CN109381456A - 三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用。本发明将三氟淫羊藿素用于治疗心血管疾病的药物中的应用中，证明三氟淫羊藿素可减轻缺血再灌注诱导的心电图损害，降低缺血再灌注损伤的心肌氧化应激、抑制心肌细胞自噬与凋亡，提高Akt信号的活化，降低自噬标记物Beclin‑1和LC3‑Ⅱ水平。是一种有开发前景的治疗心血管疾病的药物，尤其是治疗心肌缺血(心肌梗死)再灌注损伤的药物。

Description

三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用
技术领域：
本发明属于医药领域，具体涉及三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用和三氟淫羊藿素在制备抑制细胞凋亡药物中的应用。
背景技术：
随着我国经济的不断发展和人民生活水平的不断提高，心血管系统疾病在我国的发病率不断升高，并成为导致我国居民死亡的主要原因之一，其中缺血性心肌病已成为人类首要致死病因。缺血的心肌组织再次得到血液供应的治疗手段往往不同程度地导致再灌注损伤，出现明显的心肌功能障碍和结构损伤。这种在心肌缺血基础上恢复血流供应后组织损伤加重甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血/再灌注损伤这种损伤减少了再灌注治疗的效果，导致心脏功能受损和心肌细胞损伤等，严重影响了基础疾病的预后,成为临床心脏病学的重要问题。心肌缺血再灌注损伤发生的机制复杂多变，可能与活性氧自由基攻击有关，而且Ca2+超载、炎症反应浸润、能量代谢障碍等各机制间相互关联，互为因果。因此，寻找通过多靶点起效，能够有效预防或改善心肌缺血/再灌注损伤的药物是目前最紧要的目标。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用。
本发明经过试验发现，ICTF(三氟淫羊藿素)升高Akt的磷酸化水平，降低自噬标记物Beclin-1和LC3-Ⅱ，说明ICTF可通过激活Akt信号抑制自噬，从而减轻心肌细胞损伤。ICTF可升高抗凋亡的Bcl-2的mRNA表达，降低促凋亡基因Caspase-3的表达，提示ICTF可通过抑制细胞凋亡起保护缺血再灌注心肌的作用。
因此，本发明提供三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供三氟淫羊藿素在制备抑制细胞凋亡药物中的应用。
优选，是在制备升高抗凋亡的Bcl-2的mRNA表达，降低促凋亡基因Caspase-3的表达药物中的应用。
本发明的第三目的是提供一种三氟淫羊藿素通过激活Akt信号抑制自噬，从而减轻心肌细胞损伤和/或通过抑制细胞凋亡起保护缺血再灌注心肌的作用在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
所述的治疗心血管疾病药物优选为治疗心肌缺血(心肌梗死)再灌注损伤的药物。
优选，所述的三氟淫羊藿素是以三氟淫羊藿素与药物上可接受的载体和/或稀释剂组成的药物组合物的形式。
本发明将三氟淫羊藿素用于治疗心血管疾病的药物中的应用中，证明三氟淫羊藿素可减轻缺血再灌注诱导的心电图损害，降低缺血再灌注损伤的心肌氧化应激、抑制心肌细胞自噬与凋亡，提高Akt信号的活化，降低自噬标记物Beclin-1和LC3-Ⅱ水平。是一种有开发前景的治疗心血管疾病的药物，尤其是治疗心肌缺血(心肌梗死)再灌注损伤的药物。
附图说明：
图1是三氟淫羊藿素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图的影响；
图2是三氟淫羊藿素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死范围的影响；
图3是三氟淫羊藿素对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织p-Akt、Beclin-1、LC3B-Ⅰ蛋白表达的影响；
图4是三氟淫羊藿素对心肌缺血再灌注大鼠心肌组织凋亡相关基因表达的影响；
其中Sham代表假手术对照组，MIR+Vehichle(或Vehichle)代表肌缺血再灌注损伤模型组；MIR+0.5mg/kg ICTF代表心肌缺血再灌注损伤模型+三氟淫羊藿素低剂量组：腹腔注射0.5mg/ml三氟淫羊藿素；MIR+1mg/kg ICTF代表心肌缺血再灌注损伤模型+三氟淫羊藿素中剂量组：腹腔注射1mg/ml三氟淫羊藿素；MIR+2mg/kg ICTF代表心肌缺血再灌注损伤模型+三氟淫羊藿素高剂量组：腹腔注射2mg/ml三氟淫羊藿素；
图5是三氟淫羊藿素对H2O2诱导H9C2心肌细胞活性的影响，其中图中的ctrl是空白对照组，Vehichle是H2O2模型组，1、3、10、30、100代表三氟淫羊藿素相应的处理浓度。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
(1)体内实验
1)实验动物：SPF级雄性Sprague-Dawely(SD)大鼠，30只，体重250±20g，所有大鼠自由饮水饮食，并维持在12h：12h光：暗的恒温恒湿环境中。大鼠随机分为5组
①假手术对照组：舌下静脉注射生理盐水；
②心肌缺血再灌注损伤模型组：舌下静脉注射生理盐水；
③心肌缺血再灌注损伤模型+三氟淫羊藿素低剂量组：腹腔注射0.5mg/ml三氟淫羊藿素；
④心肌缺血再灌注损伤模型+三氟淫羊藿素中剂量组：腹腔静脉注射1.0mg/ml三氟淫羊藿素；
⑤心肌缺血再灌注损伤模型+三氟淫羊藿素高剂量组：腹腔静脉注射2.0mg/ml三氟淫羊藿素；
2)心肌缺血再灌注损伤模型制备及三氟淫羊藿素处理：大鼠麻醉后，气管插管，连接动物呼吸机，肢体Ⅱ导联行心电图监测。开胸，暴露心脏，于左冠状动脉前降支起始部下2mm处结扎，结扎时用一直径约0.8mm塑料管垫于血管与结扎线之间。以心电图Ⅱ导联ST段抬高0.1mV或T波高耸、心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志。结扎40min后拔去小塑料管行再灌注60min。假手术对照组于左冠状动脉前降支起始部下2mm处穿线，不结扎。三氟淫羊藿素(0.5,1.0,2.0)组于缺血后10min，分别腹腔注射浓度为0.5,1.0,2.0mg/ml的三氟淫羊藿素，注射体积为1ml/kg；假手术对照组和模型组于同一时间点腹腔注射注射同体积的溶剂。实验过程中记录肢体二导联心电图。
3)标本收集集：心肌缺血40min，再灌注60min后，实验结束后，迅速分离心脏，将其至于生理盐水中冲洗干净后取缺血处心肌组织，于-80℃冰箱保存，用于mRNA及蛋白表达检测。
4)qPCR方法检测mRNA表达：用TRIzol提取总RNA，酶标仪测定总RNA的浓度和纯度，取4μg RNA样本，按试剂盒说明书操作进行反转录。将反应板进行短暂离心后置于冰上，往对应的反应孔内加入cDNA 2μL、1x SYBR 10μL，加超纯水至20μL。反应条件：95℃预变性20min，PCR反应，95℃变性10s，61℃退火20s，72℃延伸25s，共40个循环。
5)Western-blot法检测心肌组织中Akt其活化形式(p-Akt)和p-mTOR以及Beclin-1和LC3B蛋白的表达。
(2)体外实验
1)H9C2心肌细胞培养：H9C2心肌细胞系复苏后，传代培养，培养至第3代后用于以下实验。
2)H2O2氧化应激损伤模型制备：培养的H9C2心肌细胞，用高糖DMEM培养基加10％胎牛血清将细胞调成5×104个/ml浓度，接种于96孔板，每孔100μl，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。吸弃培养基，换无血清DMEM，用不同终浓度(50,100,200,400,800μM)的H2O2造成氧化应激损伤模型。结果以400μM的H2O2适合用于氧化应激损伤模型。
3)H2O2氧化应激损伤模型制备及药物干预方法：培养的H9C2心肌细胞，用高糖DMEM培养基加10％胎牛血清将细胞调成5×104个/ml浓度，接种于96孔板，每孔100μl，37℃，5％CO2培养箱中培养24h，加入三氟淫羊藿素进行处理(终浓度为1,3,10,30,100μM)30min后，吸弃培养基，换无血清DMEM，用终浓度为400μM的H2O2造成氧化应激损伤模型，同时给药物处理60min，每个浓度设5复孔，CCK-8方法检测细胞活性。重复实验3次。
空白对照组是H9C2心肌细胞加溶剂代替药物，模型组于H2O2造模前30钟至造模60分钟均加溶剂处理，各药物组于H2O2造模前30分钟及造模60分钟后分别加不用浓度的三氟淫羊蒮素处理。
(3)统计：采用SPSS 20.0软件统计实验数据。所有数据以均数±标准差表示，组间的总体比较采用单因素方差分析，组内的多重比较采用SNK检验，P<0.05为差异有统计学意义。
(4)体内实验结果显示：三氟淫羊藿素(Trifluoro-icaritin,ICTF)可降低大鼠左冠状动脉结扎及再通所导致的心电图T波及ST段抬高(图1)，减小梗死体积(图2)，升高Akt的磷酸化水平，降低自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B水平(图3)，提示ICTF可通过激活Akt，抑制细胞自噬起保护缺血再灌注心肌的作用。另外，三氟淫羊藿素处理后，可升高抗凋亡的Bcl-2的mRNA表达，降低促凋亡基因Caspase-3的表达(图4)，提示ICTF可通过抑制细胞凋亡起保护缺血再灌注心肌的作用。
(5)体外实验结果显示：ICTF可抑制诱导的心肌细胞损伤，提示ICTF可通过抑制氧化应激对心肌缺血再灌注损伤起保护作用(图5)。
综上所述：三氟淫羊藿素可减轻缺血再灌注诱导的心电图损害，降低缺血再灌注损伤的心肌氧化应激、抑制心肌细胞自噬与凋亡。三氟淫羊藿素是一种有开发前景的治疗心血管疾病的药物，尤其是治疗心肌缺血(心肌梗死)再灌注损伤的药物。

Claims (6)

1.三氟淫羊藿素在制备激活Akt信号抑制自噬药物中的应用。
2.三氟淫羊藿素在制备抑制细胞凋亡药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是在制备升高抗凋亡的Bcl-2的mRNA表达，抑制促凋亡基因Caspase-3的表达药物中的应用。
4.三氟淫羊藿素通过激活Akt信号抑制自噬，从而减轻心肌细胞损伤和/或通过抑制细胞凋亡起保护缺血再灌注心肌的作用在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的治疗心血管疾病药物为治疗心肌缺血-心肌梗死再灌注损伤的药物。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的应用，其特征在于，所述的三氟淫羊藿素是以三氟淫羊藿素与药物上可接受的载体和/或稀释剂组成的药物组合物的形式。
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