JPH0753118B2 - 原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法 - Google Patents
原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法Info
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- JPH0753118B2 JPH0753118B2 JP4107284A JP10728492A JPH0753118B2 JP H0753118 B2 JPH0753118 B2 JP H0753118B2 JP 4107284 A JP4107284 A JP 4107284A JP 10728492 A JP10728492 A JP 10728492A JP H0753118 B2 JPH0753118 B2 JP H0753118B2
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- C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分泌された蛋白質をコ
ード化する組換えＤＮＡを含有する原核宿主生物による
ジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質
の立体配座の形成を向上させる方法に関する。
ード化する組換えＤＮＡを含有する原核宿主生物による
ジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質
の立体配座の形成を向上させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】原核宿主生物中での蛋白質合成または翻
訳は、細胞質中のリボソームで行なわれる。細菌宿主生
物中で組換えＤＮＡを発現させる場合には、生じる組換
え遺伝子生産物もしくは細胞質からの蛋白質を細菌の細
胞内膜を通して細胞内膜と細胞外膜との間の細胞周辺腔
中に分泌させることがしばしば望まれる。更に、分泌さ
れた蛋白質は、この細胞周辺腔から、例えば浸透圧ショ
ックによって栄養媒体中に放出されることができる。こ
の方法の１つの欠点は、ジスルフィド架橋された蛋白質
の分泌に際に一般に生来もしくは天然の立体配座を正確
に形成させない、即ち生物学的に不活性であるジスルフ
ィド橋が誤って形成されたかまたは不完全に形成された
ポリペプチドを生じることにある。
訳は、細胞質中のリボソームで行なわれる。細菌宿主生
物中で組換えＤＮＡを発現させる場合には、生じる組換
え遺伝子生産物もしくは細胞質からの蛋白質を細菌の細
胞内膜を通して細胞内膜と細胞外膜との間の細胞周辺腔
中に分泌させることがしばしば望まれる。更に、分泌さ
れた蛋白質は、この細胞周辺腔から、例えば浸透圧ショ
ックによって栄養媒体中に放出されることができる。こ
の方法の１つの欠点は、ジスルフィド架橋された蛋白質
の分泌に際に一般に生来もしくは天然の立体配座を正確
に形成させない、即ち生物学的に不活性であるジスルフ
ィド橋が誤って形成されたかまたは不完全に形成された
ポリペプチドを生じることにある。
【０００３】チオール試薬は、不溶性の蛋白質を試験管
内で再生する方法の場合に使用され、この不溶性の蛋白
質は、組換えＤＮＡを原核細胞中で発現させる際に細胞
質で細胞封入体として生じる。チオール試薬について
は、このチオール試薬が空気酸素の存在下に急速に酸化
されてジスルフィドに変わることが知られている。
内で再生する方法の場合に使用され、この不溶性の蛋白
質は、組換えＤＮＡを原核細胞中で発現させる際に細胞
質で細胞封入体として生じる。チオール試薬について
は、このチオール試薬が空気酸素の存在下に急速に酸化
されてジスルフィドに変わることが知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの課題
は、ジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然の
蛋白質の立体配座の形成を向上させることであった。
は、ジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然の
蛋白質の立体配座の形成を向上させることであった。
【０００５】殊に、誤ってジスルフィド架橋された蛋白
質の部分的にまさに費用にかかる試験管内での再生を、
天然蛋白質の立体配座の形成によって補償しうることで
あった。
質の部分的にまさに費用にかかる試験管内での再生を、
天然蛋白質の立体配座の形成によって補償しうることで
あった。
【０００６】
【問題を解決するための手段】本発明による課題は、原
核宿主生物を適当な栄養媒体中で適当な条件下で組換え
ＤＮＡの発現のために培養する場合、分泌された蛋白質
をコード化する組換えＤＮＡを含有する原核宿主生物に
よるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋
白質の立体配座の形成を向上させる方法によって解決さ
れ、この場合この方法は、１つまたはそれ以上のＳＨ基
を有する還元チオール試薬またはＳＨ基を有する還元チ
オール試薬とジスルフィド基を有する酸化チオール試薬
との混合物０．１〜２０ミリモル／ｌの含量を有する栄
養媒体を使用することによって特徴付けられる。
核宿主生物を適当な栄養媒体中で適当な条件下で組換え
ＤＮＡの発現のために培養する場合、分泌された蛋白質
をコード化する組換えＤＮＡを含有する原核宿主生物に
よるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋
白質の立体配座の形成を向上させる方法によって解決さ
れ、この場合この方法は、１つまたはそれ以上のＳＨ基
を有する還元チオール試薬またはＳＨ基を有する還元チ
オール試薬とジスルフィド基を有する酸化チオール試薬
との混合物０．１〜２０ミリモル／ｌの含量を有する栄
養媒体を使用することによって特徴付けられる。
【０００７】本発明方法によれば、意外なことに、チオ
ール試薬を発酵媒体中に添加することによって正確にジ
スルフィド架橋された蛋白質の収量を上昇させることが
できる。本発明による方法は、１つまたはそれ以上のジ
スルフィド橋を含有する全ての蛋白質の場合に使用する
ことができる。殊に僅かな蛋白質量が必要とされる場
合、例えばｍｇ規模での成長因子（神経成長因子、イン
ターロイキンまたは類縁の化合物）の生産の場合には、
本発明方法の使用によって試験管内での再生を省略する
ことができる。
ール試薬を発酵媒体中に添加することによって正確にジ
スルフィド架橋された蛋白質の収量を上昇させることが
できる。本発明による方法は、１つまたはそれ以上のジ
スルフィド橋を含有する全ての蛋白質の場合に使用する
ことができる。殊に僅かな蛋白質量が必要とされる場
合、例えばｍｇ規模での成長因子（神経成長因子、イン
ターロイキンまたは類縁の化合物）の生産の場合には、
本発明方法の使用によって試験管内での再生を省略する
ことができる。
【０００８】本発明による方法には、１つまたはそれ以
上のチオール試薬０．１〜２０ミリモル／ｌを含有する
栄養媒体が適当であることが判明した。チオール試薬
０．１ミリモル／ｌ未満を含有する栄養媒体を使用する
場合には、天然蛋白質の立体配座の形成が言うに値する
ほど向上しないことが見い出された。チオール濃度の上
限は、約２０ミリモル／ｌであり、かつ分泌された機能
蛋白質の収量の明らかな減少の場合ならびに細胞成長の
強い退行の場合に顕在化する。有利には、１つまたはそ
れ以上のチオール試薬１〜１５ミリモル／ｌの含量、特
に好ましくは３〜１２ミリモル／ｌの含量を有する栄養
媒体が使用される。グルタチオンをチオール試薬として
使用する場合には、約５ミリモル／ｌが最適な濃度であ
ることが判明した。
上のチオール試薬０．１〜２０ミリモル／ｌを含有する
栄養媒体が適当であることが判明した。チオール試薬
０．１ミリモル／ｌ未満を含有する栄養媒体を使用する
場合には、天然蛋白質の立体配座の形成が言うに値する
ほど向上しないことが見い出された。チオール濃度の上
限は、約２０ミリモル／ｌであり、かつ分泌された機能
蛋白質の収量の明らかな減少の場合ならびに細胞成長の
強い退行の場合に顕在化する。有利には、１つまたはそ
れ以上のチオール試薬１〜１５ミリモル／ｌの含量、特
に好ましくは３〜１２ミリモル／ｌの含量を有する栄養
媒体が使用される。グルタチオンをチオール試薬として
使用する場合には、約５ミリモル／ｌが最適な濃度であ
ることが判明した。
【０００９】本明細書中で使用される“チオール試薬”
の概念は、ＳＨ基を有する還元チオール試薬を意味する
か、或いはＳＨ基を有する還元チオール試薬とジスルフ
ィド基を有する酸化チオール試薬との混合物を意味す
る。
の概念は、ＳＨ基を有する還元チオール試薬を意味する
か、或いはＳＨ基を有する還元チオール試薬とジスルフ
ィド基を有する酸化チオール試薬との混合物を意味す
る。
【００１０】還元チオール試薬としては、殊に１分子当
たり唯１個のＳＨ基を有するものが適当である。特に好
ましい物質は、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、システイ
ン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、β−メル
カプトエタノールおよび類縁化合物である。最も多くの
場合に好ましいのは、Ｎ−アセチルシステインおよび還
元グルタチオン（ＧＳＨ）である。チオール試薬は、単
独で使用しても混合物で使用してもよい。
たり唯１個のＳＨ基を有するものが適当である。特に好
ましい物質は、還元グルタチオン（ＧＳＨ）、システイ
ン、Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、β−メル
カプトエタノールおよび類縁化合物である。最も多くの
場合に好ましいのは、Ｎ−アセチルシステインおよび還
元グルタチオン（ＧＳＨ）である。チオール試薬は、単
独で使用しても混合物で使用してもよい。
【００１１】還元チオール試薬を専ら使用することが一
般に有利であるとしても、還元チオール試薬と酸化チオ
ール試薬との混合物の使用により、正確にジスルフィド
架橋された蛋白質の改善された収量がもたらされる。こ
の種の還元チオール試薬と酸化チオール試薬との混合物
を使用する場合には、還元チオール試薬と、酸化チオー
ル試薬とのモル比は、特に２：１〜２０：１、特に有利
に５：１〜１０：１である。還元チオール試薬と酸化チ
オール試薬との混合物は、例えば還元グルタチオン（Ｇ
ＳＨ）およびグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）で
ある。
般に有利であるとしても、還元チオール試薬と酸化チオ
ール試薬との混合物の使用により、正確にジスルフィド
架橋された蛋白質の改善された収量がもたらされる。こ
の種の還元チオール試薬と酸化チオール試薬との混合物
を使用する場合には、還元チオール試薬と、酸化チオー
ル試薬とのモル比は、特に２：１〜２０：１、特に有利
に５：１〜１０：１である。還元チオール試薬と酸化チ
オール試薬との混合物は、例えば還元グルタチオン（Ｇ
ＳＨ）およびグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）で
ある。
【００１２】本発明による方法の１つの例は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉの場合にエロイシネ・コラカナ・ガエルトネリ（El
eusine coracana Gaertneri）（ＲＢＩ）からの２官能
性α−アミラーゼ／トリプシン抑制因子の異種の表現で
ある。抑制因子は、シバラージ（Shivaraj）およびパッ
タビラマン（Pattabiraman）によって特性決定された
（B. Shivaraj & T.N. Pattabiraman, Indian J. Bioch
em. Biophys. 17 (1980),181-193; B. Shivaraj & T.N.
Pattabiraman, Biochem. J. 193 (1981), 29-36）。抑
制因子のアミノ酸配列は、カンポス（Campos）およびリ
チャードソン（Richardson）によって説明された（F.A.
P. Campos & M. Richardson, FEBS Letters 152 (198
3), 300-304）。この蛋白質は、５個の分子内ジスルフ
ィド橋を含有する１２２個のアミノ酸からなり、かつα
−アミラーゼ／トリプシン抑制因子種に属し（Harford
他、Biochim. Biophys. Acta 950 (1988), 435-440）、
この場合この蛋白質は、唯１つの２官能性の代表例であ
る。しかし、この立場から、本発明による方法は、原核
宿主生物の場合に分泌される別のジスルフィド架橋され
た組換え蛋白質（例えば、抗体断片）の取得に転用する
こともできることに注目すべきである。
ｌｉの場合にエロイシネ・コラカナ・ガエルトネリ（El
eusine coracana Gaertneri）（ＲＢＩ）からの２官能
性α−アミラーゼ／トリプシン抑制因子の異種の表現で
ある。抑制因子は、シバラージ（Shivaraj）およびパッ
タビラマン（Pattabiraman）によって特性決定された
（B. Shivaraj & T.N. Pattabiraman, Indian J. Bioch
em. Biophys. 17 (1980),181-193; B. Shivaraj & T.N.
Pattabiraman, Biochem. J. 193 (1981), 29-36）。抑
制因子のアミノ酸配列は、カンポス（Campos）およびリ
チャードソン（Richardson）によって説明された（F.A.
P. Campos & M. Richardson, FEBS Letters 152 (198
3), 300-304）。この蛋白質は、５個の分子内ジスルフ
ィド橋を含有する１２２個のアミノ酸からなり、かつα
−アミラーゼ／トリプシン抑制因子種に属し（Harford
他、Biochim. Biophys. Acta 950 (1988), 435-440）、
この場合この蛋白質は、唯１つの２官能性の代表例であ
る。しかし、この立場から、本発明による方法は、原核
宿主生物の場合に分泌される別のジスルフィド架橋され
た組換え蛋白質（例えば、抗体断片）の取得に転用する
こともできることに注目すべきである。
【００１３】Ｅ．ｃｏｌｉの場合に分泌性ＲＢＩ蛋白質
を官能性の形で取得するために、合成ＲＢＩ遺伝子は、
遺伝子工学的手段を用いてＥ．ｃｏｌｉの外層膜蛋白質
Ａ（ＯｍｐＡ）のシグナル配列に融合され、この融合物
は、組換えプラスミド上でＥ．ｃｏｌｉの場合にラクト
ースプロモーターの制御下に圧縮される。こうして、組
換え蛋白質のポリペプチド鎖は、原核宿主細胞の細胞周
辺腔中に輸送され、この細胞周辺腔中でポリペプチド鎖
は、シグナル配列の分割後にこの細胞画分化の酸化性の
性質のために分子内ジスルフィド橋の形成下に天然蛋白
質に重ねることができる。しかし、この二重化の場合に
は、官能性蛋白質の微少量のみを得ることができる。し
かし、本発明によれば、チオール試薬が栄養媒体中に存
在する場合には、官能性蛋白質の収量を著しく（５倍だ
け）上昇させることができる。
を官能性の形で取得するために、合成ＲＢＩ遺伝子は、
遺伝子工学的手段を用いてＥ．ｃｏｌｉの外層膜蛋白質
Ａ（ＯｍｐＡ）のシグナル配列に融合され、この融合物
は、組換えプラスミド上でＥ．ｃｏｌｉの場合にラクト
ースプロモーターの制御下に圧縮される。こうして、組
換え蛋白質のポリペプチド鎖は、原核宿主細胞の細胞周
辺腔中に輸送され、この細胞周辺腔中でポリペプチド鎖
は、シグナル配列の分割後にこの細胞画分化の酸化性の
性質のために分子内ジスルフィド橋の形成下に天然蛋白
質に重ねることができる。しかし、この二重化の場合に
は、官能性蛋白質の微少量のみを得ることができる。し
かし、本発明によれば、チオール試薬が栄養媒体中に存
在する場合には、官能性蛋白質の収量を著しく（５倍だ
け）上昇させることができる。
【００１４】本発明による方法の宿主生物は、原核宿主
生物である。有利に組換え蛋白質の発現は、グラム陰性
原核宿主生物中、特に有利にＥ．ｃｏｌｉ中で実施され
る。本発明による方法の場合には、一般に、分泌された
蛋白質をコード化する組換えＤＮＡが細菌の細胞内膜へ
の浸透のためにシグナルペプチドをコード化するＤＮＡ
断片と操作的に結合していることは、有利である。本発
明の範囲内で“操作的結合”の概念は、異種蛋白質とシ
グナルペプチドとの間に翻訳融合が存在することを意味
する。この場合、シグナルペプチドは、通常、翻訳融合
のＮ−末端含量を形成する。シグナルペプチドそれ自体
の種類は、シグナルペプチドが組換え蛋白質の分泌を可
能にすることを除いて、重要なことではない。多数のこ
の種のシグナルペプチドは、分子生物学の分野の当業者
に知られている。一連のシグナルペプチドは、例えばウ
ィンアッカー（Winnacker）(Gene und Klone, Eine Ein
fuehrung in die Gentechnologie, Verlag Chemie Wein
heim (1985)、第２５６頁)の場合に挙げられている。宿
主生物としてのＥ．ｃｏｌｉの際に本発明による方法を
実施した場合には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡ蛋白質から
のシグナルペプチドは、特に適当であることが判明し
た。
生物である。有利に組換え蛋白質の発現は、グラム陰性
原核宿主生物中、特に有利にＥ．ｃｏｌｉ中で実施され
る。本発明による方法の場合には、一般に、分泌された
蛋白質をコード化する組換えＤＮＡが細菌の細胞内膜へ
の浸透のためにシグナルペプチドをコード化するＤＮＡ
断片と操作的に結合していることは、有利である。本発
明の範囲内で“操作的結合”の概念は、異種蛋白質とシ
グナルペプチドとの間に翻訳融合が存在することを意味
する。この場合、シグナルペプチドは、通常、翻訳融合
のＮ−末端含量を形成する。シグナルペプチドそれ自体
の種類は、シグナルペプチドが組換え蛋白質の分泌を可
能にすることを除いて、重要なことではない。多数のこ
の種のシグナルペプチドは、分子生物学の分野の当業者
に知られている。一連のシグナルペプチドは、例えばウ
ィンアッカー（Winnacker）(Gene und Klone, Eine Ein
fuehrung in die Gentechnologie, Verlag Chemie Wein
heim (1985)、第２５６頁)の場合に挙げられている。宿
主生物としてのＥ．ｃｏｌｉの際に本発明による方法を
実施した場合には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡ蛋白質から
のシグナルペプチドは、特に適当であることが判明し
た。
【００１５】原核宿主生物の場合の発現のためには、分
泌された蛋白質をコード化する組換えＤＮＡは、宿主の
転写系によって認識される発現シグナルもしくはプロモ
ーターの制御下に存在しなければならない。原核宿主細
胞中で活性のこの種の発現シグナルは、分子生物学の分
野の当業者に知られている。特に、本発明による方法に
は、誘発可能な発現シグナルが使用される。誘導可能な
Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターの例は、イソプロピル−β
−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能であ
るラクトースプロモーター、ならびにラクトースプロモ
ーターの合成誘導体（例えば、ｔａｃ−プロモーターま
たはｔｒｃ−プロモーター）である。
泌された蛋白質をコード化する組換えＤＮＡは、宿主の
転写系によって認識される発現シグナルもしくはプロモ
ーターの制御下に存在しなければならない。原核宿主細
胞中で活性のこの種の発現シグナルは、分子生物学の分
野の当業者に知られている。特に、本発明による方法に
は、誘発可能な発現シグナルが使用される。誘導可能な
Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターの例は、イソプロピル−β
−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能であ
るラクトースプロモーター、ならびにラクトースプロモ
ーターの合成誘導体（例えば、ｔａｃ−プロモーターま
たはｔｒｃ−プロモーター）である。
【００１６】ジスルフィド架橋された分泌蛋白質をコー
ド化する組換えＤＮＡは、一般に形質転換によって原核
宿主細胞中に導入される。種々の原核宿主生物を形質転
換する方法は、当業者に公知であり、したがって詳細を
記載することは不必要である。この場合形質転換された
宿主細胞中に存在する組換えＤＮＡは、通常、組換えベ
クター上に存在し、この組換えベクターは、宿主細胞の
場合に染色体外（例えば、プラスミド）で存在すること
ができるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込んで（例
えば、細菌ファージλ）存在することができる。有利に
は、ベクターとしてプラスミドが使用される。この場
合、このベクターは、本発明による方法にとっては重要
なものではなく、その際の本発明による方法の場合に
は、特殊なプラスミドを発現ベクターとして使用する。
宿主細胞の望ましい蛋白質をコード化する組換えＤＮＡ
を十分な程度に転写しかつ翻訳することができることの
みが問題である。しかし、組換えＤＮＡの翻訳生産物
は、細菌の内膜を通して細胞周辺腔中への分泌を可能に
する形で存在することができる。
ド化する組換えＤＮＡは、一般に形質転換によって原核
宿主細胞中に導入される。種々の原核宿主生物を形質転
換する方法は、当業者に公知であり、したがって詳細を
記載することは不必要である。この場合形質転換された
宿主細胞中に存在する組換えＤＮＡは、通常、組換えベ
クター上に存在し、この組換えベクターは、宿主細胞の
場合に染色体外（例えば、プラスミド）で存在すること
ができるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込んで（例
えば、細菌ファージλ）存在することができる。有利に
は、ベクターとしてプラスミドが使用される。この場
合、このベクターは、本発明による方法にとっては重要
なものではなく、その際の本発明による方法の場合に
は、特殊なプラスミドを発現ベクターとして使用する。
宿主細胞の望ましい蛋白質をコード化する組換えＤＮＡ
を十分な程度に転写しかつ翻訳することができることの
みが問題である。しかし、組換えＤＮＡの翻訳生産物
は、細菌の内膜を通して細胞周辺腔中への分泌を可能に
する形で存在することができる。
【００１７】上記したように、通常、シグナル配列と融
合されている組換えＤＮＡは、原核宿主細胞の周辺腔中
へ翻訳される。しかし、一定の宿主菌株を使用する場合
には、細胞周辺腔中への分泌が行なわれるだけでなく、
栄養媒体中への実質的な蛋白質の分泌も行なわれる。欧
州特許出願公開第０３３８４１０号明細書には、この種
の栄養媒体中への実質的な蛋白質分泌の状態にあるＥ．
ｃｏｌｉ菌株およびこの種の菌株の製造法が開示されて
いる。この分泌型突然変異体を製造するための出発菌株
として、有利には欧州特許出願公開第０３３８４１０号
明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＳ４１０（ＤＳＭ４
５１３）もしくはＢＷ７２６１（ＤＳＭ５２３１）が使
用される。
合されている組換えＤＮＡは、原核宿主細胞の周辺腔中
へ翻訳される。しかし、一定の宿主菌株を使用する場合
には、細胞周辺腔中への分泌が行なわれるだけでなく、
栄養媒体中への実質的な蛋白質の分泌も行なわれる。欧
州特許出願公開第０３３８４１０号明細書には、この種
の栄養媒体中への実質的な蛋白質分泌の状態にあるＥ．
ｃｏｌｉ菌株およびこの種の菌株の製造法が開示されて
いる。この分泌型突然変異体を製造するための出発菌株
として、有利には欧州特許出願公開第０３３８４１０号
明細書に記載のＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＳ４１０（ＤＳＭ４
５１３）もしくはＢＷ７２６１（ＤＳＭ５２３１）が使
用される。
【００１８】本発明による方法の栄養媒体として、有利
には完全媒体、殊に細胞エキスからの物質または物質混
合物を含有する媒体が使用される。このような媒体の１
例は、酵素により消化された細胞エキス（バクト−トリ
プトンおよびイーストエキス）からの物質混合物を含有
するＬＢ媒体である。
には完全媒体、殊に細胞エキスからの物質または物質混
合物を含有する媒体が使用される。このような媒体の１
例は、酵素により消化された細胞エキス（バクト−トリ
プトンおよびイーストエキス）からの物質混合物を含有
するＬＢ媒体である。
【００１９】栄養媒体のｐＨ値は、特にｐＨ５〜ｐＨ９
の範囲内にある。特に有利には、栄養媒体のｐＨ値は６
〜８の間にある。ＬＢ媒体を栄養媒体として使用する場
合には、媒体の製造の際にｐＨ値を７．４に調節するこ
とが有利であることが判明した。更に、細胞成長の間、
媒体のｐＨ値は減少し、経験によれば、不変に１晩培養
した場合（細胞の収穫時点）には、約６．８である。
の範囲内にある。特に有利には、栄養媒体のｐＨ値は６
〜８の間にある。ＬＢ媒体を栄養媒体として使用する場
合には、媒体の製造の際にｐＨ値を７．４に調節するこ
とが有利であることが判明した。更に、細胞成長の間、
媒体のｐＨ値は減少し、経験によれば、不変に１晩培養
した場合（細胞の収穫時点）には、約６．８である。
【００２０】本発明による方法は、特に完全媒体中の振
盪培地中で実施される。しかし、宿主生物を強力に通気
される発酵器中または／および最少培地の存在下に培養
することも可能である。
盪培地中で実施される。しかし、宿主生物を強力に通気
される発酵器中または／および最少培地の存在下に培養
することも可能である。
【００２１】本発明による方法のもう１つの実施態様
は、さらに栄養媒体に原核宿主生物によって代謝される
ことのない１つまたはそれ以上の単糖類または／および
オリゴ糖類を添加することにある。即ち、バウデン（Bo
wden）およびジョオジオ（Georgiou）の文献（J. Biol.
Chem. 265 (1990), 16760-16766）から、代謝不可能な
糖の添加により天然の蛋白質の形質転換の形成が要求さ
れうることは公知である。本発明による方法の範囲内で
この代謝不可能な糖の付加的な使用により、分泌された
蛋白質からの天然蛋白質の形質転換の際にさらに支持さ
れる効果が示される。代謝不可能な糖の例は、例えばソ
ルボース（単糖類）、サッカロース（二糖類）およびラ
フィノース（三糖類）である。栄養媒体中での代謝不可
能な単糖類または／およびオリゴ糖類の濃度は、本発明
による方法にとって有利には０．１モル／ｌ〜１モル／
ｌの間、特に０．３モル／ｌ〜０．７モル／ｌの間にあ
る。
は、さらに栄養媒体に原核宿主生物によって代謝される
ことのない１つまたはそれ以上の単糖類または／および
オリゴ糖類を添加することにある。即ち、バウデン（Bo
wden）およびジョオジオ（Georgiou）の文献（J. Biol.
Chem. 265 (1990), 16760-16766）から、代謝不可能な
糖の添加により天然の蛋白質の形質転換の形成が要求さ
れうることは公知である。本発明による方法の範囲内で
この代謝不可能な糖の付加的な使用により、分泌された
蛋白質からの天然蛋白質の形質転換の際にさらに支持さ
れる効果が示される。代謝不可能な糖の例は、例えばソ
ルボース（単糖類）、サッカロース（二糖類）およびラ
フィノース（三糖類）である。栄養媒体中での代謝不可
能な単糖類または／およびオリゴ糖類の濃度は、本発明
による方法にとって有利には０．１モル／ｌ〜１モル／
ｌの間、特に０．３モル／ｌ〜０．７モル／ｌの間にあ
る。
【００２２】本発明による方法のもう１つの特に好まし
い実施態様は、宿主生物中で分泌すべきジスルフィド架
橋された蛋白質をコード化する組換えＤＮＡの発現と一
緒に蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の超発現を
実施することにある。有利には、グラム陰性細菌類から
の蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子、特に有利に
はＥ．ｃｏｌｉからの蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ
遺伝子が使用される。この種の遺伝子のＤＮＡ配列は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。
い実施態様は、宿主生物中で分泌すべきジスルフィド架
橋された蛋白質をコード化する組換えＤＮＡの発現と一
緒に蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の超発現を
実施することにある。有利には、グラム陰性細菌類から
の蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子、特に有利に
はＥ．ｃｏｌｉからの蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ
遺伝子が使用される。この種の遺伝子のＤＮＡ配列は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。
【００２３】意外なことに、栄養媒体中へのチオール試
薬の添加と組み合わせた宿主に固有の蛋白質ジスルフィ
ドイソメラーゼ遺伝子の同時発現および同時分泌によ
り、チオール試薬を添加した際の専らの作用をなお凌駕
する、分泌された官能性蛋白質の収量の向上が惹起され
ることが確認された。これとは異なり、蛋白質ジスルフ
ィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の専らの同時発現は、チオ
ール試薬の添加なしでは収量の増大を全く生じなかっ
た。
薬の添加と組み合わせた宿主に固有の蛋白質ジスルフィ
ドイソメラーゼ遺伝子の同時発現および同時分泌によ
り、チオール試薬を添加した際の専らの作用をなお凌駕
する、分泌された官能性蛋白質の収量の向上が惹起され
ることが確認された。これとは異なり、蛋白質ジスルフ
ィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の専らの同時発現は、チオ
ール試薬の添加なしでは収量の増大を全く生じなかっ
た。
【００２４】本発明によれば、“超発現”の概念は、そ
のつど使用された原核宿主生物の野生種と比較して蛋白
質ジスルフィドイソメラーゼ発現の向上を意味する。こ
の種の超発現は、例えば蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼ遺伝子が（例えば、ラクトースプロモーターまたはそ
の誘導体の）特に誘発可能な強い発現シグナルの制御下
に存在することによって達成することができる。特に、
ＰＤＩ遺伝子の超発現は、シグナルペプチドとの“操作
的結合”の場合に細菌の内膜への浸透のために行なわれ
る。この目的のために、特に有利には天然のＰＤＩシグ
ナル配列が使用される。
のつど使用された原核宿主生物の野生種と比較して蛋白
質ジスルフィドイソメラーゼ発現の向上を意味する。こ
の種の超発現は、例えば蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼ遺伝子が（例えば、ラクトースプロモーターまたはそ
の誘導体の）特に誘発可能な強い発現シグナルの制御下
に存在することによって達成することができる。特に、
ＰＤＩ遺伝子の超発現は、シグナルペプチドとの“操作
的結合”の場合に細菌の内膜への浸透のために行なわれ
る。この目的のために、特に有利には天然のＰＤＩシグ
ナル配列が使用される。
【００２５】本発明による方法の１つの実施態様の場合
には、例えば分泌すべき蛋白質をコード化する組換えＤ
ＮＡおよび蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子は、
宿主細胞中の唯１つの発現ベクター上に存在することが
できる。この発現ベクターは、特に染色体外ベクター、
即ちプラスミドであるが、しかし発現ベクターは、宿主
細胞の染色体中に組み込まれて存在することができる
（例えば、λファージ）。唯１つの発現ベクターを使用
する場合には、組換えＤＮＡおよび蛋白質ジスルフィド
イソメラーゼ遺伝子は、唯１つの発現シグナルの制御下
に、即ちディシストロニックオペロン(dicistronischen
Operon)の形で存在するのが有利である。
には、例えば分泌すべき蛋白質をコード化する組換えＤ
ＮＡおよび蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子は、
宿主細胞中の唯１つの発現ベクター上に存在することが
できる。この発現ベクターは、特に染色体外ベクター、
即ちプラスミドであるが、しかし発現ベクターは、宿主
細胞の染色体中に組み込まれて存在することができる
（例えば、λファージ）。唯１つの発現ベクターを使用
する場合には、組換えＤＮＡおよび蛋白質ジスルフィド
イソメラーゼ遺伝子は、唯１つの発現シグナルの制御下
に、即ちディシストロニックオペロン(dicistronischen
Operon)の形で存在するのが有利である。
【００２６】しかし、他面分泌すべき蛋白質をコード化
する組換えＤＮＡおよび蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼ遺伝子は、それぞれ固有の発現シグナル（プロモータ
ー）の制御下に２個の互いに適合する染色体外の発現ベ
クター上に存在することが可能である。
する組換えＤＮＡおよび蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼ遺伝子は、それぞれ固有の発現シグナル（プロモータ
ー）の制御下に２個の互いに適合する染色体外の発現ベ
クター上に存在することが可能である。
【００２７】更に、本発明は、図１および図２に関連し
て次の例およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜５によって明
示される。
て次の例およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜５によって明
示される。
【００２８】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ＲＢＩおよび
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０からの蛋白質ジスルフィドイ
ソメラーゼ（ＰＤＩ）の同時発現のために使用されるプ
ラスミドｐＲＢＩａｌ−ＰＤＩのＤＮＡ配列を示す。
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０からの蛋白質ジスルフィドイ
ソメラーゼ（ＰＤＩ）の同時発現のために使用されるプ
ラスミドｐＲＢＩａｌ−ＰＤＩのＤＮＡ配列を示す。
【００２９】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ＯｍｐＡ／Ｒ
ＢＩ遺伝子の配列を示す。二重鎖ＤＮＡは、１４個の合
成オリゴヌクレオチドから構成され、かつ制限切断位置
ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって制限される。配
列プロトコル中に示されたＤＮＡ鎖は、７個のオリゴヌ
クレオチドから構成されており、このオリゴヌクレオチ
ドは、次の断片に相当する： １：塩基 ２〜 ６２ ２：塩基 ６３〜１２６ ３：塩基 １２７〜１９５ ４：塩基 １９６〜２５８ ５：塩基 ２５９〜３２２ ６：塩基 ３２３〜３９６ ７：塩基 ３９７〜４５５ 対向鎖は、同様に７個のオリゴヌクレオチドから形成さ
れ、このオリゴヌクレオチドは、示されたＤＮＡ鎖の次
の断片が補足される： ８ ：塩基 ６〜 ６８ ９ ：塩基 ６９〜１３２ １０：塩基 １３３〜２０１ １１：塩基 ２０２〜２６４ １２：塩基 ２６５〜３２８ １３：塩基 ３２９〜４０２ １４：塩基 ４０３〜４５９ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、天然のシグナル配列および
染色体結合位置を有する蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼ遺伝子の配列を示す。
ＢＩ遺伝子の配列を示す。二重鎖ＤＮＡは、１４個の合
成オリゴヌクレオチドから構成され、かつ制限切断位置
ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって制限される。配
列プロトコル中に示されたＤＮＡ鎖は、７個のオリゴヌ
クレオチドから構成されており、このオリゴヌクレオチ
ドは、次の断片に相当する： １：塩基 ２〜 ６２ ２：塩基 ６３〜１２６ ３：塩基 １２７〜１９５ ４：塩基 １９６〜２５８ ５：塩基 ２５９〜３２２ ６：塩基 ３２３〜３９６ ７：塩基 ３９７〜４５５ 対向鎖は、同様に７個のオリゴヌクレオチドから形成さ
れ、このオリゴヌクレオチドは、示されたＤＮＡ鎖の次
の断片が補足される： ８ ：塩基 ６〜 ６８ ９ ：塩基 ６９〜１３２ １０：塩基 １３３〜２０１ １１：塩基 ２０２〜２６４ １２：塩基 ２６５〜３２８ １３：塩基 ３２９〜４０２ １４：塩基 ４０３〜４５９ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、天然のシグナル配列および
染色体結合位置を有する蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼ遺伝子の配列を示す。
【００３０】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ＰＤＩ遺伝子
の増殖のためのＮ−末端プライマーを示す。
の増殖のためのＮ−末端プライマーを示す。
【００３１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、ＰＤＩ遺伝子
の増殖のためのＣ−末端プライマーを示す。
の増殖のためのＣ−末端プライマーを示す。
【００３２】
例１ 遺伝子合成 注釈：分子遺伝学的技術は、マニアティス（Maniatis）
他（Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1982),
Cold Spring Harbor Laboratory, New York）の方法に
基づくものであった。オリゴヌクレオチドをホスホルア
ミダイト方法(Sinha他，Nucl. Acids. Res. 12 (1984),
4539-4557; B. E. Kaplan, Trends Biotechnol. 3 (198
5), 253〜256）によりアプライド バイオシステムズ社
（ Applied Biosystems GmbH）の自動合成装置 型式３
８０Ａ上で製造した。
他（Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1982),
Cold Spring Harbor Laboratory, New York）の方法に
基づくものであった。オリゴヌクレオチドをホスホルア
ミダイト方法(Sinha他，Nucl. Acids. Res. 12 (1984),
4539-4557; B. E. Kaplan, Trends Biotechnol. 3 (198
5), 253〜256）によりアプライド バイオシステムズ社
（ Applied Biosystems GmbH）の自動合成装置 型式３
８０Ａ上で製造した。
【００３３】ＯｍｐＡシグナル配列とＲＢＩとの間の融
合をコード化する合成遺伝子を１４個の合成オリゴヌク
レオチドから構成させた（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド／尿素ゲル電
気泳動法によって精製し、かつ遺伝子の５′末端および
３′末端の２つの上方に存在するオリゴヌクレオチドを
取り出すことによりそれぞれ５′末端で燐酸化した。そ
の後に、全部のオリゴヌクレオチドを等モル比で精製
し、唯１つの配合物中でハイブリッド形成し、かつ結合
した。この遺伝子は制限部位ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩによって制限される。ＯｍｐＡシグナル配列のアミ
ノ酸は、負の記号で示される。
合をコード化する合成遺伝子を１４個の合成オリゴヌク
レオチドから構成させた（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド／尿素ゲル電
気泳動法によって精製し、かつ遺伝子の５′末端および
３′末端の２つの上方に存在するオリゴヌクレオチドを
取り出すことによりそれぞれ５′末端で燐酸化した。そ
の後に、全部のオリゴヌクレオチドを等モル比で精製
し、唯１つの配合物中でハイブリッド形成し、かつ結合
した。この遺伝子は制限部位ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩによって制限される。ＯｍｐＡシグナル配列のアミ
ノ酸は、負の記号で示される。
【００３４】例２ 表現プラスミドｐＲＢＩａ １ の構成 例１により得られた合成遺伝子を制限部位ＸｂａＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩを介して表現プラスミドｐＡＳＫ４０
（Skerra他, BIO/TECHNOLGY 9 (1991),273-278）中にク
ローン化した。合成遺伝子の配列をジデソキシ配列決定
によって試験した。生じるプラスミドは、ｐＲＢＩａ１
で表わされる。
びＨｉｎｄＩＩＩを介して表現プラスミドｐＡＳＫ４０
（Skerra他, BIO/TECHNOLGY 9 (1991),273-278）中にク
ローン化した。合成遺伝子の配列をジデソキシ配列決定
によって試験した。生じるプラスミドは、ｐＲＢＩａ１
で表わされる。
【００３５】例３ Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔中でのＲＢＩの官能的発現 ｐＲＢＩａ１で形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ
８３（Yannish-Perron他, Gene 33 (1985), 103〜119）
の１晩静置培養した培養液を１：１００の割合でＬＢ媒
体２．５ｌ（バクト−トリプシン１０ｇ（Difco Factor
ies, Detroit,Michigan, USA）、イースト菌エキス５ｇ
（Difco Factories）およびＮａＣｌ５ｇ，ｐＨ７．４
を含有するＬＢ媒体１ｌ）中でアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）で希釈し、かつ１．０のＯＤ550が達成され
るまで２６℃で振盪した。その後に、この培養液を９個
の同じ２５０ｍｌの分量に分割し、全ての培養液をＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド；最終的濃
度１ミリモル／ｌ）と一緒に誘発させたが、しかし種々
の量のグルタチオン（ＧＳＨ）を添加した。細胞を１晩
中、２６℃でさらに振盪し、遠心分離によって収穫した
（Sorvall SS34,４℃，５０００ｒｐｍ，１５分間）。
その後に、この細胞を４℃でトリス／ＨＣｌ １００ミ
リモル／ｌ，ｐＨ７．５、Ｎａ−ＥＤＴＡ ２０ミリモ
ル／ｌ中に入れ、こうしてそれぞれ２００（ＯＤ550）
の細胞密度を得た。その上、この細胞をフレンチプレス
の細胞プレス（Aminco）中で１８０００ｐｓｉで溶解し
た。この溶解液を遠心分離し（Sorvall SS34,４℃，１
５０００ｒｐｍ，３０分間）、可溶性の上澄み液を可溶
性の官能性ＲＢＩの含量について試験した。
８３（Yannish-Perron他, Gene 33 (1985), 103〜119）
の１晩静置培養した培養液を１：１００の割合でＬＢ媒
体２．５ｌ（バクト−トリプシン１０ｇ（Difco Factor
ies, Detroit,Michigan, USA）、イースト菌エキス５ｇ
（Difco Factories）およびＮａＣｌ５ｇ，ｐＨ７．４
を含有するＬＢ媒体１ｌ）中でアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）で希釈し、かつ１．０のＯＤ550が達成され
るまで２６℃で振盪した。その後に、この培養液を９個
の同じ２５０ｍｌの分量に分割し、全ての培養液をＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド；最終的濃
度１ミリモル／ｌ）と一緒に誘発させたが、しかし種々
の量のグルタチオン（ＧＳＨ）を添加した。細胞を１晩
中、２６℃でさらに振盪し、遠心分離によって収穫した
（Sorvall SS34,４℃，５０００ｒｐｍ，１５分間）。
その後に、この細胞を４℃でトリス／ＨＣｌ １００ミ
リモル／ｌ，ｐＨ７．５、Ｎａ−ＥＤＴＡ ２０ミリモ
ル／ｌ中に入れ、こうしてそれぞれ２００（ＯＤ550）
の細胞密度を得た。その上、この細胞をフレンチプレス
の細胞プレス（Aminco）中で１８０００ｐｓｉで溶解し
た。この溶解液を遠心分離し（Sorvall SS34,４℃，１
５０００ｒｐｍ，３０分間）、可溶性の上澄み液を可溶
性の官能性ＲＢＩの含量について試験した。
【００３６】得られた可溶性上澄み液５μｌをそれぞれ
１５％のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分離した
（Fling & Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986) 83-
88）。分離した蛋白質を電気溶離によってニトロセルロ
ース膜上に移し、ＲＢＩバンドをＲＢＩイエウサギ抗体
を用いて免疫特異的に着色した。免疫ブロッティングを
ブレイク（Blake)他，Anal. Biochem. １３６（１９８
４），１７５〜１７９により実施した。
１５％のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分離した
（Fling & Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986) 83-
88）。分離した蛋白質を電気溶離によってニトロセルロ
ース膜上に移し、ＲＢＩバンドをＲＢＩイエウサギ抗体
を用いて免疫特異的に着色した。免疫ブロッティングを
ブレイク（Blake)他，Anal. Biochem. １３６（１９８
４），１７５〜１７９により実施した。
【００３７】図１は、免疫ブロッティングによる可溶性
ＲＢＩの発現収量の分析を示す。痕跡１は、分子量標準
を表わす。痕跡２の場合には、エロイシネ・コラカナ・
ガエルトネリ（Eleusine coracana Gaertneri）からの
精製されたＲＢＩ ０．８μｇを塗布した。痕跡３〜６
上には、等量の細胞エキスをグルタチオンの種々の添加
量と一緒に塗布した。痕跡３の場合には、培地に対して
ＧＳＨの添加を行なわなかった。痕跡４、５および６の
場合には、培地にＧＳＨ １ミリモル／ｌ、５ミリモル
／ｌもしくは１０ミリモル／ｌを添加した。
ＲＢＩの発現収量の分析を示す。痕跡１は、分子量標準
を表わす。痕跡２の場合には、エロイシネ・コラカナ・
ガエルトネリ（Eleusine coracana Gaertneri）からの
精製されたＲＢＩ ０．８μｇを塗布した。痕跡３〜６
上には、等量の細胞エキスをグルタチオンの種々の添加
量と一緒に塗布した。痕跡３の場合には、培地に対して
ＧＳＨの添加を行なわなかった。痕跡４、５および６の
場合には、培地にＧＳＨ １ミリモル／ｌ、５ミリモル
／ｌもしくは１０ミリモル／ｌを添加した。
【００３８】抗体として、標準法（例えば、Sambrook
他, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第１８章）に
よりニュージーランド産イエウサギをエロイシネ・コラ
カナ・ガエルトネリ（Eleusinecoracana Gaertneri）か
らの精製されたＲＢＩで２回免疫することによって得ら
れたポリクローナル抗ＲＢＩ抗血清を使用した。
他, Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第１８章）に
よりニュージーランド産イエウサギをエロイシネ・コラ
カナ・ガエルトネリ（Eleusinecoracana Gaertneri）か
らの精製されたＲＢＩで２回免疫することによって得ら
れたポリクローナル抗ＲＢＩ抗血清を使用した。
【００３９】図１から明らかなように、ＧＳＨの添加に
より、免疫特異的に着色されたバンドの強さは増強され
た。このことは、特にＧＳＨ ５ミリモル／ｌおよび１
０ミリモル／ｌの濃度の際に明らかである。
より、免疫特異的に着色されたバンドの強さは増強され
た。このことは、特にＧＳＨ ５ミリモル／ｌおよび１
０ミリモル／ｌの濃度の際に明らかである。
【００４０】牛の膵臓からのトリプシンに対する阻害活
性を測定することによって、ＲＢＩ量を得られた細胞エ
キスの可溶性の割合で定量的に測定した。細胞内の官能
的抑制因子の量を記載した媒体の添加なしに発現に比し
て５倍まで上昇させることができることが判明した（第
１表）。
性を測定することによって、ＲＢＩ量を得られた細胞エ
キスの可溶性の割合で定量的に測定した。細胞内の官能
的抑制因子の量を記載した媒体の添加なしに発現に比し
て５倍まで上昇させることができることが判明した（第
１表）。
【００４１】更に、還元グルタチオン（ＧＳＨ）とグル
タチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）との混合物の添加に
よって官能的抑制因子の収量の改善が得られることは、
明らかである。
タチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）との混合物の添加に
よって官能的抑制因子の収量の改善が得られることは、
明らかである。
【００４２】全ての実施された試験の場合、牛の膵臓か
らのトリプシン５μｇをＮａＣｌ１００ミリモル／ｌ、
トリス／ＨＣｌ ５０ミリモル／ｌ ｐＨ８．０、Ｃａ
Ｃｌ2 １０ミリモル／ｌ、トリトン（Triton）Ｘ−１
００ ０．００５％ １ｍｌ中で測定すべき量のＲＢＩ
と一緒に２５℃で３０分間インキュベートした。Ｎ−α
−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトラニド１０ｍ
ｌ／ｌ ２０μｌ（色素原試験物質）の添加後、トリプ
シンの残留活性を吸着の時間的増大の制御によって４０
５ｎｍで測定した。この試験の場合の抑制因子濃度を遊
離酵素（抑制因子の添加なし）の活性とそのつど測定さ
れた残留活性との間の差から測定した。
らのトリプシン５μｇをＮａＣｌ１００ミリモル／ｌ、
トリス／ＨＣｌ ５０ミリモル／ｌ ｐＨ８．０、Ｃａ
Ｃｌ2 １０ミリモル／ｌ、トリトン（Triton）Ｘ−１
００ ０．００５％ １ｍｌ中で測定すべき量のＲＢＩ
と一緒に２５℃で３０分間インキュベートした。Ｎ−α
−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトラニド１０ｍ
ｌ／ｌ ２０μｌ（色素原試験物質）の添加後、トリプ
シンの残留活性を吸着の時間的増大の制御によって４０
５ｎｍで測定した。この試験の場合の抑制因子濃度を遊
離酵素（抑制因子の添加なし）の活性とそのつど測定さ
れた残留活性との間の差から測定した。
【００４３】第１表は、ＧＳＨもしくはＧＳＨとＧＳＳ
Ｇとの混合物の添加による官能的ＲＢＩの発現の向上を
示す。
Ｇとの混合物の添加による官能的ＲＢＩの発現の向上を
示す。
【００４４】 第１表 mg/l.OD＊ 相対的増大量 mg/l＊ 相対的増大量 ＧＳＨなし 0.07 1.0 0.36 1.0 ＧＳＨ５ミリモル／ｌ 0.37 5.3 1.65 4.6 ＧＳＨ１０ミリモル／l 0.34 4.9 1.38 3.8 ＧＳＨ５ミリモル／ｌ＋ ＧＳＳＧ１ミリモル／ｌ 0.25 3.9 1.18 2.7 ＊ 細胞内の官能的ＲＢＩの収量は、ｍｇ／ｌ．ＯＤ
（リットル×光学的密度）で記載され、容量の収量は、
ｍｇ／ｌで記載されている。
（リットル×光学的密度）で記載され、容量の収量は、
ｍｇ／ｌで記載されている。
【００４５】例４ 他のチオール試薬としてのＮ−アセチル−Ｌ−システイ
ンの使用 例３の記載と同様に、プラスミドｐＲＢＩａｌで形質転
換されているＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３の培養液を２６℃
でアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ媒体
中で増殖させ、かつＯＤ550＝１でＩＰＴＧ（最終的濃
度：１ミリモル／ｌ）と一緒に誘発させる。同時に、Ｎ
−アセチル−Ｌ−システインを固体の形で添加した（最
終的濃度：５ミリモル／ｌおよび１０ミリモル／ｌ）。
次に、この培養液を１晩中さらに振盪させ、例３の記載
と同様にトリプシン抑制試験によって官能的ＲＢＩの含
量について試験した。結果は、第２表に記載されてお
り、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが作用する濃度範囲
が還元グルタチオンの場合と著しく類似していることを
示す。
ンの使用 例３の記載と同様に、プラスミドｐＲＢＩａｌで形質転
換されているＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３の培養液を２６℃
でアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ媒体
中で増殖させ、かつＯＤ550＝１でＩＰＴＧ（最終的濃
度：１ミリモル／ｌ）と一緒に誘発させる。同時に、Ｎ
−アセチル−Ｌ−システインを固体の形で添加した（最
終的濃度：５ミリモル／ｌおよび１０ミリモル／ｌ）。
次に、この培養液を１晩中さらに振盪させ、例３の記載
と同様にトリプシン抑制試験によって官能的ＲＢＩの含
量について試験した。結果は、第２表に記載されてお
り、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが作用する濃度範囲
が還元グルタチオンの場合と著しく類似していることを
示す。
【００４６】 第２表 Ｎ−アセチル−システインの添加による官能性ＲＢＩの発現 媒体中の添加剤 mg/l.OD＊ 相対的増大量 mg/l＊ 相対的増大量 添加剤なし 0.07 1.0 0.36 1.0 Ｎ−アセチル−システイン ５ミリモル／ｌ 0.31 4.4 1.27 3.5 Ｎ−アセチル−システイン １０ミリモル／l 0.25 3.6 0.83 2.3 ＧＳＨ５ミリモル／ｌ 0.37 5.3 1.65 4.6 ＊ 細胞内の官能的ＲＢＩの収量は、ｍｇ／ｌ．ＯＤで
記載され、容量の収量は、ｍｇ／ｌで記載されている。
ＲＢＩ活性の測定は、全細胞エキスの可溶性部分中での
トリプシン抑制試験によって行なわれる（例３参照）。
記載され、容量の収量は、ｍｇ／ｌで記載されている。
ＲＢＩ活性の測定は、全細胞エキスの可溶性部分中での
トリプシン抑制試験によって行なわれる（例３参照）。
【００４７】例５ ペリプラズム蛋白質ジスルフィドジイソメラーゼ（ＰＤ
Ｉ）の同時発現および同時分泌ならびに培地中へのチオ
ール試薬の同時の添加 宿主固有のペリプラズム蛋白質ジスルフィドジイソメラ
ーゼ（ＰＤＩ）の同時発現のために、Ｅｃｏｌｉ Ｋ１
２野生種菌株Ｗ３１１０（B.J. Bachmann, (1972), Bac
teriol. Rev. 36, 525-557）のゲノムからのＰＤＩ遺伝
子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖させ
た。この場合には、遺伝子の公知の塩基配列（J.C.A. B
ardwell, K. McGovern, J. Beckwith、 “Identificatio
n of a Protein Required for Disulfide Bond Formati
on in vivo ”, Cell,67 (1991),581-589）を相応する
オリゴヌクレオチドプライマーの設計のための出発点と
して使用した。
Ｉ）の同時発現および同時分泌ならびに培地中へのチオ
ール試薬の同時の添加 宿主固有のペリプラズム蛋白質ジスルフィドジイソメラ
ーゼ（ＰＤＩ）の同時発現のために、Ｅｃｏｌｉ Ｋ１
２野生種菌株Ｗ３１１０（B.J. Bachmann, (1972), Bac
teriol. Rev. 36, 525-557）のゲノムからのＰＤＩ遺伝
子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖させ
た。この場合には、遺伝子の公知の塩基配列（J.C.A. B
ardwell, K. McGovern, J. Beckwith、 “Identificatio
n of a Protein Required for Disulfide Bond Formati
on in vivo ”, Cell,67 (1991),581-589）を相応する
オリゴヌクレオチドプライマーの設計のための出発点と
して使用した。
【００４８】ＰＤＩ遺伝子の増殖のために、次のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用した： Ｎ−末端プライマー：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） ５´ＴＴＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴ
ＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡ
ＧＡＴ ３´ Ｃ−末端プライマー：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５） ５´ＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣ
ＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴ
Ｃ ３´ ＰＤＩを含めてシグナル配列およびリボソーム結合部位
の完全遺伝子を含有する増殖されたＤＮＡ断片を分離
し、かつ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切
断した。プラスミドｐＲＢＩａ１を同一の酵素と一緒に
消化し、ベクター断片を分離し、かつＰＤＩ遺伝子と結
合した。生じるプラスミドｐＲＢＩａ１−ＰＤＩは、Ｏ
ｍｐＡ／ＲＢＩおよびＰＤＩに対する遺伝子をディシス
トロニックオペロン（dicistronisches Operon）として
ラクトースプロモーターの制御下に含有する（図３）。
プラスミドの完全ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１で証明されている。
ヌクレオチドをプライマーとして使用した： Ｎ−末端プライマー：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４） ５´ＴＴＧＣＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴ
ＣＴＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡ
ＧＡＴ ３´ Ｃ−末端プライマー：（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５） ５´ＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣ
ＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴ
Ｃ ３´ ＰＤＩを含めてシグナル配列およびリボソーム結合部位
の完全遺伝子を含有する増殖されたＤＮＡ断片を分離
し、かつ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで切
断した。プラスミドｐＲＢＩａ１を同一の酵素と一緒に
消化し、ベクター断片を分離し、かつＰＤＩ遺伝子と結
合した。生じるプラスミドｐＲＢＩａ１−ＰＤＩは、Ｏ
ｍｐＡ／ＲＢＩおよびＰＤＩに対する遺伝子をディシス
トロニックオペロン（dicistronisches Operon）として
ラクトースプロモーターの制御下に含有する（図３）。
プラスミドの完全ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１で証明されている。
【００４９】ＰＤＩの同時発現および同時分泌の効果の
分析のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３をプラスミドｐ
ＲＧＩ−ＰＤＩを用いて形質転換した。形成された細胞
内ＲＢＩ量の培養および測定は、例３および４の記載と
同様に行なった。分析により、ＰＤＩの同時発現および
同時分泌は還元グルタチオンの同時添加の際にのみ、グ
ルタチオンの単独での添加の際に観察される収量上昇を
著しく上廻る収量上昇を生じ、ＰＤＩの単独での発現は
官能的ペリプラズムＲＢＩの量に対して一般に何らの効
果も生じないことが判明した（第３表）。
分析のために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３をプラスミドｐ
ＲＧＩ−ＰＤＩを用いて形質転換した。形成された細胞
内ＲＢＩ量の培養および測定は、例３および４の記載と
同様に行なった。分析により、ＰＤＩの同時発現および
同時分泌は還元グルタチオンの同時添加の際にのみ、グ
ルタチオンの単独での添加の際に観察される収量上昇を
著しく上廻る収量上昇を生じ、ＰＤＩの単独での発現は
官能的ペリプラズムＲＢＩの量に対して一般に何らの効
果も生じないことが判明した（第３表）。
【００５０】 第３表 Ｅ．ｃｏｌｉからのＰＤＩの同時発現による官能的ＲＢＩの発現上昇 媒体中の添加剤 mg/l.OD＊ 相対的増大量 mg/l＊ 相対的増大量 添加剤なし 0.08 1.0 0.38 1.0 ＧＳＨ５ミリモル／ｌ 0.37 4.6 1.65 4.3 ＰＤＩ 0.08 1.0 0.39 1.0 ＰＤＩ＋ＧＳＨ１ｍＭ 0.42 6.0 1.71 4.4 ＰＤＩ＋ＧＳＨ５ｍＭ 0.97 13.7 4.33 11.1 ＰＤＩ＋ＧＳＨ１０ｍＭ 0.54 7.7 2.17 5.6 ＰＤＩ＋ＧＳＨ１ｍＭ ＋ＧＳＳＧ０.５ｍＭ 0.38 5.4 2.00 5.1 ＰＤＩ＋ＧＳＨ５ｍＭ ＋ＧＳＳＧ０.５ｍＭ 0.60 8.6 2.54 6.5 ＰＤＩ＋ＧＳＨ１０ｍＭ ＋ＧＳＳＧ０.５ｍＭ 0.46 6.6 1.93 4.9 ＰＤＩ ＋ＧＳＳＧ０.５ｍＭ 0.10 1.4 0.57 1.5 ＊ 細胞内の官能的ＲＢＩの収量は、ｍｇ／ｌ．ＯＤで
記載され、容量の収量は、ｍｇ／ｌで記載されている。
ＲＢＩ活性の測定は、全細胞エキスの可溶性部分中での
トリプシン抑制試験によって行なわれた（例３参照）。
記載され、容量の収量は、ｍｇ／ｌで記載されている。
ＲＢＩ活性の測定は、全細胞エキスの可溶性部分中での
トリプシン抑制試験によって行なわれた（例３参照）。
【００５１】
【表１】
【００５２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： 長さ：４６９０塩基対 タイプ：相応する蛋白質を有する核酸 鎖形：二重鎖 トポロジー：環状 名称：シグナルペプチドＯｍｐＡ 位置：１３２８．．１３９１ 名称：成熟ペプチドＲＢＩ 位置：１３９２．．１７５６ 名称：シグナルペプチド 位置：１７８９．．１８４５ 名称：成熟ペプチドＰＤＩ 位置：１８４６．．２４１２
【００５３】
【表２】
【００５４】
【表３】
【００５５】
【表４】
【００５６】
【表５】
【００５７】
【表６】
【００５８】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 長さ：４６０塩基対 タイプ：相応する蛋白質を有する核酸 鎖形：二重鎖 トポロジー：線状 名称：シグナルペプチド 位置：２２．．８５ 名称：シグナルペプチド 位置：８６．．４５１
【００５９】
【表７】
【００６０】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ 長さ：６３９塩基対 タイプ：相応する蛋白質を有する核酸 鎖形：二重鎖 トポロジー：線状 名称：シグナルペプチド 位置：１６．．７２ 名称：シグナルペプチド 位置：７３．．６３９
【００６１】
【表８】
【００６２】
【表９】
【００６３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ 長さ：５１塩基 タイプ：核酸 鎖形：一重鎖 トポロジー：線状
【００６４】
【表１０】
【００６５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ 長さ：４９塩基 タイプ：核酸 鎖形：一重鎖 トポロジー：線状
【図面の簡単な説明】
【図１】種々の量のグルタチオンを栄養媒体中に添加し
た後に処理された可溶性ＲＢＩを検出するための免疫ブ
ロットを示す。
た後に処理された可溶性ＲＢＩを検出するための免疫ブ
ロットを示す。
【図２】発現プラスミドｐＲＢｌａｌ−ＰＤＩの制限地
図を示す。
図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルティナ ヴンダーリッヒ ドイツ連邦共和国 レーゲンスブルク ノ ートハフトシュトラーセ ５ (72)発明者 アルネ シュケラ ドイツ連邦共和国 ヴィースバーデン ヒ ェルスカーヴェーク ６ (72)発明者 ライナー ルードルフ ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム フェ ルバーガッセ17
Claims (15)
- 【請求項１】 原核宿主生物を適当な栄養媒体中で適当
な条件下で組換えＤＮＡの発現のために培養する場合、
分泌された蛋白質をコード化する組換えＤＮＡを含有す
る原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の
分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方
法において、１つまたはそれ以上のＳＨ基を有する還元
チオール試薬またはＳＨ基を有する還元チオール試薬と
ジスルフィド基を有する酸化チオール試薬との混合物
０．１〜２０ミリモル／ｌの含量を有する栄養媒体を使
用することを特徴とする、原核宿主生物によるジスルフ
ィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配
座の形成を向上させる方法。 - 【請求項２】 １つまたはそれ以上のチオール試薬１〜
１５ミリモル／ｌの含量を有する栄養媒体を使用する、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 １つまたはそれ以上のチオール試薬３〜
１２ミリモル／ｌの含量を有する栄養媒体を使用する、
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ＳＨ基を有する還元チオール試薬を使用
する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項５】 １分子当たり１個のＳＨ基を有する還元
チオール試薬を使用する、請求項１から４までのいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項６】 グルタチオン（ＧＳＨ）、システイン、
Ｎ−アセチルシステイン、システアミン、β−メルカプ
トエタノールまたはその混合物を還元チオール試薬とし
て使用する、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 ＳＨ基を有する還元チオール試薬とジス
ルフィド基を有する酸化チオール試薬との混合物を使用
する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項８】 還元チオール試薬と、酸化チオール試薬
とのモル比が２：１〜２０：１である、請求項７記載の
方法。 - 【請求項９】 還元グルタチオン（ＧＳＨ）およびグル
タチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）からなる混合物を使
用する、請求項７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】 分泌された蛋白質をコード化する組換
えＤＮＡが細菌の細胞内膜への浸透のためにシグナルペ
プチドをコード化するＤＮＡ断片と操作的に結合してい
る、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 シグナルペプチドがＥ．ｃｏｌｉ Ｏ
ｍｐＡ蛋白質に由来する、請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 分泌された蛋白質をコード化する組換
えＤＮＡが誘発可能な発現シグナルの制御下に存在す
る、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項１３】 さらに栄養媒体に、宿主生物によって
代謝されることのない１つまたはそれ以上の単糖類およ
び／またはオリゴ糖類を添加する、請求項１から１２ま
でのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】 ソルボース、サッカロース、ラフィノ
ースまたはその混合物からなる群から選択された、１つ
またはそれ以上の単糖類および／またはオリゴ糖類を使
用する、請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 宿主生物中で分泌すべきジスルフィド
架橋された蛋白質をコード化する組換えＤＮＡの発現と
一緒に、そのつど使用された原核宿主生物の野生種と比
較して蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現を
向上させる超発現を実施する、請求項１から１４までの
いずれか１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4113750A DE4113750A1 (de) | 1991-04-26 | 1991-04-26 | Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen |
| DE4113750.7 | 1991-04-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268983A JPH05268983A (ja) | 1993-10-19 |
| JPH0753118B2 true JPH0753118B2 (ja) | 1995-06-07 |
Family
ID=6430469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4107284A Expired - Lifetime JPH0753118B2 (ja) | 1991-04-26 | 1992-04-27 | 原核宿主生物によるジスルフィド架橋された蛋白質の分泌の際に天然蛋白質の立体配座の形成を向上させる方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0510658B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0753118B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE109205T1 (ja) |
| AU (1) | AU636537B2 (ja) |
| CA (1) | CA2066370C (ja) |
| DE (2) | DE4113750A1 (ja) |
| DK (1) | DK0510658T3 (ja) |
| ES (1) | ES2057944T3 (ja) |
| FI (1) | FI104262B (ja) |
| IE (1) | IE65792B1 (ja) |
| IL (1) | IL101686A (ja) |
| NO (1) | NO309153B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ242492A (ja) |
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| US6291205B1 (en) * | 1992-06-12 | 2001-09-18 | Merck & Co., Inc. | Method of increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by saccharomyces cerevisiae |
| US5639635A (en) * | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US5789199A (en) * | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US6027888A (en) * | 1996-04-05 | 2000-02-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
| US6083715A (en) * | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
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| US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
| US6753165B1 (en) | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
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| BR122013003013B8 (pt) * | 1999-01-14 | 2021-07-06 | Bolder Biotechnology Inc | proteína isolada monopeguilada do hormônio do crescimento e método para sua obtenção |
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| US7244616B2 (en) | 2003-06-27 | 2007-07-17 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells |
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