). (b) FIG4 también se estimuló después del tratamiento con RA BDNF. (c) La qRT-PCR mostró una expresión estimulada de FIG4 después del tratamiento con RA BDNF ES en comparación con el tratamiento con RA BDNF. La línea punteada representa las células de neuroblastoma SHSY5Y indiferenciadas. (d) Análisis mediante transferencia de Western de la vía de síntesis de PIP3. (e) La cuantificación de las bandas de la transferencia de Western mostró un aumento significativo en las expresiones de las proteínas PI3KII y FIG4 después de ES. UDN son neuronas indiferenciadas y DN son neuronas diferenciadas. La barra de escala es de 50 pm.

Células tratadas con RA+BDNF durante 10 días.

Células tratadas con RA+BDNF+ES durante 6 días.

Células tratadas con RA+BDNF+ES durante 8 días.

Células tratadas con RA+BDNF+ES durante 10 días.

neuronas indiferenciadas,

células tratadas con RA+BDNF+ES,

células tratadas con RA+BDNF

* Indica significación estadística.

Figura 8: La ES mejora la diferenciación de células de neuroblastoma SHSY5Y humano después del tratamiento con ARNip de FIG4. (a) Expresión de LAMP2 que indica la formación tardía de endosomas en células de neuroblastoma sin tratamiento y tras el tratamiento de FIG4. LAMP2 es un marcador para la etapa tardía del endosoma, lo que conduce además a la formación de vacuolas. (b) Las células sometidas a tratamiento con RA+BDNF+ES post-ARNip de FIG4 tenían una mayor expresión de NeuN en comparación con las células de control que no estaban expuestas a ES. (c) FIG4 también se estimuló después del tratamiento con ES en comparación con las células de control, (d) LAMP2 disminuyó en las células sometidas a ES tras el tratamiento con ARNip de FIG4 en comparación con las células de control que no se expusieron a ES. (e) La expresión de ARNm mostró niveles más altos de FIG4 en RA+BDNF+ES después del tratamiento con ARNip de FIG4 en comparación con las células no expuestas a ES. La línea punteada representa células de neuroblastoma SHSY5Y indiferenciadas después del tratamiento con ARNip de FIG4. (f) Análisis de transferencia de Western de la vía de síntesis de PIP3 después del tratamiento con ARNip de FIG4. (g) La cuantificación de las bandas de transferencia de Western mostró un aumento significativo de la expresión de la proteína FIG4 después del tratamiento con RA+BDNF+ES en comparación con las células de control que no se expusieron a ES. La barra de escala es de 50 pm.

Células tratadas con RA+BDNF después del tratamiento con ARNip de FIG4.

Células tratadas con RA+BDNF+ES después del tratamiento con ARNip de FIG4.

IS l Células tratadas con ARNip de FIG4,

células tratadas con RA+BDNF+ES después del tratamiento con ARNip de FIG4.

Células tratadas con RA+BDNF después del tratamiento con ARNip de FIG4.

Indica significación estadística.

Figura 9: PGP9.5 (análisis de reinervación) en heridas cutáneas humanas. (a) IHC de la expresión de PGP9.5. En la epidermis, se detectaron inicialmente señales de PGP9.5 más débiles en el día 3 de cicatrización, que se fortalecieron en el día 14. "C" indica heridas en cicatrización espontánea y "ES" indica heridas en cicatrización estimuladas eléctricamente. (b) La cuantificación de las intensidades de las bandas de transferencia de Western para PGP9.5 mostró una mayor expresión de proteína en las heridas ES14 en comparación con las heridas C14. ES indica heridas en cicatrización estimuladas eléctricamente. (b) La cuantificación de las intensidades de las bandas de transferencia de Western para PGP9.5 mostró una mayor expresión de proteína en las heridas ES14 en comparación con las heridas C14. Clave como en la Figura 1.

Figura 10: Sustancia P (expresión de neuropéptidos) en heridas cutáneas humanas. (a) IHC de la expresión de SP. De manera similar a la expresión de PGP9.5, la expresión de SP fue débil hasta el día 10 en la epidermis de las heridas en proceso de cicatrización. (b) La cuantificación de las intensidades de las bandas de transferencia de Western para SP mostró una mayor expresión de proteína en las heridas ES14 en comparación con las heridas C14.

Clave como en la Figura 1.

Figura 11: Imágenes de IHC de la expresión de TUBB3 en heridas en proceso de cicatrización. Se observó una expresión de TUBB3 estimulada en las heridas cutáneas tratadas con ES en comparación con la cicatrización espontánea normal. En todas las imágenes, las líneas punteadas separan la epidermis de la dermis.

Figura 12: Imágenes de IHC de la expresión de FIG4 en las heridas en proceso de cicatrización. Se observó una expresión de TUBB3 estimulada en las heridas cutáneas tratadas con ES en comparación con la cicatrización espontánea normal. En todas las imágenes, las líneas punteadas separan la epidermis de la dermis.

Figura 13: La ES regula la expresión de TUBB3 y mejora la melanogénesis en la cicatrización de la piel humana. (a) La coexpresión de TUBB3/gp100 mostró una estimulación de las células TUBB3+/gp100+ en la epidermis de las heridas ES14. (b) El análisis de la melanogénesis mediante histoquímica de Masson-Fontana mostró una estimulación en las células de la capa basal de la epidermis humana en cicatrización después de la ES. NS es piel normal (Día 0). La barra de escala es de 100 gm. Clave como en la Figura 1.

Figura 14: Expresiones de TUBB3 y PGP9.5 estimuladas en las células de Merkel después del tratamiento con ES en heridas cutáneas humanas. (a) IHC de la coexpresión de TUBB3/CK20 en heridas en cicatrización cutánea humana sometida a tratamiento con ES y heridas en cicatrización normal. (b) Imágenes de la coexpresión de PGP9.5/CK20 de heridas en cicatrización normal y heridas tratadas con ES. NS es piel normal (Día 0). La barra de escala es de 100 gm.

Figura 15: Análisis de la proliferación de melanocitos y células de Merkel en heridas en cicatrización normal de piel humana. (a) Los análisis de coexpresión de Ki67/gp100 y (b) Ki67/CK20 no mostraron diferencias significativas en la proliferación celular entre las heridas en cicatrización normal y las tratadas con ES. NS es piel normal. La barra de escala es de 100 gm.

Figura 16: Expresión de NGF estimulada en heridas tratadas con ES en comparación con heridas en cicatrización normal en la piel humana. IHC de NGF en heridas en cicatrización en los días 10 y 14. El nivel de expresión de NGF fue significativamente más bajo en todos los demás días de cicatrización (antes de 10) para la observación y la cuantificación adicional. La barra de escala es de 100 gm.

Figura 17: (a) Vía de síntesis de PIP3. (b) Las células de neuroblastoma SHSY5Y se transfectaron con ARNip de SIVA1 (5 nM y 10 nM). Noventa y seis horas después de la transfección, se extrajeron las proteínas y se sometieron a análisis de transferencia de Western. La inactivación eficaz se logró a una concentración de 10 nM del ARNip de transfección. (c) Expresión de ARNm después de la inactivación del gen SIVA1. (d) Vacuologénesis post-tratamiento con ARNip de FIG4 en células SHSY5Y indiferenciadas. La barra de escala es de 10 gm.

Aunque estos resultados clínicos muestran la eficacia del tratamiento del daño del nervio en las heridas, el método de estimulación eléctrica no se limita a la reinervación de los nervios dañados en las heridas. Es aplicable a cualquier forma de daño de nervios.

Sustancias o composiciones

Se puede proporcionar una sustancia o composición para su uso en un método que promueva la reinervación de un nervio dañado en un paciente, en el que el método comprende administrar la sustancia o composición al paciente en combinación con una estimulación eléctrica de la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del daño del nervio.

La estimulación eléctrica de la piel del paciente se definió anteriormente, y es aplicable cualquiera de las formas discutidas anteriormente. La terapia de combinación también se definió anteriormente.

La sustancia o composición es en una realización un armazón que promueve la reinervación, un injerto que promueve la reinervación, una población de células que promueve la reinervación o un fármaco que promueve la reinervación.

Se puede utilizar cualquier armazón que promueva la reinervación. El armazón puede comprender una o más fibras biocompatibles. Una fibra es biocompatible si no provoca reacciones adversas o efectos secundarios cuando entra en contacto con un tejido dañado. Puede haber presente cualquier número de fibras biocompatibles, como más de una fibra, como al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos al menos 200, al menos 500 fibras, al menos 1000 fibras o incluso más fibras.

Las fibras biocompatibles adecuadas se conocen en la técnica. La o las fibras biocompatibles pueden ser naturales o sintéticas. Las fibras biocompatibles pueden incluir, entre otras, fibras de celulosa, fibras de colágeno, fibras de colágeno-glucosaminoglicano, fibras de gelatina, fibras de fibroína de seda, una o más fibras de fibrina, fibras de quitosano, fibras de almidón, fibras de alginato, fibras de hialuronano, fibras de poloxámero o una combinación de las mismas. El glucosaminoglicano es en una realización condroitina. La celulosa es en una realización carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o metilcelulosa. El poloxámero es en una realización ácido plurónico, opcionalmente Pluronic F-127. Si hay presente más de una fibra en la composición, la población de fibras puede ser homogénea. En otras palabras, todas las fibras de la población pueden ser del mismo tipo de fibra, p. ej., fibras de celulosa. Alternativamente, la población de fibras puede ser heterogénea. En otras palabras, la población de fibras puede contener diferentes tipos de fibra, tales como fibras de celulosa y fibras de colágeno.

La o las fibras pueden tener cualquier longitud. La o las fibras tienen en una realización aproximadamente la misma longitud que la profundidad del daño, que se va a tratar usando la composición. La longitud de una o más fibras está diseñada en una realización de modo que la composición pueda penetrar en un tejido dañado hasta una profundidad prescrita. La o las fibras pueden tener cualquier longitud. El límite inferior de la longitud de una o más fibras se determina típicamente por el diámetro de una o más células terapéuticas. Las longitudes adecuadas incluyen, pero sin limitación, al menos 1 gm de longitud, al menos 10 gm de longitud, al menos 100 gm de longitud, al menos 500 gm de longitud, al menos 1 mm de longitud, al menos 10 mm (1 cm) de longitud, al menos 100 mm (10 cm) de longitud, al menos 500 mm (50 cm) de longitud o al menos 1000 mm (100 cm o 1 m) de longitud. La o las fibras pueden ser incluso más largas. Por ejemplo, una o más fibras pueden tener una longitud de hasta 5 m o 10 m, por ejemplo, si se usan para reparar daños a lo largo del tracto intestinal humano, o incluso más largas si se usan en animales más grandes, como caballos. La longitud de una o más fibras se determina típicamente por su uso previsto y/o su capacidad para ser manipuladas, por ejemplo, por un cirujano, por un robot o por algún otro medio, como magnéticamente.

El armazón puede comprender un adhesivo biocompatible que une una o más células terapéuticas a una o más fibras. El adhesivo biocompatible puede unir una o más células terapéuticas (a) sobre la superficie de una o más fibras, (b) dentro de una o más fibras o (c) tanto sobre la superficie como dentro de una o más fibras.

El adhesivo biocompatible puede ser natural o sintético. Los adhesivos biocompatibles adecuados se conocen en la técnica. Los adhesivos adecuados incluyen, entre otros, fibrina, gel de fibrina, integrina, gel de integrina, cadherina y gel de cadherina.

El armazón puede comprender un gel biocompatible. Los geles biocompatibles adecuados se conocen en la técnica. El gel biocompatible puede ser natural o sintético. Los geles biocompatibles pueden incluir, entre otros, un gel de celulosa, un gel de colágeno, un gel de gelatina, un gel de fibrina, un gel de quitosano, un gel de almidón, un gel de alginato, un gel de hialuronano, un gel de agarosa, un gel de poloxámero o una combinación de los mismos. El gel de celulosa se puede formar a partir de cualquiera de las celulosas discutidas anteriormente. La concentración de polímero de celulosa es en una realización de aproximadamente 1,5 % (p/p) a aproximadamente 4,0 % (p/p), tal como de aproximadamente 2,0 % (p/p) a aproximadamente 3,0 % (p/p). El polímero de celulosa en una realización tiene un peso molecular de aproximadamente 450.000 a aproximadamente 4.000.000, tal como de aproximadamente 500.000 a aproximadamente 3.500.000, de aproximadamente 500.000 a aproximadamente 3.000.000 o de aproximadamente 750.000 a aproximadamente 2.500.000, o de aproximadamente 1.000.000 a aproximadamente 2.0000.000

El gel de poloxámero es en una realización un gel de ácido plurónico, opcionalmente un gel Pluronic F-127. El adhesivo y/o gel en una realización tiene una viscosidad en el rango de 1000 a 500000 mPa^s (cps) a temperatura ambiente, tal como de aproximadamente 1500 a aproximadamente 450 000 mPa^s a temperatura ambiente, de aproximadamente 2000 a aproximadamente 400 000 mPa^s a temperatura ambiente, de aproximadamente 2500 a aproximadamente 350000 mPa^s a temperatura ambiente, de aproximadamente 5000 a aproximadamente 300000 mPâ s a temperatura ambiente, de aproximadamente 10000 a aproximadamente 250000 mPa^s a temperatura ambiente, de aproximadamente 50000 a aproximadamente 200000 mPa^sa temperatura ambiente o de aproximadamente 50000 a aproximadamente 150000 mPa^sa temperatura ambiente.

La viscosidad es una medida de la resistencia del adhesivo y/o gel a ser deformado por esfuerzo cortante o esfuerzo de tracción. La viscosidad se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica. Los métodos adecuados incluyen, pero sin limitación, usar un viscosímetro o un reómetro.

La temperatura ambiente es típicamente de alrededor de 18 °C a alrededor de 25 °C, tal como de alrededor de 19 °C a alrededor de 24 °C o de alrededor de 20 °C a alrededor de 23 °C o de alrededor de 21 °C a alrededor de 22 °C. La temperatura ambiente es en una realización cualquiera de 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C y 25 °C. La viscosidad se puede medir a 25 °C.

En cualquiera de las realizaciones discutidas anteriormente, el adhesivo biocompatible y/o el gel biocompatible en una realización comprende un lisado de plaquetas. Por ejemplo, el adhesivo y/o el gel pueden ser un gel de lisado de plaquetas. El lisado de plaquetas se refiere a la combinación de factores de crecimiento naturales contenidos en las plaquetas que se ha liberado mediante la lisis de esas plaquetas. La lisis se puede lograr por medios químicos (es decir, CaCl²), medios osmóticos (uso de H²O destilada) o mediante procedimientos de congelación/descongelación. El lisado de plaquetas puede derivar de sangre completa como se describe en la pat. de EE. UU. N.° 5.198.357. El lisado de plaquetas se prepara en una realización como se describe en el documento PCT/GB12/052911 (publicado como WO 2013/076507). Por ejemplo, puede prepararse sometiendo una población de plaquetas a al menos un ciclo de congelación-descongelación, en el que la porción de congelación de cada ciclo se lleva a cabo a una temperatura inferior o igual a -78 °C. El lisado de plaquetas es en una realización un lisado de plaquetas humanas. El lisado de plaquetas se analiza con más detalle a continuación.

En una realización, el injerto es un injerto de nervio, un injerto de vena o un injerto de nervio aloplástico. Las técnicas de injerto adecuadas se conocen en la técnica. El injerto puede ser un autoinjerto, un aloinjerto o un xenoinjerto. Los injertos aloplásticos adecuados incluyen, entre otros, conductos de colágeno, tubos de silicona, un tubo de ácido poliglicólico, como Neurotube®, filamentos y tubos de perineuro.

La población de células es en una realización una población de células terapéuticas. Las células terapéuticas son células que son capaces de tener un efecto terapéutico. Las células terapéuticas son típicamente células vivas. Las células terapéuticas son típicamente células que son capaces de reparar tejidos dañados, como los nervios. Las células terapéuticas son en una realización autólogas. En otras palabras, las células derivan en una realización del paciente al que se administrarán las células. Alternativamente, las células son en una realización alogénicas. En otras palabras, las células derivan en una realización de un paciente que es inmunológicamente compatible con el paciente al que se administrarán las células. Las células pueden ser semi-alogénicas. Las poblaciones semialogénicas normalmente se producen a partir de dos o más pacientes que son inmunológicamente compatibles con el paciente al que se administrarán las células. En otras palabras, las células son en una realización genéticamente idénticas al paciente al que se administrarán o suficientemente idénticas genéticamente para que las células sean inmunológicamente compatibles con el paciente al que se administrarán.

Puede administrarse cualquier número de células. La población típicamente comprende al menos alrededor de 2, al menos alrededor de 5, al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 30, al menos alrededor de 40, al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 1000, al menos alrededor de 2000, al menos alrededor de 5000, al menos alrededor de 10000, al menos alrededor de 50000, al menos alrededor de 100000, al menos alrededor de 5 x 105, al menos alrededor de 1 x 106, al menos alrededor de 2 x 106, al menos alrededor de 5 x 106, al menos alrededor de 1 x 107, al menos alrededor de 2 x 107, al menos alrededor de 5 x 107, al menos alrededor de 1 x 108 o al menos alrededor de 2 x 108 células. En algunos casos, pueden administrarse al menos alrededor de 1,0 x 107, al menos alrededor de 1,0 x 108, al menos alrededor de 1,0 x 109, al menos alrededor de 1,0 x 1010, al menos alrededor de 1,0 x 1011 o al menos alrededor de 1,0 x 1012 células o incluso más células.

La población de células puede ser homogénea. En otras palabras, todas las células de la población pueden ser del mismo tipo de célula, p. ej. células madre mesenquimatosas (MSC). Alternativamente, la población de células puede ser heterogénea. En otras palabras, la población de células puede contener diferentes tipos de células, tales como MSC y células progenitoras de linaje mesodérmico (PML).

Las células pueden ser las células progenitoras de linaje mesodérmico (PML) descritas en el documento PCT/GB2012/051600 (publicado como WO 2013/005053).

Las células pueden ser células madre mesenquimatosas (MSC). Las MSC adecuadas se conocen en la técnica. Las MSC adecuadas están disponibles comercialmente en Mesoblast® Ltd, Osiris Therapeutics® Inc. o Lonza®. Las MSC humanas se obtienen en una realización de Lonza®.

Las células pueden ser células precursoras mesenquimatosas (MPC). Las células pueden ser células precursoras mesenquimatosas humanas (MPC).

Las células pueden ser células dendríticas, plaquetas, fibroblastos o miofibroblastos.

Las células pueden ser células madre embrionarias (ES), como células ES humanas, o células madre pluripotentes inducidas (células iPS), como células iPS humanas. Las técnicas para obtener dichas células se conocen en la técnica.

En una realización, las células son humanas.

Las células generalmente se cultivan in vitro antes de ser administradas. Las técnicas para cultivar células son muy conocidas para un experto en la técnica. Las células pueden cultivarse en condiciones estándar de 37 °C, CO² al 5% en medio sin suero.

Las células se pueden modificar ex vivo utilizando cualquier técnica conocida. Por ejemplo, la población puede transfectarse o cargarse con agentes terapéuticos o de diagnóstico.

El producto farmacéutico en una realización comprende una molécula pequeña, una proteína, un anticuerpo, un polinucleótido, un oligonucleótido, un ARN antisentido, ARN de interferencia pequeño (ARNip) o ARN de horquilla pequeña (ARNsh). El producto farmacéutico es en una realización parte de una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable como se define a continuación.

El fármaco es en una realización un factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante (TGF) o N-acetilcisteína. Se puede administrar cualquier combinación de estos.

Inhibidores del inhibidor del crecimiento de neuritas-66 (Nogo-66)

El producto farmacéutico es en una realización un inhibidor de la señalización de Nogo-66. La sustancia es en una realización un inhibidor de la señalización de Nogo-66, y el nervio dañado está en el sistema nervioso central (SNC).

Nogo-66 es un dominio de 66 aminoácidos de Nogo (también conocido como reticulón-4) que inhibe el crecimiento de neuritas en el sistema nervioso central.

Un inhibidor de la señalización de Nogo-66 es cualquier molécula que disminuya o reduzca la señalización de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la señalización de Nogo-66 en cualquier cantidad. Por ejemplo, la señalización puede reducirse al menos un 10 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos 95%. Un inhibidor puede suprimir la señalización de Nogo-66 (es decir, la función disminuye en un 100 %). La señalización de Nogo-66 puede medirse usando técnicas conocidas. La medida en que un inhibidor afecta a Nogo-66 puede determinarse midiendo la señalización en células, como los oligodendrocitos, en presencia y ausencia del inhibidor. La actividad del inhibidor puede medirse determinando el efecto del inhibidor sobre la capacidad de un ligando del receptor de Nogo-66 de activar cualquiera de las vías de transducción de señales del receptor de Nogo-66 usando ensayos conocidos. Los inhibidores también se pueden ensayar utilizando ensayos conocidos de angiogénesis.

El inhibidor puede afectar la señalización de Nogo-66 de cualquier manera. Por ejemplo, el inhibidor puede disminuir la cantidad del receptor de Nogo-66, por ejemplo al disminuir la expresión o aumentar la degradación del receptor de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la actividad del receptor de Nogo-66, por ejemplo, uniéndose al receptor de Nogo-66 o a la(s) molécula(s) que activa(n) el receptor de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la cantidad y/o la actividad de Nogo-66.

El inhibidor puede ser un inhibidor competitivo (que se une al sitio activo de la molécula a la que se une) o un inhibidor alostérico (que no se une al sitio activo de la molécula a la que se une). El inhibidor puede ser reversible. El inhibidor puede ser irreversible.

Inhibidores del receptor de Nogo-66

El inhibidor es en una realización un inhibidor del receptor de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la producción o expresión del receptor de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la transcripción del receptor de Nogo-66. El inhibidor puede alterar el ADN del receptor de Nogo-66, por ejemplo, mediante mutagénesis específica de sitio utilizando métodos como las nucleasas con dedos de zinc. El inhibidor puede disminuir el nivel de ARNm del receptor de Nogo-66 o interferir con el procesamiento del ARNm del receptor de Nogo-66, por ejemplo, mediante ARN antisentido o interferencia de ARN. Esto se discute con más detalle más adelante.

El inhibidor puede aumentar la degradación de proteínas del receptor de Nogo-66. El inhibidor puede aumentar el nivel de inhibidores naturales del receptor de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la función del receptor de Nogo-66 mediante fosforilación inhibidora, ubiquitilación, sumoilación o similares.

El inhibidor del receptor de Nogo-66 es en una realización un inhibidor de molécula pequeña, una proteína, un anticuerpo, un polinucleótido, un oligonucleótido, un ARN antisentido, ARN de interferencia pequeño (ARNip) o ARN de horquilla pequeña (ARNsh).

El inhibidor del receptor de Nogo-66 puede ser una proteína. El inhibidor es en una realización una forma de función reducida del receptor de Nogo-66. La función de la forma de función reducida se puede reducir/disminuir en cualquier cantidad. Por ejemplo, la función se puede reducir/disminuir en al menos un 10 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % en comparación con el receptor de Nogo-66 de tipo natural. El inhibidor puede ser una forma no funcional del receptor de Nogo-66. Una forma de función reducida o no funcional del receptor de Nogo-66 competirá con el receptor de Nogo-66 nativo (es decir, de tipo natural) y reducirá la señalización de Nogo-66.

NGRH1 y NGRH 2 median en las respuestas celulares a Nogo-66. Las secuencias de aminoácidos de NGRH1 y NGRH2 humanos se muestran en SEQ ID N°: 4 y 6. El inhibidor es en una realización una variante de función reducida o una variante no funcional de SEQ ID N°: 4 o 6. Una variante de función reducida es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la de SEQ ID N°: 4 o 6 y tiene una capacidad reducida/disminuida de formar un receptor de Nogo-66 funcional o activar rutas de transducción de señales. La función se puede reducir/disminuir en cualquier cantidad, como se explicó anteriormente. Una variante no funcional es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la de SEQ ID N°: 4 o 6 y no tiene la capacidad de formar un receptor de Nogo-66 funcional o activar las vías de transducción de señales. Por ejemplo, la variante no funcional puede tener una o más mutaciones en el sitio que forma el receptor dimérico o interactúa con las vías de transducción de señales. La variante no funcional también puede ser una forma truncada que secuestra Nogo-66 u otros ligandos del receptor de Nogo-66. La variante no funcional también puede ser una forma soluble del receptor que secuestra Nogo-66 u otros ligandos del receptor de Nogo-66. La capacidad de una variante de funcionar como receptor de Nogo-66 puede ensayarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. La capacidad funcional comparativa de las variantes de función reducida y no funcionales se mide típicamente en comparación con el receptor de Nogo-66 de tipo natural, como SEQ ID N°: 4 o 6.

A lo largo de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 4 o 6, una variante de función reducida o no funcional será en una realización al menos un 50 % homóloga a esa secuencia basada en la identidad de aminoácidos, es decir, tendrá al menos un 50% de identidad de aminoácidos en toda la secuencia. En una realización, la variante de función reducida o no funcional puede ser al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % y en una realización al menos el 95 %, 97 % o 99% homóloga basada en la identidad de aminoácidos (o idéntica) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 4 o 6 a lo largo de toda la secuencia. Puede haber al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 85 %, un 90 % o un 95 % de identidad de aminoácidos en un tramo de 100 o más, por ejemplo, 200 o 300 o más, aminoácidos contiguos ("homología dura").

Pueden usarse métodos estándar en la técnica para determinar la homología. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT, que se puede usar para calcular la homología, por ejemplo, se usa en su configuración predeterminada (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, págs. 387-395). Se pueden usar los algoritmos PILEUP y BLAST para calcular la homología o alinear secuencias (como identificar residuos equivalentes o secuencias correspondientes (normalmente en su configuración predeterminada)), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F y otros (1990) J Mol Biol 215:403-10. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 4 o 6, por ejemplo, de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50, 100 o 200 sustituciones. Las sustituciones conservativas reemplazan los aminoácidos con otros aminoácidos de estructura química similar, propiedades químicas similares o volumen similar de la cadena lateral. Los aminoácidos introducidos pueden tener una polaridad, hidrofilia, hidrofobia, basicidad, acidez, neutralidad o carga similar a la de los aminoácidos que reemplazan. Alternativamente, la sustitución conservativa puede introducir otro aminoácido que sea aromático o alifático en lugar de un aminoácido aromático o alifático preexistente. Los cambios conservativos de aminoácidos son muy conocidos en la técnica, y pueden seleccionarse de acuerdo con las propiedades de los 20 aminoácidos principales como se define en la Tabla a continuación. Cuando los aminoácidos tienen una polaridad similar, esto también se puede determinar con referencia a la escala de hidropatía para las cadenas laterales de los aminoácidos en la segunda tabla a continuación.

Tabla - Propiedades químicas de los aminoácidos

Tabla - Escala de hidropatía

Uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 4 o 6 pueden eliminarse adicionalmente de los polipéptidos descritos anteriormente. Se pueden eliminar hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 o 50 residuos, o más.

Las variantes de función reducida o no funcionales pueden incluir fragmentos de SEQ ID N°: 4 o 6. Dichos fragmentos normalmente retienen el dominio de SEQ ID N°: 4 o 6 que se une a Nogo-66 u otros ligandos del receptor de Nogo-66 pero son de función reducida o no funcionales. Los fragmentos pueden tener una longitud de al menos 200, 300, 400 o 500 aminoácidos. Se pueden añadir uno o más aminoácidos alternativa o adicionalmente a los polipéptidos descritos anteriormente.

Alternativamente, el inhibidor puede ser un polinucleótido que codifica una variante no funcional o de función reducida del receptor de Nogo-66. La variante de función reducida o no funcional puede ser cualquiera de las discutidas anteriormente.

Un polinucleótido, como un ácido nucleico, es un polímero que comprende dos o más nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser naturales o artificiales. Un nucleótido normalmente contiene una nucleobase, un azúcar y al menos un grupo de enlace, tal como un grupo fosfato, 2'O-metilo, 2'-metoxietilo, fosforamidato, metilfosfonato o fosforotioato. La nucleobase es típicamente heterocíclica. Las nucleobases incluyen, pero sin limitación, purinas y pirimidinas y más específicamente adenina (A), guanina (G), timina (T), uracilo (U) y citosina (C). El azúcar es típicamente un azúcar de pentosa. Los azúcares de nucleótidos incluyen, pero sin limitación, ribosa y desoxirribosa. El nucleótido es típicamente un ribonucleótido o desoxirribonucleótido. El nucleótido contiene típicamente un monofosfato, difosfato o trifosfato. Los fosfatos se pueden unir en el lado 5' o 3' de un nucleótido.

Los nucleótidos incluyen, entre otros, monofosfato de adenosina (AMP), difosfato de adenosina (ADP), trifosfato de adenosina (ATP), monofosfato de guanosina (GMP), difosfato de guanosina (GDP), trifosfato de guanosina (GTP), monofosfato de timidina (TMP) , difosfato de timidina (TDP), trifosfato de timidina (TTP), monofosfato de uridina (UMP), difosfato de uridina (UDP), trifosfato de uridina (UTP), monofosfato de citidina (CMP), difosfato de citidina (CDP), trifosfato de citidina (CTP), monofosfato de 5-metilcitidina, difosfato de 5-metilcitidina, trifosfato de 5-metilcitidina, monofosfato de 5-hidroximetilcitidina, difosfato de 5-hidroximetilcitidina, trifosfato de 5-hidroximetilcitidina, monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), monofosfato de guanosina cíclico (cGMP), monofosfato de desoxiadenosina (dAMP), difosfato de desoxiadenosina (dADP), trifosfato de desoxiadenosina (dATP), monofosfato de desoxiguanosina (dGMP), difosfato de desoxiguanosina (dGDP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), monofosfato de desoxitimidina (dTMP), difosfato de desoxitimidina (dTDP), trifosfato de desoxitimidina (dTTP), monofosfato de desoxiuridina (dUMP), difosfato de desoxiuridina (dUDP), trifosfato de desoxiuridina (dUTP), monofosfato de desoxicitidina (dCMP), difosfato de desoxicitidina (dCDP) y trifosfato de desoxicitidina (dCTP), monofosfato de 5-metil-2'-desoxicitidina, difosfato de 5-metil-2'-desoxicitidina, trifosfato de 5-metil-2'-desoxicitidina, monofosfato de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina, difosfato de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina y trifosfato de 5-hidroximetil-2'-desoxicitidina. Los nucleótidos se seleccionan en una realización de AMP, TMP, GMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP o dCMP.

Los nucleótidos pueden contener modificaciones adicionales. En particular, los nucleótidos modificados adecuados incluyen, entre otros, 2'-aminopirimidinas (tales como 2'-aminocitidina y 2'-aminouridina), 2'-hidroxilpurinas (tales como 2'-fluoropirimidinas (tales como como 2'-fluorocitidina y 2'-fluorouridina), hidroxilpirimidinas (como 5'-a-P-boranouridina), 2'-O-metilnucleótidos (como 2'-O-metil adenosina, 2'-O-metil guanosina, 2'-O-metilcitidina y 2'-O-metiluridina), 4'-tiopirimidinas (como 4'-tiouridina y 4'-tiocitidina) y nucleótidos que tienen modificaciones de la nucleobase (como 5-pentinil-2'-desoxiuridina, 5-(3-aminopropil)-uridina y 1,6-diaminohexil-N-5-carbamoilmetiluridina).

Uno o más nucleótidos del polinucleótido pueden estar oxidados o metilados. Uno o más nucleótidos del polinucleótido pueden estar dañados. Por ejemplo, el polinucleótido puede comprender un dímero de pirimidina. Dichos dímeros se asocian típicamente al daño por luz ultravioleta.

Los nucleótidos del polinucleótido pueden estar unidos entre sí de cualquier manera. Los nucleótidos pueden estar unidos por enlaces fosfato, 2'O-metilo, 2'-metoxietilo, fosforamidato, metilfosfonato o fosforotioato. Los nucleótidos suelen estar unidos por sus grupos azúcar y fosfato como en los ácidos nucleicos. Los nucleótidos pueden estar conectados a través de sus nucleobases como en los dímeros de pirimidina.

El polinucleótido puede ser un ácido nucleico, como el ácido desoxirribonucleico (ADN) o un ácido ribonucleico (ARN). El polinucleótido puede ser cualquier ácido nucleico sintético conocido en la técnica, como ácido nucleico peptídico (PNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), ácido nucleico de treosa (TNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de morfolino u otros polímeros sintéticos con cadenas laterales de nucleótidos. El polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario.

La secuencia de polinucleótidos en una realización codifica una variante de función reducida o no funcional de SEQ ID N°: 4 o 6 como se discutió anteriormente. La secuencia de polinucleótidos en una realización comprende una variante de SEQ ID N°: 3 o 5 con al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de homología basada en la identidad de nucleótidos a lo largo de la secuencia completa, es decir, la identidad de nucleótidos a lo largo de las secuencias completas. Puede haber al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 85 %, un 90 % o un 95 % de identidad de nucleótidos en un tramo de 300 o más, por ejemplo, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 o más, nucleótidos contiguos ("homología dura"). La homología se puede calcular como se describió anteriormente.

Las secuencias de polinucleótidos se pueden derivar y replicar usando métodos estándar en la técnica, por ejemplo usando PCR que involucra cebadores específicos. Es sencillo generar secuencias de polinucleótidos utilizando tales técnicas estándar.

Las secuencias amplificadas pueden incorporarse en un vector replicable recombinante tal como un vector de clonación. El vector puede usarse para replicar el polinucleótido en una célula huésped compatible. Por lo tanto, las secuencias de polinucleótidos pueden prepararse introduciendo el polinucleótido en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que provoquen la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Las células huésped adecuadas para la clonación de polinucleótidos se conocen en la técnica y se describen con más detalle a continuación.

La secuencia de polinucleótidos se puede clonar en cualquier vector de expresión adecuado. En un vector de expresión, la secuencia de polinucleótidos que codifica una construcción normalmente se une de forma operable a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por parte de la célula huésped. Dichos vectores de expresión se pueden usar para expresar una construcción.

La expresión "unido de forma operable" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida de forma operable" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logre en condiciones compatibles con las secuencias de control. Se pueden introducir en el vector múltiples copias del mismo o diferente polinucleótido.

A continuación, el vector de expresión puede introducirse en una célula huésped adecuada. Por lo tanto, se puede producir una construcción insertando una secuencia polinucleotídica que codifica una construcción en un vector de expresión, introduciendo el vector en una célula huésped bacteriana compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que provocan la expresión de la secuencia polinucleotídica. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos, virales o fagos provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicha secuencia polinucleotídica y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo, un gen de resistencia a la ampicilina. Los promotores y otras señales de regulación de la expresión pueden seleccionarse para que sean compatibles con la célula huésped para la que se diseña el vector de expresión. Típicamente se usa un promotor de T7, trc, lac, ara o A^l.

La célula huésped normalmente expresa la construcción a alto nivel. Las células huésped transformadas con una secuencia polinucleotídica que codifica una construcción se elegirán para que sean compatibles con el vector de expresión utilizado para transformar la célula. La célula huésped es típicamente bacteriana, y en una realización E. coli. Cualquier célula con un lisógeno A DE3, por ejemplo C41 (DE3), ^b L21 (DE3), JM109 (DE3), B834 (DE3), TUNER, Origami y Origami B, puede expresar un vector que comprende el promotor T7.

Los inhibidores del receptor de Nogo-66 también pueden reducir las cantidades del receptor de Nogo-66 presentes en el paciente o en el SNC, por ejemplo, al anular la expresión del receptor de Nogo-66. La tecnología antisentido y de ARN de interferencia (ARNi) para anular la expresión de proteínas es muy conocida en la técnica, y se pueden emplear métodos estándar para anular la expresión del receptor de Nogo-66.

Tanto la tecnología antisentido como la de ARNip interfieren con el ARNm. Los oligonucleótidos antisentido interfieren con el ARNm uniéndose a (hibridando con) una sección del ARNm. Por lo tanto, el oligonucleótido antisentido está diseñado para ser complementario al ARNm (aunque el oligonucleótido no tiene que ser un 100 % complementario como se analiza a continuación). En otras palabras, el oligonucleótido antisentido puede ser una sección del ADNc. Nuevamente, la secuencia de oligonucleótidos puede no ser un 100% idéntica a la secuencia de ADNc. Esto también se discute a continuación.

El ARNi implica el uso de ARN de doble cadena, como el ARN de interferencia pequeño (ARNip) o el ARN de horquilla pequeña (ARNsh), que pueden unirse al ARNm e inhibir la expresión de proteínas.

Por consiguiente, el inhibidor en una realización comprende un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una parte del ARNm del receptor de Nogo-66. El inhibidor en una realización comprende un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una parte de SEQ ID N°: 3 o 5 (ARNm de NGRH1 o NGRH2 humano). Los oligonucleótidos son polímeros de nucleótidos cortos que típicamente tienen 50 o menos nucleótidos, tal como 40 o menos, 30 o menos, 22 o menos, 21 o menos, 20 o menos, 10 o menos o 5 o menos nucleótidos. El oligonucleótido utilizado en un ejemplo tiene una longitud de 20 a 25 nucleótidos, en una realización de 21 ó 22 nucleótidos de longitud. Los nucleótidos pueden ser naturales o artificiales. Los nucleótidos pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente.

Un oligonucleótido en una realización se hibrida específicamente con una parte de SEQ ID N°: 3 o 5, en lo sucesivo denominada secuencia diana. La longitud de la secuencia diana normalmente corresponde a la longitud del oligonucleótido. Por ejemplo, un oligonucleótido de 21 ó 22 nucleótidos típicamente hibrida específicamente con una secuencia diana de 21 ó 22 nucleótidos. Por lo tanto, la secuencia diana puede tener cualquiera de las longitudes discutidas anteriormente con referencia a la longitud del oligonucleótido. La secuencia diana es típicamente nucleótidos consecutivos dentro del polinucleótido objetivo.

Un oligonucleótido "hibrida específicamente" con una secuencia diana cuando en una realización hibrida con o tiene una alta afinidad por la secuencia diana pero no hibrida sustancialmente, no hibrida o hibrida solo con baja afinidad con otras secuencias.

Un oligonucleótido "hibrida específicamente" si hibrida con la secuencia diana con una temperatura de fusión (Tm) que es al menos 2 °C, como al menos 3 °C, al menos 4 °C, al menos 5 °C, al menos 6 °C, al menos 7 °C, al menos 8 °C, al menos 9 °C o al menos 10 °C, mayor que su Tm para otras secuencias. En una realización, el oligonucleótido hibrida con la secuencia diana con una Tm que es al menos 2 °C, como al menos 3 °C, al menos 4 °C, al menos 5 °C, al menos 6 °C, al menos 7 °C, al menos 8 °C, al menos 9 ° C, al menos 10 °C, al menos 20 °C, al menos 30 °C o al menos 40 °C, mayor que su Tm para otros ácidos nucleicos. En una realización, la porción hibrida con la secuencia diana con una Tm que es al menos 2 °C, como al menos 3 °C, al menos 4 °C, al menos 5 °C, al menos 6 °C, al menos 7 °C, al menos 8 °C, al menos 9 ° C, al menos 10 °C, al menos 20 °C, al menos 30 °C o al menos 40 °C, mayor que su Tm para una secuencia que difiere de la secuencia diana en uno o más nucleótidos, tal como en 1, 2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos. La porción típicamente hibrida con la secuencia diana con una Tm de al menos 90 °C, tal como al menos 92 °C o al menos 95 °C. La Tm puede medirse experimentalmente utilizando técnicas conocidas, incluido el uso de micromatrices de ADN, o puede calcularse utilizando calculadoras de Tm disponibles públicamente, como las disponibles en Internet.

Las condiciones que permiten la hibridación son muy conocidas en la técnica (por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; y Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York (1995)). La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de baja rigurosidad, por ejemplo, en presencia de una disolución tamponada del 30 al 35 % de formamida, NaCl 1 M y SDS (dodecilsulfato de sodio) al 1 % a 37 °C, seguido de un lavado con SSC desde 1X (Na+ 0,1650 M) a 2X (Na+ 0,33 M) (citrato de sodio estándar) a 50 °C. La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de rigurosidad moderadas, por ejemplo, en presencia de una solución tampón del 40 al 45 % de formamida, NaCl 1 M y SDS al 1 % a 37 °C, seguido de un lavado con SSC desde 0,5X (Na+ 0,0825 M) a 1X (Na+ 0,1650 M) a 55 °C. La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, en presencia de una disolución tamponada de formamida al 50 %, NaCl 1 M, SDS al 1 % a 37 °C, seguida de un lavado con SSC 0,1X (Na+ 0,0165 M) a 60 °C.

El oligonucleótido puede comprender una secuencia que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana. Típicamente, los oligonucleótidos son complementarios al 100 %. Sin embargo, también pueden ser aceptables niveles más bajos de complementariedad, como un 95 %, 90 %, 85 % e incluso 80 %. La complementariedad por debajo del 100 % es aceptable siempre que los oligonucleótidos hibriden específicamente con la secuencia diana. Por lo tanto, un oligonucleótido puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más emparejamientos incorrectos en una región de 5, 10, 15, 20, 21, 22, 30, 40 o 50 nucleótidos.

Alternativamente, el inhibidor en una realización comprende un oligonucleótido que comprende 50 o menos nucleótidos consecutivos del complemento inverso de SEQ ID N°: 3 o 5. El oligonucleótido puede tener cualquiera de las longitudes discutidas anteriormente. En una realización, tiene 21 o 22 nucleótidos de longitud. El oligonucleótido puede comprender cualquiera de los nucleótidos discutidos anteriormente, incluidos los nucleótidos modificados.

El oligonucleótido puede ser un ácido nucleico, como cualquiera de los discutidos anteriormente. El oligonucleótido es en una realización ARN.

El oligonucleótido puede ser monocatenario. El oligonucleótido puede ser bicatenario. El oligonucleótido puede comprender una horquilla.

Los oligonucleótidos se pueden sintetizar utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Alternativamente, se pueden comprar los oligonucleótidos.

El inhibidor es en una realización un anticuerpo que se une específicamente al receptor de Nogo-66. El anticuerpo en una realización se une a la secuencia que se muestra en SEQ ID N°: 4 o 6.

Un anticuerpo "se une específicamente" a una proteína cuando se une con una afinidad preferencial o alta a esa proteína, pero no se une sustancialmente, no se une o se une solo con una afinidad baja a otras proteínas. Por ejemplo, un anticuerpo "se une específicamente" a SEQ ID N°: 31 cuando se une con una afinidad preferencial o alta a SEQ ID N°: 31, pero no se une sustancialmente, no se une o se une solo con baja afinidad a otras proteínas humanas.

Un anticuerpo se une con una afinidad preferencial o alta si se une con una Kd de 1 x 10-7 M o menos, en una realización 5 x 10-8 M o menos, en una realización 1 x 10-8 M o menos o en una realización 5 x 10-9 M o menos. Un anticuerpo se une con baja afinidad si se une con una Kd de 1 x 10-6 M o más, en una realización 1 x 10-5 M o más, en una realización 1 x 10-4 M o más, en una realización 1 x 10-3 M o más, en una realización 1 x 10-2 M o más. En la técnica se conocen bien una variedad de protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos para determinar la capacidad de unión específica de los compuestos, tales como anticuerpos o construcciones de anticuerpos y oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Maddox y otros, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993).

El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo injertado con CDR o un anticuerpo humanizado. El anticuerpo puede ser una molécula de inmunoglobulina intacta o un fragmento de la misma tal como un fragmento Fab, F(ab^')2 o Fv.

Inhibidores de Nogo-66

El inhibidor es en una realización un inhibidor de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la producción o expresión de Nogo-66 o Nogo-66A. El inhibidor puede disminuir la transcripción de Nogo-66. El inhibidor puede alterar el ADN de Nogo-66, por ejemplo, mediante mutagénesis específica del sitio utilizando métodos como las nucleasas con dedos de zinc. El inhibidor puede disminuir el nivel de ARNm de Nogo-66 o interferir con el procesamiento del ARNm de Nogo-66, por ejemplo, mediante ARN antisentido o interferencia de ARN. Esto se discute con más detalle más adelante.

El inhibidor puede aumentar la degradación proteica de Nogo-66. El inhibidor puede aumentar el nivel de inhibidores naturales de Nogo-66. El inhibidor puede disminuir la función de Nogo-66 mediante fosforilación inhibidora, ubiquitilación, sumoilación o similares.

El inhibidor de Nogo-66 es en una realización un inhibidor de molécula pequeña, una proteína, un anticuerpo, un polinucleótido, un oligonucleótido, un ARN antisentido, ARN de interferencia pequeño (ARNip) o ARN de horquilla pequeña (ARNsh).

El inhibidor de Nogo-66 puede ser una proteína. El inhibidor es en una realización una forma de función reducida de Nogo-66. La función de la forma de función reducida se puede reducir/disminuir en cualquier cantidad. Por ejemplo, la función se puede reducir/disminuir en al menos un 10 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos el 95% en comparación con el Nogo-66 de tipo natural. El inhibidor puede ser una forma no funcional de Nogo-66. Una forma de función reducida o no funcional de Nogo-66 competirá con el Nogo-66 nativo (es decir, de tipo natural) y reducirá la señalización de Nogo-66.

La secuencia de aminoácidos del Nogo-66 humano se muestra en los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2. Los inhibidores pueden basarse en la propia SEQ ID N°: 2 o simplemente en los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2. En una realización, el inhibidor es una variante de función reducida, como una variante no funcional de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2. Una variante de función reducida es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2, tiene la capacidad de unirse al receptor de Nogo-66, como Nogo-66R2, y tiene una capacidad reducida/disminuida de activar o actuar como agonista del receptor de Nogo-66. La función se puede reducir/disminuir en cualquier cantidad, como se explicó anteriormente. Una variante no funcional es una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de la de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2, tiene la capacidad de unirse al receptor de Nogo-66, como Nogo-66R2, y no tiene la capacidad de activar o actuar como agonista del receptor de Nogo-66.

La capacidad de unión comparativa de las variantes de función reducida y no funcionales se mide normalmente en comparación con Nogo-66 de tipo natural (como SEQ ID N°: 2 o residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2). La unión se puede medir utilizando técnicas conocidas.

La variante de función reducida puede reducir la señalización de Nogo-66 al competir con los ligandos naturales para unirse al receptor de Nogo-66, pero activando el receptor en menor grado. La variante no funcional puede reducir la señalización de Nogo-66 al competir con los ligandos naturales para unirse al receptor de Nogo-66, pero sin activar el receptor. La capacidad de una variante de unirse y activar o actuar como agonista del receptor de Nogo-66 puede ensayarse utilizando cualquier método conocido en la técnica.

A lo largo de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2, una variante de función reducida o no funcional será en una realización al menos un 50 % homóloga a esa secuencia basada en la identidad de aminoácidos, es decir, tendrá al menos un 50 % de identidad de aminoácidos en toda la secuencia. En una realización, la variante de función reducida o no funcional puede ser al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % y en una realización al menos un 95 %, 97 % o 99% homóloga con respecto a la identidad de aminoácidos (o idéntica) a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2 en toda la secuencia. Puede haber al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 85 %, un 90 % o un 95 %, de identidad de aminoácidos en un tramo de 100 o más, por ejemplo, 200 o 300 o más, aminoácidos contiguos ("homología dura").

Se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2, por ejemplo hasta 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 50 o 100 sustituciones. Se pueden hacer sustituciones conservativas como se discutió anteriormente.

Uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2 pueden eliminarse adicionalmente de los polipéptidos descritos anteriormente. Se pueden eliminar hasta 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30 o 50 residuos, o más.

Las variantes de función reducida o no funcionales pueden incluir fragmentos de SEQ ID N°: 2 o los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2. Dichos fragmentos normalmente retienen el dominio que se une al receptor de Nogo-66, pero carecen del dominio que activa el receptor. Los fragmentos pueden tener al menos 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 aminoácidos de longitud. Se pueden añadir uno o más aminoácidos alternativa o adicionalmente a los polipéptidos descritos anteriormente.

Un inhibidor para el uso en un ejemplo es el péptido antagonista de Nogo-66(1 40) (NEP1 40) que consta de los residuos 1055 a 1094 de SEQ ID N°: 2 (GrandPré T1, Li S, Strittmatter SM, Nature. 30 de mayo de 2002; 417 (6888): 547-51).

Alternativamente, el inhibidor puede ser un polinucleótido que codifica una variante no funcional o de función reducida de Nogo-66. La variante de función reducida o no funcional puede ser cualquiera de las discutidas anteriormente. Los polinucleótidos se definen anteriormente.

Los inhibidores de Nogo-66 también pueden reducir las cantidades de Nogo-66 presentes en el paciente o en el SNC, por ejemplo, eliminando la expresión de Nogo-66. La tecnología antisentido y de ARN de interferencia (ARNi) para anular la expresión de proteínas es muy conocida en la técnica, y pueden emplearse métodos estándar para anular la expresión de Nogo-66.

Tanto la tecnología antisentido como la de ARNip interfieren con el ARNm. Los oligonucleótidos antisentido interfieren con el ARNm uniéndose a (hibridando con) una sección del ARNm. Por lo tanto, el oligonucleótido antisentido está diseñado para ser complementario al ARNm (aunque el oligonucleótido no tiene que ser un 100 % complementario como se analiza a continuación). En otras palabras, el oligonucleótido antisentido puede ser una sección del ADNc. Nuevamente, la secuencia de oligonucleótidos puede no ser un 100% idéntica a la secuencia de ADNc. Esto también se discute a continuación.

La iARN implica el uso de ARN de doble cadena, como el ARN de interferencia pequeño (ARNip) o el ARN de horquilla pequeña (ARNsh), que pueden unirse al ARNm e inhibir la expresión de proteínas.

En consecuencia, el inhibidor en una realización comprende un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una parte del ARNm de Nogo-66. El inhibidor en una realización comprende un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una parte de SEQ ID N°: 1 (el ARNm de reticulón-4 humano).

Los oligonucleótidos son polímeros de nucleótidos cortos que típicamente tienen 50 o menos nucleótidos, tal como 40 o menos, 30 o menos, 22 o menos, 21 o menos, 20 o menos, 10 o menos o 5 o menos nucleótidos. El oligonucleótido utilizado en una realización tiene una longitud de 20 a 25 nucleótidos, o en una realización de 21 ó 22 nucleótidos de longitud. Los nucleótidos pueden ser naturales o artificiales. Los nucleótidos pueden ser cualquiera de los descritos anteriormente.

Un oligonucleótido en una realización hibrida específicamente con una parte de SEQ ID N°: 1, en lo sucesivo denominada secuencia diana. La longitud de la secuencia diana normalmente corresponde a la longitud del oligonucleótido. Por ejemplo, un oligonucleótido de 21 o 22 nucleótidos típicamente hibrida específicamente con una secuencia diana de 21 ó 22 nucleótidos. Por lo tanto, la secuencia diana puede tener cualquiera de las longitudes discutidas anteriormente con referencia a la longitud del oligonucleótido. La secuencia diana es típicamente nucleótidos consecutivos dentro del polinucleótido objetivo. La secuencia diana está en una realización dentro de los nucleótidos 3461 a 3658 de SEQ ID N°: 1.

Un oligonucleótido "hibrida específicamente" a una secuencia diana como se definió anteriormente.

El oligonucleótido puede comprender una secuencia que es sustancialmente complementaria a la secuencia diana. Típicamente, los oligonucleótidos son complementarios al 100 %. Sin embargo, también pueden ser aceptables niveles más bajos de complementariedad, como un 95%, 90%, 85% e incluso un 80%. La complementariedad por debajo del 100 % es aceptable siempre que los oligonucleótidos hibriden específicamente con la secuencia diana. Por lo tanto, un oligonucleótido puede tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más emparejamientos incorrectos en una región de 5, 10, 15, 20, 21, 22, 30, 40 o 50 nucleótidos.

Alternativamente, el inhibidor en una realización comprende un oligonucleótido que comprende 50 o menos nucleótidos consecutivos del complemento inverso de SEQ ID N°: 1. El oligonucleótido puede tener cualquiera de las longitudes discutidas anteriormente. En una realización, tiene 21 o 22 nucleótidos de longitud. El oligonucleótido puede comprender cualquiera de los nucleótidos discutidos anteriormente, incluidos los nucleótidos modificados. El oligonucleótido puede ser cualquiera de los tipos discutidos anteriormente.

El inhibidor es en una realización un anticuerpo que se une específicamente a Nogo-66. El anticuerpo en una realización se une a la secuencia mostrada por los residuos 1055 a 1120 de SEQ ID N°: 2. La unión específica se define anteriormente. El anticuerpo puede ser cualquiera de los tipos discutidos anteriormente.

Otros inhibidores

La inhibición de otras moléculas en el SNC puede promover la reinervación nerviosa. El fármaco es en una realización un inhibidor de NI-35, un inhibidor de proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG), un inhibidor de glucosaminoglicanos o un inhibidor de proteoglicano de sulfato de queratano (KSPG), un inhibidor de la glicoproteína asociada a mielina (MAG, un inhibidor de glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (OMgp), un inhibidor de Efrina B3, un inhibidor de semaforina 4D (Sema 4D) o un inhibidor de Sema 3A, en una realización cuando el nervio dañado está en el SNC. Los CSPG son en una realización CS-E, agrecano, fosfocano, neurocano o NG-2. Cualquiera de las definiciones de inhibidores con referencia a Nogo-66 es aplicable igualmente a estos inhibidores.

Administración

En el método, la sustancia, la composición o el inhibidor se administra al paciente. La sustancia, la composición o el inhibidor pueden administrarse al paciente de cualquier manera apropiada. La sustancia, la composición o el inhibidor se pueden administrar en una variedad de formas farmacéuticas. Así, puede administrarse por vía oral, por ejemplo en forma de comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos dispersables o gránulos. También se puede administrar por vía enteral o parenteral, como por vía bucal, anal, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intraarticular, tópica u otras vías de administración apropiadas. La sustancia, la composición o el inhibidor pueden administrarse directamente en el ojo a tratar. La vía de administración es una realización intravenosa. Un médico podrá determinar la ruta de administración requerida para cada paciente en particular.

La formulación de la sustancia, la composición o el inhibidor dependerán de factores tales como la naturaleza de la sustancia, la composición o el inhibidor exacto, etc. La sustancia, la composición o el inhibidor pueden formularse para uso simultáneo, por separado o secuencial con otras terapias o con estimulación eléctrica.

La sustancia, composición o inhibidor se formulan normalmente para su administración con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables. El vehículo o diluyente farmacéutico puede ser, por ejemplo, una disolución isotónica. Por ejemplo, las formas orales sólidas pueden contener, junto con el principio activo, diluyentes, p. ej. lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidón de maíz o de patata; lubricantes, p. ej. sílice, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio o calcio y/o polietilenglicoles; agentes aglutinantes; p. ej. almidones, goma arábiga, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinilpirrolidona; agentes de desagregación, p. ej. almidón, ácido algínico, alginatos o glicolato de almidón sódico; mezclas efervescentes; colorantes; edulcorantes; agentes humectantes, tales como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; y, en general, sustancias atóxicas y farmacológicamente inactivas utilizadas en las formulaciones farmacéuticas. Tales preparaciones farmacéuticas pueden fabricarse de manera conocida, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado, granulado, formación de comprimidos, recubrimiento con azúcar o recubrimiento con película.

Las dispersiones líquidas para administración oral pueden ser jarabes, emulsiones o suspensiones. Los jarabes pueden contener como vehículos, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con glicerina y/o manitol y/o sorbitol.

Las suspensiones y emulsiones pueden contener como vehículo, por ejemplo, goma natural, agar, alginato de sodio, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o poli(alcohol vinílico). Las suspensiones o disoluciones para inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el principio activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, p. ej. agua esterilizada, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles, p. ej. propilenglicol y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaína.

Las disoluciones para administración intravenosa o infusión pueden contener como vehículo, por ejemplo, agua estéril o, en una realización, pueden estar en forma de disoluciones salinas isotónicas acuosas estériles.

Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el rango del 0,5% al 10%, en una realización del 1% al 2%.

Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contienen del 10% al 95% de ingrediente activo, en una realización del 25% al 70%. Cuando la composición farmacéutica esté liofilizada, el material liofilizado puede reconstituirse antes de la administración, p. ej. una suspensión. La reconstitución es una realización efectuada en un tampón.

Las cápsulas, comprimidos y píldoras para administración oral a un individuo pueden estar provistas de un recubrimiento entérico que comprende, por ejemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulosa, acetato ftalato de celulosa o hidroxipropilmetilcelulosa.

Los polinucleótidos u oligonucleótidos pueden ser secuencias nucleotídicas desnudas o estar en combinación con lípidos catiónicos, polímeros o sistemas de selección del objetivo. Pueden administrarse mediante cualquier técnica disponible. Por ejemplo, el polinucleótido u oligonucleótido puede introducirse mediante inyección con una aguja, en una realización por vía intradérmica, subcutánea o intramuscular. Alternativamente, el polinucleótido u oligonucleótido puede administrarse directamente a través de la piel usando un dispositivo de administración como la administración de genes mediada por partículas. El polinucleótido u oligonucleótido puede administrarse tópicamente en la piel o en las superficies mucosas, por ejemplo, mediante administración intranasal, oral o intrarrectal.

La captación de construcciones de polinucleótidos u oligonucleótidos puede mejorarse mediante varias técnicas de transfección conocidas, por ejemplo aquellas que incluyen el uso de agentes de transfección. Los ejemplos de estos agentes incluyen los agentes catiónicos, por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-dextrano y lipofectantes, por ejemplo, lipofectam y transfectam. La dosificación del polinucleótido u oligonucleótido a administrar puede modificarse.

Típicamente se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de la sustancia, composición o inhibidor. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para promover la reinervación nerviosa o mejorar uno o más síntomas del daño del nervio. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad eficaz para suprimir uno o más, o todos los síntomas del daño del nervio.

La dosis puede determinarse según varios parámetros, especialmente según la sustancia utilizada; la edad, el peso y el estado del paciente a tratar; la vía de administración; y el régimen requerido. Nuevamente, un médico podrá determinar la ruta de administración y las dosis requeridas para cualquier paciente en particular. Una dosis diaria típica es de aproximadamente 0,1 a 50 mg por kg de peso corporal, según la actividad de la sustancia, composición o inhibidor específico, la edad, el peso y las condiciones del sujeto a tratar y la frecuencia y vía de administración. La dosis se puede proporcionar como una dosis única o como dosis múltiples, por ejemplo tomadas a intervalos regulares, por ejemplo 2, 3 o 4 dosis administradas cada hora. En una realización, los niveles de dosificación son de 5 mg a 2 g.

Normalmente, los polinucleótidos u oligonucleótidos se administran en el intervalo de 1 pg a 1 mg, en una realización de 1 pg a 10 pg de ácido nucleico para la administración mediada por partículas y de 10 pg a 1 mg para otras vías.

Kit

También se puede proporcionar un kit para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente. El kit comprende un dispositivo capaz de estimular eléctricamente la piel del paciente. Los dispositivos adecuados se describieron anteriormente. El kit también comprende un armazón que promueve la reinervación, un injerto que promueve la reinervación, una población de células que promueven la reinervación o un fármaco que promueve la reinervación. El kit puede comprender cualquiera de los armazones, injertos, células o productos farmacéuticos discutidos anteriormente.

El kit puede comprender adicionalmente uno o más reactivos o instrumentos que permitan llevar a cabo el método. Dichos reactivos incluyen medios para tomar una muestra del paciente o para administrar una sustancia o composición al paciente y tampones adecuados. El kit puede comprender, opcionalmente, instrucciones para permitir que el kit se use en el método o detalles sobre los pacientes en los que se puede llevar a cabo el método.

Ejemplo

En el reciente informe sobre la aplicación in vivo de la ES en la cicatrización cutánea humana28 (n = 20), se tuvo la limitación de un solo análisis de punto de tiempo post-herida (día 14). Sin embargo, en el estudio actual (n = 40), se han incluido puntos de tiempo intermedios como los días 3, 7 y 10 para comprender explícitamente la formación de redes neuronales durante la reparación. La reinervación mejorada post-ES se validó aún más con 1) análisis de la expresión de TUBB3 y FIG4, reinervación, síntesis de neuropéptidos y diferenciación celular relacionada con los nervios en tejido de granulación de heridas, específicamente en melanocitos y células de Merkel, 2) cinética de la melanogénesis, 3) proliferación celular y análisis del factor de crecimiento nervioso, y 4) el papel in vitro de la ES en la diferenciación neuronal.

Materiales y Métodos

Selección y reclutamiento de pacientes

Este estudio se realizó de acuerdo con los principios éticos de Buenas Prácticas Clínicas y la Declaración de Helsinki. Este estudio recibió la aprobación ética del comité de investigación local (Manchester, Reino Unido), y todos los sujetos (n = 40; Tabla a continuación) dieron su consentimiento informado completo por escrito.

Cultivo y diferenciación de células SHSY5Y

Se cultivaron células SHSY5Y de neuroblastoma humano (ATCC, CRL-2266) en medio de Eagle modificado por Dulbecco con mezcla de nutrientes F12 (DMEM-F12; cat. 11320-074; Life Technologies, Paisley, Reino Unido) suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS , 4 x glutamina 10-3 M, 10 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO² al 5 % (v/v). Las células se sembraron en cubreobjetos redondos de 22 mm (BD Biosciences, Oxford, Reino Unido) en placas de 6 pocillos (a una densidad de 3 x 104 células/cm2). Después de 24 horas, se indujo la diferenciación neural con ácido retinoico (RA; 10­ 5 M; cat. R2625, Sigma Aldrich, Dorset, Reino Unido) en medio suplementado con FCS al 2 % durante 6 días. Se añadió factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF; 50 ng/ml; cat. B3795, Sigma Aldrich, Reino Unido) durante 4 días más en medio suplementado con FCS al 0,5 %, como se informó anteriormente40.

Estimulación eléctrica in vitro

Las células SHSY5Y se sometieron a la forma de onda de ES DW (onda sinusoidal bifásica degenerativa)21 a 100 mV/mm (60 Hz).

Dispositivo de estimulación eléctrica utilizado en voluntarios humanos.

El dispositivo de estimulación eléctrica utilizado para las heridas tratadas in vivo con ES fueron el sistema Fenzian (Fenzian Ltd, Hungerford, Reino Unido)29 que está registrado en la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) 510(k) y aprobado por la Conformite Europenne (CE). Este es un dispositivo transcutáneo de baja intensidad, que detecta cambios en la impedancia de la piel y produce una "forma de onda eléctrica degenerativa" de ajuste donde cada impulso depende de las propiedades eléctricas de la piel a medida que se alteran (es decir, utiliza la electrobiorretroalimentación). Este dispositivo entrega 0,004 miliamperios, 20-80 V, tiene una frecuencia por defecto de 60 Hz e impulsos cuyo ancho es de aproximadamente 1 a 100 gs.

Recolección de biopsias humanas en sacabocados para estudios de cicatrización de heridas

El protocolo que se adoptó para los estudios de ES in vivo se mencionan en nuestro estudio anterior29. Se dividió a los voluntarios en 2 cohortes (n=20 en cada cohorte); la primera cohorte (Cohorte A) proporcionó biopsias con sacabocados para la cicatrización de heridas normal y tratada con ES en los días 3 y 7, y la segunda cohorte (Cohorte B) las proporcionó para la cicatrización de heridas normal y tratada con ES en los días 10 y 14. La metodología adoptada para ambos conjuntos fue la misma, excepto los días asignados para la toma de biopsias con sacabocados. Las biopsias de cicatrización de heridas normales (control) recogidas los días 3, 7, 10 y 14 se indican como C3, C7, C10 y C14 respectivamente. De manera similar, las biopsias de cicatrización tratadas con ES recogidas en los días 3, 7, 10 y 14 se indican como ES3, ES7, ES10 y ES14, respectivamente.

Cohorte A

El día 0, a los participantes se les realizaron dos biopsias de piel de espesor completo de 5 mm de diámetro debajo de la parte superior interna del brazo, que actuó como brazo de control para monitorear la cicatrización normal de la herida. El día 3, se realizó una biopsia de piel de 7 mm de diámetro que abarcaba uno de los sitios anteriores de la herida (C3). El día 7, se realizó otra biopsia de piel de 7 mm de diámetro para extirpar el segundo sitio anterior de la herida (C7). El mismo día 7, se crearon biopsias de 2 x 5 mm en la misma ubicación anatómica en la parte superior interna del brazo contralateral con una fase de intervención del tratamiento de ES58. A partir de este día (día 7), el voluntario fue tratado con ES hasta el día 14. A los voluntarios tratados con ES se les tomaron biopsias intermedias en los días 10 (ES3) y 14 (ES7), similares a las de los días 3 (C3) y 7 (C7) para la cicatrización normal.

Cohorte B

En esta cohorte, las biopsias se tomaron en los días 10 (C10) y 14 (C14) para obtener muestras de cicatrización normal en los días 10 y 14. Sin embargo, las otras 2 biopsias en el brazo contralateral se realizaron en el día 14. A partir del día 14, el voluntario se trató con ES y las heridas se rebiopsiaron en los días 24 (ES10) y 28 (ES14).

Preparación de tejidos para inclusión en cera, obtención de cortes, tinción histológica y semicuantificación

Los tejidos para la inclusión en cera se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % (cat. F5304; Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido) a 4 °C y se procesaron como se describió anteriormente28.

Análisis de micromatrices

En las micromatrices (n=4), las muestras de cicatrización normal de heridas se compararon con las muestras de ES en los días 3, 7, 10 y 14. En este estudio se usó el kit Agilent Whole Human Genome (SurePrint G3 Hmn GE 8x60K V2) Oligo Microarray siguiendo el protocolo del fabricante; análisis de la expresión génica basado en micromatrices de un color (kit Low Input QuickAmp Labeling)59. Los datos se analizaron con Qlucore Omics Explorer (Qlucore AB, Lund, Suecia)60. La significación estadística (P < 0,05) también se generó con el mismo software.

Aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

Para las biopsias in vivo obtenidas en diferentes días de cicatrización, se realizaron el aislamiento del ARN, la síntesis de ADNc y la qRT-PCR como se explicó anteriormente28. Se utilizó RPL3228 como control interno y se utilizó el método de AAC^t para calcular el cambio proporcional de la expresión génica. Los cebadores utilizados se detallan en la siguiente tabla.

Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica

La tinción inmunohistoquímica se realizó como se detalla en nuestros informes anteriores28. Los controles positivos para la detección de proteínas fueron todos tejidos normalizados en laboratorio, y los cortes sin anticuerpo primario sirvieron como controles negativos. Todos los portaobjetos histológicos fueron analizados con un microscopio de contraste de fases (microscopio Olympus IX51; Olympus, Reino Unido) por dos observadores independientes.

Para los experimentos de inmunofluorescencia tisular, se realizó el desparafinado y la recuperación de antígenos como se explicó anteriormente. Además, los tejidos se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 30 min y luego se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5 % en PBS. Posteriormente se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios apropiados y se tiñeron conjuntamente con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; cat. H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.).

Para los experimentos de inmunocitoquímica, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 30 min. Se bloquearon con albúmina de suero bovino al 5% en PBS durante 1 hora. A continuación, las células se tiñeron con anticuerpos primarios y secundarios apropiados y se tiñeron conjuntamente con DAPI.

Análisis de imágenes de inmunohistoquímica mediante el software Definiens

Se utilizó Definiens Tissue Studio versión 3.51 (Definiens AK, Múnich, Alemania) para cuantificar los resultados de IHC.29 Los portaobjetos se escanearon y las imágenes se cargaron en el programa Definiens IHC para cuantificar aún más los resultados. Aquí, inicialmente, en el módulo de análisis celular, se seleccionaron 12 subconjuntos en la muestra de tejido para el reconocimiento del sitio. La detección nuclear, la detección del área nuclear y la clasificación del núcleo también se realizaron en los subconjuntos. Para la tinción con peroxidasa para IHC, se ajustó el umbral de hematoxilina para la detección de células. El análisis se realizó con un aumento de 20X.

Transferencia de Western

Para células: La transferencia de Western se realizó de acuerdo con nuestro protocolo anterior29. Se usó nitro azul de tetrazolio / fosfato de S-bromo-4-cloroindoxilo (NBT/BCIP, cat. 34042; Thermo Scientific) en 1 etapa para revelar la transferencia.

Para tejidos: Los tejidos se lisaron en tampón RIPA y se homogeneizaron en un lisador de tejidos (Qiagen). Se centrifugaron a 10000 g durante 20 min y se recogió el sobrenadante. Se realizaron transferencias y separaciones de proteínas adicionales como se explicó para los estudios celulares.

Análisis de las bandas de transferencia de Western mediante el software Image J

El porcentaje de intensidad de las bandas se calculó mediante el análisis de Image J (Fiji, 1.47t, NIH, EE. UU.)29. La intensidad de las bandas se calculó en el software mediante la evaluación del gráfico de perfiles de las bandas, seguido del análisis y etiquetado de los picos generados. Esta intensidad de bandas se normalizó después respecto de la banda de p-actina respectiva. Luego se calculó el porcentaje en función de la intensidad de las bandas individuales normalizadas en comparación con la intensidad total del resto de las bandas en la fila particular (para la proteína particular), que se calcularon en consecuencia.

Histoquímica de Masson-Fontana

Brevemente, se obtuvieron cortes de 4 pm de espesor de bloques de tejido parafinado. Se desparafinaron en una serie de xileno y etanol. La recuperación del antígeno se realizó con tampón citrato (pH 6,0) a 60 °C durante 1 h. Los tejidos se trataron con una disolución de nitrato de plata amoniacal (nitrato de plata al 10% (cat. 209139; Sigma-Aldrich) hidróxido de amonio concentrado (cat. 320145; Sigma-Aldrich) añadido gota a gota hasta que se aclara, dejado 24 horas en la oscuridad a temperatura ambiente) durante 40 min a 56 °C en la oscuridad. Después de lavar en agua destilada, los cortes se trataron con tiosulfato de sodio acuoso al 5% (cat. 72049; Sigma-Aldrich) durante 1 min. Luego, los cortes se lavaron con agua corriente del grifo durante 3 min y se contratiñeron con hematoxilina durante 3 min. Después de lavar con agua destilada, los cortes se deshidrataron y se cubrieron con cubreobjetos.

Transfección de ARNip de FIG4

Se cultivaron células SHSY5Y (4 x 105 células/pocillo) en cubreobjetos recubiertos de colágeno de 22 mm en placas de 6 pocillos por triplicado y la transfección se llevó a cabo en suspensión utilizando complejos de ARNip preparados con el reactivo de transfección siPORT™ NeoFX™ (Ambion) según el protocolo del fabricante. Se usó una versión aleatorizada de ARNip (Ambion) como control. Posteriormente, las células se incubaron durante 96 horas en el medio de transfección.

Microscopía y espesor de las fibras nerviosas

Las imágenes de las células vivas se realizaron utilizando un microscopio invertido Olympus IX71 (Olympus, Southendon-sea, Reino Unido) con un objetivo 20X NA. Las imágenes de fluorescencia se tomaron utilizando un microscopio vertical Olympus IX51 (Olympus, Reino Unido) con un objetivo de inmersión en aceite de 100X. El grosor promedio de la fibra se determinó tomando 12 medidas/muestra al azar de la red de fibras y analizándolas en el software NIH Image J.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media /- desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado (n=3). El análisis estadístico se calculó utilizando ANOVA unidireccional para la comparación entre tres grupos con la prueba post hoc de Turkey y la prueba t de Student para la comparación entre dos grupos. Se eligieron intervalos de confianza del 95 % con un valor de P correspondiente de 0,05 a lo largo del análisis.

Resultados

La reinervación y la síntesis de neuropéptidos aumentaron en las heridas tratadas con ES

Se obtuvieron biopsias con sacabocados temporales que experimentaban cicatrización espontánea normal y tratamiento de ES de la parte superior interna del brazo de 40 voluntarios sanos en los días 3, 7, 10 y 14, siguiendo el diseño experimental publicado anteriormente29 (Materiales y métodos). Los análisis iniciales en el día 14 de cicatrización de heridas mostraron que las transcripciones del producto del gen de la proteína 9.5 (PGP9.5) estaban significativamente estimuladas en las heridas tratadas con ES (ES14, cicatrización de heridas estimulada eléctricamente en el día 14) en comparación con las heridas de control (C14, cicatrización espontánea de heridas en el día 14; P <0,05; ES14/C14 = 1,45; Figura 1a). Además, el número de fibras nerviosas PGP9.5+ o sustancia P+ (SP) (Fig. 1 b-d y 1e-g respectivamente; Fig. 9a-b y 9a-b respectivamente) en piel humana herida aumentaron significativamente en las heridas tratadas con ES (P < 0,05; ES14/C14 = 1,44 y 1,34 para PGP9.5+ y SP+, respectivamente). En la piel sana normal (día 0), las fibras nerviosas amielínicas delgadas se distribuyeron por toda la epidermis, pero se dispersaron escasamente por encima del estrato granuloso. Sin embargo, en la cicatrización de heridas, se observó la expresión de PGP9.5 en pocas células de la dermis desde el día 3 en adelante, que fue en un momento anterior al observado anteriormente30. En la epidermis de las heridas (tratadas con ES y sin tratar) en el día de cicatrización 14, la red nerviosa fibrilar fue significativamente mayor en la capa basal en comparación con la de la piel sana (día 0). Aquí, las heridas tratadas con ES exhibieron una mayor ramificación que las heridas normales en proceso de cicatrización. Además, el grosor de las fibras nerviosas en la epidermis fue ~ 6% mayor en las heridas ES14 en comparación con las heridas C14 (P > 0,05; el grosor medio de las fibras nerviosas fue de 1,02 ± 0,17 gm y 0,96 ± 0,17 gm, para ES14 y C14 respectivamente, en la piel normal fue de 1,08 ± 0,15 gm). También se observaron resultados corroborativos para las expresiones de PGP9.5 y SP estimuladas en las heridas tratadas con ES a partir de la transferencia de Western (Fig. 1d y g, respectivamente para PGP9.5 y SP).

TUBB3 y FIG4 aumentaron en heridas tratadas con ES

Para identificar los objetivos de ES en la reinervación, se realizó un perfil transcripcional de todo el genoma utilizando micromatrices de 1) piel sana normal (N0), 2) cicatrización espontánea y 3) heridas en cicatrización tratadas con ES (tanto 2 como 3 en los días de cicatrización de heridas 3, 7, 10 y 14). Los datos mostraron que la diferenciación neuronal, así como el gen asociado a los melanocitos, la p-tubulina de clase III (TÜBB3)31-32, aumentaron mucho en las heridas ES14 (P = 6,19 x 10-5, ES14/N0 = 5,87; P = 4,5 x 10-3, C14/N0 = 4,4; P > 0,05, ES14/C14 = 1,33; Fig. 2a; Conjunto de datos complementario S1). Los resultados posteriores de qRT-PCR revelaron que la transcripción intracutánea de TÜBB3 estuvo estimulada (P < 0,05) en ES10 y ES14 en comparación con C10 y C14, respectivamente (Fig. 2b). Esto se investigó más a fondo mediante inmunohistoquímica cuantitativa (IHC; utilizando anticuerpos monoclonales específicos TUJ-131 contra TÜBB3) y transferencia de Western.

En la piel sana normal, se observó una inmunorreactividad similar a TÜBB3 en células aisladas dispersas a lo largo del estrato basal, además de algunas células intradérmicas (Fig. 2c). En el centro de la herida en proceso de cicatrización, se observó TÜBB3 en las capas epidérmicas diferenciadas, tanto en las heridas en proceso de cicatrización normal como en las tratadas con ES (Fig. 2d). Sin embargo, en el borde de la herida y en posición proximal al centro de la herida, TÜBB3 se dispersó al azar en las células del estrato basal con estructuras de tipo dendrítico TÜBB3+ que se ramificaban hacia las capas superiores de la epidermis, alcanzando el estrato granuloso (Fig. 2e y 2f para las heridas en cicatrización normal y las tratadas con ES, respectivamente; Fig. 11). Los resultados de IHC confirmaron una estimulación significativa (P < 0,05) de la expresión de TÜBB3 en las heridas tratadas con ES en comparación con las heridas en cicatrización normal (Fig. 2g). En el tejido de granulación de la herida, la expresión de TÜBB3 se restringió principalmente a las células estrelladas y fusiformes (fibroblastos/miofibroblastos) y las pocas células que recubren los neocapilares en el área de granulación de la herida (Fig. 2h). La estimulación de la proteína TÜBB3 total en las heridas tratadas con ES en comparación con las heridas en cicatrización normal se confirmó con los resultados de la transferencia de Western (Fig. 2i y j).

En el análisis de micromatrices, FIG4 (marcador relacionado con la diferenciación neural17) se estimuló significativamente en ES14 en comparación con las heridas C14 (P < 0,05, ES14/C14 = 1,12; P > 0,05, C14/N0 = 0,86; P > 0,05, ES14/NO = 1,18; Conjunto de datos complementario S1). Esto se confirmó adicionalmente mediante los análisis de qRT-PCR (Fig. 3a), IHC (Fig. 3b y c) y la transferencia de Western (Fig. 3d y e). En la piel sana, FIG4 se expresó en los queratinocitos en diferenciación y pocas células dispersas en la dermis. Sin embargo, en las heridas del día 14, FIG4 estuvo presente de manera abundante tanto en la epidermis como en la dermis. A lo largo del proceso de reparación, las células FIG4+ estuvieron presentes en el tejido de granulación y la neoepidermis (Fig. 12). En conjunto, los datos cuantitativos de las expresiones de TÜBB3 y FIG4 sugieren una estimulación de la diferenciación celular por parte de ES.

ES amplía el grupo de melanocitos, estimula la expresión de TUBB3 en los melanocitos y promueve la melanogénesis en la cicatrización cutánea

Para caracterizar aún más TÜBB3, examinamos la expresión de TÜBB3 en los melanocitos (al igual que las neuronas periféricas, los melanocitos derivan de la cresta neural) ya que TÜBB3 se ha correlacionado con el linaje del desarrollo de los melanocitos33. El efecto de la ES sobre los genes asociados con los melanocitos y los productos génicos no se ha informado antes. Aquí, se empleó el anticuerpo gp100 (demarca los melanocitos diferenciados, melanogénicamente activos, los melanocitos amelanóticos y los melanoblastos34) y la histoquímica de Fontana-Masson como parámetros de lectura de melanocitos/melanogénesis35. Gp100 se estimuló en las heridas tratadas con ES (P < 0,05, ES14/C14 = 1,26; P > 0,05 en todos los demás días de cicatrización; Fig. 4a y Fig. 13a) y estuvo presente tanto en la epidermis como en la dermis de las heridas en cicatrización (Fig. 13a). Sin embargo, se localizó una población predominante de células gp100+ en la epidermis de las heridas tratadas con ES en comparación con unas pocas en las heridas sin tratar. La inmunotinción de TÜBB3 con gp100 reveló que ES estimuló el número de células intraepidérmicas TÜBB3/gp100 doblemente positivas (P <0,05; ES14/C14 = 1,32; Fig. 4b y c, Fig. 13a). ES también estimuló la melanogénesis intraepidérmica (P < 0,05) como se ve mediante la histoquímica cuantitativa de Masson-Fontana para melanina (Fig. 4d y e; Fig. 13b). Estos resultados indican el potencial de ES para promover la expresión de TÜBB3 fuera del sistema nervioso en desarrollo, reclutar melanocitos y determinar la extensión de la repigmentación en la cicatrización de la piel humana.

ES estimula la expresión de TUBB3 y PGP9.5 en las células de Merkel en el tejido de granulación cutánea

La distribución espacial de TUBB3+ durante la cicatrización planteó la posibilidad de que esta proteína también se exprese en las células de Merkel, es decir, las células epiteliales mecanosensoriales y neurosecretoras que pueden conectarse a una fibra nerviosa sensorial36. Además, no se ha citado antes evidencia que apoye la expresión de TUBB3 en las células de Merkel en la piel humana normal/regenerada. Aquí, empleamos la citoqueratina-CK20 selectiva de células de Merkel como marcador de detección celular37. Los resultados mostraron que las células de Merkel CK20+ aumentaron en los compartimentos epidérmico y dérmico con los días de cicatrización progresiva, especialmente en las heridas tratadas con ES en comparación con los controles (P > 0,05; Fig. 5a, Fig. 14a y b). A partir de los resultados de la coexpresión, pocas células CK20+ también expresaron TUBB3, y se observaron células TUBB3+/CK20+ tanto en la epidermis como en la dermis (Fig. 5b y c; Fig. 14a). Sin embargo, esta fracción de células aumentó en la epidermis con los días posteriores de cicatrización de heridas. Curiosamente, ES aumentó significativamente las células TUBB3+/CK20+ en los días de cicatrización 10 y 14 en comparación con las respectivas heridas en cicatrización normal (P < 0,05, ES10/C10 y ES14/C14 = 1,44 y 1,50 respectivamente; P > 0,05 en todos los demás días de cicatrización). Además, ES mejoró significativamente la inervación de las células de Merkel, según lo evaluado mediante inmunotinción doble de CK20/PGP9.5 (P < 0,05 para ES14/C14 = 1,48; Fig. 5d y e, Fig. 14b). La mayoría de las células CK20+/PGP9.5+ se localizaron en la dermis en los días posteriores de cicatrización de las heridas. En conjunto, los datos sugieren la mejora de las distintas subpoblaciones de células de Merkel (TUBB3+ y PGP9.5+), post-ES.

Ausencia de células de Merkel y melanocitos en proliferación en las heridas en cicatrización y expresión estimulada del factor de crecimiento nervioso en las heridas tratadas con ES

Para comprender mejor cómo aumentaron los melanocitos y las células de Merkel después de la aplicación de ES (P < 0,05 y P > 0,05 respectivamente), se realizó una inmunotinción doble Ki67/gp100 y Ki67/CK20 para comprender el papel de la proliferación celular durante la reparación. Sorprendentemente, los resultados mostraron la ausencia de proliferación (es decir, Ki67+) de melanocitos y células de Merkel en el nicho de la herida en cicatrización (Fig. 15a y b). Este hallazgo también plantea una pregunta desde la perspectiva de la biología del desarrollo sobre el origen de las células de Merkel, ya sea a partir de divisiones asimétricas de células de la capa basal o de la cresta neural38. Los resultados sugieren que el aumento del número de ambos tipos de células observado después de la ES podría deberse principalmente a una mayor diferenciación intracutánea y migración de células precursoras residentes, como melanoblastos y progenitores de células de Merkel.

El NGF epidérmico (proteína neurotrófica) se ha correlacionado parcialmente in vitro con procesos de diferenciación específicos de los melanocitos (mayor quimiotaxia y dendricidad18), así como a una mayor densidad de inervación en varios tejidos39. Por lo tanto, se examinó la expresión de NGF como una explicación plausible para la reinervación mejorada, así como el número de células de melanocitos y células de Merkel. Aquí, los resultados mostraron una estimulación significativa del ARNm de NGF (P < 0,05; ES14/C14 = 1,91; Fig. 6a) y la expresión de proteínas (P < 0,05; ES14/C14 = 1,39 y 1,52, respectivamente, de IHC y análisis de transferencia de Western, Fig. 6b-e, Fig. 16), post-ES. Sin embargo, la expresión cutánea de NGF solo fue detectable a partir del día 10 durante el proceso de reparación. Aunque no hubo una diferencia significativa en la expresión de NGF en el compartimento dérmico de las heridas tratadas con ES y las no tratadas, el NGF fue significativamente mayor el día 14 en el compartimento epidérmico de las heridas tratadas con ES. Estos resultados sugieren una regulación diferencial de NGF mediada por ES, que también podría contribuir en parte a la cicatrización acelerada por ES (Fig. 6f).

ES estimula la expresión de FIG4 y mejora la diferenciación en las células de neuroblastoma humano

Habiendo observado una reinervación mejorada en las heridas agudas, se investigó más a fondo si la ES puede promover la diferenciación neural en condiciones in vitro. Dado que FIG4 se expresó diferencialmente en el análisis de micromatrices, se examinó su papel en la diferenciación neural. Aquí, se cultivaron células de neuroblastoma humano SHSY5Y y se diferenciaron usando ácido retinoico (RA) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)40 (Fig. 7a; tratamiento de RA durante 6 días iniciales seguido de tratamiento con BDNF durante 4 días). NeuN, un marcador predominante de núcleos neurales posmitóticos, mostró una estimulación en las células diferenciadas. Aquí, se observó un aumento de la expresión de FIG4 durante el proceso de diferenciación (Fig. 7b). Sin embargo, para determinar el papel de la ES en la diferenciación neural, además de tratar las células con RA+BDNF, también se sometieron a ES durante 1 hora/día durante 10 días. El campo eléctrico aplicado fue de 100 mV/mm ya que este valor correspondía a la "corriente de lesión" endógena que prevalece en la cicatrización de heridas cutáneas durante el inicio del tejido de granulación, fibroplasia, contracción de la herida y neovascularización4142. La qRT-PCR indicó un aumento significativo de FIG4 en el 10° día de tratamiento con RA+BDNF+ES en comparación con el tratamiento con RA+BDNF (P < 0,05, ~ aumento de 1,5 veces; Figura 7c). Además, el análisis de transferencia de Western de las células de neuroblastoma mostró una estimulación significativa de la fosfatidilinositol-3-quinasa de clase II (PI3KII) y FIG4, después del tratamiento con RA BDNF ES (P < 0,05, aumento del ~ 77% y ~ 43%, respectivamente; Figura 7d y e).

A continuación, para comprender la importancia de FIG4 en la ruta PIP³ (Fig. 17a) durante la diferenciación celular, se inactivó FIG4 en células de neuroblastoma mediante la transfección de ARNip (Fig. 17b y c). Aquí, se observó la vacuologénesis intracelular después de 3 días de transfección (Fig. 17d). Estas vacuolas se inmunotiñeron con un marcador específico de proteína de membrana asociada a lisosomas 2 (LAMP2) que típicamente representaba los endosomas de etapa tardía (Fig. 8a).

Posteriormente, se investigó si las células transfectadas con ARNip también tenían la capacidad de diferenciación neuronal y si ES podría afectar al proceso. Para esto, se sometió a las células transfectadas con ARNip a diferenciación mediante 1) tratamientos con RA+BDNF y 2) RA+BDNF+ES. Curiosamente, las células tratadas con ES mostraron una mejor diferenciación con mayores expresiones de NeuN nuclear, FIG4 y TUBB3, en comparación con las células no tratadas con ES (Fig. 8b y 8c). Además, la expresión de LAMP2 también disminuyó después de ES (Fig. 8d). El análisis de qRT-PCR reveló un aumento del doble en la expresión de ARNm de FIG4 después de ES (Fig. 8e), lo que corroboró los datos de la transferencia de Western (Fig. 8f y 8g). En particular, FIG4 fue la única proteína que se estimuló mediante ES tanto en el análisis de ARNm como en el de proteínas. Además, para evaluar la integridad celular después de la diferenciación celular, se aplicó ES durante 1 hora el último día (10° día) a las células tratadas con RA+BDNF. Sorprendentemente, todas las células se lisaron en los 35 minutos desde la ES (Video complementario S1), mientras que las células tratadas con ES expuestas de forma rutinaria (RA BDNF ES) sobrevivieron (Video complementario S2). Esto indicó el potencial de ES para restaurar la integridad de las células neurales después de la vacuologénesis y durante el proceso de diferenciación posterior. Por lo tanto, colectivamente, los estudios sugieren que la ES mejora la reinervación y la diferenciación neural al dirigirse a proteínas específicas como TUBB3 y FIG4, durante la reparación cutánea humana.

Discusión

Que se sepa, este es el primer informe que investiga cuantitativamente la expresión de biomarcadores de diferenciación neuronal durante la reinervación en la cicatrización cutánea humana. En particular, la ES estimuló fuertemente 1) la expresión de TUBB3 y FIG4 en heridas cutáneas, 2) la expresión de TUBB3 en melanocitos y células de Merkel de heridas, 2) el recuento de melanocitos y la melanogénesis, 3) la reinervación en células de Merkel, 4) la expresión de NGF en el tejido de granulación de heridas y 5) la diferenciación neural, así como la integridad celular posterior a la vacuologénesis en las células de neuroblastoma. En conjunto, el estudio actual proporciona pruebas de que la ES puede modular la biología de las células pigmentarias en los melanocitos y la neuroanatomía de la piel humana normal, estimula la diferenciación de los melanoblastos residentes y los progenitores de las células de Merkel in loco, y contribuye a la mejora reconocida de la cicatrización de heridas cutáneas 2843.

La estimulación de TUBB3 en las heridas tratadas con ES se caracterizó por un aumento de los procesos dendríticos de las neuronas periféricas (los cuerpos celulares están ubicados en otros lugares) en la dermis y la epidermis. Curiosamente, Shibazaki etal., había observado que la expresión de TUBB3 dependía del ciclo celular, y está mediada por la unión del factor de transcripción silenciador de RE-1 REST al elemento RE-1, que está presente en el primer intrón del gen TUBB332. En este contexto, es posible que la desregulación del eje REST-TUBB3 pueda causar una expresión diferencial de TUBB3. Aparte de que TUBB3 está presente en los microtúbulos de los queratinocitos12 y los fibroblastos44, aún no se han atribuido funciones celulares específicas. Sin embargo, la investigación adicional de TUBB3 en los melanocitos maduros muestra que es un componente activo de las pistas de microtúbulos de las proteínas quinesina y dineína, que transportan melanosomas33. Todavía se tiene que dilucidar el significado fisiológico de la expresión de TUBB3 en la red de fibras nerviosas epidérmicas durante la reparación45.

Al igual que las neuronas periféricas, los melanocitos también derivan de la cresta neural y poseen múltiples procesos dendríticos, receptores similares (por ejemplo, p75NTR y c-Kit) y responden a neurotrofinas idénticas46. El NGF se une al receptor de superficie neuronal/relacionado con las células neuronales-receptor de tropomiosina cinasa A e inicia vías de señalización intracelulares, como las cascadas de proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK), la estimulación de AKT con fosfatidil inositol-3-cinasa y la generación de dependiente de fosfolipasa C ^y de trifosfato de inositol y diacilglicerol que conducen a la movilización y activación de los almacenes de Ca2+ 11. Además, la cinasa MAPK fosforila la cinasa 1/2 regulada por señales extracelulares (miembro de la familia MAPK) que conduce a la activación de genes para la diferenciación celular. La ES mejoró la expresión de NGF en heridas, lo que puede explicar una mayor quimiotaxia de los melanocitos de la epidermis interfolicular sana cercana47. La mejora posterior de la melanogénesis es un efecto secundario del aumento de los melanocitos o de la aceleración de la melanogénesis en células individuales, lo que proporciona suficiente melanina a la epidermis en regeneración48. Además, la expresión de TUBB3 estimulada en los melanocitos también es una indicación de una mayor diferenciación, caracterizada por una mayor formación de dendritas18.

Curiosamente, se ha demostrado que varios tratamientos farmacológicos inducen el crecimiento de neuritas mediante la sobreexpresión de neurotrofinas4950. Se ha informado que NGF, en asociación con la ES, induce el crecimiento de neuritas in vitrou , que en parte se correlaciona con un proceso de diferenciación celular mejorado. En este contexto, se observa un efecto similar con la expresión posterior de TUBB3 en asociación con terminales nerviosas con las células de Merkel post-ES, lo que podría conducir a un linaje diferenciado51. Estos datos proporcionan más información sobre la posible aplicación de la ES para aumentar la conexión entre la inervación y las células de Merkel indiferenciadas/inmaduras en el área protuberante de los folículos pilosos. Curiosamente, la mayoría de células CK20+ en contacto con células PGP9.5+ se encontraron sólo en la dermis. Sin embargo, se observaron células TUBB3+/CK20+ tanto en la epidermis como en la dermis con un número aumentado en la epidermis durante las etapas finales de la cicatrización. Esto plantea la pregunta de si las células de Merkel migran a la epidermis después del inicio de la diferenciación durante la cicatrización de heridas o, paradójicamente, ¿es necesario que las células de Merkel tengan una guía de contacto con los elementos nerviosos para que experimenten la diferenciación?

Durante la cicatrización de heridas, se invierte la migración secuencial de los progenitores de melanocitos desde la epidermis hacia áreas definidas de las protuberancias interfoliculares48. Además, las células progenitoras salieron de su nicho y migraron al sitio de la herida sin proliferación, p. ej. células madre de melanocitos47. Al correlacionar los resultados de IHC cuantitativa en las células gp100+/CK20+ y la proliferación con el anticuerpo Ki67, se concluye que la migración de las células progenitoras y el destino posterior de las células podrían determinarse mediante la ES.

Una desregulación de la síntesis y el recambio de lípidos de fosfoinositol fosforilados, que funcionan como moléculas de señalización52 durante la diferenciación celular, podría dar lugar a alteraciones fenotípicas. Del mismo modo, la mutación en el gen FIG4 da como resultado trastornos neurodegenerativos que incluyen la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) y la mucolipidosis53. Los resultados en la inactivación de FIG4 están de acuerdo con Chow et a/, lo que implica la inactivación de FIG4 y PI(5) quinasa (Pikfyve), lo que lleva a la anulación de la síntesis de 3,5-bisfosfato de fosfatidilinositol (PI(3,5)P2) que resulta en la acumulación tardía en el endosoma53. Además, la falta de PI(3,5)P2 conduce a la vacuologénesis intracelular fisiológica debido a los defectos en la señalización de la membrana que surgen de los endosomas tardíos54. Ya que no se ha realizado el análisis de fosfoinosítidos intermedios en la vía de PIP³ , es muy probable que se produjera un agotamiento en la síntesis de PI(3,5)P2 en las células de neuroblastoma, como es evidente a partir de la vacuologénesis en ausencia de FIG4. En los resultados, las vacuolas tenían biomarcadores endosómicos tardíos, lo que concuerda con los hallazgos de Zhang et a/54. Dado que no se observó una estimulación de PI3KII durante el tratamiento con RA+BDNF+ES post-ARNip de FIG4 (como se observó sin el tratamiento con ARNip de FIG4), el papel de PI3KII en la ES y la diferenciación neural es cuestionable.

Durante el recambio de lípidos en la membrana plasmática durante la diferenciación celular (Fig. 17a), la síntesis de PI(3,5)P2 a partir de 3-fosfato de fosfatidilinositol (PI(3)P) requiere Pikfyve55. La reacción inversa requiere PI(3,5)P2 5-fosfatasa FIG456 y curiosamente, tanto las proteínas para las reacciones directas como las inversas coexisten en el mismo complejo proteico57. Sin embargo, la especificidad de la ES solo hacia FIG4 en este complejo múltiple necesita más investigación.

Finalmente, la aparente estimulación de los neuropéptidos en el tejido de granulación y el avance temporal y espacial de las fibras nerviosas en la epidermis de las heridas tratadas con E^s sugieren que el efecto de la ES es más proximal a los nervios sensoriales, aunque los estudios continúan examinando el principal objetivo de ES. En este contexto, la metodología no invasiva de la ES para promover la diferenciación celular neuronal/relacionada con los nervios, además de los datos que muestran una mayor supervivencia celular después de la ES, sugiere nuevas perspectivas y objetivos moleculares para la ES en la reparación de tejidos. En conclusión, los hallazgos proporcionan evidencia de que la aplicación de ES impacta profundamente en los melanocitos, las células de Merkel y la reinervación de las heridas de la piel humana in vivo.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un kit para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente, en el que el kit comprende: un dispositivo para promover la reinervación de un nervio dañado en un paciente, y el dispositivo comprende medios para estimular eléctricamente la piel del paciente en un lugar diferente del sitio del nervio dañado; y

un armazón que promueve la reinervación, un injerto que promueve la reinervación, una población de células que promueve la reinervación o un fármaco que promueve la reinervación;

en el que los medios para estimular eléctricamente la piel del paciente están configurados para estimular eléctricamente la piel del paciente con un ciclo de frecuencia fluctuante de aproximadamente 15 Hz a aproximadamente 351 Hz, y en el que la frecuencia cambia entre los límites superior e inferior del rango de frecuencia dentro de un ciclo de aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 20 segundos.

2. Un kit según la reivindicación 1, en el que los medios para estimular eléctricamente la piel del paciente están configurados para estimular eléctricamente la piel del paciente con una corriente de aproximadamente 0,001 mA a aproximadamente 0,006 mA.

3. Un kit según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los medios para estimular eléctricamente la piel del paciente están configurados para estimular eléctricamente la piel del paciente con una amplitud de aproximadamente 10 V a aproximadamente 100 V.

4. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los medios para estimular eléctricamente la piel del paciente están configurados para estimular eléctricamente la piel del paciente con ciclos interrumpidos.

5. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los medios para estimular eléctricamente la piel del paciente están configurados para estimular eléctricamente la piel del paciente durante uno o más ciclos de frecuencia fluctuante al final de una ronda de tratamiento.