ES2204911T3

ES2204911T3 - Procedimiento para el control de la produccion de un polipeptido en una bacteria.

Info

Publication number: ES2204911T3
Application number: ES94901629T
Authority: ES
Inventors: Steven Bass; James R. Swartz
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-19
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2013-11-19
Also published as: EP0669980A1; WO1994012636A1; JPH08503612A; IL107564A0; US5304472A; CA2145388C; ATE247167T1; AU671512B2; DE69333145D1; DK0669980T3; JP3503705B2; PT669980E; IL107564A; DE69333145T2; CA2145388A1; EP0669980B1; AU5615194A

Abstract

SE PROPORCIONA ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UNA MOLECULA QUE TIENE CIERTAS VARIACIONES DENTRO DE LA REGION DE ENLACE DE FOSFATO O E. COLI PSTS. ADICIONALMENTE SE PROPORCIONAN CELULAS BACTERIANAS QUE COMPRENDEN ESTE ACIDO NUCLEICO BAJO CONTROL DEL PROMOTOR DE GEN PSTS NATIVO, Y OPCIONALMENTE COMPRENDE ADEMAS ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO DE INTERES BAJO CONTROL DEL PROMOTOR DE FOSFATASA ALCALINA (AP). CELULAS BACTERIANAS QUE CONTIENEN AMBAS VARIANTES PSTS ACIDO NUCLEICO Y ACIDO NUCLEICO POLIPEPTIDO SE CULTIVAN EN UN MEDIO A UNA CONCENTRACION DE FOSFATO INORGANICO QUE EN TODAS LAS FASES DEL CRECIMIENTO CELULAR ESTA POR ENCIMA DEL NIVEL AL QUE LAS CELULAS CARECEN DE FOSFATO. ALTERNATIVAMENTE, LAS CELULAS SE CULTIVAN BAJO CONDICIONES POR LAS QUE LA CONCENTRACION DE FOSFATO INORGANICO EN EL MEDIO DE CULTIVO SE CONTROLA DURANTE EL PERIODO DE PRODUCCION PARA QUE EL POLIPEPTIDO SE PRODUZCA BAJO CONTROL DEL PROMOTOR AP PARCIALMENTE INDUCIDO.

Description

Procedimiento para el control de la producción de un polipéptido en una bacteria.

Estado de la técnica anterior a la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere al ácido nucleico y a las células huésped útiles para controlar la producción de polipéptidos en cultivos celulares huésped bacterianos. Más particularmente, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica variantes PstS que tienen mutaciones en la región de unión a fosfato de la proteína PstS nativa, lo cual permite la regulación de la inducción de la síntesis polipeptídica en las células bacterianas.

Descripción del estado de la técnica relacionado

El gen pstS (phoS) codifica una proteína periplasmática de unión a fosfato que es parte del sistema de transporte con elevada afinidad por el fosfato, el cual media la toma de fosfato en ciertos organismos procariotas como por ejemplo E. coli, con una disociación constante para el fosfato menor que 1 \muM. Medveczky y Rosenberg, Biochim. Biophys. Acta, 211: 158-168 (1970). La estructura molecular de la proteína de transporte de fosfato se proporciona en Luecke y Quiocho, Nature, 347: 402-406 (1990).

El gen pstS pertenece al regulón de fosfato cuya expresión se induce mediante la privación de fosfato y está regulado positivamente. La caja fosfato (pho) es una secuencia consenso compartida por las regiones reguladoras de los genes en el regulón pho o pst. Más de veinte genes están regulados por fosfato, incluidos pstA, pstS, phoE, pstB, phoU y ugpAB. Cuando la concentración de fosfato del medio disminuye por debajo de aproximadamente de 0,1 \muM a 0,2 mM (Torriani, Biochim. Biophys. Acta, 38: 460-469 [1960]) o en una mutante pstS (Amemura et al., supra), la expresión de estos genes está inducida por un sistema regulador que requiere los reguladores positivos PhoB y PgoR.

Para tener una visión general del regulón de fosfato en E. coli, véase Escherichia coli, Metabolismo en Fosfato y Regulación Celular en Microorganismos, Torriani-Gorini et al., eds. (Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC, 1987), pp. 20-25; Wanner, "Regulación por Fosfato de la Expresión Génica en Escherichia coli", Neidhart FC et al. (eds.) Escherichia coli y Salmonella typhimurium: Biología Celular y Molecular (Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC, 1987) p. 1326-1333; Torriani, BioEssays, 12: 371-376 (1990); Matin et al., Annu. Rev. Microbiol., 43: 293-316 (1989).

El fragmento de ADN que contiene el gen pstS se ha aislado del ADN cromosómico de la cepa K-12 de E. coli, Iwakura et al., J. Biochem., 92: 615-622 (1982). Más tarde, la secuencia nucleotídica completa de, y la secuencia aminoacídica completa codificada por, el gen PstS y el gen prepstS fueron descritas por Magota et al., J. Bacteriol., 157: 909-917 (1984). Véase también Surin et al., J. Biochem., 92: 615-622 (1982). La proteína pre-PstS contiene una extensión del péptido compuesto por 25 residuos de aminoácido en el término amino de la proteína PstS, la cual tiene las características generales de un péptido señal. La proteína madura PstS está compuesta por 321 aminoácidos con un peso molecular calculado de aproximadamente 34.422-34.427. La región reguladora del gen pstS contiene una secuencia Shine-Dalgarno característica en una posición apropiada que precede el sitio de iniciación translacional, así como tres posibles cajas Prlbnow y una secuencia -35. Las secuencias del gen pstS estructural y de la región promotora se describen también en Surin et al., J. Bacteriol., 157: 772-778 (1984), quienes identifican una región promotora alternativa sobre la base de homología con las regiones promotoras de los genes pstA y pstE. Kimura et al., Mol. Gen. Genet., 215: 374-380 (1989), estudiaron también el promotor del gen pstS.

La función de la proteína PstS es transportar fosfato inorgánico desde el periplasma hacia dentro de la célula, como una proteína de transporte específica de fosfato. El transporte se consigue cuando la proteína PstS se une al fosfato mediante su dominio de unión a fosfato. Para E. coli, este dominio incluye el esqueleto de los residuos 10, 11, 38, 140 y 141 y las cadenas laterales de los residuos 10, 38, 56, 135, 139 y 141. Otros residuos también pueden afectar indirectamente la unión, la transición conformacional asociada al cambio de complejo abierto a cerrado cuando el fosfato está unido a PstS, y/o la vía de señalización asociada.

Se descubrió que todas las mutaciones pstS definidas en la región PST carecían de la proteína de unión a fosfato periplasmático, de manera que se consideró está locus como el gen estructural de la proteína de unión. Levitz et al., Mol. Gen. Genet., 200: 118-122 (1985).

El promotor de la fosfatasa alcalina (phoA) se ha utilizado a menudo como un promotor para expresar ADN homólogo y heterólogo en células bacterianas. Véase, por ejemplo, la patente JP 61/280292, publicada el 10 de diciembre de 1986. En la producción de polipéptidos que utilizan el promotor de la fosfatasa alcalina o el promotor de pstS, el crecimiento celular tiene lugar inicialmente a baja concentración de fosfato inorgánico en el medio. Dichas células utilizan el fosfato en el medio de manera que la inducción de la expresión del gen que codifica el polipéptido tiene lugar en la fase logarítmica tardía del crecimiento celular a medida el contenido de fosfato decrece por debajo de un valor límite. Entonces a las células se les priva completamente de fosfato, provocando un cesamiento del crecimiento, un aumento de varias veces en la degradación de proteínas celulares y una inhibición de la síntesis de ARN. St. John y Goldberg, J. Bacteriol., 143: 1223-1233 (1980). Además, la extensión de la expresión y la velocidad de producción de la proteína no pueden controlarse debido a la necesidad de una ausencia de fosfato inorgánico en las proximidades en el medio.

La patente WO 86/04089 se refiere a una cepa de E. coli que lleva una mutación en el gen PhoS, que ha sido transformada con el gen que codifica la fosfatasa alcalina. EL aumento de la concentración de fosfato en el medio condujo a una disminución de la actividad específica de la fosfatasa alcalina.

Se han explorado varios métodos destinados a aumentar los niveles de expresión utilizando el regulón pst. Por ejemplo, se ha descrito que un vector de expresión que contiene un gen que codifica la PstS unida a un replicón aumenta los niveles de expresión de los genes de interés en bacterias. Patente estadounidense Nº 4,703,005, publicada el 27 de octubre de 1987. Adicionalmente, un polipéptido de fusión de la secuencia PstS-Sc-X, donde Sc es una secuencia que codifica una diana de restricción y X es el gen que codifica una proteína específica, se describe en la solicitud de patente francesa Nº 2,5999,380, publicada el 4 de diciembre de 1987.

También se han descrito mutantes de proteínas de transporte específicas de fosfato. Por ejemplo, se han descrito cepas de E. coli que contienen mutantes pstA preparados mezclando las bacterias con compuestos N-nitroso. Solicitud de patente israelí Nº 60714/3, fechada el 31 de julio de 1980. También se han descrito cepas de E. coli que excretan específicamente fosfatasa alcalina que tienen una mutación en el regulón pst (incluida una mutación tipo pstS) y que son transformadas por un plásmido que contiene un fragmento de ADN de E. coli que corresponde a la región a 8,5 minutos del mapa genético. Patente WO 86/04089, publicada el 17 de julio de 1986. Los mutantes PhA de E. coli preparados en dichas cepas también se han descrito. Patente IL 60,714, publicada el 31 de julio de 1980. Se han descrito las enzimas fosfatasa alcalina mutadas producidas por E. coli con al menos una mutación de un aminoácido, que tienen una actividad enzimática aumentada por encima de la de la enzima tipo salvaje. Patente EP 441,252, publicada el 14 de agosto de 1991.

Además, la función PstS se examinó por análisis de 12 mutantes pstS, ocho de los cuales tenían un cambio de Thr-10 a Ile-10, dos de los cuales tenían un cambio de Ser-254 a Phe-254, uno de los cuales tenía dos cambios: de Thr-10 a Ile-10 y de Gly-140 a Glu-140, y uno de los cuales tenía tres cambios: de Thr-10 a Ile-10, de Thr-253 a Ile-253 y de Ser-254 a Phe-254. Los autores postularon a partir de los resultados que la Thr-10 y la Ser-254 están implicados en la interacción con los componentes de la membrana del sistema Pst, mientras que la Gly-140 está implicada en la unión de fosfato, o alternativamente, puede haber más de un dominio de unión a fosfato en la proteína de unión a fosfato, y Thr-10 o Ser-254 pueden estar también implicadas en la unión a fosfato. Nakata et al., "Análisis Genético y Bioquímico del Sistema de Transporte en Escherichia coli", en Metabolismo de Fosfato y Regulación Celular en Microorganismos, Torriani-Gorini et al., eds., supra, pp. 150-155.

Es objeto de la presente invención identificar nuevas moléculas de ácido nucleico que codifican variantes específicas de PstS que, cuando se integran en el cromosoma de células bacterianas como reemplazo del gen de tipo salvaje, permitirán el crecimiento de células bacterianas transformadas con ADN que codifica un polipéptido de interés bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina en células bacterianas.

Otro objeto es utilizar las moléculas nucleacídicas nuevas para controlar la velocidad de transcripción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés y por tanto para controlar la extensión de la inducción del promotor de la fosfatasa alcalina en células bacterianas.

Es otro objetivo minimizar la proteolisis de polipéptidos producidos por las células bacterianas bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina.

Es otro objetivo controlar la fuerza de la inducción del promotor de la fosfatasa alcalina para minimizar la toxicidad celular provocada por la rápida inducción del promotor.

Éstos y otros objetivos de la invención serán evidentes para el experto medio en la técnica considerando la descripción en su totalidad.

Resumen de la invención

En relación con lo anterior, en una realización de la presente invención se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una variante PstS de E. coli seleccionada entre el grupo que consiste en T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS y T141H PstS.

En otra realización, la invención proporciona células huésped de E. coli que comprenden la molécula de ácido nucleico indicada más arriba, bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS de E. coli de tipo salvaje, preferentemente integrado en el cromosoma de la misma. Dichas células huésped comprenden además opcionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de interés que comprende cultivar células bacterianas que carecen de su gen pstS nativo y que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una variante PstS que tiene una variación de aminoácido en la región de unión a fosfato de la correspondiente PstS nativa, estando dicha molécula bajo el control transcripcional del promotor del gen PstS de tipo salvaje, y comprendiendo también dichas células bacterianas una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina, teniendo lugar el cultivo en un medio de cultivo con una concentración de fosfato inorgánico en el medio que, durante todas las fases de crecimiento celular, se encuentra por encima del nivel en el cual se priva a las células de fosfato, y tiene lugar en condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés.

Preferentemente, la variante pstS es homóloga al gen pstS nativo en las células huésped. Además, preferentemente las células bacterianas son E. coli y un residuo hidrofóbico se substituye por treonina en la posición 10 o una serina se substituye por ácido aspártico en la posición 56 de la región de unión a fosfato de la PstS nativa de E. coli. Preferentemente, la variación de aminoácido en la molécula de ácido nucleico es una substitución y la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

Alternativamente, la invención proporciona un procedimiento para controlar la velocidad de expresión de un polipéptido en células bacterianas que comprende cultivar células bacterianas que carecen de su gen pstS nativo y que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de PstS que tiene una variación de aminoácido en la región de unión a fosfato de la PstS nativa correspondiente, estando dicha molécula de ácido nucleico bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS de tipo salvaje, y comprendiendo también dichas células bacterianas una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina, donde el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones en las cuales la concentración del fosfato inorgánico en el medio de cultivo se controla durante la fase de producción de crecimiento celular, de manera que el polipéptido se produce bajo el control transcripcional de un promotor de la fosfatasa alcalina parcialmente inducido.

Las variantes PstS permiten aquí la preparación de células huésped bacterianas que proporcionan un rendimiento mayor de polipéptido intacto. Además, la inducción a una concentración de fosfato mayor permite utilizar un medio más rico, lo cual se traduce en una mayor densidad celular. El procedimiento proporciona también un procedimiento para controlar la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido, mediante el control del nivel de fosfato en el estadio de crecimiento celular en la producción de polipéptido.

Además, el sistema de proteína mutada PstS permite una mejor regulación de la fuerza de la inducción del promotor de la fosfatasa alcalina, de manera que se previene la toxicidad celular, utilizando bajas alimentaciones de fosfato y/o la medida "on line" y el control de los niveles de fosfato en el sobrenadante.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la secuencia nucleotídica y la secuencia aminoacídica traducida del gen estructural pstS de E. coli. (SEQ. ID. NO. 1 y SEQ. ID. NO. 2, respectivamente)

La Figura 2 ilustra el plásmido pSB20 utilizado para la generación de los mutantes pstS.

La Figura 3 ilustra que la sobreexpresión de PstS disminuye la inducción de PhoA. Los círculos abiertos son la cepa 1A2 de E. coli W3110 de tipo salvaje, los cuadrados abiertos grandes son la cepa 13G8 de pstS-W311O, los círculos sólidos son la cepa 13G8 de pstS transformada con pSB2O, un plásmido de múltiple copia que contiene el gen pstS de tipo salvaje, los diamantes son la mutante T10A PstS en pSB2O, los cuadrados sólidos son la mutante D38A PstS en pSB2O, los cuadrados abiertos pequeños son la mutante D56A PstS en pSB2O, los triángulos sólidos son la mutante R135A PstS en pSB2O, los triángulos abiertos son la mutante D137A PstS en pSB2O, las x's son la mutante S139A PstS en pSB2O y los +'s son la mutante T141A PstS en pSB2O. La Figura 3B representa los mismos datos que la Figura 3A, pero expande el rango -10 - 35 del recambio metabólico de p-nitrofenilfosfato (PNPP) de manera que la inducción de los mutantes puede verse en detalle. Los símbolos de la Figura 3B son los mismos que los de la Figura 3A.

La Figura 4 ilustra los perfiles de inducción de PhoA de mutantes PstS multicopia obtenidos por el cribado de las randomizaciones de los codones que codifican el residuo Thr10. En esta figura los +'s son la mutante T10F PstS, los diamantes sólidos son la mutante T10G PstS, las x's son la mutante T10C PstS, los diamantes abiertos son la mutante T10L PstS, los cuadrados sólidos son la mutante T10Y PstS, los cuadrados abiertos pequeños son la mutante T10A PstS, los triángulos sólidos son la mutante de T10M PstS, los círculos abiertos son la cepa de tipo salvaje 1A2, los triángulos abiertos son la cepa de pstS 13G8 y los cuadrados abiertos grandes son la cepa de pstS transformada con pSB2O.

La Figura 5 ilustra los perfiles de inducción de PhoA de más mutantes PstS multicopia obtenidos por el cribado de librerías de mutantes aleatorios de Ser38, Asp56, Ser139 y Thr141, En esta figura, los +'s son la mutante S139T PstS, los diamantes son la mutante S139L PstS, los cuadrados sólidos son la mutante T141H PstS, los triángulos sólidos grandes son la mutante D56S PstS, la x es la mutante D56A PstS, los cuadrados abiertos pequeños son la mutante D56V PstS, los círculos abiertos pequeños son la mutante D56l PstS, los triángulos sólidos pequeños son la mutante S38F PstS, los círculos abiertos grandes son la cepa de tipo salvaje 1A2, los triángulos abiertos son la cepa de pstS 13G8 y los cuadrados abiertos grandes son la cepa de pstS transformada con pSB2O.

La Figura 6A compara los efectos de diferentes mutaciones en los residuos Thr10, Asp56 y Thr141 de PstS sobre la inducción de PhoA. Los círculos abiertos son la cepa de tipo salvaje 1A2, los triángulos abiertos son la cepa de PstS 13G8, los cuadrados abiertos son la cepa de pstS transformada con pSB2O, los diamantes abiertos son la mutante T10A PstS, los +'s son la mutante T10M, los cuadrados sólidos son la mutante T10Y PstS, las x's son la mutante D56A PstS, los círculos sólidos son la mutante D56S PstS, los diamantes sólidos son la mutante T141A PstS y los triángulos sólidos son la mutante T141H PstS. La Figura 6B representa los mismos datos que la Figura 6A, pero expande el rango -10 - 70 del recambio metabólico de PNPP, de manera que la inducción de los mutantes puede verse en detalle. Los símbolos utilizados en la Figura 6B son los mismos que los utilizados en la Figura 6A.

La Figura 7 ilustra los perfiles de inducción de PhoA de cepas de mutantes del cromosoma PstS de copia única, donde los triángulos abiertos son la mutante de pstS 13G8, los círculos sólidos son la mutante de PstS T10M, los cuadrados abiertos son la mutante de PstS T10Y, los cuadrados sólidos son la mutante de PstS D56S y los triángulos sólidos son la mutante T141H PstS.

La Figura 8 representa la construcción del plásmido pLS32, un plásmido intermediario en la preparación de pLS32Tsc, el cual contiene un gen que codifica IGF-i y que a su vez se utiliza para preparar pBKIGF-2, el vector de expresión que codifica IGF-i utilizado en los ejemplos más abajo.

La Figura 9 representa la construcción de pAPlamB, otro plásmido intermediario en la preparación de pLS32Tsc y en la preparación de un plásmido intermediario adicional, pLamBIGF.

La Figura 10 representa la construcción de pLS32IamB, otro plásmido más intermediario en la construcción de pLS32Tsc.

La Figura 11 representa la construcción de pLS33Iam, otro plásmido intermediario en la preparación de pLS32Tsc.

La Figura 12 representa la construcción de pLS33Tsc, otro intermediario en la preparación de pLS32Tsc y pBKIGF-2.

La Figura 13 representa la construcción de pLS32Tsc a partir de pLS33Tsc y pLS32IamB.

La Figura 14 representa la secuencia nucleotídica del casete de expresión y la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia señal IamB y el gen IGF-I en el plásmido pLS32Tsc (SEQ. ID. NO. 27 y SEQ. ID. NO. 28, respectivamente).

La Figura 15 muestra un mapa de restricción del plásmido p200, utilizado para producir pLamBIGF, un plásmido intermediario en la producción de pLBIGFTsc, utilizado para preparar pBKIGF-2.

La Figura 16 representa la secuencia nucleotídica del fragmento de EcoRI-EcoRI (de las posiciones 1149 a 1633) de p200 que contiene las secuencias de la prepro de MF alfa I y del gen IGF-1 (SEQ. ID. NO. 29).

La Figura 17 representa la construcción de pLamBIGF a partir de tres fragmentos de plásmido y un fragmento de ADN sintético (SEQ. ID. NO. 30 y SEQ. ID. NO. 31).

La Figura 18 representa la construcción del plásmido intermediario pLBIGFTsc a partir de pLamBIGF.

La Figura 19 representa la construcción del plásmido intermediario pRanTsc utilizado en la producción de pBKIGF-2.

La Figura 20 representa la construcción de pBKIGF-2 a partir de pLS32Tsc, pLS33Tsc y pRanTsc.

La Figura 21 muestra la densidad celular final obtenida en cultivos en matraces de agitación para varias cepas de E. coli transformadas con pBKIGF-2 como una función de la concentración de fosfato inicial en el medio. Los cuadrados abiertos son la cepa de tipo salvaje 9E4 (pstS+), los cuadrados sólidos son la cepa mutante 39B4(TM10), los triángulos abiertos son la cepa mutante 39B5(T10Y), los círculos abiertos son la cepa mutante 39B6(T10H) y los triángulos sólidos son la cepa mutante 36B7(D56S).

La Figura 22 ilustra la concentración de IGF-I asociado a la célula determinado por HPLC como una función de la concentración de fosfato inicial. Los símbolos son tal y como se ha definido en la leyenda de la Figura 21.

La Figura 23 ilustra la concentración de IGF-i total como una función del tiempo de ejecución de la fermentación a elevada densidad celular para cuatro de los mutantes pstS en función del huésped de tipo salvaje, todos transformados con pBKIGF-2. Los cuadrados abiertos son la cepa de tipo salvaje 9E4 (pstS+), los diamantes sólidos son la cepa mutante 39B4(TM10), los círculos abiertos son la cepa mutante 39B5(T10Y), los triángulos abiertos son la cepa mutante 39B6(T10H) y los cuadrados sólidos son la cepa mutante 36B7(D56S).

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La Figura 24 muestra el efecto de las velocidades cada vez mayores de la alimentación de fosfato sobre la producción de IGF-I por organismos huésped que tienen proteínas pstS de tipo salvaje [barras sólidas] y mutadas [barras diagonales, 39B7(D56S)].

Descripción detallada de las realizaciones preferidas A. Definiciones

En general, las siguientes palabras o frases tienen la definición indicada cuando se utilizan en la descripción, en los ejemplos y en las reivindicaciones:

El término "PstS" se refiere a la proteína codificada por el gen pstS que se encuentra en las células bacterianas, especialmente en las células de Enterobacteriaceae, incluidas las células de E. coli. Esta proteína se conoce como la proteína de unión a fosfato de las células bacterianas y contiene una región de unión a fosfato.

La "región de unión a fosfato" es la región de la proteína que se une al fosfato inorgánico. Esta región incluye el dominio donde se forman puentes de hidrógeno entre las dos moléculas. En la PstS de E. coli, esta región es:

Cadenas laterales	Esqueleto
Thr10	Thr10
Ser38	Thr141
Asp56	Ser38
Arg135	Gly140
Ser139	Phe11
Thr141

Esta región incluye también otros residuos que indirectamente afectan la unión de fosfato, la transición conformacional asociada al cambio de complejo abierto a cerrado cuando está unido el fosfato y/o la vía de señalización asociada. Por lo tanto, las mutaciones en los residuos de PstS que no están en contacto directo con el fosfato (o las proteínas truncadas por codones de stop o cambios de marco de lectura) pueden tener fenotipos similares que las mutaciones en los residuos de PstS que se unen directamente al fosfato.

Las "variantes PstS" se definen como moléculas en las cuales la secuencia aminoacídica de la proteína PstS nativa (tipo salvaje) correspondiente se ha modificado (mediante una mutación predeterminada o aleatoria) en la región de unión a fosfato de la misma, de tal manera que la proteína PstS ya sigue funcionando como un represor a niveles de fosfato superiores a aproximadamente 10 \muM. Para más detalles, véase "Sistemas de Transporte Sensibles a Choque Osmótico", en Neidhardt FC et al. (eds) Escherichia coli y Salmonella typhimurium: Biología Celular y Molecular, Vol. 1 (Sociedad Americana de Microbiología, Washington DC, 1987), p.768-796, particularmente p. 772-773. Por lo tanto, la mutación reduce la afinidad de la proteína de unión por el fosfato. Las variantes de secuencia aminoacídica de PstS incluyen, por ejemplo, deleciones, o inserciones o substituciones, de residuos en la secuencia aminoacídica de PstS mostrada en la Figura 1. Puede realizarse también cualquier combinación de deleción, inserción y substitución de manera que éstas lleguen a la construcción final, siempre y cuando la construcción final posea la propiedad deseada de permitir la inducción por la célula huésped bacteriana a concentraciones de fosfato en el medio que están por encima del nivel de privación.

La expresión "residuos hidrofóbicos" se refiere a los residuos norleucina, cisteína, meteonina, alanina, valina, leucina, tirosina, fenilalanina, triptófano e isoleucina. El término "polipéptidos de interés" se refiere en general a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser homólogos a la célula bacteriana huésped o preferentemente, pueden ser heterólogos a la célula huésped, como por ejemplo los polipéptidos de levadura o más preferentemente, los polipéptidos de mamíferos. Algunos ejemplos de polipéptidos bacterianos incluyen, por ejemplo, la fosfatasa alcalina y la \beta-lactamasa. Algunos ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen moléculas como por ejemplo la renina, una hormona de crecimiento, incluida la humana del crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana des-N-metionil y la hormona de crecimiento bovino; el factor de liberación de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora del tiroides; la tiroxina; las lipoproteínas; la \alpha-1-antitripsina; la cadena de insulina A; la cadena de insulina B; la proinsulina; la hormona estimuladora del folículo; la calcitonina; la hormona leutinizante; el glucagón; factores de coagulación como por ejemplo el factor VIIIC, el factor IX, el factor de tejido y el factor von Willebrands; los factores anti-coagulantes como por ejemplo la Proteína C; el factor naturiético atrial; el surfactante de pulmón; un activador de plasminógeno, como por ejemplo la uroquinasa o la urina humana o el activador de plasminógeno dependiente de tejido (t-PA); la bombesina; la trombina; el factor de crecimiento hemopoiético; el factor de necrosis de tumor -alfa y -beta; la encefalinasa; una albúmina del suero como por ejemplo la albúmina del suero humana; la sustancia inhibidora muleriana; la cadena de relaxina A; la cadena de relaxina B; la prorelaxina; el péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, como por ejemplo la beta-lactamasa; La ADNasa; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; los receptores de hormonas o factores de crecimiento; la integrina; la trombopoietina; la proteína A o D; los factores reumatoides; un factor neurotrópico como por ejemplo el factor neurotrópico derivado del hueso (BDNF), la neurotropina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento de nervio como por ejemplo NGF-\beta; el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); un factor de crecimiento de fibroblasto como por ejemplo aFGF y bFGF; el factor de crecimiento epidérmico (EGF); el factor de crecimiento transformador (TGF) como por ejemplo TGF-alfa y TGF-beta, incluido TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4 o TGF-\beta5; el factor de crecimiento tipo insulina -I y -II (IGF-I e IGF-II); las proteínas de unión del factor de crecimiento tipo insulina; las proteínas CD como por ejemplo CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; la eritropoietina; los factores osteoinductivos; las inmunotoxinas; una proteína morfogenética de hueso (BMP); las somatotropinas; un interferón como por ejemplo interferón-alfa, -beta y -gamma; los factores estimuladores de colonias (CSFs), por ejemplo M-CSF, GM-CSF y G-CSF; las interleuquinas (ILs); por ejemplo de la IL-1 a la IL-10; la dismutasa de superóxido; los receptores de células T; las proteínas de membranas de superficie; el factor acelerador de la desintegración; un antígeno vírico como por ejemplo una porción de la envoltura del virus del SIDA; las proteínas de transporte; los receptores de alojamiento; las adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados más arriba. Los polipéptidos preferidos de interés son aquellos que se expresan fácilmente en las células bacterianas con un mínimo de proteolisis y un máximo en replegamiento correcto o material activo y no tienen que glicosilarse para su propósito de utilización. Algunos ejemplos de dichos polipéptidos de mamíferos incluyen el IGF-I, la hormona de crecimiento, la ADNasa, la relaxina, el factor liberador de la hormona del crecimiento; la insulina, la uroquinasa, las inmunotoxinas y los antígenos. Algunos polipéptidos de mamíferos preferidos particularmente incluyen el IGF-I y la hormona del crecimiento.

El término "fase de producción del crecimiento celular" se refiere al periodo de tiempo de crecimiento celular que sigue a la inducción del promotor cuando se está produciendo el polipéptido de interés.

El término "parcialmente inducido" aplicado al promotor de la fosfatasa alcalina se refiere a un estado en el cual no se consigue la inducción completa del promotor de la fosfatasa alcalina, sino más bien sólo una inducción parcial de la misma. En este sentido, se controla la velocidad de transcripción del ácido nucleico deseado a expresar.

La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para las bacterias incluyen el promotor de la fosfatasa alcalina, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se sitúa en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o de un líder secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un intensificador está unido operativamente a una secuencia codificadora si éste afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificadora si éste se posiciona de tal manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido operativamente" quiere decir que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y que, en el caso de un líder secretor, que son contiguas y que se encuentran en fase de lectura. La unión se consigue por ligamiento en dianas de restricción convenientes. Si dichas dianas no existen, se utilizan secuencias adaptadoras o conectoras oligonucleotídicas sintéticas, de acuerdo con la práctica convencional.

En el sentido utilizado aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable y todas dichas designaciones incluyen la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria en cuestión y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada para la célula transformada original. En el caso en que se pretenda hacer designaciones distintivas, quedará claro a partir del contexto.

La técnica de la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", en el sentido utilizado aquí, se refiere generalmente a un procedimiento en el cual cantidades mínimas de un fragmento específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican tal y como se describe en la patente estadounidense Nº. 4,683,195, publicada el 28 de julio de 1987. Generalmente, la información de la secuencia desde los extremos de la región de interés o más allá debe ser accesible, puedan diseñarse de manera que los cebadores oligonucleotídicos; dichos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a cadenas opuestas de la plantilla a amplificar. Los nucleótidos 5'-terminales de los dos cebadores deben coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede utilizarse para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir de ADN genómico total, y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase, en general, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., Tecnología de PCR, (Stockton Press, NY, 1989). Para una revisión reciente de los avances de la PCR, véase Erlich et al. Science, 252: 1643-1650 (1991).

En el sentido que se utiliza aquí, la PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de un procedimiento de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra test de ácido nucleico, que comprende la utilización de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un fragmento específico de ácido nucleico.

En el sentido utilizado aquí, el término "nivel de privación de fosfato" o "nivel al cual se privan a las células de fosfato" se refiere a una concentración de fosfato inorgánico (por ejemplo sales de ácido fosfórico como por ejemplo el fosfato de sodio, el fosfato de potasio o el fosfato asociado a fuentes de nitrógeno complejo como por ejemplo hidrolisados de caseína o extractos de levadura, etc) tan baja en el medio de cultivo que las células se consideran privadas de los iones fosfato, lo cual conduce a un aumento reversible en la velocidad de degradación de proteína, a una inhibición de la síntesis de ARN, a una disminución de crecimiento celular y a una disminución de ATP. Esto se describe con mayor detalle en St. John y Goldberg, supra. Este nivel de privación debe distinguirse del nivel de fosfato requerido para la inducción/represión del promotor de phoA. No se requiere una privación completa para inducir dicho promotor. Se piensa que pstS es el sensor de niveles de fosfato de las células y que por lo tanto induce indirectamente la expresión de phoA. La concentración de fosfato inorgánico deseada para inducir la producción de polipéptido dependerá de factores tales como el tipo de polipéptido producido, el tipo de célula huésped, el tipo de medio y las condiciones de cultivo empleadas. Una concentración ejemplar para este propósito es de 0,1-10 \muM.

B. Maneras de llevar a cabo la invención

Para los fines de la invención, una variante PstS contiene una o más mutaciones de aminoácido en su región de unión a fosfato y procede preferentemente de E. coli. Dichas variantes pueden prepararse por cualquier medio, por ejemplo recombinante, sintético o parcialmente sintético. Las variantes de secuencia aminoacídica de PstS se preparan adecuadamente mediante la introducción de los cambios nucleotídicos apropiados en el ADN de pstS. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones y substituciones de residuos en la secuencia aminoacídica de la PstS de E. coli mostrada en la Figura 1. Cualquier combinación de deleción, inserción y substitución se hace para llegar a la construcción final, siempre y cuando la construcción final posea las características deseadas. Se excluye del alcance de la presente invención las variantes de PstS que no son nuevas y no son obvias a partir del estado de la técnica anterior.

Para diseñar las variantes de secuencia aminoacídica de PstS, las características de inducción óptima dependerán de la localización del sitio de mutación en la región de unión a fosfato y la naturaleza de la mutación. Los sitios de mutación pueden modificarse individualmente o en series, por ejemplo, (1) substituyendo primero con selecciones de aminoácidos conservativas y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados conseguidos, (2) delecionando el residuo diana, o (3) insertando residuos de la misma clase o diferentes, adyacentes a la localización del sitio, o combinaciones de las opciones 1-3.

Mientras que el sitio de introducción de una variación de secuencia aminoacídica está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene por qué estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar la realización de una mutación en un determinado sitio, se lleva a cabo adecuadamente una mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se exploran las características de inducción óptima en las variantes PstS expresadas.

Las deleciones en la secuencia aminoacídica en el dominio de unión a fosfato de PstS en el dominio de unión a fosfato variarán generalmente de aproximadamente 1 a 5 residuos, y son típicamente contiguas. Las deleciones contiguas se llevan a cabo normalmente en números pares de residuos, pero una única deleción o números impares de deleciones están contempladas dentro del alcance de la invención.

Las inserciones en la secuencia aminoacídica son inserciones intrasecuencia de un único residuo de aminoácido o múltiples residuos de aminoácidos en el dominio de unión a fosfato, que varían generalmente de aproximadamente 1 a 5 residuos, más preferentemente de 1 a 3 residuos. Las inserciones se realizan preferentemente en números pares de residuos, pero no se requiere.

Un tercer grupo de variantes, preferido aquí, son variantes de substitución de aminoácido. Dichas variantes tienen como mínimo un residuo de aminoácido eliminado de la región de unión a fosfato de la molécula de PstS nativa y un residuo diferente insertado en su lugar.

Se consiguen modificaciones substanciales en la capacidad de unión a fosfato de la proteína PstS seleccionando substituciones que difieren significativamente en su efecto sobre la manutención de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico de PstS en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos existentes en la naturaleza se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1): hidrofóbicos: norleucina, cys, met, ala, val, leu, tyr, phe, trp, ile;

(2): hidrofílicos neutros: ser, thr;

(3): acídicos: asp, glu;

(4): básicos: asn, gln, his, lys, erg; y

(5): residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro.

Preferentemente, las variantes son aquellas en las cuales uno o más de los residuos de aminoácido posicionados en la región crítica de unión a fosfato de la proteína contraparte nativa se substituye por uno o más aminoácidos diferentes. Para las variantes de pstS de E. coli, los residuos thr, pro o leu substituyen preferentemente el residuo de serina en la posición 139, el residuo his substituye el residuo de treonina en la posición 141, los residuos phe, leu, met, tyr, ala, cys o gly substituyen el residuo de treonina en la posición 10, y/o los residuos val, ala, leu o ser substituyen el residuo de asparagina en la posición 56 de la PstS nativa. Las variantes de PstS de E. coli más preferidas aquí son aquellas en las cuales un aminoácido hidrofóbico substituye el residuo de treonina en la posición 10, más preferentemente T10M PstS y T10Y PstS y las variantes D56S PstS y T141H PstS, utilizando la nomenclatura indicada más abajo. Dichos cambios de aminoácidos pueden combinarse también para proporcionar una molécula variante con más de un aminoácido alterado.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de la secuencia aminoacídica de PstS se preparan mediante diferentes procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Dichos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido (o mutagénesis dirigida a sitio), mutagénesis de barrido de alanina, mutagénesis aleatoria, mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una variante o una versión no variante de PstS preparada anteriormente.

La mutagénesis mediada por oligonucleótido representa un procedimiento preferido para preparar variantes de substitución, deleción e inserción del gen PstS, aunque pueden utilizarse otros procedimientos si se desea. Esta técnica es bien conocida en el estado de la técnica tal y como describen Zoller y Smith, Nucleic Acids Res., 10: 6487 (1982). Brevemente, se altera el ADN de PstS mediante la hibridación de un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una plantilla de ADN, donde dicha plantilla es la forma de cadena sencilla de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN inalterada o nativa de pstS. Después de la hibridación, se utiliza una polimerasa de ADN para sintetizar una segunda cadena complementaria de la plantilla que por lo tanto incorporará el cebador oligonucleotídico y codificará la alteración seleccionada en el ADN de pstS.

Generalmente, se utilizan oligonucleótidos de cómo mínimo 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son completamente complementarios a la plantilla en ambos extremos del(de los) nucleótido(s) que codifican la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibridará correctamente la molécula plantilla de ADN de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica tales como las que describen Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765 (1978).

La plantilla puede generarse mediante los vectores que derivan de los vectores del bacteriófago M13 (son adecuados los vectores M13mp18 y M13mp19, comerciales) o los vectores que contienen un origen de replicación de fago de cadena sencilla tal y como describen Viera et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Por lo tanto, el ADN a mutar puede insertarse en uno de estos vectores para generar una plantilla de cadena sencilla. La producción de la plantilla de cadena sencilla se describe en las Secciones 4.21-4.41 de Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio (Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, 1989).

Alternativamente, puede generarse una plantilla de ADN de cadena sencilla desnaturalizando un ADN de plásmido (u otros) de doble cadena utilizando técnicas estándar.

Un procedimiento útil para identificar ciertos residuos o regiones de la proteína PstS que son localizaciones preferidas de mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", tal y como describen Cunnigham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo residuos cargados como por ejemplo arg, asp, his, lys y glu) y se substituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para influir la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso circundante dentro o fuera de la célula. Los dominios que muestran una sensibilidad funcional a las substituciones se reafinan entonces introduciendo más variantes u otras variantes en los sitios de substitución. Por lo tanto, aunque se predetermina el sitio de introducción de una variación en la secuencia aminoacídica, la naturaleza de la mutación per se no tiene por qué predeterminarse. Por ejemplo, para optimizar la realización de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo una mutagénesis de barrido de alanina o aleatoria en el codón o región diana y se explora la combinación óptima de la actividad deseada entre las variantes de PstS.

Para alterar la secuencia de ADN nativa (para generar las variantes de secuencia aminoacídica, por ejemplo), el procedimiento preferido es la combinación de mutagénesis dirigida por oligonucleótido y mutagénesis aleatoria tal y como describen Kunkel et al., Methods Enzymol., 154: 367 (1987). En este procedimiento, la mutagénesis dirigida por oligonucleótido se emplea para randomizar codones particulares del gen PstS tipo salvaje para codificar todos los residuos posibles. Se utiliza un mezcla de oligonucleótidos con cadena complementaria (aproximadamente 10-15 bases) flanqueando el codón de elección. El codón de elección se substituye con los nucleótidos NNS, donde N es cualquier nucleótido y S es G o C, para dar una mezcla de oligonucleótidos que codifican todos los posibles aminoácidos en 32 codones.

En este procedimiento preferido, un plásmido derivado de pBR322 con un origen de replicación de cadena sencilla se prepara como plantilla plasmídica de cadena sencilla en una cepa de E. coli dut- ung- como por ejemplo CJ236 (Kunkel et al., supra). Estas dos mutaciones en la cepa provocan la incorporación de dos o más nucleótidos uracilo en el ADN de cadena sencilla en vez de timina. Los oligonucleótidos aleatorios se hibridan, se elongan con la polimerasa de ADN del fago T7 de E. coli, se ligan, y se transforman en una cepa de E. coli de tipo salvaje como por ejemplo W3110 o la cepa 13G8 (W3111 tonA\Delta PhoS64). La última cepa es pstS menos y deriva de CGS6777 (C75-b), la cual deriva de C75, descrito por Amemura et al., J. Bacter., 152: 692-701 (1982). La cepa de tipo salvaje corrige la incorporación equivocada de uracilo utilizando la cadena mutante sintética como plantilla, produciendo aproximadamente el 90% de mutantes.

El ADN que codifica mutantes PstS con más de un aminoácido a substituir pueden generarse en una de las varias maneras. Si los aminoácidos están localizados cercanos entre sí en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica todas las substituciones de aminoácido deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están localizados a cierta distancia entre sí (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En lugar de ello, pueden emplearse uno de dos procedimientos alternativos.

En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido a substituir. Entonces los oligonucleótidos se hibridan a la plantilla de ADN de cadena sencillla simultáneamente y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir de la plantilla codificará todas las substituciones de aminoácido deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más ciclos de mutagénesis para producir el mutante deseado. El primer ciclo es tal y como se ha descrito para los mutantes únicos: se utiliza ADN tipo salvaje como plantilla, un oligonucleótido que codifica
la(s) primera(s) substitución(ones) de aminoácido se hibrida a esta plantilla y se genera entonces la molécula de ADN heterodúplex. El segundo ciclo de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en el primer ciclo de mutagénesis como plantilla. Por lo tanto, esta plantilla contiene ya una o más mutaciones. El oligonucleótido que codifica
la(s) substitución(ones) de aminoácido deseada(s) se hibrida entonces a esta plantilla y la cadena resultante de ADN codifica ahora mutaciones de la primera y segunda ronda de mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como plantilla en un tercer ciclo de mutagénesis, y así sucesivamente.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para hacer variantes de aminoácido de PstS. Aunque la siguiente discusión se refiere a ADN, se entiende que la técnica también puede aplicarse con ARN. La técnica de la PCR se refiere generalmente al siguiente procedimiento (véase Erlich, supra, el capítulo de R. Higuchi, p. 61-70): cuando se utilizan cantidades pequeñas de ADN plantilla como material de partida en una PCR, pueden utilizarse cebadores que difieren ligeramente en secuencia respecto la región correspondiente en el ADN plantilla para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiere de la secuencia de la plantilla sólo en las posiciones donde los cebadores difieren de la plantilla. Para introducir una mutación en un ADN plasmídico, uno de los cebadores se diseña de tal manera que solape la posición de la mutación y que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un segmento de la secuencia de la cadena opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede localizarse en cualquier sitio a los largo del ADN plasmídico. Sin embargo, se prefiere que la secuencia del segundo cebador esté localizada a 200 nucleótidos del primero, de tal manera que al final, la región amplificada completa del ADN unido por los cebadores puede secuenciarse fácilmente. La amplificación por PCR utilizando un par de cebadores como el descrito provoca una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación especificada por el cebador y posiblemente en otras posiciones, dado que la copia de plantilla es de alguna manera susceptible a error.

Si la relación de plantilla a material producto es extremadamente baja, la vasta mayoría de fragmentos de ADN producto incorporan la(s) mutación(ones) deseadas. Este material producto se utiliza para substituir la región correspondiente en el plásmido que sirvió como plantilla para la PCR utilizando tecnología de ADN estándar. Las mutaciones en posiciones separadas pueden introducirse simultáneamente utilizando un segundo cebador mutante o llevando a cabo una segunda PCR con diferentes cebadores mutantes y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes al fragmento vectorial en una ligamiento de tres (o más) partes.

En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR, el ADN plasmídico plantilla (1 \mug) se lineariza mediante digestión con una endonucleasa de restricción que tiene un único sitio de reconocimiento en el ADN plasmídico fuera de la región a amplificar. De este material, 100 ng se añaden a una mezcla de PCR que contiene tampón de PCR, el cual contiene los cuatro trifosfatos de deoxinucleótido y se incluye en los kits GeneAmp® (obtenidos de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) y 25 pmol de cada cebador oligonucleotídico, hasta un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se cubre con una capa de 35 \mul de aceite mineral. La mezcla de reacción se desnaturaliza durante cinco minutos a 100ºC, se coloca brevemente en hielo y entonces se añada por debajo de la capa de aceite mineral 1 \mul de polimerasa de ADN de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/\mul, adquirida en Perkin-Elmer Cetus). La mezcla de reacción se inserta entonces en un Ciclador Térmico de ADN (adquirido en Perkin-Elmer Cetus) programado tal y como se indica a continuación:

: 2 min. 55ºC

: 30 seg. 72ºC, después 19 ciclos de lo siguiente:

: 30 seg. 94ºC

: 30 seg. 55ºC y

: 30 seg. 72ºC

Al final del programa, el vial de reacción se extrae del ciclador térmico y la fase acuosa se transfiere a un nuevo vial, se extrae con fenol/cloroformo (50:50 en volumen) y se precipita con etanol y el ADN se recupera mediante procedimientos estándar. Este material se somete a continuación a los tratamientos apropiados para su inserción en un vector.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis en casete, se basa en la técnica descrita por Wells et al., Gene, 34: 315 (1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN de pstS a mutar. Se identifica el codón(ones) a mutar en el ADN de pstS. Debe haber una única diana de restricción por endonucleasa en cada extremo del sitio(s) de mutación identificado. Si no existen dichas dianas de restricción, deben generarse utilizando el procedimiento de mutagénesis mediado por oligonucleótido descrito más arriba, para introducirlas en localizaciones apropiadas en el ADN de pstS. Después de introducir las dianas de restricción en el plásmido, se corta el plásmido en estas dianas para linearizarlo. Se sintetiza un oligonucleótido de doble cadena que codifica la secuencia de ADN entre las dianas de restricción pero que contiene la mutación(ones) deseadas utilizando procedimientos estándar. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y después se hibridan entre sí utilizando técnicas estándar. Nos referiremos a este oligonucleótido de doble cadena como el casete. Se diseña este casete de manera que tenga extremos 3' y 5' que sean compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de tal manera que pueda ligarse directamente en el plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de ADN de pstS mutada.

También puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico que codifique la variante de PstS y asemblarse mediante cualquiera de las múltiples técnicas, antes de su expresión en una célula huésped. [Véase, por ejemplo, Caruthers, patente estadounidense Nº. 4,500,707; Balland et al., Biochimie, 67: 725-736 (1985); Edge et al., Nature, 292: 756-762 (1982)].

Con el fin de designar abreviadamente las variantes de PstS descritas aquí, se apunta que los números se refieren al residuo/posición de aminoácido a lo largo de las secuencias aminoacídicas de la proteína PstS madura. La identificación de aminoácido utiliza el alfabeto de única letra de los aminoácidos, es decir,

Asp	D	Ácido aspártico	Ile	I	Isoleucina
Thr	T	Treonina	Leu	L	Leucina
Ser	S	Serina	Tyr	Y	Tirosina
Glu	E	Ácido glutámico	Phe	F	Fenilalanina
Pro	P	Prolina	His	H	Histidina
Gly	G	Glicina	Lys	K	Lisina
Ala	A	Alanina	Arg	R	Arginina
Cys	C	Cisteína	Trp	W	Triptófano
Val	V	Valina	Gln	Q	Glutamina
Met	M	Metionina	Asn	N	Asparagina

La designación de una variante de substitución consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra (más a la izquierda) designa el aminoácido en la proteína PstS madura de tipo salvaje. El número se refiere a la posición de aminoácido donde se realiza la substitución de aminoácido y la segunda letra (más a la derecha) designa el aminoácido utilizado para substituir el aminoácido de tipo salvaje. La designación de una variante de inserción consiste en la letra i seguida de un número que designa la posición del residuo en la proteína PstS madura de tipo salvaje antes de que empiece la inserción, seguido de una o más letras en mayúscula que indican, inclusivamente, la inserción a realizar. La designación de una variante de deleción consiste en la letra d seguida del número de la posición de inicio de la deleción hasta el número de la posición final de la deleción, basándose las posiciones en la proteína PstS madura de tipo salvaje. Las mutaciones múltiples se separan por una coma en la anotación para mayor facilidad de lectura.

Algunos ejemplos de nomenclatura de la proteína PstS de E. coli se indican a continuación: una variante de substitución donde la treonina en la posición 10 de la proteína PstS de tipo salvaje se substituye por un residuo de meteonina se designa como T10M PstS. Una variante de substitución con múltiples substituciones M y S en las posiciones 10 y 56 de la proteína PstS de tipo salvaje se designa como T10M, D56S PstS. Una variante de inserción donde el aminoácido (treonina) en la posición 10 se deleciona a partir de la PstS madura se designa como dT10 PstS. Tal y como se ha indicado en los ejemplos anteriores, la anotación "PstS" sigue al nombre de cada mutante.

No se espera que la mayoría de las deleciones e inserciones, y en particular de las substituciones, produzcan cambios radicales en las características de la molécula de PstS. Sin embargo, aunque es difícil predecir el efecto exacto de la substitución, deleción o inserción antes de realizarlas, un experto medio en la técnica estimará que el efecto puede evaluarse mediante ensayos de cribados rutinarios.

Una variante de ADN puede realizarse típicamente mediante mutagénesis aleatoria y/específica de sitio del ácido nucleico que codifica la PstS nativa y transfectando o integrando el gen de la variante de pstS en los cromosomas de un huésped bacteriano o mediante mutagénesis aleatoria de un huésped que contiene el gen pstS nativo. Entonces debe explorarse la variante de ácido nucleico que tiene las características deseadas en un ensayo de cribado adecuado.

Por ejemplo, en una realización se explora la actividad fosfatasa alcalina entre los genes mutantes a una alta concentración de fosfato (aproximadamente 3 mM de fosfato) transformando la mezcla mutante en una cepa de pstS W3110 como por ejemplo la cepa 13G8 descrita más arriba o C75 (Amemura et al., supra) y haciendo una extensión sobre placas de LB-BCIP-carbenicilina. Los plásmidos se aíslan a partir de las colonias azules y el gen pstS se secuencia entonces para determinar las mutaciones específicas.

Alternativamente, los transformantes simples se dejan crecer durante una noche en placas de 96 pozos que contienen una alta concentración (2-5 mM) o una baja concentración de fosfato (0,3 mM). Se ensaya la actividad PhoA de las alícuotas mediante hidrólisis de PNPP. Las mutantes con una actividad aumentada, en particular aquellas que tienen una actividad aumentada a una concentración alta de fosfato, se secuencian y se caracteriza mejor su actividad.

Las mutantes secuenciadas seleccionadas en cada cribado se caracterizan mejor dejando crecer las células en placas de 96 pozos que contienen una serie de concentraciones de fosfato que van desde 0,02 mM hasta 50 mM y se ensaya la actividad PhoA en las alícuotas.

Las mutantes seleccionadas por este cribado se integran en el locus pstS cromosomal para substituir el gen de tipo salvaje y para situarlo bajo el control transcripcional del promotor PstS. Las cepas integradas se caracterizan analizando los niveles de PhoA. Aquellas cepas que satisfacen este último análisis pueden evaluarse entonces en cultivos de matraz de agitación con concentraciones de fosfato iniciales variables para analizar la expresión de productos de proteína homólogos o heterólogos según sea apropiado. Además, o alternativamente, pueden evaluarse los nuevos organismos en fermentaciones a alta densidad celular donde se emplean diferentes velocidades de alimentación de fosfato después de eliminar el fosfato cargado inicialmente. Como análisis final y optimización, pueden utilizarse estas cepas en un fermentador donde los niveles de fosfato pueden monitorizarse y regularse "on line". Si el polipéptido de interés es homólogo a las células bacterianas con el gen mutado, es decir, PhoA, entonces pueden caracterizarse las células analizando los niveles de dicho polipéptido. Si el polipéptido de interés es heterólogo para las células bacterianas, las células se transforman con el ácido nucleico que codifica este polipéptido y se analizan los niveles del polipéptido producido bajo el control transcripcional del promotor de PhoA.

En la última aplicación, el nivel de fosfato del medio en el cual se cultivan las células huésped bacterianas se mide "on line" (es decir, mediante muestreo continuo), empezando con un exceso de fosfato (40 mM) en el medio. Entonces se elimina fosfato hasta un nivel de aproximadamente 0,2 mM a 5 mM de fosfato, y la velocidad de inducción del promotor PhoA se mide mediante técnicas conocidas para los expertos medios en la técnica. Las mutaciones de PstS preferidas son aquellas en las que la inducción de polipéptido a esta concentración de fosfato aumenta el rendimiento final de polipéptido o aumenta la cantidad relativa de polipéptido intacto o la densidad celular.

Si el ácido nucleico que codifica la variante de PstS se produce fuera de la célula huésped bacteriana que producirá finalmente el polipéptido de interés, se introduce el ácido nucleico en la célula bacteriana apropiada utilizando cualquier procedimiento adecuado, incluidas la transfección y la transformación por un vector que codifica la variante de PstS y, preferentemente, la integración en el cromosoma de las células bacterianas mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en el estado de la técnica. Un ejemplo de inserción del gen pstS en el genoma huésped incluye aquella que utiliza las especies de E. coli como huésped. En este caso se incluye en el vector para la transformación una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia encontrada en el ADN genómico de E. coli. La transfección de E. coli con este vector resulta en una recombinación homóloga con el genoma y la inserción del gen variante de pstS. El huésped para este objetivo es PstS menos o tiene su gene pstS de tipo salvaje substituido por el gen variante pstS mediante la integración del mismo.

Las células bacterianas que contienen el gen pstS mutado pueden llevar inherentemente el polipéptido de interés. Por ejemplo, la fosfatasa alcalina es una proteína que es homóloga para E. coli y que puede inducirse sin tener que transfectar la célula con un vector de ADN. En el caso de polipéptidos heterólogos, como por ejemplo IGF-I y la hormona del crecimiento, el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo ADNc o ADN genómico) se inserta de forma adecuada en un vector replicable para expresarlo en el medio de cultivo bacteriano bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina. Diversos vectores pueden adquirirse con este objetivo y la selección del vector apropiado dependerá del tamaño del ácido nucleico a insertar en el vector y la célula huésped particular a transformar en el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped con la que es compatible. Los componentes del vector para la transformación bacteriana incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores y un promotor de la fosfatasa alcalina.

En general, se utilizan vectores plasmídicos que contienen un replicón y secuencias control que derivan de especies compatibles con la célula huésped en conexión con los huéspedes bacterianos. El vector lleva normalmente un sitio de replicación, así como secuencias de marcaje que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente utilizando pBR322, un plásmido derivado de un especie de E. coli (véase por ejemplo Boliver et al., Gene, 2: 95 [1977]). El vector pBR322 contiene genes que otorgan resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y por lo tanto constituye una manera fácil de identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos o fagos microbianos, debe contener también, o modificarse para contener, promotores que pueden utilizarse en el organismo microbiano para la expresión de genes marcadores seleccionables.

El ADN que codifica el polipéptido de interés debe expresarse no sólo directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga una diana de restricción específica en el extremo N-terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte de ADN polipeptídico que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser reconocida y procesada (es decir, eliminada por una peptidasa señal) por la célula huésped. En el caso de células huésped bacterianas que no reconocen y procesan la secuencia señal polipeptídica nativa, la secuencia señal se substituye por una secuencia señal bacteriana seleccionada, por ejemplo, entre el grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp o líders de enterotoxina II estables al calor.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias replicantes de forma autónoma. Se conocen bien dichas secuencias para diversas bacterias. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas.

Los vectores de expresión y clonación deben contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas en un medio de cultivo selectivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotrópicas o (c) proporcionan nutrientes críticos no accesibles a partir del medio complejo, por ejemplo el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección emplea un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y que por lo tanto sobrevive al régimen de selección. El vector de expresión para producir un polipéptido heterólogo contiene un promotor de la fosfatasa alcalina que es reconocido por el organismo bacteriano huésped y que está unido operativamente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Este promotor es inducible, es decir, que inicia un aumento de los niveles de transcripción a partir del ADN bajo su control como respuesta a una disminución en la concentración de fosfato inorgánico en el medio de cultivo. El promotor de PhoA puede eliminarse de la fuente de ADN bacteriana mediante una digestión con enzimas de restricción y puede insertarse en el vector que contiene el ADN deseado.

La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados más arriba emplea técnicas de ligamiento estándar. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se separan, se recortan y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para realizar un análisis de confirmación de las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligamiento se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31, 446) u otras cepas y los transformantes con éxito se seleccionan por su resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina, según convenga. Se preparan los plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante digestión por endonucleasa y/o se secuencian por el método de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) o Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o mediante el método de Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

Las células huésped bacterianas utilizadas para expresar los vectores que codifican el polipéptido de interés son aquellas que en la naturaleza contienen un gen pstS nativo. En el caso del presente procedimiento el gen nativo está ausente y se ha substituido por el gen variante de pstS, que es preferentemente homólogo al gen pstS nativo presente normalmente en las células huésped. Algunas bacterias adecuadas para este fin incluyen las eubactaria, especialmente las Enterobacteriaceae, donde el gen pstS se encuentra por lo tanto ampliamente distribuido. Algunos ejemplos de bacterias que pertenecen a las Enterobacteriaceae incluyen Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia y Shigella. Un huésped de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31, 446), aunque otras cepas como por ejemplo E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31, 537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son adecuadas. Estos ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo no limitativo. También pueden emplearse las células mutantes de cualquiera de las bacterias mencionadas más arriba. Evidentemente, es necesario seleccionar las bacterias apropiadas teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, las especies de E. coli, Serratia o Salmonella pueden utilizarse de forma apropiada como huéspedes si se utilizan plásmidos bien caracterizados como por ejemplo pBR322, pBR325, pACYA177 o pKN410 para proporcionar el replicón.

La cepa de E. coli W3110 se prefiere particularmente como huésped madre debido a que es una cepa huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 debe modificarse para que efectúe una mutación genética en los genes que codifican las proteasas; algunos ejemplos de dichos huéspedes incluyen la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3, la preparación de la cual se describe más abajo, y la cepa 27C7 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3 PhoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan'. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 en la Colección de Cultivos Tipo Americana como ATCC Nº. 55,244. Alternativamente, puede emplearse la cepa de E. coli que tiene una proteasa periplasmática mutante, descrita en la patente estadounidense Nº. 4,946,783, publicada el 7 de agosto de 1990.

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión de la presente invención descritos más arriba y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según convenga para inducir el promotor de la fosfatasa alcalina.

Transformación significa introducir un ADN en un organismo de manera que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o como un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento de calcio con cloruro cálcico, tal y como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra, se utiliza generalmente para las células bacterianas que contienen substanciales barreras de pared bacteriana. Otro procedimiento de transformación emplea polietilenglicol/DMSO, tal y como se describe en Chung y Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988).

Las células bacterianas utilizadas para producir el polipéptido de interés de la presente invención se cultivan en un medio adecuado en el cual el promotor de la fosfatasa alcalina puede inducirse parcial o totalmente, tal y como se describe en general, por ejemplo, en Sambrook et al., supra. La necesidad de cultivo nunca tiene lugar en ausencia de fosfato inorgánico o a niveles de privación de fosfato. Al principio, el medio contiene fosfato inorgánico en una cantidad por encima del nivel de inducción de la síntesis proteica y suficiente para el crecimiento de la bacteria. A medida que las células crecen y utilizan el fosfato, disminuye el nivel de fosfato en el medio, provocando de esta manera la inducción de la síntesis del polipéptido.

También puede incluirse en concentraciones apropiadas cualquier otro de los suplementos necesarios aparte de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico y se introducen aisladamente o como una mezcla con otro suplemento o medio como por ejemplo una fuente de nitrógeno compleja.

Si el polipéptido es la fosfatasa alcalina, la composición de las fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato del medio nutriente es preferentemente es tal, que durante la fase intensiva de acumulación de polipéptido el contenido en glucosa del medio es aproximadamente del 0%, el contenido en fosfato es mayor que aproximadamente 0,5 mM y menor que aproximadamente 5 mM, dependiendo de la variante PstS empleada, y la concentración de nitrógeno no es mayor que aproximadamente 30 \mug/ml. La alimentación de glucosa se lleva a cabo preferentemente durante la fase de transición. El medio de fermentación se somete preferentemente a un mezclado intensivo y la fermentación se lleva a cabo preferentemente a aproximadamente 25-40ºC, más preferentemente aproximadamente 37ºC.

La expresión génica puede medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante un northern blotting convencional, para cuantificar la transcripción de RNAm. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980). Pueden emplearse diversas marcas, las más comunes radioisótopos, en particular ^{32}P. Sin embargo, pueden emplearse también otras técnicas, como por ejemplo la utilización de nucleótidos modificados con biotina para introducirlos en un polinucleótido. La biotina sirve como el sitio de unión a avidina o a anticuerpos, que pueden marcarse con una gran variedad de marcas, como por ejemplo radionucleido, agentes fluorescentes, enzimas o similares.

El polipéptido de interés se recupera preferentemente del periplasma o del medio de cultivo como un polipéptido de secreción, aunque también puede recuperarse a partir de lisados de las células huésped si se expresa directamente sin una señal secretora.

Se prefiere a menudo purificar el polipéptido de interés a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas en cuanto al polipéptido de interés. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los deshechos celulares particulados. Las fracciones de proteínas de membrana y solubles pueden separarse entonces si es necesario. Después, el polipéptido se solubiliza y se pliega, si es necesario, y se purifica frente a las proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, siendo los siguientes procedimientos ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: columnas de fraccionamiento por inmunoafinidad o por intercambio iónico; precipitación por etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía en una resina de sílica o de intercambio catiónico, como por ejemplo DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

La invención proporciona también un procedimiento para controlar el promotor de la fosfatasa alcalina de manera que sólo se induzca parcialmente, pudiéndose regular así la velocidad de expresión del polipéptido. No era posible conseguir esto en el pasado, dado que el nivel de fosfato inorgánico tenía que ser extremadamente bajo para inducir el promotor y que no es práctico controlar concentraciones tan bajas. Con organismos que tienen la proteína PstS con afinidad reducida hacia el fosfato, la concentración de fosfato inorgánico se controla de forma adecuada controlando la velocidad de alimentación al medio de fosfato inorgánico o de una fuente que contiene fosfato inorgánico como por ejemplo una fuente de nitrógeno compleja.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo no limitativo.

Ejemplo I Preparación y caracterización de cepas mutantes Preparación de cepas mutantes

Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita más arriba utilizando el kit GeneAmp de Perkin-Elmer Cetus, para crear un fragmento de ADN de 1,3 kb que contiene el gen pstS con su propio promotor. Se utilizó la secuencia publicada del gen pstS (Surin et al., 1984, supra y Megota et al., supra; mostrada en la Figura 1) para diseñar los siguientes oligonucleótidos como cebadores para la PCR. Los nucleótidos subrayados se añadieron a la secuencia de pstS natural para introducir las dianas de restricción (EcoRI y AvaI, respectivamente) para finalidades de clonación:

5'-G GAA TTC TGT CAT CTC TTC GTT AT (SEQ. ID. NO. 3)

5'-CTG CCC GAG CCA TAA GTT ACT CTT CAG (SEQ. ID. NO. 4)

Se preparó el ADN cromosómico a partir de la cepa de E. coli W3110, esencialmente tal y como describen Silhavy et al., Experimentos con Fusiones Génicas (Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1984). Los productos de la PCR se extrajeron con fenol/cloroformo, se precipitaron con etanol, se cortaron con EcoRI y AvaI (New England Biolabs), después se aislaron a partir de un gel de agarosa al 1% fundido a baja temperatura junto al esqueleto de un plásmido phGHr cortado de forma similar. Fuh et al., J. Biol. Chem., 265: 3111-3115 (1990). Los fragmentos se ligaron con la ligasa de ADN T4 (New England Biolabs), obteniéndose el plásmido pSB2O mostrado en la Figura 2. El plásmido pSB2O es un derivado de pBR322 que tiene un origen de replicación del fago f1 (Fuh et al., supra) y 1329 pb del gen PstS de E. coli, incluidos su promotor y su secuencia de finalización/terminador. pSB2O se transformó en la cepa de E. coli 13G8 descrita más arriba y se hizo una extensión sobre placas LB-BCIP (Sigma) más carbenicilina (50 \mug/ml). Las colonias blancas indicaron la complementación de la mutación de PstS cromosómico mediante el plásmido que codifica PstS. La secuenciación de ADN (Sanger et al., supra) del gen PstS en el plásmido recuperado estaba de acuerdo con la secuencia publicada.

La mutagénesis dirigida por oligonucleótido tal y como se describe en Zoller y Smith, supra, se combinó con una mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, supra) y con una síntesis oligonucleotídica aleatoria utilizando la técnica de Kunkel et al., supra, para producir los mutantes empleados en este ejemplo. Estos procedimientos se utilizaron con los oligonucleótidos mostrados en la Tabla I, para cambiar los codones de la secuencia pstS de tipo salvaje por los residuos apropiados (en negrita) correspondientes a alanina o para randomizar de manera que se codifiquen todos los residuos posibles (N es G, A, T o C; S es G o C) y se introduzcan nuevas dianas de restricción (subrayadas). La presencia de todas las mutaciones se confirmó mediante secuenciación de ADN. Se utilizó una mezcla de oligonucleótidos con secuencias complementarias (10-15 bases) flanqueando el codón de elección. El codón de elección se substituyó por NNS en la síntesis para producir una mezcla de oligonucleótidos que codifican todos los aminoácidos posibles en 32 codones.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I Secuencias de oligonucleótidos usados en génesis mutante

1

La plantilla de cadena sencilla se preparó en un cepa dut- ung- de E. coli CJ236, tal y como describe Kunkel et al., supra. Las mutaciones en esta cepa conducen a la incorporación de uno o más nucleótidos uracilo en el ADN de cadena sencilla en vez de timidina. Cada uno de los oligonucleótidos aleatorios de la mezcla descrita más arriba se hibridó, se elongó con la polimerasa de ADN del fago T7 de E. coli, se ligó y se transformó en la cepa 13G8. La cepa de tipo salvaje corrige la incorporación errónea de uracilo utilizando la cadena (mutante) sintética como plantilla, dando aproximadamente el 90% de mutantes.

Se exploró la actividad PhoA en los mutantes aleatorios a elevada concentración de fosfato (aproximadamente 3 mM Pi) mediante la transformación de la mezcla mutante en la cepa 13G8 pst- W3110 y extensión sobre placas LB-BCIP-carbenicilina. Se aislaron los plásmidos de las colonias azules y el gen PstS se secuenció para determinar las mutaciones específicas. Alternativamente, tal y como se describe más abajo, los transformantes simples se dejaron crecer durante una noche por duplicado en placas de 96 pozos, a una concentración de fosfato elevada (2-5 mM) o baja (0,3 mM), ensayándose después la actividad PhoA de las alícuotas mediante hidrólisis de PNPP (Sigma). Los mutantes con actividad aumentada se secuenciaron y se caracterizaron con mayor detalle.

Los genes mutantes pstS seleccionados en los primeros cribados, es decir, T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS y T141H PstS, se caracterizaron con mayor detalle haciendo crecer las células en placas de 96 pozos que contenían 0,2 ml/pozo de un medio mínimo [0,4% de glucosa, 1,6 mM de MgSO_{4}, 20 mM de NH_{4}Cl, 50 mM de KCl, 20 mM de NaCl, 120 mM de trietanolamina-HCl (pH 7,4)] con una concentración añadida apropiada de KH_{2}PO_{4} de 0 mM a 50 mM. Se siguió el crecimiento celular midiendo la absorbancia a 620 nM. Las células se sedimentaron después de una noche de crecimiento a 37ºC bajo agitación, se resuspendieron en 0,2 ml de NaCl 0,15 M, después las alícuotas se diluyeron 1:10 en otra placa de 96 pozos que contenía Tris-HCl 1M (pH 8,0), PNPP 1 mM y sulfato sódico de dodecilo (SDS) al 1%. La actividad de la fosfatasa alcalina se determinó como la velocidad de hidrólisis del substrato cromogénico PNPP o el aumento en la absorbancia a 405 nm. La actividad PhoA se normaliza en cuanto al crecimiento celular expresando el cambio en OD_{405}/min./OD_{620}.

Los genes pstS mutantes que codifican T10M, T10Y, D56S y T141H se integraron en el cromosoma de E. coli en el locus pstS para substituir el gen pstS de tipo salvaje, utilizando una cepa polA, esencialmente tal y como se describe en Gutterson y Koshland, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4894-4898 (1983) (véase la Fig. 1 de la publicación).

El procedimiento aprovecha el hecho de que los plásmidos derivados de ColE1 como por ejemplo pBR322 requieren la polimerasa I de ADN (el producto génico polA) para replicarse extracromosómicamente. La cepa A401 de polA (Russel y Holmgren, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 990-994 [1988]) se transformó (Chung y Miller, supra) pasando a ser resistente a la carbenicilina con el clon plasmídico que contenía el gen PstS mutante de interés. La recombinación homóloga entre los genes pstS clonados y cromosómicos conduce a la integración del plásmido completo en el gen pstS cromosómico. La recombinación puede tener lugar a la izquierda o a la derecha de la mutación, dando lugar a una o dos posibles estructuras de ADN cromosómicas con el plásmido integrado. Los integrados plasmídicos se obtienen mediante la selección de resistencia a la carbenicilina.

La integración en el gen pstS se confirmó mediante la cotransducción de P1 (Silhavy et al., supra) de la resistencia a carbenicilina junto a los genes de resistencia a tetraciclina de Tn10 inserciones localizadas cerca del gen pstS (zie-296::Tn10 y ilv-500::Tn10). Singer et al., Microbiol. Revs., 53: 1-24 (1989). La transducción P1 se utilizó entonces para transferir el plásmido integrado a la cepa de tipo salvaje W3110 mediante la selección por carbenicilina. Los plásmidos podrán replicarse libremente y separarse del cromosoma dejando el gen pstS de tipo salvaje o mutante en el cromosoma y el resto en el plásmido que se replica libremente. Estos transductantes se hicieron crecer en un caldo de cultivo LB que contenía 100 \mug/ml de santonina para curar las células de los plásmidos separados (Bharathi y Polasa, FEMS Microbiol. Letts., 68: 213-216 [1990]), después se extendieron sobre placas LB-BCIP. Se aislaron las colonias azules que contienen el gen pstS mutante en el cromosoma y están libres de plásmido (sensibles a la carbenicilina).

Cribado de las cepas mutantes

La expresión de la actividad PhoA se utilizó para determinar los efectos de las mutaciones de pstS sobre la inducción de los genes regulados por fosfato. Las Figuras 3-7 muestran la inducción de la actividad PhoA como respuesta a la variación de la concentración de fosfato en el medio de crecimiento. En las células pstS+ de tipo salvaje, el gen PhoA se reprime hasta que la concentración de fosfato inicial disminuye por debajo de 0,4 mM. La sobreproducción de PstS en células que tienen el gen pstS en un plásmido derivado de pBR322 redujo drásticamente el nivel de inducción de PhoA, pero se obtuvo un perfil similar.

Las substituciones por alanina en cada una de las seis cadenas laterales que se había propuesto que interaccionan con el fosfato unido tuvieron poco efecto sobre este perfil de inducción. La substitución de Thr10, Ser38 o Asp56 por alanina condujo a cierta expresión de PhoA a una concentración de Pi superior respecto al tipo salvaje, pero no una inducción completa (Fig. 3).

La Figura 3A muestra que la sobreexpresión de PstS por las cepas de tipo salvaje W3110 y 13G8 disminuyó la inducción de PhoA. La Figura 3B muestra la actividad específica PhoA en varias cepas mutantes de alanina de pstS, siendo lo mejor para los fines de la presente invención la máxima velocidad de recambio metabólico de PNPP a medida que la concentración de fosfato en el medio aumenta. T10 mostró ser el máximo a altas concentraciones de fosfato.

La estructura cristalina muestra que la cadena lateral de Asp137 está unida por puente de hidrógeno con la cadena lateral de Arg135 y orienta la Arg135 hacia el PO_{4} unido. Para evaluar la importancia de esta interacción sobre la unión a PO_{4}, se substituyó también el Asp137 por alanina. Sorprendentemente, la retirada de cualquier cadena mostró tener poco efecto sobre la unión de PO_{4} en este sistema.

Dado que las substituciones por alanina tuvieron poco efecto sobre la inducción de PhoA a niveles de fosfato variables, se razonó que la substitución de estos residuos con cadenas laterales más grandes tendría mayores efectos debido al impedimento estérico sobre la unión de PO_{4} sobre este sistema.

Los codones que codifican los residuos Thr10, Ser38, Asp56, Ser139 y Thr141 se randomizaron en una etapa de manera que codifiquen las mezclas de todos los residuos. Se exploró la actividad PhoA aumentada en estas mezclas después de crecer en medio a baja y alta concentración de fosfato. La Tabla II muestra las mutaciones de aminoácido específicas en los genes pstS a partir de las colonias azules y el número de veces que fueron aislados.

TABLA II

Substituciones de aminoácidos de mutaciones sin sentido de pstS secuenciadas
Thr10	Asp56
Ala	Ala(7)
Met	Val(4)
Phe(2)^{a}	Leu(4)
Leu(6)	Ser
Tyr	Ser139
Cys	Thr(6)
Gly	Pro(5)
Ser38	Leu
Phe	Thr141
	His
^{a} Los números en paréntesis se refieren al número de veces que se aisló una determinada mutación.

La Figura 4 muestra que los perfiles de inducción de PhoA de mutantes PstS multicopia randomizados en el residuo Thr10 y aislados a partir del cribado. De los mutantes, T10Y y T10M mostraron tener la máxima velocidad de recambio metabólico de PNPP.

La Figura 5 ilustra los perfiles de inducción de PhoA de más mutantes PstS multicopia obtenidos cribando randomizaciones de los codones que codifican los residuos Ser38, Asp56, Ser139 y Thr141. De estos mutantes, D56S y T141H mostraron tener la máxima velocidad de recambio metabólico de PNPP a altas concentraciones de fosfato.

De la misma manera que la Figura 3A, la Figura 6A muestra que la expresión de PstS disminuyó la inducción de PhoA. La Figura 6B muestra varias mutantes de PstS randomizadas, teniendo T141H y D56S una velocidad de recambio metabólico de PNPP aumentada a elevadas concentraciones de fosfato.

La Figura 7 muestra los perfiles de inducción de PhoA de cepas mutantes de pstS de única copia con la mutación integrada en el cromosoma. Todas estas mutantes (T10M PstS, T10Y PstS, D56S PstS y T141H PstS) condujeron a la inducción de PhoA a mayores concentraciones de fosfato en comparación con la cepa W3110 de tipo salvaje, pero siguen estando reguladas por concentraciones de fosfato aún mayores, permitiendo controlar el sistema.

Ejemplo II Experimentos en matraces de agitación con cepas mutantes Cepas utilizadas

La cepa huésped de partida K-12 de E. coli (W3110tonA ptr3) se construyó en varias etapas utilizando técnicas que implican transducciones con el fago Pi kc, derivado de P1 [J. Miller, Experimentos en Genética Molecular (Cold Spring Harbor, N.Y.: Col Spring Harbor Laboratory, 1972)] y la genética del transposón [Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159 (1977)].

El huésped de partida utlilizado fue la cepa de E. coli K12 W3110, que es una cepa K12 que es F-, \gamma- [Bachmann, Bact. Rev., 36: 525-557 (1972); Bachman, Derivados y Genotipos de Algunos Derivados Mutantes de Escherichia coli K-12, p. 1190-1219, F.C. Niedhart et al. ed., Escherichia coli y Salmonella typhimurium: Biología Celular y Molecular, vol. 2, Sociedad Americana de Microbiología, Washington D.C. (1987)].

En primer lugar, el gen tonA (fhuA) [Kadner et al., J. Bact., 143: 180-230 (1983), Bachmann, Microbiol. Rev., 47: 180-230 (1983), Bachman, "Mapa de Ligamiento de Escherichia coli K-12", edición 7, p. 807-876, en F.C. Niehart et al. ed., Escherichia coli y Salmonella typhimurium: Biología Celular y Molecular, vol. 2, Sociedad Americana de Microbiología, Washington D.C. (1987)] se delecionó a partir de W3110 mediante la inserción en el gen tonA y la ulterior excisión imprecisa de un transposón Tn10.

En la primera etapa de este procedimiento, la cepa E. coli W3110 se transdujo con \lambda::Tn10 para generar una mezcla con repeticiones separadas de transposón en el gen tonA.

La mezcla con repeticiones separadas de E. coli W3110::Tn10 se hizo crecer en caldo de cultivo L a 37ºC a una densidad celular de aproximadamente 1x10^{9}/ml. Un total de 0,5 ml del cultivo se centrifugó y el sedimento se resuspendió en 0,2 ml de un lisado \lambdaphi80 que contenía 7,0x10^{9} pfu. Se permitió al fago adsorberse durante 30 minutos a 37ºC. Entonces se extendió la suspensión sobre placas EMB suplementadas con tetraciclina (15 \mug/ml). Después de una incubación durante una noche a 37ºC, las colonias se mezclaron en 3 ml de caldo de cultivo L, se dejaron crecer durante una noche a 37ºC, se lavaron dos veces y se resuspendieron en caldo de cultivo L. Se hizo un lisado por bacteriófago P1kc sobre este cultivo [Miller, J.H., Experimentos en Biología Molecular, supra, página 304].

La cepa E. coli AT982 (no. 4546, Centro de Stock Genético de E. coli, New Haven, Conn.) se transdujo para ser resistente a tetraciclina con este lisado de P1kc. Se seleccionaron los transductantes sobre placas de cultivo L suplementadas con tetraciclina (15 \mug/ml) y 40 \mug/ml de ácido diaminopimélico (dap). Se exploró la resistencia a tetraciclina y la regeneración del gen dap (dap^{+}, tat^{R}) entre los transductantes resultantes. Se analizó la resistencia a \lambdaphi80 entre los transductantes con el genotipo dap^{+}, tat^{R}.

Se llevaron a cabo lisados P1 kc sobre varias cepas resistentes a dap^{+}, tat^{R}, \lambdaphi80. Los lisados se utilizaron para transducir la cepa E. coli W3110 de manera que sea resistente a tetraciclina. Se exploró la resistencia a \lambdaphi80 entre los transductantes y se seleccionaron en base a ello.

Las fracciones aisladas sensibles a tetraciclina se seleccionaron a partir de los transductantes W3110 tonA::Tn10-\lambdaphi80R. [Maloy y Nunn, J. Bacteriol., 145: 1110 (1981)]. Se comprobó la resistencia a \lambdaphi80 y la sensibilidad a tetraciclina en estas fracciones aisladas después de una única purificación de colonias.

Se aisló el ADN a partir de diversos mutantes resistentes a \lambdaphi80 sensibles a la tetraciclina y se digirió con SstII. El ADN digerido con SstII se caracterizó mediante el procedimiento de Southern blot utilizando ADN \lambda::Tn10 digerido con SstII y marcado radioactivamente como sonda para determinar si se había excindido [Davis et al., Genética Bacteriana Avanzada (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980)]. Una de las fracciones aisladas sensibles a tetraciclina mostró haber perdido dos de las bandas de hibridación Tn10 en comparación con la hibridación entre ADN de \lambda::Tn10 y la cepa madre W3110 tonA::Tn10-\lambdaphi80R. Una tercera banda de hibridación tenía una movilidad alterada, indicando que había tenido lugar una deleción provocada por la excisión imprecisa de W3110 Tn10.

Una electroforesis en gel SDS de las preparaciones de la membrana exterior a partir de la cepa con una excisión imprecisa Tn10 reveló que la banda que se asumía que era la proteína codificada por tonA tenía una movilidad electroforética alterada en comparación con la proteína de tipo salvaje codificada por el gen tonA. La proteína resultante no era funcional como proteína receptora del fago \lambdaphi80. Una segunda cepa independiente que también había experimentado una excisión imprecisa de Tn10 no mostró ninguna proteína codificada por tonA en el gel SDS.

Ninguna de estas cepas mostró una reversión a la resistencia a tetraciclina o a la susceptibilidad a \lambdaphi80, lo cual indica que había una excisión imprecisa del transposón completo Tn10 o parte del mismo junto a una deleción parcial o completa del gen tonA. Por lo tanto, la proteína codificada por el gen tonA (peso molecular 78.000) se eliminó de la membrana exterior, haciendo a la cepa W3110 tonA resistente a varios bacteriófagos. La cepa resultante, designada 1A2, es resistente a los bacteriófagos T1 y \phi80.

El gen ptr3 [Cheng et al., J. Bacteriol., 140: 125-130 (1979)] se introdujo en la cepa 1A2 tal y como sigue. En primer lugar, la mutación thyA8 se aisló en 1A2 seleccionando por resistencia a la trimetoprima para dar la cepa 9E1. Entonces se transportó el locus argA81::tn10 de 9D9 (obtenido de B. Bachman, Centro Stock Genético de E. coli, New Haven, Conn.) en 9E1 por transducción con el fago P1kc para dar 9E3. El locus ptr3 se encuentra entre thyA8 y argA81. La transducción con el fago P1 que se ha hecho crecer en una mutante ptr3 [9D7, J. Bact., 140: 125 (1979)] provocó la introducción de la mutación ptr3 simultáneamente con la conversión de thyA8 y argA81::Tn10 a los locus de tipo salvaje. Esta cepa, designada 9E4, carece de la proteasa periplasmática III. La conclusión de que la mutación ptr3 está incluida en 9E4 se respalda por una acumulación de IGF-I fuertemente mejorada en la cepa resultante.

Las cepas derivadas de 9E4 con mutaciones conocidas en el gen pstS se produjeron tal y como se describe en el Ejemplo I y se les otorga números de catálogo tal y como se indica más abajo:

Número de catálogo	Descripción
9E4	E. coli W3110 tonA ptr3
39B4	E. coli W3110 tonA ptr3 PstS (T10M)
39B5	E. coli W3110 tonA ptr3 PstS (T10Y)
39B6	E. coli W3110 tonA ptr3 PstS (T141H)
39B7	E. coli W3110 tonA ptr3 PstS (D56S)

Construcción de vectores de expresión

Las cepas anteriores se transformaron con el plásmido de expresión de IGF-I pSKIGF-2 utilizando técnicas de transformación estándar. Las secuencias transcripcionales y translacionales requeridas para la expresión del gen IGF-I en E. coli son proporcionadas por el promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia trp Shine-Dalgarno. El terminador transcripcional lambda t_{o} está situado adyacente al codón de terminación IGF-I. La secreción de la proteína desde el citoplasma se dirige por la secuencia señal lamB o alternativamente por la secuencia señal STII. La mayoría de rhIGF-I se encuentra en el espacio periplasmático celular. El plásmido pBKIGF-2 confiere resistencia a la tetraciclina al transformar al huésped.

El plásmido pBKIGF-2 se construyó en varias etapas utilizando como intermedios los plásmidos pLS32Tsc, pLBIGFtsc, pLS33Tsc y pRanTsc.

Etapa A

pLS32Tsc

Etapa 1

pLS32

El plásmido pLS32 provoca la fusión de la secuencia codificadora de IGF-I con la secuencia codificadora de la secuencia señal de la enterotoxina I (STII), estable al calor. Se preparó ligando cuatro fragmentos de ADN tal y como se muestra en la Figura 8. El primero de ellos era el vector pTF2A12 [Paborsky et al., Biochemistry, 28: 8072-8077 (1989)] del cual se había eliminado el pequeño fragmento NsiI-BamHI que contenía el gen factor de tejido. La secuencia señal STII se describe en Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983).

El segundo fragmento era un dúplex sintético de 55 pb que codificaba los primeros 18 aminoácidos de la IGF-I madura. Este dúplex tiene la siguiente secuencia:

3

El tercer fragmento en la ligamiento era un fragmento BstEII-HindIII de 154 pb procedente de pK1ZZIGF-I, que codifica el resto de los aminoácidos 19-70 de la IGF-I; pK1ZZIGF-I es un plásmido resistente a la kanamicina que contiene un promotor lac junto a un promotor de la Proteína A, el cual a su vez está conectado a la señal de la Proteína A, fusionada a dos regiones Z consenso de la Proteína A que unen IgGs y secretan proteínas, acopladas a un gen sintético de IGF-I utilizando dos codones que codifican una interfase Asn-Gly. También contiene una región F para dar un elevado número de copias. Este plásmido es similar al pZZ-IGF-I descrito y mostrado en la Fig. 6 de la publicación EP No.230,869 publicada en 5 de agosto de 1987, donde el gen de la ampicilina se ha reemplazado por un gen de kanamicina.

El último fragmento era un fragmento HindIII-BamHI de 291 pb a partir del plásmido pLS8. Este último fragmento es simplemente la secuencia codificadora del inicio del gen de la tetraciclina de pBR322 [Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 43: 77-90 (1978)] en el cual se introdujo por ingeniería genética una diana de restricción HindIII inmediatamente cadena arriba del codón de inicio de la metionina.

El plásmido resultante, pLS32, expresa eficientemente y secreta rhIGF-I al medio. Las siguientes dos etapas de construcción se realizaron para substituir la secuencia señal STII por la secuencia señal lamB, mejorando el rendimiento del producto.

Etapa 2

pAPlamB

El plásmido pAPlamB se construyó tal y como se muestra en la Figura 9, ligando dos fragmentos de ADN y da como resultado la situación de la secuencia codificadora de la señal lamB cadena abajo del promotor AP y de la secuencia trp Shine-Dalgarno. Se incluyó en la ligamiento el vector pRA1 del cual se había eliminado el pequeño fragmento XbaI-BglII. Este plásmido es un derivado de phGH1 (Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987), conteniendo este último plásmido el promotor AP, la señal STII y el ADN que codifica hGH. pRA1 difiere de phGH1 en el hecho de que contiene ADN que codifica la cadena de relaxina A (la secuencia de la cual se describe en la patente estadounidense Nº. 4,758,516) en vez de hGH y contiene una diana de restricción BglII apropiada cadena abajo respecto al promotor y el sitio de unión a ribosoma. El segundo fragmento en la ligamiento era un dúplex de ADN sintético de 80 pb con la siguiente secuencia, que codifica la secuencia señal lamB, descrita por Clement y Hofnung, Cell, 27: 507-514 (1981):

4

Etapa 3

pLS32lamB

El plásmido pLS32lamB da como resultado la fusión de la secuencia señal de lamB con la región codificadora de IGF-I y se construyó tal y como se muestra en la Figura 10, mediante la ligamiento de tres fragmentos de ADN. El primero de ellos era el vector pLS32 en el cual se había eliminado el pequeño fragmento XbaI-BstEII. El segundo era un fragmento XbaI-EaeI de 75 pb procedente de pAPlamB que codifica la secuencia señal lamB. El tercero era un dúplex de ADN sintético de 55 pb que codifica los 18 primeros aminoácidos de la IGF-I madura y que tiene la siguiente secuencia:

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Las siguientes etapas introducen en el plásmido los terminadores transcripcionales. Estos cambios en el plásmido dieron como resultado un mayor rendimiento de producto.

Etapa 4

pLS33lamB

El plásmido pLS33lamB es un intermedio en la preparación de pLS32Tsc y se construyó tal y como se muestra en la Figura 11 ligando tres fragmentos de ADN. El primero de ellos era el vector pLS32 en el cual se había eliminado el pequeño fragmento XbaI-BstEII. El segundo era un fragmento XbaI-EaeI de 75 pb procedente de pAPlamB que codifica la secuencia señal lamB. El tercero era un dúplex de ADN sintético de 46 pb con la siguiente secuencia:

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La secuencia indicada más arriba codifica los aminoácidos 4-18 de la IGF-I madura.

Etapa 5

pLS33Tsc

El plásmido pLS33Tsc da como resultado la localización del terminador transcripcional lambda to inmediatamente corriente debajo de la secuencia codificadora de IGF-I. Se ligaron tres fragmentos de ADN, tal y como se muestra en la Figura 12, para construir el plásmido. El primer fragmento era el vector pLS32 en el cual se había eliminado el pequeño fragmento XbaI-BstEII. pLS18 es un derivado de phGH1 [Chang et al., supra] que contiene el ADN que codifica la ADNasa humana (tal y como se describe en la patente WO 90/07572, publicada el 12 de julio de 1990) en vez de hGH. El plásmido phGH1 podía utilizarse para generar el mismo fragmento. El fragmento contiene desde la diana de restricción BamHI hasta el extremo 3' del gen de la tetraciclina, faltando aproximadamente 300 pb en el extremo 5' del gen.

\newpage

El segundo fragmento de la ligamiento era un fragmento XbaI-HindIII de 75 pb procedente del plásmido
pLS33lamB en el cual se ha hecho roma la diana de restricción HindIII mediante tratamiento con la polimerasa I de ADN (Klenow).

La tercera parte de la ligamiento era un fragmento StuI-BamHI de 412 pb procedente del plásmido pdH108-4. Este fragmento contiene el terminador transcripcional lambda t_{o} [Scholtissek y Grosse, Nuc. Acids Res., 15: 3185 (1987)] y los pares de bases 2-375 de pBR322 [Sutcliffe, supra], donde dichos pares de bases 2-375 están cadena abajo del extremo 3' del terminador transcripcional. La secuencia de la región terminadora de este fragmento es tal y como sigue:

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Etapa 6

pLS32Tsc

El plásmido final pLS32Tsc se construyó tal y como se muestra en la Figura 13, ligando dos fragmentos de ADN. El primero de ellos era el vector pLS33Tsc a partir del cual se había eliminado el pequeño fragmento EcoRI-BstEII. El segundo era un fragmento EcoRI-BstEII de 550 pb procedente de pLS32lamB que contiene el promotor AP, la secuencia trp Shine-Dalgarno y la secuencia codificadora de la secuencia señal lamB fusionada a los 18 primeros aminoácidos de la IGF-I. El plásmido resultante se analizó mediante digestión con una endonucleasa de restricción. La secuencia promotora y codificadora completas de pLS32Tsc se verificó mediante secuenciación de ADN, obteniéndose la secuencia indicada en la Figura 14 (SEQ. ID. NO. 27). También se proporciona en la Figura 14 la secuencia aminoacídica (SEQ. ID. NO. 28) codificada por la secuencia señal lamB y el ADN de IGF-I en el plásmido pLS32Tsc.

Etapa B

pLBIGFTsc

Etapa 1

pLamBIGF

Para la primera parte de la ligamiento, el fragmento vectorial EcoRI-PstI se aisló a partir de pBR322. Para la segunda parte de la ligamiento, se aisló un fragmento PstI-NcoI de 1244 pb a partir de pAPLamB. Para la tercera parte de la ligamiento, se aisló el fragmento HaeII-EcoRI de 196 pb que contiene el gen IFG-I exceptuando el extremo 5' inicial a partir del plásmido p200. El plásmido p200 es un plásmido derivado de pBR322 que lleva, en dirección de 5' a 3', el promotor de la quelatina, la secuencia señal de la prepro MF alfa I, el ADN que codifica la IGF-I madura y el terminador de 2-micras. Contiene el origen de replicación ColE1 para bacterias y el origen 2-micras para levaduras. En la Figura 15 se proporciona un diagrama de restricción del plásmido p200. En la Figura 16 se proporciona la secuencia nucleotídica (SEQ. ID. NO. 29) del fragmento que va de EcoRI (empezando en la posición 1149) a EcoRI (empezando en la posición 1628) de p200, que contiene el gen de la prepro MF alfa I y del gen de IGF-I. Las dianas de restricción HaeII, PstI, BamHI y SalI, que también están en el diagrama en la Figura 15, se indican mediante subrayado en la secuencia. Se preparó un fragmento de ADN sintético ligando la secuencia señal con el gen IGF-I (NcoI a HaeII) y posee la siguiente secuencia:

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Los tres fragmentos plasmídicos del ADN sintético se ligaron para dar pLamBIGF tal y como se indica en la Figura 17.

Etapa 2

pLBIGFTsc

El fragmento vectorial XbaI-BamHI se aisló de pLS18 como el primer fragmento de ligamiento. La segunda parte de la ligamiento era un fragmento StuI-BamHI de 412 pb procedente del plásmido pdH108-4 descrito más arriba. La tercera parte de la ligamiento se preparó mediante una digestión con EcoRI de pLamBIGF, seguida de un

\hbox{tratamiento}

con el fragmento Klenow de la polimerasa de ADN, seguido por una digestión con Xbal. Se aisló el fragmento resultante de 302 pb. Estos tres fragmentos se ligaron para rendir pLBIGFTsc, tal y como se muestra en la Figura 18.

Etapa C

pRan Tsc

El fragmento vectorial XbaI-BamHI se aisló de pLS18 como el primer fragmento de ligamiento. La segunda parte de la ligamiento era un fragmento StuI-BamHI de 412 pb procedente del plásmido pdH108-4 descrito más arriba. La tercera parte de la ligamiento se preparó a partir de pRANTES. El plásmido pRANTES es un plásmido basado en pBR322 que contiene un fragmento de un conector Xbal seguido por la señal STII, seguida por el ADNc que codifica RANTES [publicado por Schall et al., J. Immunol., 141: 1018 (1988)], seguido de un conector BamHI. El tercer fragmento se preparó por digestión de pRANTES con BamHI, seguido de un tratamiento con el fragmento Klenow de la polimerasa de ADN, seguido por una digestión con Xbal. Se aisló el fragmento de 303 pb resultante. Estos tres fragmentos se ligaron para rendir pRan Tsc, tal y como se muestra en la Figura 19.

Etapa D

pBKIGF-2

Tal y como se muestra en la Figura 20, el fragmento EcoRI-PstI de 540 pb, que contiene el promotor de la fosfatasa alcalina, la secuencia señal lamB y el ADN que codifica los primeros 15 aminoácidos de la IGF-I se separó de pLS32Tsc. El fragmento Pst-Bsp1286I (70 pb) que contiene ADN que codifica los aminoácidos 16-38 de la IGF-I se separó de pLBIGFTsc. El fragmento Bsp1286I-HindIII (-179 pb) que contiene el ADN que codifica los aminoácidos 39-70 de la IGF-I, el terminador lambda y la porción 5' (30 pb) del promotor Tc se separó de pLS33Tsc. Finalmente, el fragmento vectorial EcoRI-HindIII de 4331 pb (basado en pBR322) se separó de pRanTsc. Estos cuatro fragmentos se ligaron para dar pBKIGF-2, que contiene el promotor AP, la secuencia señal lamB, el ADN que codifica la proteína IGF-I completa, el terminador transcripcional, el promotor Tc y los marcadores de resistencia a la tetraciclina y a la ampicilina.

Cultivo

Las cinco cepas transformadas se evaluaron en cultivos en matraces de agitación tal y como sigue. Se inocularon aproximadamente 0,3 ml de un cultivo que ha crecido durante una noche en un medio LB con 10 \mug/ml de tetraciclina en 20 ml de un medio con baja concentración de fosfato, de manera que la densidad celular inicial era de 0,05 (A550) y que la contaminación por fosfato era menor que 0,04 mM. El medio con baja concentración de fosfato contenido requería sales minerales y un 1,1% de Hycase SF más un 0,06% de extracto de levadura. La concentración de fosfato inicial total se estimó como 0,2 mM. La composición del medio era tal y como sigue: 10 \mug/ml de tetraciclina, 1,5 g/l de glucosa, MgSO_{4} 1,6 mM, NH_{4}Cl 20 mM, KCl 50 mM, NaCl 20 mM y trietanolamina 120 mM, pH 7,4. En el caso de cultivos con concentraciones de fosfato inicial mayores, se añadió fosfato inorgánico para conseguir la concentración de fosfato total inicial indicada.

Los cultivos se agitaron a 37ºC en matraces amortiguados de 125 ml durante 24 horas, período de tiempo en el cual habían alcanzado su densidad celular máxima. Se midió la densidad celular (A55O) y se tomaron muestras celulares para analizar la concentración total de IGF-I asociada a la célula. Se aislaron las células mediante centrifugación y el IGF-I asociado a la célula se solubilizó y se extrajo con urea 6 M, DTT 10 mM, EDTA 5 mM y tampón Tris 50 mM, pH 8,0. Entonces se centrifugaron las muestras y se filtraron antes del análisis por HPLC. El análisis por HPLC se llevó a cabo con dos columnas PLRP-S de Polymer Labs en serie a 50ºC utilizando un 0,1% de ácido trifluoroacético y un gradiente de concentración de acetonitrilo entre el 32% y el 45% con una velocidad de flujo de la fase móvil de 1,5 ml/min.

Resultados

La Figura 21 muestra la densidad celular final obtenida para los diversos organismos como una función de la concentración de fosfato inicial en el medio. Tal y como era de esperar, los organismos con las proteínas PstS mutadas no crecieron tan bien en el medio con concentraciones de fosfato bajas, aunque todos los organismos alcanzaron aproximadamente la misma densidad celular a una concentración de fosfato elevada. La Figura 22 presenta los resultados de la HPLC para concentraciones de IGF-I asociado a la célula. Estos resultados también indican que la afinidad disminuida de la proteína PstS por el fosfato ha permitido una mayor acumulación de IGF-I a concentraciones de fosfato mayores (0,6 mM y 1,2 mM de PO_{4} inicial) respecto las que pueden producirse por los organismos con la proteína PstS de tipo salvaje. El mejor productor de los estudiados en este experimento fue T10Y PstS.

Ejemplo III Fermentaciones a elevada densidad celular con cepas mutantes

Para evaluar la utilidad de los mutantes pstS en un caso práctico, se llevaron a cabo experimentos de fermentación. El objetivo era analizar el efecto de una menor afinidad de PstS por fosfato sobre la producción del producto heterólogo, IGF-I, en una fermentación a elevada densidad celular relevante industrialmente. Sería de esperar que la máxima utilidad se llevaría a cabo controlando la corriente de alimentación de fosfato basándose en medidas "on line" de la concentración de fosfato en el medio de crecimiento. Sin embargo, un modo de puesta en práctica más sencillo para la invención sería utilizar una concentración constante pero mayor de alimentación de fosfato con los mutantes pstS que con el organismo de tipo salvaje. Este tipo de experimento se describe en los siguientes párrafos.

Las cepas celulares empleadas en el Ejemplo II para los experimentos en matraces de agitación se transformaron con pBKIGF-2 mediante técnicas de transformación estándar. Los transformantes se seleccionaron y se purificaron en placas LB que contenían 20 mg/L de tetraciclina. Este medio tenía la siguiente composición: 10 g/L de Bacto-Tryptone, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de cloruro sódico y 20 mg/L de tetraciclina-HCl.

Se utilizó una colonia transformada de cada tipo celular para inocular el caldo de cultivo LB estéril que contenía 20 mg/L de tetraciclina. Los cultivos de los matraces se incubaron a 35-39ºC hasta que la densidad óptica a 550 nm alcanzó aproximadamente 1,0. Se añadió DMSO estéril a los cultivos para dar una concentración final de DMSO del 10% (v/v). Se repartieron alícuotas de 1-2 ml en viales estériles y se almacenaron a -60ºC o menos.

Se prepararon los inóculos del fermentador para producir rhIGF-I inoculando 1 ml de cada cultivo congelado 1-OD (A550) en 500 ml de medio LB que contenía 5 \mug/ml de tetraciclina. Estos cultivos se incubaron durante 8 horas en un matraz amortiguado de 2 litros bajo agitación hasta que los cultivos alcanzaron aproximadamente 3 OD. El matraz de agitación se utilizó entonces para inocular un fermentador de 10 l que contenía 6 l de medio de cultivo con la siguiente composición:

(Tabla pasa a página siguiente)

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El proceso de la fermentación se llevó a cabo a 37ºC bajo agitación vigorosa y aireación a pH 7,3, controlándose el pH utilizando adiciones de hidróxido amónico. La velocidad de agitación se fijó a 650-1000 rpm y la velocidad de aireación a 0,7-1,5 volúmenes de aire por volumen de cultivo por minuto. Después de agotarse la glucosa inicial, se alimentó una disolución estéril de glucosa al 50% para mantener el cultivo cercano a su velocidad de crecimiento máxima durante la parte inicial de la fermentación, a una velocidad suficientemente rápida para permitir el crecimiento rápido pero no tan rápido como para provocar que el nivel de oxígeno disuelto disminuya por debajo del 30% de los niveles de saturación del aire durante la porción final de la fermentación (cuando se ha acumulado una masa celular significativa).

A aproximadamente 40 OD (6-9 horas después de la inoculación) se inició una alimentación de nitrógeno complejo. Se utilizaron tres alimentaciones diferentes y se denominaron 1x, 2x y 4x en relación a la proporción aproximada de la cantidad de fosfato distribuida. La siguiente tabla describe las tres alimentaciones:

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Aproximadamente 12 horas después de la inoculación, se agotó el fosfato en el medio y se indujo la producción de IGF-I. Las fermentaciones continuaron hasta 40 horas después de la inoculación, sacándose muestras cada dos horas para determinar el IGF-I total acumulado. Se extrajeron muestras completas de caldo de cultivo con guanidina 6 M HCl y DTT 100 mM en tampón Tris 50 mM, pH 9,0. El IGF-I extraído se ensayó por HPLC utilizando una columna de fase reversa Bakerbond con un gradiente de acetonitrilo al 34-35% en ácido trifluoroacético al 0,1% a 2 ml/min y 50ºC.

La Figura 23 presenta los resultados obtenidos con la alimentación 2x para cuatro de los mutantes pstS respecto el huésped de tipo salvaje. Había un beneficio significativo en la acumulación de IGF-I total con todos los mutantes investigados.

Para una mejor caracterización del rendimiento de los organismos mutados, se comparó el huésped 39B7 transformado con una mutación en D56S pstS con el huésped con la proteína PstS de tipo salvaje, en relación al pico de IGF-I total para tres diferentes velocidades de alimentación de fosfato, a saber 14, 27 y 57 \mumol/min. La Figura 24 muestra que para las tres velocidades de alimentación de fosfato, 39B7/pBKIGF-2 produjo más producto. En el caso del huésped de tipo salvaje, las velocidades de alimentación de fosfato mayores reducieron la acumulación de IGF-I. En el caso del mutante, la mayor acumulación de IGF-I tuvo lugar con la velocidad de alimentación intermedia, lo cual está de acuerdo con el control logrado por la proteína PstS con una afinidad menor por el fosfato. A esta velocidad de alimentación, la acumulación de IGF-I era un 78% mayor para el mutante 39B7 que para 9E4 de tipo salvaje y era un 58% mayor que la acumulación de IGF-I obtenida para el huésped de tipo salvaje a su velocidad de alimentación de fosfato óptima, 14 \mumol/min.

En resumen, la proteína PstS de unión a fosfato periplasmática es un componente del sistema de transporte activo de fosfato en E. coli que está implicado en la regulación de más de veinte genes, al cual se hace referencia como el regulón pho, siendo inducidos dichos genes por limitación de fosfato. Las proteínas PstSCAB y phoU actúan como reguladores negativos de estos genes en condiciones de alta concentración de fosfato.

El papel de la unión de fosfato por PstS en la regulación del regulón pho se determinó ensayando la actividad de la fosfatasa alcalina (PhoA) en cepas que contenían mutaciones en el bolsillo de unión a fosfato de PstS, las cuales se hicieron crecer en una serie de concentraciones de fosfato. La estructura cristalina de PstS implica las cadenas laterales de seis residuos en la unión a fosfato. La importancia de estos residuos se determinó inicialmente mediante mutagénesis de barrido de alanina. La expresión de PhoA permaneció relativamente invariable, de manera que estos residuos se randomizaron individualmente con todas la substituciones posibles y se exploró una actividad mejorada PhoA entre las mezclas mutantes después de crecer en un medio con alta concentración de fosfato. Se aislaron las mutaciones en PstS que conducían a una mayor expresión de PhoA a elevadas concentraciones de fosfato. Estas mutaciones permitieron también una mayor expresión y acumulación de productos heterólogos, por ejemplo IGF-I, en fermentaciones a elevada densidad celular de importancia industrial.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA EL CONTROL DE LA PRODUCCIÓN POLIPEPTÍDICA EN BACTERIAS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 31

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DIRECCIÓN: Genentech, Inc

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 460 Point San Bruno Blvd

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: San Francisco Sur

\vskip0.333000\baselineskip

(D): ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: EEUU

\vskip0.333000\baselineskip

(F): ZIP: 94080

\vskip0.666000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: 5,25 pulg., disquete de 360 Kb

\vskip0.333000\baselineskip

(B): COMPUTADORA: compatible con PC IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: patin (Genentech)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE ENTRADA:

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE ENTRADA:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Hasak, Janet E

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 28,616

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: 752

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 415/225-1896

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TELEX: 910/371-7168

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1400 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 348 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 348 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

14

15

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAATTCTGT CATCTCTTCG TTAT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTGCCCGAGC CATAAGTTAC TCTTCAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACAGGTGCA GGCGCCGCCT CCCCTGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAGGGTATCG GTGGCTCGGG TGGCGTAA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTTGGTGCCT CTGCAGCGCC GCTGT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTGTAGTAC GCGCTGCAGA TGGCT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTACGCCGCG CTGCAGGCTC CGGGA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGCAGATGGC GCCGGGACTT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATGGCTCCG GCGCCTCCTT CGCTT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACAGGTGCA GGCGCCNNST TCCCTGCGCC G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAGGGTATCG GTNNSTCCGG TGGCGTA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTGATTTTG GCGCCTCTNN SGCGCCGCTG TCT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGCGCAGATG GCNNSGGGAC TTCCT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATGGCTCCG GGNNSTCCTT CGCTT

\hfill

25

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCCCGAAA CTCTGTGCGG TGCTGAACTG GTTGACGCTC TGCAGTTTGT

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTGCG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 64 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACGTCCAGGG CTTTGAGACA CGCCACGACT TGACCAACTG CGAGACGTCA

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AACAAACGCC ACTG

\hfill

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 84 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTAGAATTAT GATGATTACT CTGCGCAAAC TTCCTCTGGC GGTTGCCGTC

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCAGCGGGCG TAATGTCTGC TCAGGCCATG GCCA

\hfill

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 84 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTAATACTAC TAATGAGACG CGTTTGAAGG AGACCGCCAA CGGCAGCGTC

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCCCGCATTA CAGACGAGTC CGGTACCGGT CTAG

\hfill

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGCCGGTCCC GAAACTCTGT GCGGTGCTGA ACTGGTTGAC GCTCTGCAGT

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTGTTTGCG

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAGGGCTTT GAGACACGCC ACGACTTGAC CAACTGCGAG ACGTCAAACA

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AACGCCACTG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGCCACTCTG TGCGGTGCTG AACTGGTTGA CGCTCTGCAG TTTGTTTGCG

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGAGACACGC CACGACTTGA CCAACTGCGA GACGTCAAAC AAACGCCACT

\hfill

50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

G

\hfill

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCTAACGCTC GGTTGCCGCC GGGCGTTTTT TATTGTTAA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGATTGCGAG CCAACGGCGG CCCGCAAAAA ATAACAATT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 757 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 94 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 485 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CATGGCCGGT CCGGAAACTC TGTGCGGCGC

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGGCCAGGCC TTTGAGACAC GC

\hfill

22

Claims

1. Molécula de ácido nucleico que codifica una variante de PstS de E. coli seleccionada entre el grupo que consiste en T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS y T141H PstS.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 que codifica T10M PstS, T10Y PstS, D56L PstS o T141H PstS.

3. Células huésped de E. coli que comprenden la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS tipo salvaje de E. coli.

4. Células huésped según la reivindicación 3, en las cuales la molécula de ácido nucleico se integra en el cromosoma de las mismas.

5. Células huésped según la reivindicación 3 que comprenden además una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina.

6. Procedimiento para producir un polipéptido de interés que comprende cultivar células bacterianas que carecen de su gen PstS nativo y que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una variante PstS que tiene una variación de aminoácido en la región de unión a fosfato de la correspondiente PstS nativa, teniendo dicha variante una menor afinidad por fosfato, estando dicha molécula de ácido nucleico bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS de tipo salvaje, y comprendiendo también dichas células bacterianas una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina, teniendo lugar el cultivo en un medio de cultivo con una concentración de fosfato inorgánico en el medio que, durante todas las fases de crecimiento celular, se encuentra por encima de 0,1-10 \muM y teniendo lugar bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el cual la concentración de fosfato inorgánico en todas las fases del crecimiento celular es mayor que aproximadamente 0,5 mM y en el cual la variante pstS es homóloga al gen pstS nativo en las células huésped.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 que comprende además la recuperación del polipéptido a partir del cultivo celular.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el cual el polipéptido se recupera a partir del periplasma o del medio de cultivo.

10. Procedimiento según la reivindicación 6, en el cual el polipéptido es la fosfatasa alcalina.

11. Procedimiento según la reivindicación 6, en el cual el polipéptido es heterólogo a las células bacterianas.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el cual el polipéptido es un polipéptido de mamífero.

13. Procedimiento según la reivindicación 6, en el cual las células bacterianas son células de Enterobacteriaceae.

14. Procedimiento según la reivindicación 6, en el cual la variación de aminoácido en la molécula de ácido nucleico es una substitución de aminoácido.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el cual las células bacterianas son E. coli y en el cual se substituye un residuo hidrofóbico por treonina en la posición 10 de la región de unión a fosfato de la PstS nativa de E. coli o en el cual se substituye una serina por ácido aspártico en la posición 56 de la región de unión a fosfato de la PstS nativa de E. coli.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el cual la molécula de ácido nucleico que codifica una variante de PstS codifica una variante de PstS de E. coli seleccionada entre el grupo que consiste en T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS y T141H PstS bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS tipo salvaje de E. coli.

17. Procedimiento para controlar la velocidad de expresión de un polipéptido en células bacterianas que comprende cultivar células bacterianas que carecen de su gen PstS nativo y que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una variante de PstS que tiene una variación de aminoácido en la región de unión a fosfato de la correspondiente PstS nativa, teniendo dicha variante una afinidad reducida por fosfato, estando dicha molécula de ácido nucleico bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS de tipo salvaje, y comprendiendo también dichas células bacterianas una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés bajo el control transcripcional del promotor de la fosfatasa alcalina, llevándose a cabo el cultivo bajo condiciones en las cuales la concentración del fosfato inorgánico en el medio de cultivo se controla durante la fase de producción de crecimiento celular, de manera que el polipéptido se produce bajo el control transcripcional de un promotor de la fosfatasa alcalina parcialmente inducido.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el cual la concentración de fosfato inorgánico se controla controlando la velocidad de alimentación de fosfato inorgánico en el medio o una fuente de nitrógeno complejo que contiene fosfato inorgánico.

19. Procedimiento según la reivindicación 17, en el cual las células son células de Enterobacteriaceae y la variación de aminoácido en la molécula de ácido nucleico es una substitución de aminoácido.

20. Procedimiento según la reivindicación 17, en el cual la molécula de ácido nucleico que codifica una variante de PstS codifica una variante de PstS de E. coli seleccionada entre el grupo que consiste en T10F PstS, T10L PstS, T10M PstS, T10Y PstS, T10A PstS, T10C PstS, T10G PstS, S38F PstS, D56V PstS, D56A PstS, D56L PstS, D56S PstS, S139T PstS, S139P PstS, S139L PstS y T141H PstS bajo el control transcripcional del promotor del gen pstS tipo salvaje de E. coli.