CN108434311A - 一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药及其制备方法与应用 - Google Patents

一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药及其制备方法与应用，属于医药技术领域。传统的瓜蒌薤白半夏汤剂，有效成分不可控，服用量较大，药效不稳定。部位药有效成分可控、使用剂量小、服用方便，可以改善汤剂的缺陷。制备方法，包括粉碎、分步醇提、浓缩、萃取等步骤。本发明的部位药能同时达到以下功效：改变心电图ST段数值、减少心肌梗死面积、降低血浆中血脂含量、降低血清心肌酶活性、保护心肌细胞、抑制高糖对细胞的损伤，起到高效治疗二型糖尿病合并冠心病的效果，且无副作用、患者无痛苦。

Description

一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药及 其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药及其制备方法与应用，属于医药技术领域。
背景技术
目前，糖尿病(DM)已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。25%的DM患者有血管并发症，如冠心病(CHD)、动脉粥样硬化等。其中，二型糖尿病合并冠心病(DM2-CHD)死亡率高，且患者日趋年轻化。因此，严重危害了人类健康，增加社会医疗负担。
目前临床DM2-CHD的治疗手段主要有经皮穿刺腔内冠状动脉成形术或溶栓药物治疗。这些治疗方式虽然在一定程度上可以缓解患者的症状，改善心肌供血，但仍然没有完全改变当前该病发病率高的现状，且副作用大。长期中医临床实践表明，中医药治疗该病疗效高，毒副作用小。研发防治DM2-CHD的高效中药，将造福患者，产生显著的社会与经济效益。
瓜蒌薤白半夏汤(GXBD)，出自东汉著名医家张仲景所著《金匮要略》，具有通阳散结、祛痰活血、行气止痛之效；是目前中医临床防治心血管系统疾病的重要方剂，被广泛用于心绞痛、糖尿病等多种心血管疾病的治疗。但传统的瓜蒌薤白半夏汤剂，有效成分不可控，服用量较大，药效不稳定。
部位药有效成分可控、使用剂量小、服用方便，可以改善汤剂的缺陷，经检索，目前还没有有关治疗(DM2-CHD)的部位药的公开报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药及其制备方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法，包括步骤如下：
(1) 将瓜蒌、薤白、半夏按质量比为6:3:2的比例混匀，粉碎，得混合物；
(2) 向混合物中加入混合物10倍量的75%乙醇浸泡，加热回流提取，得到提取液Ⅰ和药渣Ⅰ；
(3) 向药渣Ⅰ中加入药渣Ⅰ8倍量的75%乙醇，加热回流提取，得到提取液Ⅱ和药渣Ⅱ；
(4) 向药渣Ⅱ中加入药渣Ⅱ6倍量的75%乙醇，加热回流提取，得到提取液Ⅲ；
(5) 合并提取液Ⅰ、提取液Ⅱ和提取液Ⅲ，回收乙醇，得到药液；
(6) 减压抽滤药液；
(7) 将药液浓缩成浸膏；
(8) 将浸膏溶解于纯水中，制成浓度为2g生药/ml的浸膏药液；
(9)将浸膏药液依次用石油醚、氯仿(CHCl3)萃取，石油醚、氯仿萃取后，再用乙酸乙酯(CH2COOCH2CH3)进行萃取，回收萃取液中溶剂，然后减压浓缩、真空干燥，得到治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药。
根据本发明优选的，步骤（1）中瓜蒌、薤白、半夏的质量比为6:3:2。
根据本发明优选的，步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中乙醇均为质量浓度为75%的乙醇。
根据本发明优选的，步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中加热回流提取温度为90℃，提取时间为2h。
根据本发明优选的，步骤（9）中，石油醚、氯仿(CHCl3)萃取分别萃取三次。
一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药，按上述方法制得。
一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的应用，用于治疗二型糖尿病合并冠心病。
一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的应用，加入常规药用辅料制成药物制剂，制剂中含有瓜蒌薤白半夏汤部位药的剂量为50%。
本发明的优良效果如下：
1、本发明依次用石油醚、氯仿(CHCl3)萃取后，再用乙酸乙酯(CH2COOCH2CH3)进行萃取得到的部位药可以有效的治疗二型糖尿病合并冠心病。
2、本发明的部位药能同时达到以下功效：改变心电图ST段数值、减少心肌梗死面积、降低血浆中血脂含量、降低血清心肌酶活性、保护心肌细胞、抑制高糖对细胞的损伤，起到高效治疗二型糖尿病合并冠心病的效果，且无副作用、患者无痛苦。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中所用原料均为常规原料，所用设备均为常规设备。
实施例1
一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法的制备方法，包括步骤如下：
(1) 将瓜蒌、薤白、半夏三种中药材按照6:3:2的比例混匀、捣碎，得混合物；
(2) 混合物加入10倍量75%的乙醇浸泡40分钟；加热回流提取2小时，得到提取液Ⅰ和药渣Ⅰ；
(3) 药渣Ⅰ加入8倍量75%的乙醇进行第二次加热回流提取2小时，得到提取液Ⅱ和药渣Ⅱ；
(4) 药渣Ⅱ加入6倍量75%的乙醇进行第三次加热回流提取2小时，得到提取液Ⅲ；
(5) 合并提取液Ⅰ、提取液Ⅱ和提取液Ⅲ，回收乙醇，得到药液；
(6) 减压抽滤药液；
(7) 将药液浓缩成浸膏；
(8) 将浸膏溶解于纯水中，使浓度约为1.5g生药/ml；
(9) 再将药液层依次用石油醚、氯仿(CHCl3)，每个部位都需要连续萃取三次；
(10) 上述两种溶剂萃取后，用乙酸乙酯(CH2COOCH2CH3)进行萃取，用回流装置回收萃取液中的溶剂，得到组分3。将组分3减压浓缩、真空干燥，得提取物干膏；即GXBD-SM3部位药。
验证实验例
对DM2-CHD干预效果显著高于复方丹参片
实验例一、动物实验：对DM2-CHD模型大鼠的保护作用
1. 实验方法
1.1 DM2-CHD大鼠模型的制备
采用高脂乳灌胃联合腹腔注射小剂量STZ的方法制造DM2-CHD大鼠模型。
(1) 制备高血脂大鼠：大鼠灌服高脂乳(10ml·kg-1·d-1)，同时喂以普通饲料。空白对照组灌服相当剂量的生理盐水并喂以普通饲料。分别于灌服高脂乳后第14天、21天，乙醚麻醉大鼠后眼眶取血，连续两次测定血浆TC，TG，LDL，HDL。测试数据取平均值，其中TC，TG，LDL升高，HDL降低，与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。即视为高脂血症动物模型制作成功。
(2) 制备DM2大鼠模型：挑选以上述方法高脂血症造模成功的大鼠，过夜禁食后称重。40mg/kg体重腹腔单次注射低剂量STZ。3天后，大鼠空腹18小时，用1ml针头从尾静脉采集血样，检测血空腹葡萄糖。然后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。OGTT试验后2天，选取糖尿病大鼠、正常大鼠各4只，进行胰岛素耐量实验(ITT)。将空腹血糖>10mmol/L的大鼠视为造模成功大鼠。
(3) DM2-CHD大鼠模型的制备 糖尿病大鼠模型成立后，进行冠脉结扎术。手术过程简述如下：大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后(按0.3ml/100g腹腔注射)，进行气管插管，并连接呼吸机，行机械辅助呼吸。从左侧第3、4肋间开胸，用止血钳分层钝性分离皮下组织、胸大肌及前锯肌，显露肋骨和肋间肌，用眼科镊逐步撕开心包膜，暴露心脏。用圆形无创伤缝合针和6/0丝线于左冠状动脉前降支起始部下2mm处，结扎，以心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志。 用消毒脱脂棉处理胸腔内的积血和积液。处理完成后，挤压并紧密闭合胸腔，逐步分层缝合肋骨、肌肉、皮肤。碘伏消毒缝合处皮肤。
血糖检测
各组大鼠分别与高脂乳灌胃造模1周后(实验开始的第7天)、糖尿病成模后(实验开始的第28天)、冠脉结扎术后第3天(实验开始的第31天)进行三次血糖检测。禁食18小时后，尾静脉采血，按生化试剂盒说明书测血糖。
血脂检测
各组大鼠分别与高脂乳灌胃造模的第7、14、21、31及处死的当天进行5次血脂测。处死前禁食18小时后，尾静脉采血，处死时腹主动脉取血，酶联免疫法(ELISA)检测。按试剂盒说明书进行。
心电图检测
冠脉结扎前后、冠脉结扎后第3天心电图改变。将大鼠麻醉(100g/L水合氯醛，0.3ml/100g)后，在BL-420E生物机能实验系统下进行心电图观察。具备以下条件之一者判断为心肌梗死阳性：(1) J点水平向下或向上偏移≥0.1mv；(2) T波高耸，超过同导联R波的1/2；(3) T波高耸伴ST段移位。
心肌梗死面积检测
大鼠处死，迅速取出心脏。冰生理盐水洗尽心脏残血，并用滤纸吸干。将心脏-20℃冷冻15min，从结扎线下方开始，将心脏横切成1～2mm厚薄均匀的薄片，置于pH7.4的1%TTC(氯化三苯四氮唑)的PB缓冲液中，于37℃避光孵育15min后取出拍照。用Image ProPlus软件(Media Cybernetics)测算心梗面积。使用软件对每个切片圈出梗死心肌和正常心肌(梗死心肌呈白色，正常心肌呈暗红色)，每个心脏从结扎线下至少测算5个切面的数据，统计计算心肌梗死面积。
心肌酶谱检测
取血浆，用半自动生化分析仪、按各试剂盒说明书进行操作，分别测定血浆5项心肌酶(CK、CKMB、LDH、AST、α-HBDH)活性。
动物分组及处理
Wistar雄性大鼠80只，随机分为6组：正常对照组(简称正常组，Ctrl)，二型糖尿病合并冠心病模型组(简称模型组，DM2-AMI)、阳性药对照组(即复方丹参片干预组，简称阳性药组，Sal组)，瓜蒌薤白半夏汤乙酸乙酯组份小、中、大剂量干预组(简称SM3小、中、大剂量组，SM3-S, SM3-M, SM3-L)。因需要剔除造模不成功及死亡大鼠，为保证实验结束时每组大鼠不少于8只，开始时各组大鼠数量如下：正常组10只，其余各组每组14只，共80只。
给药方式及剂量：从冠状动脉结扎前1周开始，至处死当天，SM3小、中、大剂量组每天灌胃给药100mg/(kg.d)、200mg/(kg.d)、300mg/(kg.d)；阳性药组灌胃复方丹参片1g/(kg.d)，正常组灌胃同体积生理盐水。给药时间合计15天。冠脉结扎术后第3天，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉(100g/L，0.3ml/100g大鼠体重)。辅助动脉取血、取心脏。
以开始灌服高脂乳剂的日期为起点计算天数，按表1设计逐步制造DM2-AMI模型。
表1 GXBD-SM3干预DM2-AMI药效评估部分各组大鼠处理时间安排
注：①1d, 7d, …30d, etc. 指开始灌服高脂乳剂的第一天，第七天，…第三十天，等；②HFE指高脂乳剂(High fat emulsion)；③NS指生理盐水；④测血脂，包括乙醚麻醉，眼眶取血，生化试剂盒测血浆中血脂含量等操作。⑤测血糖，包括禁食18小时，尾静脉采血，生化试剂盒测空腹血糖等操作。⑥组别及数量中大鼠数量为实验开始时的数量，扣除实验过程中死亡和造模不成功的大鼠，需要保证实验结束时每组大鼠不少于8只。
数据统计
采用SPSS21.0软件进行两独立样本t检验，两独立样本校正t检验和完全随机设计资料的方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠心电图
冠状动脉结扎手术后第3天，大鼠麻醉后，在BL-420E生物机能实验系统下进行心电图观察。心电图检测判定标准参见第一部分。如表2所示，模型组心电图ST段数值均发生了异常变化，而丹参组心电图异常的阳性率降低到41.67% (表2)
表2 各组大鼠心电图变化 (n=8)
*与对照组比较P<0.01；△与模型组比较P<0.05
2.2 各组大鼠心肌梗死面积
如表3所示，模型组大鼠心肌梗死面积达18.65±2.76%；而灌服SM3的大鼠心肌梗死面积显著降低到11.61±1.06%(表3，P<0.05)。
表3 各组大鼠心肌梗死面积 (±s，n=8)
*与对照组比较P<0.01；△与模型组比较P<0.05
2.3 大鼠血脂水平测定
如表4所示，对照组比较，模型大鼠血浆TC、TG、LDL含量显著升高，血浆HDL浓度水平均有明显下降(P<0.01)；SM3干预可明显逆转上述变化，显著降低了DM2-AMI大鼠的血浆TC、TG、LDL的含量，同时升高了其血浆HDL水平(表4，P<0.01)。
表4 各组大鼠血脂变化(±s, n=8, 单位 mmol/L)
*与对照组比较P<0.01；△与模型组比较P<0.01；＊与阳性对照组比较P>0.01
2.4 大鼠心肌酶水平测定
血清心肌酶谱检测数据表明，与对照组相比，DM2-AMI模型大鼠血清5项心肌酶活性均显著升高(P<0.01)，灌服SM3可明显降低该模型鼠血清心肌酶活性(表5，P>0.01)。
表5 各组大鼠心肌酶变化比较(±s，n=8, 单位 u/L)
*与对照组比较P<0.01；△与模型组比较P<0.01；＊与阳性对照组比较P>0.01
2.5 各组大鼠血糖含量
如表6所示，对照组比较，模型大鼠血糖含量显著升高(P<0.01)；SM3干预可显著抑制DM2-AMI大鼠血糖含量升高(表6，P<0.05)。
表6 各组大鼠血糖变化(±s，n=8，单位 mmol/L)
*与对照组比较P>0.05；△与模型组比较P>0.05；＊与对照组比较P<0.01
实验例二：体外细胞实验：对高糖损伤的心肌细胞的保护作用
1. 实验方法
1.1心肌细胞的提取培养
取1-3d龄的大鼠乳鼠，75%酒精中浸泡10s。无菌条件下取出心脏，以预冷的PBS液中清洗三次。将心肌组织剪碎至大约1mm3，以5倍体积的0.1%胰蛋白酶，37℃恒温振荡消化8min。更换酶液反复消化，直至组织碎块完全消化。收集细胞悬液，200目过滤。滤液1000rpm 4℃离心10min。弃上清。以含10%胎牛血清的DMEM培养液，轻轻吹打成单细胞悬液。转移至培养皿中，差速贴壁90min，以使大部分心脏成纤维细胞贴壁。小心吸出未贴壁细胞，根据实验需要调整细胞密度，接种于0.1%明胶预先铺好的不同规格培养皿中，并加入终浓度为0.1mmol·L-1 的5-Brdu。置于37℃、5%CO2培养箱中培养，24h细胞第一次换液。
心肌细胞的处理
细胞常规培养5天后，分为以下4组对照组(Ctrl)、渗透压对照组(Osp-Ctrl)、高糖损伤组(Mod)以及SM3组。Ctrl组以正常心肌细胞培养液培养；Mod组培养液中添加60 mmol/L的葡萄糖；Osp-Ctrl组培养液中添加60 mmol/L的甘露醇，以维持和Mod组相同的渗透压；SM3组在Mod组的基础上分别添加系列浓度系列浓度(5、10、20、40、80、100、150μg/mL)的SM3。按上述设计分别处理10h后，进行下面的检测。
形态学观察
倒置相差显微镜下观察各组细胞形态。
细胞存活率检测
MTT法检测细胞存活率。将上述各组细胞培养于96孔板。每孔加5 mg/mL的MTT 20μL，培养4 h后加入150μL DMSO，置恒温摇床震荡10 min。酶标仪检测各孔吸光度值(OD值)，检测波长492 nm，参比波长630 nm。设定正常对照组细胞存活率为100%，按下述公式计算其余各组细胞存活率：细胞存活率(%)=(OD值-调零OD值)/(对照OD值-调零OD值)×100%。
数据处理
采用SPSS21.0统计学软件对各组数据进行统计分析。所有数据均以均数±标准差(±s)的形式表示，组间比较采用One way-ANOVA，P<0.05或P<0.01为差异具有统计学意义。
结果
2.1 各组细胞形态
相差显微镜观察发现，和正常培养及渗透压对照组细胞相比，高浓度葡萄糖处理的细胞大量从皿底脱落、死亡，细胞完整性差。培养液中加入GXBD-SM3组分处理组中，多数细胞仍呈贴壁状态，生长状态良好，仅少量细胞脱落。
各组细胞存活率
如表7所示，MTT检测数据表明，和对照组相比，含60 mmol/L葡萄糖的培养液处理细胞后，其存活率显著降低，仅为61.8% ；而渗透压对照组细胞存活率与正常对照组无显著性差异。SM3组细胞存活率高于高糖损伤组，其中10μg/mL 的SM3效果最佳，可将细胞存活率提高到83.3%。该结果表明，高浓度葡萄糖处理显著降低了心肌细胞的生存能力，瓜蒌薤白半夏汤SM3部位能显著抑制高糖对细胞的损伤(表7，P<0.01)。
表7 各组细胞存活率(±s，n=10)
注：SM3-5～SM3-150：细胞培养液中GXBD-SM3组份的含量(单位：μg/mL)； **：与正常组比较P<0.01；△△：与模型组比较P<0.01。

Claims (8)

1.一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法，包括步骤如下：
(1) 将瓜蒌、薤白、半夏按质量比为6:3:2的比例混匀，粉碎，得混合物；
(2) 向混合物中加入混合物10倍量的75%乙醇浸泡，加热回流提取，得到提取液Ⅰ和药渣Ⅰ；
(3) 向药渣Ⅰ中加入药渣Ⅰ8倍量的75%乙醇，加热回流提取，得到提取液Ⅱ和药渣Ⅱ；
(4) 向药渣Ⅱ中加入药渣Ⅱ6倍量的75%乙醇，加热回流提取，得到提取液Ⅲ；
(5) 合并提取液Ⅰ、提取液Ⅱ和提取液Ⅲ，回收乙醇，得到药液；
(6) 减压抽滤药液；
(7) 将药液浓缩成浸膏；
(8) 将浸膏溶解于纯水中，制成浓度为2g生药/ml的浸膏药液；
(9)将浸膏药液依次用石油醚、氯仿萃取，石油醚、氯仿萃取后，再用乙酸乙酯进行萃取，回收萃取液中溶剂，然后减压浓缩、真空干燥，得到治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药。
2.根据权利要求1所述的治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法，其特征在于，步骤（1）中瓜蒌、薤白、半夏的质量比为6:3:1。
3.根据权利要求1所述的治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中乙醇均为质量浓度为75%的乙醇。
4.根据权利要求1所述的治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（2）、步骤（3）中加热回流提取温度为90℃，提取时间为2h。
5.根据权利要求1所述的治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的制备方法，其特征在于，步骤（9）中，石油醚、氯仿萃取分别萃取三次。
6.一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药，采用权利要求1所述的方法制得。
7.一种治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的应用，用于治疗二型糖尿病合并冠心病。
8.根据权利要求7所述的治疗二型糖尿病合并冠心病的瓜蒌薤白半夏汤部位药的应用，加入常规药用辅料制成药物制剂，制剂中含有瓜蒌薤白半夏汤部位药的剂量为50%。
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