CN110507659A - 前列腺素e1在制备治疗脑出血的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了前列腺素E1在制备脑出血的药物中的应用，属于生物医药技术领域。与现有技术相比，本发明通过PGE1治疗脑出血，与NaCl空白对照治疗组比较：脑出血病人预后功能学明显改善；脑出血小鼠的运动能力恢复及神经功能改善得到明显提高，脑出血小鼠脑血肿周围组织凋亡神经细胞数目显著降低、存活神经细胞数目显著增加，星形胶质细胞的增殖、小胶质细胞的活化以及氧化应激反应得到明显抑制；同时PGE1在体外实验，可以减少细胞活力的降低、LDH的释放以及神经元的凋亡。

Description

前列腺素E1在制备治疗脑出血的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及前列腺素E1在制备脑出血的 药物中的应用。
背景技术
脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外伤性脑内血管自发性 破裂引起的脑实质出血，为脑卒中亚型之一，在我国约占全部脑卒中的 20％～30％。ICH是神经科常见疾病，发病急、病情重，虽经多年研究，至 今治疗手段有限，其急性期病死率为30％～40％，幸存者中多数留有不同程 度的运动障碍、认知障碍、言语吞咽障碍等后遗症。本病的高死亡率和高致 残率给家庭、社会带来沉重的痛苦和负担，随着人口老龄化，ICH造成的危害日趋严重。
目前对脑出血的治疗主要是内科对症治疗或外科手术治疗，其余尚无突 破性进展，尚无针对血肿周围组织保护的特异性治疗的药物。现有技术中， 前列腺素E1临床上主要用于心肌梗死，血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化等 症，但是关于前列腺素E1还具有何种作用，则没有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供前列腺素E1在制备脑出血的药物中 的应用，提供了前列腺素E1的新用途。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了前列腺素E1在制备治疗脑出血的药物中的应用。
优选的，通过保护脑出血后血肿周围组织来改善脑出血患者预后。
优选的，通过改善血肿周围组织的局部低脑血流状态来保护脑出血后血 肿周围组织。
优选的，通过促进血肿吸收来保护脑出血后血肿周围组织。
优选的，通过减小血肿周围损伤区域来保护脑出血后血肿周围组织。
优选的，通过减少血肿周围组织细胞活力的降低来改善脑出血患者预 后。
优选的，通过减少血肿周围组织乳酸脱氢酶的释放来改善脑出血患者预 后。
优选的，通过减少血肿周围组织神经元凋亡来改善脑出血患者预后。
优选的，通过对脑出血后血肿周围组织进行神经保护来治疗脑出血。
优选的，通过抑制血肿周围域星形胶质细胞的增殖、抑制小胶质细胞的 活化和抑制氧化应激反应途径的一种或几种来神经保护。
本发明提供了前列腺素E1在制备脑出血的药物中的应用，使用前列腺 素E1后，通过保护脑出血后血肿周围组织、减小血肿周围损伤区域、减少 血肿周围组织细胞活力的降低、减少血肿周围组织乳酸脱氢酶的释放、减少 血肿周围组织神经元凋亡和对血肿周围组织进行神经保护等几种途径来改 善脑出血患者预后，所述保护脑出血后血肿周围组织是通过改善血肿周围组 织的局部低脑血流状态、促进血肿吸收和减小血肿周围损伤区域实现的，所 述神经保护是通过抑制血肿周围组织星形胶质细胞的增殖、抑制小胶质细胞 的活化和抑制氧化应激反应途径实现的。
有益效果：
与现有技术相比，本发明通过PGE1治疗脑出血，与NaCl空白对照治 疗组比较：SPECT提示血肿、血肿周围组织近端和远端放射性填充物明显改 善，rCBF值明显提高，Ra值也明显高于对照组；脑出血小鼠的运动能力恢 复及神经功能改善得到明显提高，脑出血小鼠脑组织血肿周围组织凋亡神经 细胞数目显著降低、存活神经细胞数目显著增加，血肿周围组织星形胶质细 胞的增殖、小胶质细胞的活化以及氧化应激反应得到明显抑制；同时PGE1 在体外实验，可以减少细胞活力的降低、LDH的释放以及神经元的凋亡。
附图说明
图1是PGE1的化学结构式图；
图2是局部脑血流量分析图，其中，A为脑出血后第5天，PGE1组； B为脑出血后第20天，PGE1组；C为脑出血后第5天，对照组；D为脑出 血后第20天，对照组；
图3为血肿周围血肿体积与Ra值的相关性；
图4为血肿周围组织体积与血肿周围区域Ra值的相关性；
图5是ICH小鼠治疗神经功能恢复结果分析图，其中，A为24点法 神经功能缺陷评分；B为加速旋转试验；N＝12,*,#p<0.05，与对应时间点 对照组相比差异具有统计学意义；
图6是ICH小鼠血肿体积大小和脑水含量分析图，其中，A为ICH后 4天血肿体积、脑水含量的情况；B为ICH后14天血肿体积、脑水含量 情况；N＝6,*p<0.05，与对照组相比差异具有统计学意义；
图7是ICH后血肿周围域退变神经元数目分析图，其中，A为 ICH+NaCl、ICH+PGE110μg/kg及ICH+PGE1 20μg/kg对ICH后4天、14天 血肿周围域FJB阳性细胞数的影响；B为A的条形统计；N＝6，每张切片 观察4个视野，每个脑组织取3张切片，间隔360μm；N＝6，*p<0.05， 与ICH+NaCl组相比差异具有统计学意义；
图8是血肿周围域血肿周围域神经元的数量分析图，其中，A为ICH后 4天不同剂量PGE1治疗后血肿周围域神经元数量情况；B为PGE1 20μg/kg 之后ICH后4天和14天时的血肿周围域神经元数量情况；C和D分 别为A和B的条形统计；N＝6，*，#p<0.05，与相应对照组相比差异具有 统计学意义；
图9是血肿周围域神经元凋亡情况，其中，A为不同剂量PGE1在ICH 后1天、4天及14天时，对血肿周围域脑组织中活化Caspase-3的表达 改变影响；B为A的条形统计；C显示TUNEL阳性细胞数统计情况，D为 PGE1 10μg/kg和20μg/kg条件下，ICH后4天和14天时血肿周围域 TUNEL的表达情况；N＝6，*，#p<0.05，与相应对照组相比差异具有统计 学意义；
图10是ICH后血肿周围域星形胶质细胞增殖情况分析图，其中，A示 PGE1 10μg/kg和20μg/kg对ICH后第4天和第14天血肿周围域星形胶 质细胞增殖情况；条形统计；N＝6，*，#p<0.05，与相应对照组相比差异具 有统计学意义；
图11是血肿周围域小胶质细胞活化情况分析图，其中，A示ICH后不 同治疗组在第4天、第14天血肿周围域Iba-1表达情况；B示ICH后不 同治疗组Iba-1阳性细胞数条形统计；N＝6，*p<0.05，与相应对照组相比差 异具有统计学意义；
图12是血肿周围域氧化应激损伤的影响分析图，其中，A显示ICH后 不同处理组第4天、第14天时血肿周围组织中H2O2含量的检测；B示 ICH后不同处理组第4天、第14天时血肿周围组织中MDA含量的检 测；C示ICH后不同处理组第4天、第14天时血肿周围组织中CuZnMn-SOD的检测；N＝6，*，#p<0.05，与相应对照组相比差异具有统计 学意义；
图13是血红素诱导神经元凋亡模型(体外ICH模型)细胞活力分析图， 其中，A示CCK-8检测原代皮层神经元在不同hemin浓度刺激条件下细胞 活力状况；B示在hemin在50μM浓度刺激条件下，对原代神经元不同 时间点细胞活力的影响；C示相差显微镜下，原代皮层神经元在不同刺激条 件下明视野形态，比例尺为100μm；*p<0.05，与Normal组相比差异具有 统计学意义；
图14是PGE1在hemin诱导神经元损伤中的作用分析图，其中，A示 CCK-8检测原代皮层神经元在不同PGE1浓度条件下细胞活力状况；B示 在不同PGE1浓度条件下原代皮层神经元上清液中LDH释放情况；C示相 差显微镜下，原代皮层神经元在不同刺激条件下明视野形态，比例尺为 100μm；*p<0.05，与Hemin组相比差异具有统计学意义；
图15是PGE1在hemin诱导的氧化应激损伤中的作用分析图，其中，A 示在培养的原代皮层神经元中TRME荧光染色图；B示不同刺激条件下 TRME的荧光强度；C示在不同条件下原代神经元内总ROS含量；*p<0.05， 与Normal组相比差异有统计学意义；#p<0.05，与Hemin组相比差异具有 统计学意义；
图16是PGE1在hemin诱导神经元凋亡的作用分析图，其中，A示在 不同PGE1浓度条件下活化Caspase-3的表达情况；B示A的条形统计；C 示原代皮层神经元细胞Caspase-3活性变化；D示Bcl-2、Bax及Cyt c的 蛋白水平变化，E示D的条形统计；F示TUNEL阳性细胞数统计；G示 不同PGE1处理下TUNEL变化；*,#p<0.05，与对照组(Hemin组)相比 差异具有统计学意义。
具体实施方式
本发明提供了前列腺素E1在制备治疗脑出血的药物中的应用。在本发 明中，所述前列腺素E1(PGE1)的化学名称为(1R,2R,3R)-3-羟基-2(E)-(3S)-3- 羟基-1-辛烯基-5-氧代环戊烷庚酸，分子式为C20H34O5，化学结构式如图1 所示。在本发明中，所述药物的剂型优选为微粒体混悬液。本发明对所述前 列腺素E1在药物的含量没有特殊限定，采用常规即可。
本发明优选通过保护脑出血后血肿周围组织来治疗脑出血。在本发明 中，优选通过改善血肿周围组织的局部低脑血流状态、缩小血肿体积和减小 血肿周围损伤区域中的一种或几种来保护脑出血后血肿周围组织。
本发明优选通过减少细胞活力的降低、减少乳酸脱氢酶的释放和减少神 经元凋亡中的一种或几种来治疗脑出血。在本发明中，所述细胞优选包括 C57BL/6小鼠原代皮层神经元。
本发明优选通过神经保护来治疗脑出血，本发明优选通过抑制血肿周围 组织星形胶质细胞的增殖、抑制小胶质细胞的活化和抑制氧化应激反应途径 的一种或几种来发挥神经保护作用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
PGE1在治疗脑出血病人的运用
1、病人：2007年11月至2009年1月之间，南通大学附属医院神经内 科收治高血压脑出血病人，40例。
2、纳入及排除标准：按1995年全国脑血管病学术会议制定的诊断标准 进行本实施例。CT检查显示基底节出血量在10～30ml。病人是第一次发病， 没有任何慢性肝病或出血性疾病病史、血小板测量大于100×109/L，且凝血 功能正常。既往存在脑室出血、蛛网膜下腔出血及全身疾病引起的脑出血病 史，以及严重心、肝、肾系统功能缺陷病人须被排除参加本实施例。病情加 重、脑室血肿破裂或蛛网膜下腔出血的病人终止治疗。
3、试验分组：本实施例经南通大学附属医院伦理委员会批准，所有参 与者均知情同意。患者按入院日期随机分为两组。40名合格病人分为PGE1 组和对照组，10名男性和10名女性组成的PGE1组平均年龄在50.2±12.2 岁平均病程在10.2±12.2h，以及10名男性和10名女性组成的对照组平均年 龄在52.1±5.59，平均病程在11.8±5.35h。
4、药物治疗方法：所有患者均根据病情接受常规治疗，包括脱水降颅 内压、调控血压及控制感染等。基于常规疗法，卒中后第五天，PGE1组患 者接受静脉注射PGE1，10μg/d，连续15天。
SPECT图像分析:1)可视化:由两名经验丰富的核医学医生根据标准进行 分析，其中规定，放射性减弱或增强的区域，以及超过两层和故障类型的区 域，肉眼识别为阳性。2)半定量方法:感兴趣的区域(ROI)模型应用于以下层: 最大的血肿，血肿的中部地区，近端地区perihematomal组织，远端地区周 围的正常组织和额叶和顶叶以及对面的镜子成像区域。利用规则的9像素循 环帧获取上述区域的摄取计数，并将摄取比(Ra)定义为观察指标。采用半定 量方法计算了rCBF。Ra计算公式如下:Ra＝病变侧ROI x线计数/镜象区对侧 ROIx线计数。Ra值≤0.9或≥1.1具有临床意义。
血肿体积及血肿周围组织的计算(头颅CT示血肿周围组织低密度区)： 血肿体积的计算采用1/2ABC法。血肿周围组织体积绝对值计算公式如下: 血肿周围组织体积绝对值＝CT扫描示总病灶区(血肿与血肿周围组织混合体 积-血肿体积)。全灶区体积的测量结果与血肿体积的测量结果一致。脑卒中 后第1天、第5天、第12天(PGE1治疗后第7天)、第20天(PGE1治疗后第 20天)进行头颅CT扫描。
临床神经功能评估及预后评估：NIHSS评分分别记录在入院第5天、第 12天和第20天。根据改良Rankin量表记录入院第1天及治疗后的mRS评 分。在之后的三个月随访中也进行NIHSS和mRS评估。
SPECT脑灌注成像结果：
可视化：
对40例患者进行SPECT脑灌注成像评价，结果显示，与未损伤侧相比， 血肿、血肿周围组织近端和远端缺血的放射性分布减少。局部脑血流量(rCBF) 低于未伤侧。对照组治疗后血肿、血肿周围组织近端及远端放射性填充物无 统计学意义。rCBF的改善也不显著；但治疗组血肿、血肿周围组织近端和 远端放射性填充物与治疗前相比差异有统计学意义，rCBF值明显提高(结果 见图2)。
半定量分析:第20天，PGE1治疗组血肿周围组织近端和远端Ra值明显 高于治疗前(p<0.01)，明显高于对照组(p<0.01)。(结果见表1)。
表1治疗前后两组Ra值的变化(χ±S,n＝20)
*：P<0.01PGE1组治疗前后比较；#：P<0.01PGE1组与对照组在第20天的比较
血肿体积(cm3):PGE1组第12、20天血肿体积较第1、5天明显减少，差 异有统计学意义(p<0.01)。对照组血肿体积在第20天较第1天明显减少。第 20天，PGE1组血肿体积明显低于对照组(p<0.01)。(结果见表2)。
表2各时间点两组血肿体积的比较(χ±S，cm3，n＝20)
*：P<0.01第1天的体积比较；Δ：P<0.01第12天和第5天PGE1组的体积比较；#：P<0.01 第20天PGE1组与对照组的比较
血肿周围组织体积：PGE1组血肿周围组织体积在第20天较第5天及对 照组明显减少(均p<0.01)。(结果见表3)。
表3两组血肿周围组织体积的比较(χ±S，cm3，n＝20)
*第5天比较P<0.01；#与对照组比较P<0.01
神经功能评分(NIHSS评分、mRS评分)：PGE1治疗组与对照组比较， NIHSS评分在第20天及随访3个月时差异有统计学意义(p<0.05)。随访3个 月，两组mRS评分差异有统计学意义(p<0.01)。(结果见表4、表5)。
表4两组的NIHSS评分(χ±S,n＝20)
PGE1治疗与对照组比较*P<0.05
表5两组的mRS评分(χ±S,n＝20)
*PGE1治疗与对照组比较P<0.05
血肿周围区域Ra值、血肿体积和血肿周围组织体积之间的相关性：结 果表明，血肿中部和血肿周围区域的近端、远端Ra值，血肿和血肿周围组 织体积呈负相关。(结果见图3、4)。
不良反应和安全性评估不良反应：PGE1治疗组在治疗期间或治疗后均 未观察到出血、红斑、低细胞增生等。未观察到血尿或血便、肝肾功能异常、 凝血功能缺损或心电图异常等异常现象。
实施例2
PGE1在治疗小鼠脑出血的运用
1、动物：雄性C57BL/6小鼠，SPF级，26～30g，购买于南通大学实验 动物中心，正常饲养于清洁动物房。
2、实验分组：小鼠随机分成假手术+NaCl组、ICH组+NaCl组、ICH+PGE1 (2μg/kg)组、ICH+PGE1(10μg/kg)、ICH+PGE1(20μg/kg)，共计5组， 每组30只。
3、药物处理：所有小鼠均为术后0h、4h、12h以及24h四次腹腔内给 药(生理盐水或PGE1)；所有小鼠接受液体注入量接近相等，约0.5～0.6ml。
4、实验方法：脑内注入自体血是脑出血常用动物建模方法，本实施例 用于PGE1对脑出血的治疗作用。脑内注入自体血制备小鼠ICH模型，具 体为：①以复合麻醉剂(3ml/Kg)腹腔麻醉；②摆正小鼠体位及固定头部， 头顶局部常规备皮、消毒，头顶正中矢状切开约1.0cm，暴露颅骨；③用立 体定位仪定位一侧脑纹状体区域(以前囟门为正中点，向前0.2mm，旁开 2.3mm，进针深度3.5mm)，以2μl/min的速度注入15μl自体血作为手术 组，以同样方法只插针、不注射作为假手术组；④留针15min后缝合。
手术后0h、4h、12h以及24h经腹腔给药，分别给空白组小鼠注射NaCl， PGE1组小鼠梯度注射PGE1。
5、神经功能学评分：加速旋转试验和神经功能缺陷评分表法
加速旋转试验：加速旋转试验主要在小鼠旋转仪上进行，设定初始旋转 速度为4rpm，最高旋转速度40rpm，加速过程为8min，每只小鼠运动时间 上限为500s。在手术前3天开始训练小鼠，每天分上午、下午两次(时间 上尽可能一致)；每次训练前，小鼠在4rpm速度上运动10min以适应陌 生环境，紧接着给予2次加速旋转训练，以第六次加速旋转结果为术前基数。 ICH术后，分别于术后1天、4天、7天、14天和28天时下午时间段测 试小鼠加速旋转数据，每只小鼠测量3次，每次之间休息≥30min。运动超出 500s的，将小鼠取下，记录500s数据。
表6神经功能缺陷评分表法-24点法
脑出血小鼠治疗行为学评分结果如图5所示，可见经PGE1治疗的脑出 血小鼠神经功能缺陷评分明显低于NaCl对照治疗组，加速旋转试验运动时 间明显长于NaCl对照治疗组，表明PGE1能够显著改善脑出血小鼠的神经 功能缺陷和运动功能，具有治疗保护作用。(*表示p小于0.05)。
6、H&E染色检测ICH后血肿体积大小，干湿称重法检测脑水含量。
ICH后血肿体积大小通过H&E染色测得。结果如图6所示，在ICH 后14天时血肿体积明显缩小，对照组血肿体积为6.3±3.73mm3，PGE1 20μg/kg 组血肿体积为3.7±2.65mm3，与对照组相比差异具有统计学意义。可见 20μg/kgPGE1能够促进ICH后14天血肿体积的吸收。
脑水含量通过干湿称重法测定。ICH后特定时间点，麻醉并处死小鼠, 取脑，称量ICH同侧、对侧以及小脑的脑组织，即为湿重，然后将其放入 100℃烘箱烘烤24h，称量即为干重，小脑的称量用作对照。脑水含量＝[(湿 重-干重)/湿重×100％]。结果如图6所示，ICH后14天时出血侧纹状体的 脑水含量较对侧纹状体区域脑水含量明显降低，而ICH后4天则无明显改善。 可见PGE120μg/kg能够缓解ICH后血肿周围域的脑水含量。
7、FJB染色来检测血肿周围域退变神经元的数量。
运用了FJB染色检测血肿周围域退变神经元的数量，了解PGE1治疗后 对血肿周围域神经细胞损伤的作用。结果如图7所示，FJB阳性细胞数在ICH +NaCl组均匀分布于血肿周围区域，而ICH+PGE1 10μg/kg在ICH后4天 时减少FJB阳性细胞数，在ICH后14天时减少则无达到统计学意义。ICH +PGE1 20μg/kg在ICH后4天、14天均可减少FJB阳性细胞数，且差异具有统计学意义。
免疫荧光技术检测血肿周围域神经元的数量。
ICH后神经功能的缺失与血肿周围域神经元的数量密切相关，免疫荧光 技术检测血肿周围域神经元的数量。结果如图8所示，ICH后血肿周围域 神经元的数量较NaCl组相比明显减少，给予PGE1不同剂量治疗后， PGE120μg/kg在ICH后4天和14天均较相应ICH+NaCl组神经元数 量增多，差异具有统计学意义。可见20μg/kg能够显著减少ICH后血肿周 围域神经元的死亡。
Western blot和TUNEL检测血肿周围域神经元凋亡情况。
ICH后神经元的凋亡为ICH后神经功能缺损的一大重要因素，Western blot和TUNEL检测血肿周围域神经元凋亡情况。取血肿周围区域4mm以内 的脑组织进行匀浆，westernblot检测了活化Caspase-3的表达情况，结果如 图9所示，活化Caspase-3的表达在ICH+NaCl组明显上调，给予 PGE110μg/kg治疗，在ICH后4天较ICH+NaCl组减少；给予PGE120μg/kg 治疗，在ICH后4天和14天时，均较ICH+NaCl组减少。进一步检测血 肿周围域TUNEL情况，结果如图9所示，PGE120μg/kg时，TUNEL阳性 细胞数较ICH+NaCl组相比明显减少，且差异具有统计学意义。可见 PGE120μg/kg治疗后能够明显减轻ICH后血肿周围域神经元的凋亡。
免疫荧光技术检测ICH后血肿周围域星形胶质细胞增殖情况。
运用免疫荧光技术我们检测ICH后血肿周围域星形胶质细胞增殖情 况。结果如图10所示，在ICH+PGE1 20μg/kg组星形胶质细胞数量明显减 少，与ICH+NaCl组相比差异有统计学意义。可见PGE120μg/kg能够明显改 善ICH后血肿周围域星星胶质细胞的增殖
免疫荧光技术检测ICH后血肿周围域小胶质细胞活化情况。
小胶质细胞的激活能够导致ICH后的早期脑损伤。运用免疫荧光技术 检测了血肿周围域Iba-1的表达激活情况，检测PGE1对ICH后小胶质细胞 的影响。结果如图11所示，PGE1 20μg/kg能够明显减少ICH后4天血肿 周围域Iba1阳性细胞数。可见20μg/kg在ICH后早期能够减少小胶质细 胞的激活。
通过指标H2O2、MDA、SOD检测PGE1对ICH后血肿周围域氧化应激 损伤的影响。
检测ICH后血肿周围域H2O2的含量，探索PGE1对ICH后血肿周围 域氧化应激损伤的影响。结果如图12所示，PGE120μg/kg能够明显减少ICH 后第4天和第14天时血肿周围域H2O2的水平。
丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物， 动物或植物细胞发生氧化应激时，会发生脂质氧化。检测血肿周围域MDA 的表达水平，结果如图12所示，PGE120μg/kg能够明显减少ICH后第4天 和第14天时血肿周围域MDA的水平。
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)能催化超氧化物阴离子发 生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧 化酶。检测血肿周围域SOD的表达水平，结果如图12所示，PGE120μg/kg 处理组中ICH后第4天时SOD含量较NaCl组高。可见，PGE120μg/kg治 疗后能够显著降低ICH后血肿周围域氧化应激水平。
实施例3
本实施例对神经细胞的保护以及对氧化应激反应的抑制作用，采用血红 素诱导原代皮层神经元损伤构建脑出血体外模型。
血红素诱导神经元凋亡模型的构建(体外ICH模型)：培养胚胎15天 小鼠脑皮层神经元细胞，以不同浓度hemin(Normal、DMSO、1、10、50、 100μM)刺激，筛选最佳刺激浓度。结果如图13所示，CCK-8结果显示随 着hemin浓度增加，细胞活力逐渐降低(1μM hemin细胞活力为0.93± 0.19，10μM hemin细胞活力为0.63±0.15，50μM hemin细胞活力为0.45 ±0.09，100μM hemin细胞活力为0.25±0.04)。选择50μM hemin刺激原代 皮层神经元，检测不同时间点细胞活力，hemin刺激18小时后细胞活力为 0.67±0.14，差异具有统计学意义。从形态上，hemin 10μM、50μM以及100μM 时神经元数量明显较Normal、DMSO和1μM组少，并且神经元突起稀疏、 减少，胞体瓦解。综上，选择50μM hemin刺激浓度作为接下来研究PGE1的有效性。
PGE1在hemin诱导神经元损伤中的作用
选用不同浓度PGE1(10nM、100nM、1μM及10μM)在hemin刺 激前12小时给予预培养，检测PGE1的有效性。在hemin 50μM刺激后 24小时，运用CCK-8检测了细胞活力，结果如图14所示，hemin刺激组 细胞活力明显降低，而PGE1 10nM和100nM预处理组细胞活力明显增高，与hemin组相比增高具有统计学意义。为更进一步确认该结果的准确性， 运用LDH检测试剂盒检测了上清液中LDH含量，结果如图14所示，与 CCK-8一致，均表明PGE1 10nM和100nM预处理后细胞死亡减少。从神 经元形态上，PGE1 10nM和100nM预处理后神经元胞体较Hemin刺激组 完整，轴突细长。可见PGE1在10nM和100nM浓度时对hemin诱导的神 经元损伤具有保护作用。
PGE1在hemin诱导的氧化应激损伤中的作用
Hemin的降解产物铁离子Fe2+，通过参与Fenton反应，可以催化大量 羟自由基的产生，从而导致脂质过氧化，是活性氧的诱导剂。线粒体膜电位 MMP是维持线粒体呼吸链生理功能的重要因素，MMP的降低是细胞凋亡的 一项重要指标。通过检测MMP，可以了解细胞氧化应激水平。结果如图15 所示，在原代神经元，不同条件下TRME荧光的状态，观察到Normal组 中TRME荧光强度明显较其他组强；Hemin刺激后，TRME荧光强度减弱， 仅为对照组(Normal)的47％；预处理PGE1 10nM和100nM后，MMP荧 光强度则明显增强；预处理PGE1 1μM及10μM后，MMP荧光强度较hemin 刺激组无明显改变。此外，hemin刺激原代皮层神经元后，细胞内总ROS 含量通过DCFH荧光来检测，结果如图15所示，hemin刺激后细胞内ROS 明显增加，而PGE1 10nM和100nM预处理后，ROS生成量较对照组减少， 差异具有统计性。可见PGE110nM和100nM预处理后能够减少原代皮层神 经元中hemin诱导的氧化应激损伤。
PGE1在hemin诱导的神经元凋亡的影响
检测Hemin刺激后不同PGE1预处理条件下细胞凋亡情况,了解PGE1 对原代神经元损伤的具体作用。结果如图16所示，Hemin刺激后活化Caspase-3表达水平明显上调，而PGE110nM和100nM预处理组能够明显 降低活化Caspase-3的蛋白水平。文献报道(PMID:26276080)，Bcl-2/Bax 比值为线粒体氧化应激的敏感指标，其比值降低可反映细胞氧化应激的损伤 程度。通过检测Bcl-2/Bax，结果如图16所示，Hemin刺激条件下Bcl-2/Bax 比值明显降低，而PGE1 10nM和100nM预处理后则较hemin刺激组明显 增高，并且差异具有统计学意义；PGE1 1μM和10μM预处理后则改变不明 显。此外，进一步检测细胞色素c蛋白(Cytc)的释放，结果如图16所示， 同样揭示了PGE1 10nM和100nM预处理后较hemin刺激组好转。作为细 胞凋亡的金标准，TUNEL染色结果如图16所示，PGE1 10nM和100nM预 处理组，细胞凋亡数量明显较单纯hemin刺激组减少。可见PGE1在hemin 诱导的神经元模型(体外ICH模型)中具有神经保护作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和 润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.前列腺素E1在制备治疗脑出血的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过保护脑出血后血肿周围组织来改善脑出血患者的预后。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过改善血肿周围组织的局部低脑血流状态来保护脑出血后血肿周围组织。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过促进血肿吸收来保护脑出血后血肿周围组织。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过减小血肿周围损伤区域来保护脑出血后血肿周围组织。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过减少血肿周围组织细胞活力的降低来改善脑出血患者预后。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过减少血肿周围组织乳酸脱氢酶的释放来改善脑出血患者预后。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过减少血肿周围组织神经元凋亡来改善脑出血患者预后。
9.据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过对脑出血后血肿周围组织进行神经保护来治疗脑出血。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，通过抑制血肿周围域星形胶质细胞的增殖、抑制小胶质细胞的活化和抑制氧化应激反应途径的一种或几种来神经保护。
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