CN114807139B - 再生小分子miRNA-XU2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种再生小分子miRNA‑XU2及其应用，该miRNA‑XU2的序列如SEQ ID NO.1所示，且该miRNA‑XU2在制备受损心脏的心肌细胞再生药物中得以应用，具体制备促进受损心脏的心肌细胞再生药物；将小鼠麻醉，注射标记细胞增殖药物，细胞增殖药物为5‑乙炔基‑2'‑脱氧尿苷，小鼠心脏造模成功，向造模小鼠的受损心脏注射miRNA‑XU2，进行石蜡包埋切片，最后通过荧光染色，观察细胞增殖信号；通过向小鼠受损心脏注射本发明的miRNA‑XU2，可以实现受损心脏心肌细胞的增殖，然后石蜡切片内出现明显细胞增殖信号，因此miRNA‑XU2具有促进小鼠受损心脏的心肌再生的作用。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，具体涉及一种再生小分子miRNA-XU2及其应用。
背景技术
成年哺乳动物的心脏一直被认为是一种终末分化器官，损伤后再生能力有限。证据表明，新生鼠心脏可以通过增加心肌细胞增殖而再生。而在小鼠出生后7天，这种对损伤作出反应的再生能力就结束了，这与心肌细胞从细胞周期中退出相对应。
小鼠是研究人类心脏发病机理及心脏病治疗的一种理想的脊椎动物模型。虽然小鼠和人类的心脏不完全一样，但二者具有相当高的相似性。人类出现的心脏疾病常常可以在小鼠中重现，使得能在小鼠体内研究人类心脏病发生及对心脏病的治疗。
与小鼠类似，人体心脏细胞缺乏修复损伤的能力，这也是心脏病致命的原因之一。各种心脏疾病不可避免地最后转归为心力衰竭。在心肌梗死、心力衰竭的发生过程中，心肌细胞的丢失是最主要的病理过程。人类心肌细胞不具有再生能力，一旦损伤则永久丧失。目前的药物、介入支架等临床治疗手段在一定程度上延缓了疾病的发生，但并不能逆转心脏病的进展。如何赋予人类心脏心肌细胞的再生增殖能力，为实现受损心脏的修复提供了思路和方向。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种再生小分子miRNA-XU2及其应用。通过注射该小分子miRNA-XU2，可以促进小鼠受损心脏的心肌细胞再生。其中，小鼠心脏损伤是采用左心室前降支结扎手术方法制造心肌梗死模型，利用心肌层注射方式注射该小分子RNA。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种再生小分子miRNA-XU2，该miRNA-XU2的序列如SEQ ID NO.1所示，即该小分子为使小鼠受损心脏的心肌细胞再生的小分子序列，命名为miRNA-XU2。该小分子RNA序列来自上海吉玛制药技术有限公司的化学合成。
一种如上述的再生小分子miRNA-XU2的应用，即该miRNA-XU2在制备受损心脏的心肌细胞再生药物中的应用。
优选地，miRNA-XU2在制备促进受损心脏的心肌细胞再生药物中的应用。即通过向受损心脏注射miRNA-XU2，将促进受损心脏的心肌细胞再生。由于BMP2基因是目前已知的心肌再生的重要调控基因，则miRNA-XU2可以靶向促进BMP2基因的表达，从而实现促进受损心脏心肌细胞再生的作用。
优选地，将小鼠麻醉，注射标记细胞增殖药物，小鼠心脏造模成功，向造模小鼠的受损心脏注射miRNA-XU2，进行石蜡包埋切片，最后通过荧光染色，观察细胞增殖信号。
优选地，细胞增殖药物为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
通过向小鼠受损心脏注射本发明的miRNA-XU2，可以实现受损心脏心肌细胞的增殖，然后石蜡切片内出现明显细胞增殖信号，因此miRNA-XU2具有促进小鼠受损心脏的心肌再生的作用。
附图说明
图1为本发明的实施例1中小鼠受损心脏注射DEPC水(空白对照)的石蜡切片示意图。
图2为本发明的实施例1中小鼠受损心脏注射miRNA-NC(阴性对照)的石蜡切片示意图。
图3为本发明的实施例1中小鼠受损心脏注射miRNA-XU2(实验组)的石蜡切片示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种再生小分子miRNA-XU2及其应用。对小鼠左心室前降支结扎，同时注射标记细胞增殖药物EdU，以此制造心肌损伤模型。采用心肌注射法，向实验动物体内注射实验小分子RNA(miRNA-XU2)。一段时间后，摘取小鼠心脏进行石蜡包埋切片，进行apollo荧光染色观察。
实验具体步骤如下：
(1)上海吉玛制药技术有限公司合成的小分子RNA序列：
实验组小分子RNA(miRNA-XU2)：5’-ACUUACAGUAUAUGAUGAUAUCC-3’(SEQ IDNO.1)。
对照组小分子RNA序列(miRNA-NC)：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ IDNO.2)。
(2)小鼠心肌损伤模型建造及小分子RNA药物注射
对六周龄雌性C57/BL6J品系小鼠，通过腹腔注射4％水合氯醛进行麻醉。麻醉完成后，腹腔注射EdU，注射完十五分钟后开始造模，即建立小鼠心肌梗死模型。小鼠麻醉后用脱毛膏对胸部进行脱毛，脱毛结束将小鼠固定在手术台面，气管插管接呼吸机，体视镜下找到小鼠胸骨左旁第3、4肋间，在肋间用手术刀做一平行切口打开胸腔，剪开心包暴露心脏，用6-0缝线结扎左冠状动脉中上1/3部位，结扎瞬间可观察到小鼠左心室前壁失去原有光泽，心肌发白，心肌活动度减弱，造模成功。
心肌梗死模型造模成功后，进行局部给药，用三点注射于心肌层进行小分子RNA注射。实验组小鼠注射miRNA-XU2；阴性对照组小鼠注射miRNA-NC；空白对照组小鼠注射DEPC水(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯，简称DEPC)。每次注射肉眼可见心肌变白，即心肌层注射给药成功。注射完毕后使用3-0线逐层关闭胸腔，断呼吸机，小鼠置温毯观察并苏醒。
(3)切片染色及观察
术后小鼠3天后处死。剪下心脏，用生理盐水冲洗血液，浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定48h。经过结扎点位置横断心脏，制作石蜡块切片，pollo荧光染色，进行荧光染色观察心肌细胞增殖情况。对比观察实验组(注射miRNA-XU2)、阴性对照组(注射miRNA-NC)、空白对照组(注射DEPC水)的心梗小鼠心脏切片中，是否有细胞增殖信号。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
上海吉玛制药技术有限公司合成的小分子RNA序列：
实验组小分子RNA(miRNA-XU2)：5’-ACUUACAGUAUAUGAUGAUAUCC-3’(SEQ IDNO.1)。
对照组小分子RNA序列(miRNA-NC)：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ IDNO.2)。
实验过程：
(1).术前准备：取7只六周龄雌性C57/BL6J品系小鼠，腹腔注射4％水合氯醛(200μL/只)进行麻醉，麻醉后腹腔注射EdU(100μL/只)，注射完十五分钟后开始造模，建立小鼠心肌梗死模型。
(2).造模过程：小鼠麻醉后用脱毛膏对胸部进行脱毛，脱毛结束将小鼠固定在手术台面，气管插管接呼吸机，体视镜下找到小鼠胸骨左旁第3、4肋间，在肋间用手术刀做一平行切口打开胸腔，剪开心包暴露心脏，用6-0缝线结扎左冠状动脉中上1/3部位，结扎瞬间可观察到小鼠左心室前壁失去原有光泽，心肌发白，心肌活动度减弱，造模成功。
(3).心肌注射：小鼠心脏造模成功后进行局部给药，于心肌层注射药物(三点注射)。
实验组注射小分子RNA(miRNA-XU2)(0.8nmol/μL)共24μL，三点注射每次8μL。
对照组注射小分子RNA(miRNA-NC)(0.8nmol/μL)共24μL，三点注射每次8μL。
每次注射肉眼可见心肌变白，即心肌层注射给药成功。注射完毕后使用3-0线逐层关闭胸腔，断呼吸机，小鼠置温毯观察并苏醒。
(4).术后取材：术后小鼠于3天后处死，剪下心脏，用生理盐水冲洗血液，浸泡于4％甲醛溶液中固定48h，经过结扎点位置横断心脏，制作石蜡块切片，进行荧光染色观察心肌细胞增殖情况。
实验结果：
在注射miRNA-XU2实验组内发现明显阳性增殖信号(图3中，白色的亮点)，注射miRNA-NC阴性对照组(图2)、注射DEPC水的空白组(图1)中均未发现增殖信号。因此，注射miRNA-XU2后的小鼠受损心脏的石蜡切片内出现明显细胞增殖信号，这说明，miRNA-XU2具有促进小鼠受损心脏的心肌再生的作用。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> 再生小分子miRNA-XU2及其应用
<141> 2022-05-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acuuacagua uaugaugaua ucc 23
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caguacuuuu guguaguaca a 21
Claims (3)
1.一种再生小分子miRNA-XU2在制备促进受损心脏的心肌细胞再生的药物中的应用，所述miRNA-XU2的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将小鼠麻醉，注射标记细胞增殖药物，小鼠心脏造模成功，向造模小鼠的受损心脏注射miRNA-XU2，进行石蜡包埋切片，最后通过荧光染色，观察细胞增殖信号。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述细胞增殖药物为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。
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2022
- 2022-05-11 CN CN202210509065.3A patent/CN114807139B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114807139A (zh) | 2022-07-29 |
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